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 JoVE Immunology and Infection

Método de muestreo hisopo para la Detección de norovirus humano en superficies

1, 1, 1

1Division of Viral Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

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    Summary

    Cite this Article

    Park, G. W., Chhabra, P., Vinjé, J. Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces. J. Vis. Exp. (120), e55205, doi:10.3791/55205 (2017).

    Abstract

    norovirus humanos son una causa principal de la epidemia y la gastroenteritis esporádica en todo el mundo. Debido a que la mayoría de las infecciones se propagan ya sea directamente a través de la ruta de persona a persona o indirectamente a través de las superficies ambientales o alimentos, fómites contaminados y superficies inanimadas son vehículos importantes para la propagación del virus durante los brotes de norovirus.

    Desarrollamos y evaluamos un protocolo utilizando hisopos macroespuma para la detección y tipificación de los norovirus humanos de las superficies duras. En comparación con hisopos con punta de fibra o toallitas antiestáticas, hisopos macroespuma permiten la recuperación de virus (rango de 1,2 a 33,6%) de las superficies de asiento de inodoro de hasta 700 cm 2. El protocolo incluye los pasos para la extracción del virus de los hisopos y una mayor concentración del ARN viral usando columnas de centrifugación. En total, 127 (58,5%) de 217 muestras de frotis que habían sido recogidos de las superficies en los cruceros y centros de atención a largo plazo donde había estado la gastroenteritis por norovirusinformaron dado positivo por norovirus GII por RT-qPCR. De estos 29 (22,8%) podría ser genotipo con éxito. En conclusión, la detección de norovirus en superficies ambientales utilizando el protocolo que hemos desarrollado puede ayudar a determinar el nivel de contaminación del medio ambiente durante los brotes, así como la detección de virus cuando las muestras clínicas no están disponibles; también puede facilitar el seguimiento de la eficacia de las estrategias de remediación.

    Introduction

    Norovirus humanos son una causa principal de la epidemia y la gastroenteritis aguda esporádica en todo el mundo 1, 2, 3. El virus es muy contagioso y la transmisión ocurre a través de la interacción persona directa a persona o indirectamente por contacto con alimentos contaminados, agua o superficies ambientales. Los norovirus se pueden desprender durante períodos prolongados y prolongan la supervivencia del virus en las superficies ambientales se ha documentado 1, 2, 3. Durante derramamiento pico, miles de millones de partículas de virus son liberadas por gramo de heces, y vómito también contiene un número suficiente de partículas virales para causar la infección 4, 5, 6, 7, 8,ef "> 9, 10. Además, la transferencia del virus entre las superficies inanimadas y la piel humana puede ocurrir fácilmente 2, 11, 12. Por lo tanto, el control de la contaminación ambiental puede ayudar en la investigación de brotes y en la evaluación de la eficacia de la limpieza y procedimientos de desinfección.

    Varios protocolos de muestreo ambientales se han descrito para la detección de rotavirus, colifago MS2, calicivirus felino (FCV), y bacteriófago P22 13, 14, 15, 16. Sin embargo, las condiciones de validación descritas en estos estudios, incluyendo la desecación rápida (<1 hora) y la escasez de superficie (25 x 100 cm 2), pueden no representar adecuadamente la configuración del campo. Además, el bajos niveles de contaminación de Enviro esperadasuperficies nmental requieren protocolos que son capaces de detectar muy pocas partículas de virus.

    Hemos desarrollado un método de muestreo de superficie a base de macroespuma para la detección y tipificación de norovirus. Este método ha sido validado durante varios brotes de norovirus. El protocolo incluye 1) cómo recolectar muestras de frotis de superficies ambientales (2) mejor manera de mantener la integridad de las muestras durante la recogida y el envío al laboratorio, y 3) las pruebas de laboratorio y tipificación de norovirus.

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    Protocol

    1. torunda de muestreo en el campo

    1. Use un par de guantes limpios.
    2. Medir el tamaño de la zona de muestreo sin tocar la superficie usando una cinta de medición o una regla. Tratar de estimar el área con la mayor precisión posible y llenar un formulario de informe (Cuadro 1).
    3. Compruebe el kit de raspado de posibles fugas y bolsas de transporte de muestras de etiquetas y kits de hisopos.
    4. Mueva el hisopo por el área de muestreo como sigue: un golpe en la dirección horizontal, de un solo golpe en la dirección vertical, y un golpe en una dirección diagonal. No limpie un área superficial mayor que 700 cm 2.
    5. Coloque cada hisopo en un tubo y apretar bien la tapa.

    2. Almacenamiento y Transporte de hisopos al laboratorio

    1. Mantenga hisopos a 4 ° C durante un máximo de 48 h. Si se requiere el almacenamiento durante periodos más largos, almacenar los hisopos a -20 ° C (-70 ° C o).
    2. Mantener los tubos a 0-4 ° C (es decir,. , Utilizar bolsas de hielo) en un recipiente aislado durante el transporte al laboratorio y se envían dentro de las 24-48 horas de la recolección.

    3. La concentración de virus, el ARN viral Extracción y Purificación

    NOTA: Todos los pasos de centrifugación usar una centrífuga de mesa a 5.000 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario. Tenga mucho cuidado cuando se trabaja con el tampón universal de extracción de ácidos nucleicos (UNEX). Use gafas o careta.

    1. Etiquetar un tubo de 15 ml y una columna de ARN Midi para cada muestra. Incluir un control negativo de extracción en cada experimento.
    2. Para preparar la solución de lisis durante 10 hisopos, mezclar 25 ml de tampón de UNEX con 25 ml de PBST (PBS pH 7,2 que contiene 0,02% de Tween-80).
    3. Añadir 50 l de suspensión de colifago MS2 (10 6 PFU / l) a 50 ml de solución de lisis.
    4. Coloque una torunda en un tubo de 15 ml y añadir 5 ml de solución de lisis. Mezclar e incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
    5. Añadir 5 ml de etanol 100% a cada tubo y agitar durante 10 s.
    6. Retire cuidadosamente el hisopo del tubo de 15 ml (que contiene tampón UNEX) presionando suavemente contra el lado del tubo para eliminar el exceso de líquido y luego desechar el hisopo. Los volúmenes restantes deben ser de entre 9-10 ml.

    4. Columna Midi Viral Nucleic Acid Extracción

    1. Transferir cuidadosamente 4.5 / mezcla de etanol ml UNEX desde el paso 3.6 en una columna de midi, centrifugar y desechar el filtrado.
    2. Cargar otros 4,5 ml de la misma mezcla en la misma columna, se centrifuga, y desechar el filtrado.
    3. Para el primer lavado, añadir 3,5 ml de etanol al 70% en la región de Midi columna, centrifugar y desechar el filtrado.
    4. Para el segundo lavado, añadir otros 3,5 ml de etanol al 70% sobre la columna de Midi. Centrífuga y desechar el filtrado.
    5. Para el seco-spin, centrifugar las columnas Midi para eliminar todos los restos de etanol (que puede afectar negativamente a su recuperación de ARN viral).
    6. Colocar la columna de Midi en un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml. Añadir 250 l de tampón de elución en la columna de Midi; esperar a 1 min antes de la centrifugación para obtener la mayor recuperación de ARN viral.
    7. Almacenar el ácido nucleico extraído a -70 ° C o proceder inmediatamente al paso 5.

    5. La concentración de ácido nucleico viral utilizando ARN Clean y Concentrador Kits

    1. Añadir 500 l de tampón de unión de ARN a 250 l de ARN eluido en el paso 4.7 anterior y agitar durante 10 s.
    2. Añadir 750 l de etanol 100% y agitar durante 10 s.
    3. Etiquetar una columna de giro para cada muestra. Cargar la muestra de 750 l en una columna de centrifugado.
    4. Centrifugar las columnas de centrifugación a 12.000 xg durante 1 min. Descartar el flujo continuo.
    5. Cargar los 750 l restantes sobre una columna de centrifugación y se centrifuga a 12.000 xg durante 1 min.
    6. Para el pre-lavado, añadir 400 l de tampón RNA Prep a cada columna de centrifugación y centrifugar a 12.000 xg durante 1 min. Descartar el flujo continuo.
    7. Para el primer lavado, añadir 800 l de ARN tampón de lavado a cada columna de centrifugación y se centrifuga a 12.000 xg durante 1 min. Descartar el flujo continuo.
    8. Para el segundo lavado, añadir 400 l de tampón de lavado de ARN para hacer girar la columna y se centrifuga a 12.000 xg durante 1 min. Descartar el flujo continuo.
    9. Para el seco-spin, centrifugar la columna de centrifugación para eliminar todos los restos de tampón de lavado a 12.000 xg durante 2 min.
    10. Transferir cuidadosamente la columna de centrifugación a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpio.
    11. Añadir tampón de elución de 25 l en la columna de centrifugación y se incuba durante 1 min a temperatura ambiente. Esto aumentará la recuperación del ARN viral de la columna.
    12. Recoger ARN por centrifugación la columna de centrifugación a 10.000 xg durante 1 min.
    13. O bien proceder directamente a RT-qPCR (paso 6) o tienda de ARN a -70 ° C.

    6. Mutiplex RT-qPCR Detección de Genogrupo I y II Los norovirus, y colifago MS 2 (Cuadro 2)

    1. superficies de trabajo limpias, pipeteeES, y centrífugas con RNasa solución de descontaminación para reducir la posible contaminación.
    2. Descongelar los reactivos RT-qPCR en hielo. ARN deshielo en hielo (en un área / habitación separada).
    3. Determinar el número de reacciones y añadir al menos un 10% más de ellos (por ejemplo, si se necesitan 10 reacciones, que mezcla maestra de 11).
    4. Vortex componentes de la mezcla maestra individuales, a excepción de 25x enzima RT-qPCR, durante 5 s. Mezclar con cuidado la enzima con un movimiento rápido del tubo con un dedo.
    5. Brevemente componentes de la mezcla centrífuga maestros para 5 s.
    6. Preparar la mezcla maestra para la detección en tiempo real de RT-PCR de GI norovirus y GII de acuerdo con las instrucciones del kit y añadir cebadores y sondas de oligonucleótidos de norovirus específico en un 1,5 ml tubo de microcentrífuga (Tabla 3).
    7. Mezclar la mezcla maestra pipeteando 5-10 veces arriba y abajo (no se recomienda agitación). Alícuota de 22 l de la mezcla maestra en cada pocillo de PCR en tiempo real placa de 96 pocillos.
    8. Vortex ARN de la muestradurante 5 segundos, y cobrar por breve (5 s) centrifugación.
    9. Añadir 3 l de muestra de RNA y GI y GII controles positivos a la placa de RT-qPCR (siga la plantilla de la Tabla 2). Añadir 3 l de nucleasa freewater en los pozos sin molde y controles (NTC).
    10. Sellar la placa en tiempo real con película adhesiva óptica.
    11. centrifugar con cuidado la placa en tiempo real en 1300 xg durante 1 min para eliminar las burbujas de aire o las gotas de líquido que pueden estar presentes en los pocillos.
    12. Establecer un instrumento en tiempo real PCR y de establecimiento de las siguientes condiciones de termociclado: 1) etapa de RT durante 10 min. a 45 ° C (2) la activación de Taq polimerasa, 10 min. a 95 ° C y (3) 45 ciclos de 15 s a 95 ° C, y 60 s a 60 ° C.

    7. La cuantificación de norovirus en muestras de frotis

    1. Comprobar los resultados de los controles positivos y negativos para validar los resultados de RT-qPCR (Tabla 3).
    2. Determina si cada curva estándar se encuentra con elLos valores aceptables dan en la tabla complementaria 2 y calcular la desviación estándar global para la curva estándar utilizando la Ecuación 1.
      (Ecuación 1)% de eficiencia = 100 x 10 (promedio de valores de Ct-Intercepción) / pendiente.
    3. Si el software termociclador de PCR no calcula la pendiente de cada curva patrón, determinar la pendiente y los valores R 2 de la regresión utilizando el software estadístico (por ejemplo, Excel, SPSS o SAS). Además, se calcula el% de eficiencia para las curvas de calibración siguiente ecuación I
    4. Registre el número de copias de ARN calculado por el software termociclador para todas las muestras de prueba en base a las curvas de calibración que cumplen los criterios especificados en la Tabla 4 complementario. Vuelva a ejecutar ninguna de las muestras con las curvas de calibración t sombrero no cumplen con los criterios o tienen controles positivos falsos. Comprobar los valores de Ct de colifago MS2, que se añadió como un control interno para controlar la inhibición de la PCR.
    5. Determinar el número total de copias de ARN pmuestra er por la multiplicación del número de copias de ARN calculada en la etapa 7.2 por la relación del volumen (25 a 50 l) de eluyente de ARN total a la del ARN (3-5 l) utilizado para la reacción RT-qPCR. Alternativamente, el cálculo de la densidad de RNA dividiendo el número total de copias de ARN por el área de superficie del objeto (cm 2) analizada.

    8. El genotipado de muestras en tiempo real RT-PCR positivos por Hemi anidada amplificación por PCR convencional

    1. Preparar la primera ronda de mezcla maestra para cada conjunto de cebadores de la RT-PCR ensayo (que complementa los cuadros 2 y 5).
    2. Añadir 5 l de ARN norovirus positiva a 20 l de mezcla maestra.
    3. Ejecutar la RT-PCR en las siguientes condiciones: (1) RT paso durante 30 min a 42 ° C (2) la activación de Taq polimerasa, 15 min a 95 ° C, y (3) 40 ciclos de 30 s a 95 ° C , 30 s a 50 ° C y 60 seg a 72 ° C. Después de 40 ciclos, se incuba durante 10 min adicionales a 72 ° C.
    4. Preparar la segunda ronda de mezcla mater para cada conjunto de cebadores de la RT-PCR ensayo (que complementa los cuadros 2 y 5).
    5. Añadir 23 l maestro de la mezcla y añadir 2 l de productos de primera ronda de RT-PCR (de primera ronda) a cada tubo (lo ideal es el producto de primera ronda debe ser diluido 1/10 en agua libre de RNasa).
    6. Repita el paso 8.3.
    7. Preparar un gel de agarosa al 2% en EDTA 100 ml 1x Tris-acetato (Tris 40 mM, ácido acético 20 mM, y EDTA 1 mM, a pH 8,3). Después de disolver de agarosa por calentamiento de la mezcla en un horno de microondas, añadir 10 l de colorante de ácidos nucleicos por 100 ml de gel preparado después de enfriar la mezcla a 60-70 ° C, se vierte el gel e insertar los peines. Deje que el gel se conforme con al menos 30 minutos.
    8. Mezclar 15 l de cada producto de RT-PCR con 3 l de colorante de carga 6x. Cargar 15 l de cada muestra y a electroforesis el gel de agarosa a 100 V durante 1 h.
    9. fragmentos objetivo Impuestos Especiales RT-PCR de tamaño apropiado (330 pb para GI y 341 pb para GII) a partir de un gel de lad purificar ARN usando un kit de extracción de gel comercial. El producto de PCR purificado se puede utilizar ahora para la secuenciación de Sanger.

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    Representative Results

    La Figura 1 presenta un diagrama de flujo del protocolo de muestreo hisopo. Este protocolo consiste en cuatro pasos principales; 1) la recogida de muestras, 2) de almacenamiento de muestras y el transporte, 3) la purificación de ARN viral y la concentración y 4) ensayo de RT-qPCR y genotipado.

    Figura 1
    Figura 1: Diagrama de flujo del protocolo final para el muestreo ambiental de superficies de norovirus Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    La Tabla 1 resume los resultados de 34 muestras de frotis que fueron recolectadas desde un crucero que había reportado casos de sospecha de la gastroenteritis por norovirus durante un viaje. muestras de frotis fueron extraídos y tested por duplicado para el norovirus por múltiple en tiempo real de RT-qPCR. Diecisiete (18,5%) muestras resultaron positivas incluyendo 8 muestras de las superficies de las cabinas donde los pasajeros con síntomas de norovirus se había quedado y 9 de las áreas comunes en el barco. El número de copias genómicas por muestra se calcula a partir de los valores de Ct (que iban del 16 al 31) utilizando una curva estándar de una transcripción de ARN norovirus GII.7. La mediana del número de copias del genoma a partir de muestras de frotis en cabañas fue de 3,6 log10 (rango: 2.4 - 4.5 log10 copias de ARN), que fue significativamente mayor que las copias del genoma de las zonas comunes (rango: 1.2 a 2.1 log 10 copias del genoma) ( P <0,001). Cuatro (23,5%) de las 17 muestras de frotis positivos fueron capaces de determinar el genotipo, y todas las muestras tenían secuencias idénticas GII.1.

    Piscina
    Lugar de intercambio del medio ambiente recogió una Ct valor medio (# positiva del número total de muestras analizadas) Genotipo Norovirus ARN número de copias por área muestreada c
    Atrio pasamanos 34,3 (1/2) GII dieciséis
    Una cabina Asiento del baño 31,4 (2/2) GII. segundo 31.217
    Una cabina Grifo 37,5 (1/2) GII 491
    Una cabina tirador 35,0 (2/2) GII 2.675
    Una cabina Control remoto 38,6 (2/2) b GII.1 233
    cabina B Asiento del baño 33,5 (2/2) b GII.1 986
    Maquina de helados 34,2 (2/2) GII dieciséis
    Piscina Condimentos de mesa 35,2 (1/2) GII 15
    Piscina Mesa 35,3 (1/2) GII 14
    Pizzería superficie contraria 35,7 (1/2) GII 14
    principal Galera Máquina-tiempo de la diversión 37,1 (1/2) GII 64
    Máquina expendedora Las superficies que se pueden tocar 38,8 (1/2) GII 18
    salón del equipo Teclado y ratón de superficie 36,8 (1/2) GII 80
    C cabina El grifo y el pomo de la puerta 31,6 (2/2) b GII.1 26.458
    C cabina Teléfono 36,4 (2/2) GII 1.035
    C cabina Teclado 33,0 (2/2) GII 1.317
    Centro Médico Portapapeles 36,0 (2/2) GII 113
    una cabina A, B y C ha sido ocupada por las personas que habían estado clínicamente enfermos con síntomas virales gastoenteristis.
    b Cuatro de las 17 muestras de frotis GII-positivos se puede genotipo.
    copias de ARN se c caluated basado en una curva estándar de transcritos de ARN norovirus GII.7.
    Nota: en la fecha fueron ligeramente modificada del artículo 6 original.

    Tabla 1: Resultados de 34 muestras de frotis que fueron recolectadas desde un crucero que había reportado casos de sospecha de la gastroenteritis por norovirus durante un viaje.

    La Figura 2 muestra la relación de los valores de Ct determinados por RT-qPCR y la capacidad de secuenciar estas muestras. En total, 127 de 217 muestras de frotis positivo en la prueba de norovirus GII por RT-qPCR. Las muestras muestran un amplio rango (12-40) de los valores de Ct. En total, 29 (22,8%) de las muestras de RT-qPCR positivos se puede genotipo. muestras de frotis con valores de Ct por debajo de 27 y que oscilan entre 28-31 fueron genotipo a un ritmo de 100% y 72,2%, respectivamente. En contraste, sólo el 22,0% y el 1,6% de las muestras de torunda con los valores de Ct de 32-36 y 37-40, respectivamente, producen amplicones hemi-nested que podrían ser secuenciadas con éxito.


    Figura 2: Resultados de la detección de RT-qPCR y secuenciación de muestras de frotis que habían sido recogidas durante los brotes de norovirus confirmados. Las barras blancas representan el número de RT-qPCR virus de muestras de frotis positivo. los ácidos nucleicos de norovirus humanos en esas muestras de RT-qPCR positivos se amplificaron mediante PCR hemi-anidado y luego secuenciados para confirmar la determinación del genotipo. Negro bares y línea representan el número y el porcentaje de genotipo confirmaron muestras de frotis, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    rango de valores Ct Número de muestras RT-qPCR positivos Número (%) de las muestras de la secuencia confirmó una
    20-23 4 3 (75)
    24-27 3 3 (100)
    28-31 18 13 (72.2)
    32-36 41 9 (22.0)
    37-40 61 1 (1,6)
    a) hemi de RCP anidada

    Tabla 2: Resultados de genotipado de muestras de frotis de RT-qPCR y.

    Numero de muestra UBICACIÓN Descripción de superficie Superficie (cm2) Fecha / hora de la recogida de muestras Limpio (S / N) Si se limpia, lo desinfectante se utilizó <?/ Strong> Descripción detallada de material de la superficie y la ubicación
    1 Habitación # 7-1302 Asiento del baño 700 cm 2 06/26/2016; 09 a.m No no aplica asiento del inodoro [superficies superiores), y plastoc duro
    2 Habitación # 7-1330 teléfono mango 500 cm 2 06/26/2016; 9:25 am 1000 ppm de lejía plástico duro, botón de goma

    Suplementaria Cuadro 1: Ejemplo de formulario de descripción de la muestra.

    <td> 17
    genogrupo / virus Nombre oligonucleótido cebador / sonda Secuencia 5 → 3 y #900; Referencia
    soldado americano Cog1F CGY TGG ATG CGI TTY CAT GA 17
    Cog1R CTT AGA CGC CAT CAT CAT C TYA 17
    G1SKF CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA 17
    G1SKR CCA CCA CAC CAR TTR TAC A 17
    Ring1E-sonda FAM - TGG ACA GGR GAY CGC - MGBNFQ una Este estudio
    GII Cog2F CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG 17
    Cog2R TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA 17
    Ring2-imprimación TGG GAG GGC GAT CGC AAT TC 17
    G2SKR CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT
    Ring2-sonda Cy5 o QUASAR 670 - TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT - BHQ2 b 17
    MS2 MS2F TGG CAC TAC CCC TCT CCG TAT TCA CG 18
    MS2R GTA CGG GCG ACC CCA CGA TGA C 18
    Ms2p-sonda HEX - CAC ATC GAT AGA TCA AGG TGC CTA CAAGC - c BHQ1 18
    una sonda TaqMan GI se 5'-etiquetados con 6-carboxifluoresceína (FAM) y 3'-etiquetados con MGBNFQ (surco estrecho sitio de unión)
    b sonda TaqMan GII se 5'-etiquetados con Cy5 o Quasar 670 y 3'-etiquetados con Agujero Negro extintor; Agujero negro Refrescante (BHQ) 2 usado debido a la disponibilidad, se prefiere BHQ 3.
    sonda TaqMan c MS2 es 5R17; marcada con HEX y 5'-etiquetados con BHQ1

    Tabla complementaria 2: cebadores de oligonucleótidos y sondas información.

    Cog 2F (10 M)
    Componente Volumen por reacción (l) La concentración final
    2x RT-PCR Buffer * 12.5 1x
    -Nucleasa libre de agua * 1.08 n / A
    Detección reforzador * 1.67 n / A
    Cog 1F (10 M) 1 400 nM
    Cog 1R (10 M) 1 400 nM
    Anillo 1E-sonda (10 M) 0,5 200 nM
    1 400 nM
    Cog 2R (10 M) 1 400 nM
    Anillo 2-sonda (10 M) 0,5 200 nM
    MS2F (10 M) 0.25 100 nM
    MS2R (10 M) 0.25 100 nM
    Ms2p-sonda (10 M) 0.25 100 nM
    enzima 2x RT-PCR * 1 1x
    volumen Master Mix 22
    * Incluido en el kit en tiempo real RT-PCR

    Suplementaria Cuadro 3: mezcla maestra para múltiplex en tiempo real GI / GII / MS2 norovirus RT-PCR

    Tipo de mando interpretación de los resultados
    Muestra Control negativo En caso de ser negativo
    Control positivo En caso de ser positivo
    muestra negativa Muestra es negativa si cada valor de Ct es indetectable para GI / GII
    muestra positiva Los valores de Ct (GI / GII) de ambas réplicas es <38; este (arbitrariamente) de corte del necesita ser determinado experimentalmente para cada tiempo real plataforma de PCR y kit
    muestra positiva provisional La muestra está tentativamente positivo si el valor Ct (GI / GII) de un replicar es <38
    control de procesos internos (MS2) Las muestras con un ciclo umbral (Ct) de ≥32 fo MS2 debe ser analizado de nuevo sin diluir y diluido 1/10.
    Parámetro valor aceptable
    Curva estándar utilizando transcritos de ARN norovirus R 2 > 0,97
    Eficiencia 90% a 115%

    Suplementaria Cuadro 4: Controles de incluir en cada prueba RT-qPCR para la detección de norovirus en muestras de frotis ambientales.

    Componente La concentración final vol / rxn (l)
    5x tampón RT-PCR 1x 5.00
    mezcla de dNTP (10 mM) 0,4 mM 1.00
    mezcla de enzimas (RT y Taq) 1.00
    Cebador directo una 0,5 M 0.50
    Cebador inverso una 0,5 M 0.50
    inhibidor de RNasa (20 U / l) 20 U 1.00
    agua libre de RNasa 11.00
    Volumen total 20.00
    un avance y retroceso conjuntos de cebadores para GI y GII son Cog1F + G1SKR, y Cog2F + G2SKR, respectivamente.
    Segunda ronda de RT-PCR
    Componente La concentración final vol / rxn (l)
    5x tampón RT-PCR < / Td> 1x 5.00
    mezcla de dNTP (10 mM) 0,4 mM 1.00
    mezcla de enzimas (RT y Taq) 1.00
    B cebador directo 0,5 M 0.50
    Cebador inverso b 0,5 M 0.50
    inhibidor de RNasa (20 U / l) 20 U 1.00
    agua libre de RNasa 14.00
    Volumen total 23.0
    b avance y retroceso conjuntos de cebadores para GI y GII son G1SKF + G1SKR, y el cebador Ring2 + G2SKR, respectivamente.
    Nota: por encima de informaion fue ligeramente modificada del artículo 19 original
    _content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> complementario el cuadro 5: anidada-Hemi Master mezcla de RT-PCR.

    Fase I El muestreo de campo 1. Verificar los kits macroespuma hisopo (por ejemplo, fecha de vencimiento, las fugas del tubo, y la humedad hisopo)
    2. Swab superficie (superficie límite a ≤100 pulgadas 2 (645 cm2))
    3. Coloque torundas en los tubos de transporte, y ajuste las tuercas de seguridad para evitar fugas durante el transporte
    Un kit de raspado 4. Colocar en un ziplock bolsa
    Fase II Transporte y almacenamiento de las muestras 1. Los hisopos de muestra deberá almacenarse -70 ° C (-20 ° C o)
    hisopo 2. Transportemuestras a laboratorio a 0-4 ° C (frío-packs) en un recipiente aislado, y el envío dentro de 48 horas de la recogida de hisopos
    Fase III ARN etraction 1. Comprobar tampón de lisis (por ejemplo, los datos de caducidad)
    2. Añadir MS2 como un control interno en tampón de lisis antes de la adición de etanol al 100%
    Purificación de ARN y la concentración 3. Limpiar mesa de laboratorio y equipos pequeños utilizando la solución de extracción de ARN RNasa
    4. Cambiar los guantes con frecuencia durante los pasos para evitar una contaminación cruzada de ARN
    fase IV RT-PCR de ensayo (QA / QC) 1. Incluir los ARN transcritos cuantificados norovirus (GI y GII) para cada ensayo de RT-qPCR para controlar las variaciones en los valores de Ct para cada PCR plazo
    2.Utilice ausencia de señal de MS2 para monitorear la presencia de inhibidores de la PCR

    Suplementaria Cuadro 6: Lista de verificación para el procedimiento de toma de muestras ambientales de los CDC.

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    Discussion

    Los norovirus tienen una dosis infecciosa humana 50% entre 18 y 10 3 20 partículas de virus. Por lo tanto, incluso la contaminación de bajo nivel de las superficies puede suponer un riesgo para la salud pública. Se evaluaron varios aspectos del protocolo de muestreo hisopo incluyendo: 1) diferentes materiales de hisopo, 2) hisopos de condiciones de almacenamiento durante el transporte, 3) la concentración de ARN viral, y 4) colífagos MS2 como el control de la extracción interna.

    Hasta hace poco, sólo el rendimiento de hisopos de algodón, poliéster, nylon y paño antiestático) había sido evaluado y propuesto para uso en el campo 13, 14, 15, 21, 22. De éstos, hisopos de algodón han sido recomendados por la norma ISO 15216 de protocolo para la detección de norovirus y virus de hepatitis A de las superficies de preparación de alimentos y fómites 23. Cómonunca, hay pocos datos sobre el rendimiento de las pruebas de hisopos de algodón en condiciones de campo con grandes superficies de alto contacto tales como pomos de las puertas, computadoras y asientos de inodoro que han sido implicados con frecuencia en la transmisión de los norovirus 24, 25. Además, el tamaño de estas superficies ambientales supera la capacidad de los hisopos con punta de fibra. En nuestro estudio, hemos demostrado que los hisopos macroespuma, que tienen una cabeza más grande que bastoncillo de los hisopos con punta de fibra, tienen mayores tasas de recuperación para el norovirus humano cuando se toman muestras ambientales superficies con un área de hasta 700 cm2.

    Los norovirus en solución son relativamente inestables a temperatura ambiente y requieren por lo menos refrigeración. Por lo tanto, el envío al laboratorio debe producirse a 0-4 ° C dentro de las 48 h después de la recogida de los hisopos. El volumen de muestra que típicamente puede ser probado en una reacción de PCR es mucho menor que la de la cantidad demuestra después de la elución de la torunda (3-5 l vs. 5-10 ml) que, sin concentración, reduce significativamente la tasa de positividad. En virología ambiental, polietilenglicol (PEG) se ha utilizado con éxito para concentrar los virus a partir de grandes volúmenes de aguas ambientales. Sin embargo, los volúmenes de hasta 10 ml pueden ser fácilmente extraídos y concentrados utilizando columnas de centrifugación Midi de volúmenes tan bajos como 250 l, y se concentraron más de 10 veces con una alta recuperación utilizando columnas de centrifugación.

    Aunque RT-qPCR es el estándar de oro para la detección sensible y cuantificación de norovirus, la sensibilidad de estos ensayos puede ser fácilmente afectada por la presencia de inhibidores de la PCR que son co-extrae de las muestras de frotis. Por lo tanto, la inclusión de un control de extracción, tales como partículas de virus colifago MS2, en un formato de PCR multiplex que detecta ambos norovirus así como MS2, ayuda a controlar la presencia de inhibición de la PCR y para evaluar la variación entre los diferentes experimentos. </ P>

    Las variables de la prueba de un método de validación de laboratorio son fundamentales para determinar el poder discriminatorio de un método de ensayo y se traducen además en el posible rendimiento de muestreo de campo del método. Tomando condición de campo en el mundo real (por ejemplo, toma de muestras retraso, las superficies más grandes de hasta 700 cm 2) en cuenta, el límite de detección para el norovirus fue de 3,4 log10 (acero inoxidable) y 4 log 10 (inodoro) copias norovirus por superficie de muestreo 6. En consecuencia, los resultados de frotis negativos no son definitivos que ninguna contaminación viral se ha producido. La información clínica y epidemiológica de la enfermedad causada por el norovirus siempre triunfa hallazgos ambientales 2, 6.

    Nuestros datos de un barco de cruceros mostraron que las superficies de alto contacto tales como teléfonos, teclados de ordenador, y tiradores de las puertas dieron positivo para el norovirus en cabañas donde la gentese había quedado con reportado la gastroenteritis viral. Estas superficies o bien se contaminaron a través del contacto directo o indirectamente a través de las gotitas producidas durante la descarga del inodoro o episodios 6, 7, 8, 9, 10 vómitos.

    En conclusión, la detección de norovirus en superficies ambientales que utilizan este protocolo hisopo de nuevo desarrollo puede ayudar a determinar el nivel de contaminación del medio ambiente durante los brotes, detectar virus cuando las muestras clínicas no están disponibles y en el monitoreo de la efectividad de las prácticas de limpieza. La fibra con punta de esponja (algodón y rayón) basan los métodos de muestreo de superficie han sido ampliamente utilizados para investigar otros virus entéricos (por ejemplo, el rotavirus, adenovirus y) 27, 28, 29. Teniendo en cuenta el mayoreficiencia de recuperación para norovirus de hisopos macroespuma más de esas fibras con punta de hisopos 6, esperábamos que los hisopos macroespuma serán capaces de detectar otros virus entéricos también.

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    Disclosures

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Generic name for kits
    Macrofoam swab Premoistened EnviroMax Swab kit  Puritan 2588060PFUW
    RNA Lysis buffer  CDC UNEX buffer Microbiologics Cat No MR0501
    RNA extraction spin column Midi column Omega Biotek Cat No R6664-02
    RNA purification spin column Zymol RNA Clean and Concentrator kit  Zymo Research Cat No R1016
    Real time RT-PCR kit AgPath kit One-Step RT-PCR Kit Life Technologies Cat No 4387391
    Conventional RT-PCR kit Qiagen one step RT-PCR kit Qiagen kit Cat No 210212
    Gel extraction kit Qiagen QIAquick gel extraction kit Qiagen kit Cat No 28704 or 28706
    Coliphage MS2 ATCC Cat No 15597-B1
    RNA run-off transcripts
    Realtime PCR platform Applied Biosystems Model ABI 7500
    Optical 96-well reaction plate Thermo Scientific Cat No 4316813
    MicroAmp Clear Adhesive Film  Thermo Scientific Cat No 4306311

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