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Chemistry

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Bilton, H. A., Ahmad, Z., Janzen, N., Czorny, S., Valliant, J. F. Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry. J. Vis. Exp. (120), e55188, doi:10.3791/55188 (2017).

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Abstract

Introduction

99m Tc sigue siendo el radioisótopo más utilizado en medicina nuclear de diagnóstico, con más de 50 millones de procedimientos de imágenes realizadas por año en todo el mundo 1, 2, 3. La mayoría de los agentes de Tc 99m usados clínicamente son de tipo perfusión radiofármacos. Hay un número limitado de compuestos dirigidos activamente en la que 99m Tc se dirige para unir un marcador biológico específico a través de la ligación a un constructo de reconocimiento. La creación de 99m dirigida radiofármacos Tc es a menudo dificultada por la influencia de 99m complejos de Tc-ligando en la capacidad de la molécula de direccionamiento de obligar a la biomarcador de interés, o los isótopos de vida media no es lo suficientemente largo para su uso con biomoléculas de mayor peso molecular tales como anticuerpos. Este último requiere típicamente varios días antes de las imágenes se adquieren a fin de que la biomolécula para borrar de no diana tiss UES. Pre-focalización ofrece un enfoque alternativo para superar estos desafíos.

Pre-orientación combinada con la química bioorthogonal ha demostrado ser una forma eficaz para desarrollar nuevas sondas de imagen molecular tanto para fluorescencia y radio-formación de imágenes 4, 5, 6, 7, 8. La reacción de la demanda de electrones inversa Diels-Alder (IEDDA) entre 1,2,4,5-tetrazina (Tz) y derivados -cyclooctene trans (TCO), tal como se muestra en la Figura 1, ha demostrado ser particularmente eficaz 6. La reacción IEDDA con estos componentes puede exhibir cinética rápida en PBS (2 k ≈ 6.000 M -1 s -1) y una alta selectividad, por lo que es ideal para in vivo de orientación previa aplicaciones 9, 10.

e_content "> El enfoque más común utilizado implica la administración de un vector de orientación TCO-derivado y después de un período de retardo suficiente, se administra una tetrazina radiomarcado. tetrazinas radiomarcados basado en 11 C, 18 F, 64 Cu, 89 Zr, y 111 En haber sido reportado 11, 12, 13, 14, 15. por el contrario, sólo hay un informe de un marcado con 99mTc Tz, que se preparó usando un ligando de tipo HYNIC requerir el uso de co-ligandos para prevenir la unión a proteínas y la degradación in vivo 16. Como alternativa, se presenta aquí la síntesis de 99m Tc (I) marcado tetrazinas usando una familia de ligandos que forman complejos estables con un tridentados [99m Tc (CO) 3] + núcleo.


Figura 1: La reacción entre IEDDA bioorthogonal tetrazina y -cyclooctene trans. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La familia de ligandos preparadas contienen quelatos tridentados que varían en la polaridad y la naturaleza del grupo de enlace entre la región de unión de metal y el Tz (Figura 2). El objetivo fue identificar una Tc-99m tetrazina constructo que podría localizar y reaccionar con los sitios marcados con TCO en vivo y rápidamente claro cuando no estén unidas de manera efectiva, a fin de producir alta objetivo a no objetivo proporciones. Para probar los ligandos, se utilizó un TCO-derivado de un bisfosfonato (TCO-BP) 17. Hemos demostrado previamente que el TCO-BP se localiza en áreas de metabolismo óseo activo y puede reaccionar contetrazinas radiomarcados en vivo 18. Es un reactivo conveniente para probar nuevos tetrazinas, ya que se puede preparar en un solo paso y los experimentos se puede realizar en los ratones normales, donde la localización se produce principalmente en las articulaciones (rodillas y hombros).

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Protocol

Los estudios con animales fueron aprobados por el Consejo de Ética de Experimentación Animal de la Universidad McMaster, de acuerdo con el Consejo Canadiense de Protección de los Animales (CCPA) directrices.

1. El radiomarcado de ligandos Tz-tridentado con 99m Tc

PRECAUCIÓN: Los siguientes procedimientos requieren el uso de compuestos radiactivos. El trabajo sólo debe hacerse en un laboratorio autorizado con el cumplimiento de las normas de seguridad y eliminación. reacciones de microondas se deben realizar en un horno de microondas diseñado específicamente para la síntesis química.

  1. Síntesis de [99m Tc (CO) 3 (H2O) 3] + 19, 20
    1. En un vial para microondas, combinar 8 mg K 2 [BH 3 CO 2], 15 mg Na 2 CO 3, 20 mg Na 2 B 4 O 7 · 10H 2 O, y 25 mg KOCO [CH (OH)]2 COONa · 4H 2 O. Purgar el vial durante 10 minutos con gas argón.
    2. Añadir 4 ml de 99m TcO 4 - (~ 1.100 MBq, ~ 30 mCi) en 0,9% de solución salina al vial.
    3. La reacción se calienta en un microondas durante 3,5 min a 110 ° C después de 10 s de agitación para asegurar la mezcla completa de los reactivos.
    4. Ajustar el pH de la solución a 3,5 a 4 utilizando ~ 400 l de HCl 1 M. Comprobar el uso de papel de pH.
  2. El radiomarcado de tetrazina ligandos 1-5
    1. Disolver 2 mg de cada ligando (compuestos 1-5) en 250 ml de MeOH 21.
    2. Añadir 250 l de [99m Tc (CO) 3 (H2O) 3] + (~ 74 MBq, ~ 2 mCi) a cada solución.
    3. Se calienta la mezcla de reacción usando un horno de microondas durante 20 min a 60 ° C.
      NOTA: Este paso fue idéntica para los 5 tetrazinas.
    4. Para los compuestos 2 a 5, se evapora el disolvente y se re-DISSOLve los productos resultantes en 1 ml de 1: 1 v / v DCM: TFA.
    5. Calentar los productos de reacción disueltos (2-5) a 60 ° C en un microondas durante 6 min (2-4) o 10 min (5).
    6. Después de enfriar a temperatura ambiente, se evapora el disolvente usando un evaporador (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6000 rpm) y se disuelve el compuesto se seca en 1: 1 ACN: H 2 O o 1: 1 MeOH: H 2 O, antes de la purificación por HPLC.
    7. Purificar los compuestos marcados con Tc 99m (1-5), que incluyen la separación del producto etiquetado de ligando no marcado tetrazina, usando HPLC (C18 de fase inversa). Típicamente, usar un gradiente de elución de 30:70 ACN: H 2 O (ambos con 0,1% de TFA) a 40:60 ACN: H 2 O durante 20 min (18 min) y una columna de 4,6 x 100 mm analítica C 18. Usar tanto UV (254 nm) y detección gamma.
      1. Tomar una pequeña muestra de cada producto marcado y comparar su tiempo de retención HPLC a la de un co-injeja, no radiactivo, estándar marcado con Re (0,125 mg en 20% de metanol-H 2 O). El estándar Re-marcado se identifica en la traza de HPLC UV, y eluir en el mismo tiempo que el compuesto marcado con Tc 99m en la traza de γ-HPLC. Esta co-inyección de muestra picos a tiempos de retención comparables, lo que confirma la identidad del compuesto 99m Tc-etiquetados.
    8. Se evapora el disolvente de las fracciones de HPLC utilizando un evaporador (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6000 rpm).
    9. Formular el compuesto purificado a una concentración de 7,4 kBq / l en PBS, que contenía 0,5% de BSA y 0,01% de Tween-80.
    10. Para garantizar los compuestos marcados son estables, realice un estudio in vitro de la estabilidad en. Incubar el compuesto formulado a 37 ° C durante 1, 4 y 6 h, la inyección de una pequeña cantidad (3,7 MBq) de la mezcla en la HPLC en cada punto de tiempo para evaluar la estabilidad.

2. Pre-Estudios dirigidos biodistribución

    Preparación de los animales
    1. Utilizando, ratones Balb / c hembras de 7-9 semanas de edad (n = 3), administrar TCO-BP formulado en solución salina (20 mg / kg) (5 mg / l), a través de la cola de inyección venosa.
    2. Coloque el ratón en el dispositivo de restricción física, e identificar las venas situadas en las superficies laterales de la cola y limpie con un algodón con alcohol. En aproximadamente 2 cm desde el extremo de la cola, insertar una aguja de calibre 30 con un ángulo pequeño, en paralelo a la vena. Presione lentamente el émbolo para inyectar, retire la aguja y aplicar esponja de gasa limpia en el sitio de la inyección con una ligera presión hasta que el sangrado se detenga.
    3. A 1 h después de la inyección de TCO-BP, administrar ~ 0,74 MBq (20 Ci) de Tc-99m tetrazina formulados en 100 l de BSA al 0,5%, 0,01% de Tween-80 en PBS, a través de la cola de inyección venosa.
  1. Los estudios de biodistribución
    1. En el punto de tiempo deseado (t = 6 h), anestesiar los ratones utilizando 3% de isoflurano y mezcla de gases de oxígeno 2%. Demostrar una dee pizca de retirada en el ratón anestesiado para asegurarse de que están bajo plano quirúrgico de anestesia.
    2. Recoger la sangre (1 ml) mediante punción cardíaca usando una jeringa pre-tratado con heparina. Coloque el ratón sobre su espalda con la nariz en el cono de la nariz para la anestesia continua y localizar la apófisis xifoides en el animal.
      1. Insertar una aguja de 25 G, ligeramente a la izquierda de la línea media del animal en el marco del proceso xifoides, en un ángulo de 20 °. Inserte completamente la aguja y tire lentamente el émbolo hacia atrás para ver la sangre en el cubo de la aguja si se perfora el corazón. Ligeramente reajustar la aguja mientras mantiene el émbolo en caso necesario, para perforar el corazón. extraer lentamente sangre en la jeringa.
    3. La eutanasia a los animales por dislocación cervical, mientras que bajo anestesia.
    4. Coloque cada animal en una bolsa de plástico y utilizar un calibrador de dosis (99m Tc configuración) para medir el nivel de actividad todo el cuerpo.
    5. Recoge los siguientes tejidos y fluidos pre-pesajeed contando tubos: sangre, médula (rodilla y hombro), la vesícula biliar, los riñones, el hígado, el estómago (con su contenido), los intestinos pequeños (con su contenido), intestino grueso y ciego (con su contenido), la tiroides y la tráquea, vejiga urinaria con orina , y la cola.
    6. Enjuague tejidos apropiados (con exclusión de la sangre, la vesícula biliar y la vejiga urinaria) en PBS para eliminar la sangre y secar antes de colocar los tejidos en tubos de recuento apropiados.
    7. Coloque cadáver animal en una bolsa de plástico y medir la actividad de todo el cuerpo residual utilizando un calibrador de dosis.
    8. Pesar cada tubo que contiene una muestra de tejido. Restar el peso inicial del tubo para obtener la masa del tejido.
    9. Utilice un calibrador de dosis (99m Tc ajuste) para medir la cantidad de actividad en una muestra de ensayo (100 l) en el momento de la inyección para cada ratón.
      NOTA: Este muestra de ensayo es igual al volumen de inyección, dando así el recuento de actividad en el momento de la inyección.
    10. En el momento de la medición de tejido, unaliquot 5 l de la muestra de ensayo utilizado anteriormente. Use un contador gamma multi-detector (99m Tc configuración) y contar hasta obtener el recuento por minuto (CPM) para la muestra 5 mL.
    11. Usa los dos valores obtenidos en 2.2.9 y 2.2.10 para calcular la actividad y la relación CPM utilizando la ecuación 1 para obtener un factor de conversión (CPM Ci -1).
      (1) Ecuación 1
    12. Utilice el contador gamma para medir la cantidad de radiactividad en cada muestra de tejido o fluido.
    13. Usar la ecuación 1 para calcular la cantidad de actividad en cada tejido o fluido en el momento de la medición en relación con la dosis total inyectada. Este valor se normalizó por el peso de órganos y se expresa como porcentaje de dosis inyectada por gramo (es decir,% ID / g) de tejido.
    14. Siga los pasos 2.1.2 a 2.2.13 para llevar a cabo un experimento de control negativo utilizando las marcado con 99mTc ligandos tetrazina en el Absencina de TCO-BP. ratones Sacrificio (n = 3) a las 0,5, 1, 4 y 6 h después de la inyección y obtener tejido o fluido como se describe anteriormente.

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Representative Results

Los ligandos se sintetizaron utilizando diferentes enlazadores y quelantes a través de una simple estrategia de aminación reductora (Figura 2), seguido de acoplamiento del producto a un tetrazina disponible en el mercado 22, 23. El radiomarcado se realizó utilizando el mismo método para todos los compuestos y era altamente reproducible. El proceso se ha optimizado variando el pH, la cantidad de ligando, tiempo de reacción y la temperatura con lo cual el 99m Tc-compuestos radiomarcado 1-5 se obtuvieron en moderado a alto rendimiento radioquímico: 83% (1), 45% (2), 31% (3), 42% (4), y 54% (5). Después de la purificación por HPLC de ligando sin reaccionar y la evaporación usando un evaporador, los compuestos se formularon en PBS que contenía 0,5% de BSA y 0,01% Tween 80 antes de la inyección. La actividad específica de la p tetrazina marcado con Tc 99m urified fue ~ 1,48 MBq / mg. Se realizaron estudios para evaluar la estabilidad de los 99m Tc-etiquetados ligandos tetrazina antes de los estudios in vivo. La estabilidad se controló por HPLC a 1, 4 y 6 h sin degradación visible de más de 6 h (R t = 14 min), como se ve en la Figura 3 para el compuesto 4 como un ejemplo.

Figura 2
Figura 2: Los compuestos 1-5 se produjeron utilizando diferentes enlazadores (Y) y quelantes (X) como se muestra (parte inferior). Todos los compuestos se radiomarcados con [99m Tc (CO) 3 (H 2 O) 3] + usando las mismas condiciones de reacción (arriba), con la excepción de 1, lo que no requiere la etapa (ii).

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Figura 3: Resultados de la prueba de estabilidad utilizando el Compuesto 4. trazas γ-HPLC de 4 incubadas en PBS a 37 ° C durante 1, 4 y 6 h.

Para la prueba in vivo, se usaron ratones sanos Balb / c. Brevemente, para cada compuesto, los grupos de ratones (n = 3) fueron inyectados con TCO-BP (100 l, 20 mg / kg), que fue seguido por la administración de los compuestos marcados con Tc 99 m 1 h más tarde. A las 6 h después de la inyección de los complejos de Tc 99m, se sacrificaron los animales y las concentraciones de actividad en diversos tejidos y fluidos determinan. Los datos resultantes se informa como porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido (% ID / g) y se muestra en la Figura 4. Relaciones representativos de hueso (rodilla o el hombro) a la sangre para cada uno de los compuestos marcados con Tc Tz cinco 99m se muestran en la Tabla 1. Estos datos indican clprincipios que el compuesto 3 proporciona una óptima focalización combinado con el visto bueno de la sangre, y que había una variación considerable entre los compuestos marcados con Tc 99m en lo que se refiere a la localización de tejido desviado. Un estudio negativo de control utilizando ratones CD1 (n = 3) se llevó a cabo, donde los ratones fueron inyectados con ligandos 99m Tc-tetrazina en ausencia de TCO-BP. Se sacrificaron los ratones a las 0,5, 1, 4 y 6 h y% ID / g se determinó para todos los tejidos y fluidos. Para todos los compuestos ensayados, donde los datos para el compuesto 2 se presenta en la Figura 5, no absorción significativa se observó en el hueso o de otros tejidos (corazón, pulmones, bazo, músculo esquelético) que no se muestran en la Figura 4.

Figura 4
Figura 4. Resultados de Bio-distribución de derivados tetrazina marcado con 99mTc 1-5 (bares índicaTed). Los datos mostrados se obtuvieron de los tejidos seleccionados y fluidos tomadas 6 h después de la inyección de los derivados radiomarcados, y la actividad se normalizó a tejido o el peso de fluido, como media porcentaje de dosis por gramo de tejido o líquido (% ID / g) inyecta ± SEM. objetivos de hueso se indican mediante •. NOTA: Todos los tejidos restantes no mostrados tenido media% ID / g que fue de menos de 1%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Resultados Bio-distribución para el estudio de control utilizando marcado con Tc 99m tetrazina (2) sin inyección previa de TCO-BP. Los datos mostrados se obtuvieron de los tejidos seleccionados y fluidos tomados de 3 ratones a las 0,5, 1, 4, y 6 h después de la inyección de 2. La actividad se normalizó a los tejidos opeso de fluido, como dosis media por ciento inyectada por gramo de tejido o líquido (% ID / g) ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Compuesto
Proporción 1 2 3 4 5
Hombro: Sangre 3.5: 1 3.5: 1 21: 1 7.8: 1 0.8: 1
Rodilla: Sangre 6.9: 1 5.6: 1 26: 1 12: 1 1.3: 1

Tabla 1. tejido óseo: relaciones de sangre determinados a partir de los estudios de biodistribución.

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Discussion

Se preparó una colección de quelatos tridentado tetrazina ligados de distintas polaridades, y se evaluó la utilidad de sus complejos 99m Tc en la reacción con un derivado IEDDA TCO in vivo. Un método eficaz y reproducible 99m Tc fue desarrollado para cinco tetrazina quelatos, donde la concentración de ligando se 10 -3 M. La etapa de marcaje fue seguido por la desprotección de t- butilo (para los compuestos 2-5). La alta concentración de ligando se utiliza para mejorar el rendimiento radioquímico y reducir los tiempos de reacción que minimizan la degradación de la tetrazina 21. El producto se aisló y se separó del ligando no marcado y las impurezas radioquímicas por HPLC, lo que resulta en rendimientos radioquímicos que van desde 31 hasta 83%, con todo con una pureza radioquímica> 99% y una alta actividad específica de ~ 1,48 MBq / mg. Todos los compuestos mostraron ser estables en PBS que contiene 0.5% de BSA y 0,01% de Tween 80 durante un máximo de 6 horas (Figura 3).

compuestos con bisfosfonatos, como el TCO-BP, se localizan en las regiones del metabolismo óseo activo o lesiones, que incluyen articulaciones de rodilla y hombro en los ratones. Por lo tanto, el TCO-BP proporciona un medio sencillo para evaluar la eficacia de nuevos tetrazinas radiomarcados para entregar isótopos in vivo. Evaluación de la bio-distribución de todos los cinco 99m Tc-tetrazinas mostró captación en articulaciones de la rodilla y el hombro 6 h después de la inyección, demostrando el éxito de orientación previa al hueso in vivo (Figura 4). Los estudios anteriores confirmaron que radiomarcado TCO-BP se acumula en el hueso 18, mientras que el constructo de 99m Tc-tetrazina (2) se administran solos no lo hace (Figura 5). Esto permite concluir que la absorción ósea fue debido a la reacción IEDDA.

Las construcciones más lipófilos 1 y 2 (1); 7,6 ± 2,7 (2)) y el hombro (4,6 ± 1,4 (1); 4,8 ± 1,9 (2)). Altas concentraciones de radiactividad también fueron vistos en la vesícula biliar, el hígado y los intestinos, que es coherente con la distribución de la 99m Tc lipófilo-tetrazina compuesto 2 en ausencia de TCO-BP (Figura 5). Otros tejidos no objetivo y órganos como el músculo esquelético y el bazo no mostraron ninguna captación significativa (<1%) cuando se realizaron estudios de biodistribución en los 99m Tc-tetrazinas en ausencia de la TCO-BP (Figura 5) , por lo que estos órganos no fueron tomadas durante los experimentos de orientación previa. Además, los experimentos de biodistribución con los 99m Tc-tetrazinas solos revelaron buena separación de los tejidos no diana a las 6 horas después de la inyección. En consecuencia, this punto de tiempo, que está dentro de una vida media del isótopo, fue seleccionado como el punto de tiempo para la comparación de los diferentes ligandos radiomarcados tetrazina.

El compuesto más polar 99m Tc-tetrazina 3 que soporta un enlazador PEG 5 mostró muy alto de rodilla y la absorción del hombro (16,2 ± 4,8 y 20,7 ± 4,9, respectivamente). También había una menor actividad observada en el hígado y los intestinos. El derivado de PEG 10 correspondiente también mostró la unión al hueso y reducción de la absorción en el hígado en comparación con los compuestos 1 y 2. El derivado más polar 5, mostró unión de todos los otros constructos que es probable ósea más baja debido a su rápida eliminación.

La captación ósea alta y el hueso: relaciones de sangre (Tabla 1) en particular para los compuestos 3 y 4 demuestran que la pre-orientación y la reacción IEDDA se pueden utilizar para loccompuestos Alize marcado con 99mTc en vivo. Los métodos aquí presentados pueden ser usados ​​para evaluar cualquier tetrazina radiomarcado incluyendo próxima generación de Tc (I) ligandos -tetrazine. Cabe señalar que para la clase de ligandos que se utilizaron en este estudio, las estructuras se pueden variar fácilmente cambiando la naturaleza de los grupos donantes y enlazadores entre el complejo de metal y el tetrazina, sin alterar significativamente el procedimiento de síntesis del ligando 21. Una vez que se identifica una molécula de plomo, un método kit instantánea, que probablemente incluirá métodos de purificación en fase sólida, puede ser desarrollado para apoyar la traducción clínica.

Los complejos de Tc (I) que aquí se crean la oportunidad de preparar nuevos radiofármacos 99m Tc utilizando una amplia gama de diferentes moléculas de TCO derivados de la orientación que incluyen anticuerpos. Los anticuerpos, a pesar de sus excelentes propiedades de orientación previos a la creación de tetrazinas marcados con tecnecio, ¿no typicaliado ser utilizado con 99m Tc a causa de su lento aclaramiento (días), que es mucho más larga que la vida media del isótopo (~ 6 h). Una aplicación adicional de la química informó aquí es que la misma clase de ligandos se puede preparar con la beta radionucleidos emisores 186 y 188Re. Los análogos isoestructurales Re (I) de los agentes de Tc (I) cuando se combinan con el tumor en busca de propiedades de TCO-BP se pueden utilizar para el tratamiento de metástasis óseas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Argon gas Alphagaz --- ---
Na2CO3 EMD Millipore 106395 ---
Na2B4O7·10H2O Anachemia S9640 ---
KNaC4H4O6·4H2O Anachemia 217255 ---
Technelite 99mTc generator Lantheus medical imaging --- Source of 99mTcO4-
0.9% Saline Lantheus medical imaging --- To elute generator
1 M HCl Lab Chem --- ---
MeOH Caledon --- ---
ACN Caledon --- HPLC grade
Millipore H2O Thermo Fisher Scientific Barnstead Nanopure ---
DCM Caledon --- ---
TFA Caledon --- ---
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023 pH 7.4 1x
BSA Sigma Aldrich A7906 ---
Tween80 Sigma Aldrich P8047 ---
Isoflurane CDMV 108737 Supplier: Fresenius Kabi Animal Health
HPLC Waters 1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590) ---
HPLC column for analysis and purification of compounds 2-4 Phenomenex 00G-4435-E0 Gemini® 5 µm C18 110 Å, LC Column 250 x 4.6 mm
HPLC column for analysis and purification of compounds 1 and 5 Waters  186003115 XBridge BEH C18 Column, 130 Å, 5 µm, 4.6 mm x 100 mm
Microwave Reactor  Biotage  Initiator 8 ---
Biotage V10 Evaporator Biotage  Serial # V1041 ---
Dose calibrator Capintec, Inc.  CRC-25R ---
Gamma counter Perkin Elmer Wizard 1470 Automatic Gamma Counter ---
Animal room scale  Mettler Toledo XP105 Delta Range ---
Microwave vials  Biotage  355629 0.5-2 mL 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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