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 JoVE Chemistry

对于未螯合钆基于核酸适配体传感器(III)

1, 1, 1, 1, 1

1Department of Chemistry and Biochemistry, California State University, East Bay

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    Summary

    Cite this Article

    Edogun, O., Chan, T. Y., Nguyen, N. H., Luu, A., Halim, M. An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III). J. Vis. Exp. (119), e55216, doi:10.3791/55216 (2017).

    Introduction

    在临床诊断中,这是由该技术的固有敏感性限制磁共振成像(MRI)的重要性日益增加,已导致在研究的快速增长到新的基于钆的造影剂(GBCAs)1的开发。 GBCAs是被给药,以提高图像质量的分子,并且它们通常具有配位的多齿配体的三价钆离子(钆3+)的化学结构。这络合作为未螯合的Gd 3+是有毒至关重要;它已经牵涉于肾源性系统纤维化的一些患者的肾疾病或衰竭2的开发。因此,检测该水性自由离子是确保GBCAs的安全工具。未螯合的Gd 3+的GBCA溶液存在往往是在配体和离子的复合物的解离,或者displacemen之间不完全反应的结果其他生物金属阳离子3吨

    在目前用于确定的Gd 3+,那些在通用性和适用性4方面依靠色谱法和/或光谱法秩最高的存在下的几种技术。在他们的优势是较高的灵敏度和准确度,分析各种样品基质(包括人血清5,尿液和头发6,废水7和造影剂配方8),和多个钆3+络合物的同时定量(一个列表的能力的研究之前,2013是在全面审查Telgmann 等人 )4所述。唯一的缺点是,一些这些方法需要仪器仪表(如电感耦合等离子体质谱)4,一些实验室可能无法访问。在小说GBCA发现在研究和论证的概念层面,AR上下文elatively更方便,快速和成本有效的基于分光法(如紫外吸收或荧光)可以作为一种有价值的替代。考虑到这些应用中,水的Gd 3+的荧光基于适体的传感器被开发9。

    适体(钆适体)是与通过指数富集(SELEX)9的配体的系统进化的过程中分离出的碱基序列特异性的44碱基长的单链DNA分子。适应适体为荧光传感器,荧光团被连接到线料,然后将其与经由13互补碱基( 图1)淬火链(QS)杂交的5'末端。了QS标记有在3'末端的暗淬灭剂分子。在不存在的Gd 3+,所述传感器(钆传感器)的,由1:分别钆适体和QS的2摩尔比,将具有最小的荧光发射是由于吨从荧光基团淬灭Ø能量转移。在加入含水的Gd 3+的将从钆适体置换的QS,从而增加荧光发射。

    图1
    1. 传感器(GD-传感器),由标有荧光素(荧光基团),并标有DABCYL 13个碱基长的淬链(QS)的44个碱基长的适体(GD-适体)(暗淬灭剂)的。在不存在未螯合的Gd 3+的,传感器的荧光是最小的。与另外的Gd 3+的,发生的QS位移和增加的荧光发射是观察。 请点击此处查看该图的放大版本。

    有目前,人们常用的基于分光法检测ING水的Gd 3+。该测定使用了分子二甲酚橙,其经历在其最大吸收波长从433至573纳米时螯合离子10的换档。这两个最大吸收的比率可以用来量化未螯合的Gd 3+的量。适体传感器是一种替代(也可以是互补的),以在二甲酚橙法,因为这两种方法具有不同的反应条件(如pH值和所使用的缓冲溶液的组合物),目标的选择性,定量的线性范围,和检测方式9。

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    Protocol

    注:分子生物学级水在所有的缓冲和解决方案的准备工作时使用。所有一次性管(离心及PCR)和枪头是DNase-和无RNA酶的。请咨询使用前的所有化学品的材料安全数据表(MSDS)。强烈推荐合适的个人防护装备(PPE)的使用。

    1.适体母液的制备

    1. 购买2股多脱氧核苷酸的市场。通过高效液相色谱法(HPLC)命令与纯化两条链。
      串1(GD-适体):
      5' - / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
      链2(QS):
      5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3'
    2. 溶解每条链在水中使钆适体和的QS100μM的个别储备溶液。
    3. 存放于-20°C这些解决方案。该溶液是稳定的迄今,为3年。
    4. 为了尽量减少FREEZ电子解冻周期,存储解决方案,股价在10微升等分。

    2. 2倍的Gd-传感器溶液的制备

    1. 制备测定缓冲液(20mM HEPES,2mM的MgCl 2的,150毫摩尔NaCl,5mM的KCl)中。调整用NaOH和HCl pH值至7.4〜,并通过一次性无菌瓶顶过滤器具有0.2微米PES膜过滤器。存放在无菌瓶中。如果过滤,并妥善保存(在常温下),缓冲稳定到目前为止,2年。
    2. 稀释钆适体原液(从步骤1.2)在测定缓冲液497微升和QS原液(从步骤1.2)的2微升1微升。拌匀,用旋涡。其在2×钆传感器溶液浓度是200和400nm,分别。
      注意:在此步骤中制备的2倍的Gd-传感器溶液的体积为500微升,这是足以测试6 - 7不同浓度的Gd 3+的校准曲线和造影剂溶液(步骤3)。每个样品将在384孔板给复孔。
      1. 根据需要被测试的Gd 3+解的数目调整2倍的Gd-传感器溶液的体积。
    3. 转移2×钆传感器溶液到9的PCR管,用50微升到每个管中。放置管在热循环仪。
    4. 在热循环仪设置程序以加热在管至95℃的溶液中,保持5分钟,然后经〜15分钟缓慢地冷却该溶液至25℃(以速率〜0.05 - 0.1℃/ S)。加热和冷却循环是确保钆适体和QS之间最佳杂交。部分杂交结果不完全淬火和传感器的一个更高的背景荧光。如果热循环仪是不可用,进行利用热水浴代替这个过程。
    5. 一旦冷却到25℃,立即使用该溶液,或保持在热循环仪(最高达约2小时),直到准备好是用过的。当水浴用于加热,离开该管在浴中当水慢慢冷却到室温。

    3.构建荧光校准曲线和钆造影剂的溶液检测未螯合GD的存在3+

    1. 溶解GdCl 3在测定缓冲液固体(相同的缓冲液如在步骤2.1)。
    2. 通过连续稀释,在最终所需浓度的校准曲线(2×溶液)的双制备各6个不同的Gd 3+在微量离心管溶液100微升。
      1. 例如,为了构建一个校准为0,50,100,200,400(仅无GdCl 3缓冲液),和钆3+为800nm,制备含有0,100,200,400,800,和1600纳米的解决方案的离子。确保始终包括“空白”0纳米的Gd 3+作为阴性对照。
    3. 溶解造影剂是测试编在测定缓冲液中。准备2个或3个不同的浓度通过连续稀释的造影剂的解决方案。
      注:测试3种不同浓度造影剂溶液的建议。这是为了确保这些浓度的线性范围内。如果测试没有显示线性关系的样品中,减少造影剂的浓度使用。
    4. 服用含有从步骤2.5 2倍的Gd-传感器解决方案出来的热循环仪的PCR管。
    5. 添加来自步骤3.2的每个的Gd 3+溶液的50微升到含有2倍的Gd-传感器溶液9 PCR管6。吹打向上和向下混合。每个PCR管现在包含钆3+的所需浓度进行测试,100nM的钆适体,和200nM的QS。
    6. 到含有2倍的Gd-传感器溶液剩余的PCR管,从步骤3.3添加造影剂溶液的50微升。通过上下吹打几次拌匀。
    7. 孵育在Solutions在PCR管在室温下约5分钟。它们可以被放置长达30分钟。
    8. 传送每个管的45微升到384孔板中。每个PCR管会给重复孔中。
    9. 记录的每个孔中的荧光在平板阅读器。在GD-传感器设计中使用的荧光团(FAM),分别有495和520 nm的激发和发射最大值,对供应商的网站上所列出。选择取决于在板阅读器是否monochromator-或基于过滤器的合适的激发和发射波长或过滤器。
    10. 绘制荧光任意荧光单位(AFU)对钆3+的浓度曲线图。
    11. 画出图作为对抗的Gd 3+的荧光浓度倍数变化。由“空白”解决方案的AFU(0纳米的Gd 3+)将每个浓度的AFU计算荧光倍数变化。荧光倍数变化将使n个结果ormalization,应AFU显示一些周期性的(不同天 )的变化。
    12. 比较含有造影剂的溶液和“空白”,它是含0纳米GdCl 3(仅缓冲)该溶液的荧光发射。
      注:GBCA溶液的更高的荧光意味着未螯合的Gd 3+的存在,这可能需要造影剂的进一步纯化。未螯合的Gd 3+的存在量可以利用在步骤3.10或3.11构建的校准曲线来估算。

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    Representative Results

    在未螯合的Gd 3+的存在下的Gd-传感器溶液的典型荧光变化示于图2。发射可被绘制为荧光倍数变化( 图2A)或在原始荧光读数( 图2B)以任意单位(AFU)。两条曲线在> 3μM收率低于1μM和饱和信号的线性范围为钆浓度3+非常相似的校准曲线。检测限为〜100纳米带3的信噪比。

    在含有感兴趣的GBCA溶液,未螯合的Gd 3+的存在将被翻译成的传感器的荧光增加时相比,“空白”的解决方案。在钆DOTA复杂,比其他更高纯度之一的2个不同批次的解决方案的荧光的变化,是显示n作为的代表性结果的例子( 图3)。钆DOTA(gadoteric酸)是钆的钆络合物3+由在市售的造影剂中的有机配位体的DOTA包围。较高纯度的批料不显示在排放到钆DOTA的20mm的显著增加。当未螯合的Gd 3+存在,这一变化是明显的,即使在低于5毫米的Gd-DOTA浓度观察。在本实施例,其中数据点被绘制作为传感器的荧光的倍数变化,未螯合的Gd 3+的量的定量可以使用图2A中的校准曲线来估算。

    图2
    图2. 代表钆荧光传感器的校准曲线图。至少在重复进行所有的数据点,平均值情节泰德与标准偏差为误差线。使用100纳米的Gd-适体和200纳米QS(A)得到的校正曲线。图形绘制荧光倍数变化为y轴。 (B)相同校正曲线中(A)和以任意单位(AFU)为y轴原始荧光。 请点击此处查看该图的放大版本。

    图3
    在钆DOTA分子的样品 测试未螯合的Gd 3+ 的存在下时 图3 代表钆传感器荧光变化 钆DOTA复杂的解决方案的两个不同批次示于该图,更高的纯度(圆标记),另一种含有未螯合的Gd 3+中的一个(蓝色trianglË标记)。每个数据点是两次读数与标准偏差作为误差线的平均值。 请点击此处查看该图的放大版本。

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    Discussion

    使用基于适体的Gd-传感器,荧光发射的增加正比于观察未螯合的Gd 3+的浓度。为了最大限度地减少样品的使用量,该测定可以在384孔微量板以每孔45微升总样品体积运行。在此设计中,荧光素(FAM)和DABCYL(DAB)的选择主要基于试剂的成本;修改发射波长的荧光团不同的配对和猝灭剂,可以使用11。

    要注意的是,以获得与该传感器最好的结果是很重要的,过程的关键步骤是在该测定缓冲液加热至95℃,并缓慢冷却(步骤2.4)来实现的Gd-适体和QS之间最佳杂交链。如先前在协议中提到,如果一个热循环仪是不可用,在95℃下温育可以在水浴中进行。控制另一个关键参数为t他组成的缓冲溶液;建议使用在步骤2.1以溶解造影剂所列出的测定缓冲液中,或者也可以使用去离子水。然而,应避免含有潜在干扰物的解决方案。这样的缓冲液的一个例子是一个包含磷酸根阴离子,其可以协调对未螯合的Gd 3+形成不溶性的钆磷酸盐12。该沉淀物将不与传感器反应,导致假阴性结果。

    在实验中的一些步骤可以在不影响的结果进行修改。首先,为了简化分析和计算,需准备的Gd-传感器溶液和GdCl 3为以2倍浓度的校准曲线含水两者。如果需要的话,其它的稀释因子可以被使用(例如,10倍溶液),条件是钆适体的最终测定浓度和QS分别保持在100纳米和200纳米。第二,该测定缓冲液DOES不必是准确的pH 7.4。 7之间的任何值 - 7.4将产生所需的荧光增加,只要相同的缓冲液在整个实验中使用。第三,一旦获得荧光发射读数,数据点可被绘制或者作为在任意单位(AFU)原始荧光或荧光的倍数变化。计算荧光倍数变化,各浓度的原始荧光读数标准化为(除以)阴性对照(0纳米的Gd 3+)的读取。如在图2AB中所示,在两个重复的荧光发射的趋势是几乎相同的。倍数变化可以是对数据进行分析的更方便的方法,如果板器显示在记录在不同的时间原始读数的一些变化。最后,如果实验室装备有荧光计,但不是一个读板器中,每个数据点可以使用比色皿测定,代替微板。根据大小OF中的可用的试管,在测定制得的溶液的体积,可能需要进行调整。

    本文所报道的方法提供了一种替代chromatographic-和/或用于检测水的Gd 3+基于光谱的技术。相比于后者,钆传感器测定是在对多个物种的同时检测灵敏度,准确度和能力方面的更多的限制。另一方面,基于分光传感器需要的仪表可能可能是更容易获得,可以在更短的时间内进行,样品的准备是最小的。造影剂可以简单地溶解在缓冲溶液中,用钆传感器溶液混合,并直接测量荧光发射。此外,传感器能够检测未螯合的Gd的低得多的浓度3+比二甲酚橙指示剂(约2个数量的两种方法之间数量级的差别),并具有一对于钆3+几个其他重要的生物和过渡金属离子9较高的选择性。

    有该测定可能限制某些实验条件下它的使用的两个缺点。一个限制是,该传感器不是特定为钆3+;其显示给其他镧系元素离子(如 )9的响应。然而,这些都不是在造影剂通常发现或离子的生物系统,因此,它们的干扰是最小的。第二点要注意的是,在较高浓度(大于〜10μM)的Gd 3+,在钆传感器荧光发射逐渐降低的观察。淬火通过镧系元素离子的效果是,也被用作用于检测和定量这些14的技术的详细记录现象13。而这限制了传感器的效用,用于测量高浓度的Gd 3+

    在这项工作中,使用了在水溶液中检测的毒性未螯合的Gd 3+的便利基于荧光的技术已被描述。该测定是为基于钆的造影剂纯度的早期阶段的评价,特别是在合成和配制用于体外实验。在诊断的磁共振成像的当前的增长,越来越多的新的造影剂的不断被设计和测试。基于核酸适体的Gd-传感器将通过提供一种用于在环境pH值快速检测的未反应或解离的Gd 3+水溶液亚微摩尔浓度的存在的手段促进这一发展。此外,由于传感器显示交叉反应性与其他的三价镧系元素离子,其应用可以是扩展到这些研究领域。

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    Disclosures

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Gd-aptamer IDTDNA Input sequence and fluorophore modification in the order form A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
    Quenching strand IDTDNA Input sequence and quencher modification in the order form A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
    Molecular biology grade water No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well
    Gadolinium(III) chloride anhydrous Strem 936416 Toxic
    HEPES Fisher Scientific BP310-500
    Magnesium chloride anhydrous MP Biomedicals 0520984480 - 100 g
    Sodium Chloride Acros Organics 327300025
    Potassium chloride Fisher Scientific P333-500
    Sodium hydroxide, pellets Fisher Scientific BP359 Corrosive
    Hydrochloric acid Fisher Scientific SA49 Toxic and corrosive
    384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates Corning 3575 Plates which are suitable for fluorescence reading are required.
    Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter Thermo Scientific 5680020 The bottle top is fitted with 0.2 micron PES membrane
    Disposable sterile bottles 250 mL Corning 430281 A larger or smaller bottle may be used
    1.5 mL microcentrifuge tubes No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
    0.2 mL PCR tubes No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
    Micropipets No specific manufacturer
    Pipet tips (non filter) of appropriate sizes No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
    Equipment
    Plate reader Biotek Synergy H1 Plate readers from other manufacturers would work equally well

    References

    1. Shen, C., New, E. J. Promising strategies for Gd-based responsive magnetic resonance imaging contrast agents. Curr. Opin. Chem. Biol. 17, (2), 158-166 (2013).
    2. Cheong, B. Y. C., Muthupillai, R. Nephrogenic systemic fibrosis: a concise review for cardiologists. Tex. Heart Inst. J. 37, (5), 508-515 (2010).
    3. Hao, D., Ai, T., Goerner, F., Hu, X., Runge, V. M., Tweedle, M. MRI contrast agents: basic chemistry and safety. J Magn. Reson. Imaging. 36, (5), 1060-1071 (2012).
    4. Telgmann, L., Sperling, M., Karst, U. Determination of gadolinium-based MRI contrast agents in biological and environmental samples: a review. Anal. Chim. Acta. 764, 1-16 (2013).
    5. Frenzel, T., Lengsfeld, P., Schirmer, H., Hütter, J., Weinmann, H. -J. Stability of gadolinium-based magnetic resonance imaging contrast agents in human serum at 37 degrees C. Invest. Radiol. 43, (12), 817-828 (2008).
    6. Loreti, V., Bettmer, J. Determination of the MRI contrast agent Gd-DTPA by SEC-ICP-MS. Anal. Bioanal. Chem. 379, (7), 1050-1054 (2004).
    7. Telgmann, L., et al. Speciation and isotope dilution analysis of gadolinium-based contrast agents in wastewater. Environ. Sci. Technol. 46, (21), 11929-11936 (2012).
    8. Cleveland, D., et al. Chromatographic methods for the quantification of free and chelated gadolinium species in MRI contrast agent formulations. Anal. Bioanal. Chem. 398, (7), 2987-2995 (2010).
    9. Edogun, O., Nguyen, N. H., Halim, M. Fluorescent single-stranded DNA-based assay for detecting unchelated gadolinium(III) ions in aqueous solution. Anal. Bioanal. Chem. 408, (15), 4121-4131 (2016).
    10. Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, (5), 184-188 (2006).
    11. Johansson, M. K. Choosing reporter-quencher pairs for efficient quenching through formation of intramolecular dimers. Methods Mol. Biol. 335, 17-29 (2006).
    12. Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. A primer on gadolinium chemistry. J. Magn. Reson. Imaging. 30, (6), 1240-1248 (2009).
    13. Shakhverdov, T. A. A cross-relaxation mechanism of fluorescence quenching in complexes of lanthanide ions with organic ligands. Opt. Spectrosc. 95, (4), 571-580 (2003).
    14. Brittain, H. G. Submicrogram determination of lanthanides through quenching of calcein blue fluorescence. Anal. Chem. 59, (8), 1122-1125 (1987).

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