באמצעות מודלי דג זברה של נגיף שפעת A האדם למסך תרופות אנטי ולאפיין מארח תגובות תא חיסון

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sullivan, C., Jurcyzszak, D., Goody, M. F., Gabor, K. A., Longfellow, J. R., Millard, P. J., Kim, C. H. Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses. J. Vis. Exp. (119), e55235, doi:10.3791/55235 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO), נגיפי שפעת להדביק 5-10% של מבוגרים 20-30% מהילדים בשנה ולגרום 3-5 מיליון מקרים של מחלה חמורה עד 500,000 מקרי מוות ברחבי העולם 1. חיסונים נגד שפעת שנתיים להישאר האפשרות הטובה ביותר כדי למנוע מחלות. מאמצים מהסוג תוכנית הפעולה העולמי WHO גדלו השימוש בחיסון העונתי, קיבולת ייצור החיסון, ומחקר ופיתוח לתוך אסטרטגיות חיסון חזקה יותר על מנת להפחית את התחלואה והתמותה הקשורים התפרצויות שפעת עונתית 2. תרופות אנטי-ויראליות כמו מעכבי נורמינידאז (למשל Zanamivir ו Oseltamivir) זמינות במדינות מסוימות ו הוכיחו יעיל בתסמינים מקילות, כאשר מנוהלות בתוך 48 שעות מהופעה 3 הראשונות, 4, 5. למרות מאמצים הגלובליים, הכלה של שפעת עונתית outbreaks עדיין מהווה אתגר עצום בשלב זה, כפי להיסחף אנטיגני וירוס שפעת לעיתים קרובות עולה היכולות הנוכחיות להסתגל הגנום המשתנה של הנגיף 6. אסטרטגיות חיסון מיקוד זנים של וירוס חדש יש לפתח מראש ולפעמים ניתנים פחות יעיל בצורה אופטימלית בשל שינויים בלתי צפויים סוגי זנים שבסופו של דבר שולטים מגיפת שפעת. מסיבות אלו, יש צורך ברור לפתח אסטרטגיות טיפוליות חלופיות המכיל זיהומים וצמצום תמותה. על ידי השגת הבנה טובה יותר של האינטראקציה המאכסנת-הווירוס, זה עשוי להיות אפשרי לפתח תרופות נגד שפעת חדשות וטיפולים אדג'ובנט 7, 8.

מארח השפעת האנושית וירוס (IAV) אינטראקציה מורכבת. במודלים של בעלי חיים כמה הידבקות בני אדם IAV פותחו על מנת לקבל תובנות לגבי האינטראקציה מאכסן-וירוס, including עכברים, שרקנים, חולדות כותנה, אוגרים, חמוסים, ואת קופי 9. תוך מתן מידע חשוב שיפרו את הבנת הדינמיקה מאכסן IAV, כל אורגניזם מודל בעל חסרונות משמעותיים כי יש לקחת בחשבון כאשר מנסים לתרגם את הממצאים רפואת האדם. לדוגמה, עכברים, שהן המודל הנפוץ ביותר, לא בקלות לפתח סימפטומים IAV הנגרמת זיהום כאשר נגוע בשפעת אדם מבודד 9. הסיבה לכך היא כי עכברים חסרי הכמיהות הטבעיות לשפעת אדם מבודדות מאז תאי אפיתל העכבר להביע α-2,3 קשרי חומצת sialic במקום α-2,6 קשרי חומצת sialic הביעו על תאים אנושיים אפיתל 10. חלבוני hemagglutinin נוכח אדם IAV מבודדים לאגד לטובה וזן תאי מארחי נושאות α-2,6 קשרי חומצת sialic באמצעות אנדוציטוזה מתווך קולטן 9, 11, 12, 13. כתוצאה מכך, הוא היום מקובל בפיתוח מודלי עכבר לשפעת אדם, יש להקפיד על מנת לשייך את המתח המתאים של עכבר עם הזן המתאים של שפעת על מנת להשיג פנוטיפים מחלה כי לשחזר היבטים של המחלה האנושית. לעומת זאת, תאי אפיתל דרכי הנשימה העליונות של חמוסים להחזיק α-2,6 קשרי חומצת sialic דומות 14 תאים אנושיים. חמוסים אינפקטד לשתף רבות מהתכונות פתולוגיים וקליניים שנצפתה מחלות אנושיות, כולל פתוגניות ויכולת ההעברה של נגיפי שפעת אנושית העופות 14, 15. הם גם מאוד מקובלים ניסוייים יעילות חיסון. עם זאת, המודל החמוס לשפעת אדם יש מספר חסרונות הקשורים בעיקר גודלן ועלות הגידול בעלי שהופכים רכישת סטטיסטית מובהקתנתוני צביעות מאתגרים. בנוסף, חמוסים הפגינו בעבר בדלים הפרמקוקינטיקה סמים, זמינות ביולוגית, ורעילות שהופכים יעילות בדיקות קשות. לדוגמה, חמוסים להפגין רעילות amantadine מעכב ערוץ יון M2 16. לפיכך, ברור כי בבחירה במודל חיה בחקר שאלות על זיהומי אדם IAV, חשוב לשקול יתרונות הטבועים בו ומגבלות, וההיבט של האינטראקציה מאכסן-הווירוס כי הוא תחת חקירה.

דג הזברה, Danio rerio, הוא במודל חיה המספק הזדמנויות ייחודיות לחקר זיהום מיקרוביאלי, לארח תגובה חיסונית, וטיפולים תרופתיים פוטנציאל 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, <sup class = "Xref"> 24, 25, 26, 27, 28. הנוכחות של α-2,6 צמודות חומצות sialic על פני השטח של תאי דג הזברה הציעה הרגישות שלו IAV, אשר היה מובל החוצה במחקרי זיהום צלם in vivo באמצעות זן כתב ניאון של IAV 19. בשנת דג הזברה IAV נגועים, ביטוי מוגבר של תמלילי ifnphi1 ו MXA אנטי הצביעו על כך תגובה חיסונית מולדת היה מגורה, ואת הפתולוגיה שהפגינו דג הזברה IAV נגועים, כולל בצקת והרס רקמות, היה דומה לזה שנצפה זיהומים שפעת אנושית . יתר על כן, התמותה המוגבלת אנטי נורמינידאז IAV מעכב Zanamivir ו שכפול נגיפי מופחת של דג זברה 19.

בדו"ח זה, פרוטוקול לייזום מערכתic IAV זיהומים עוברי דג הזברה מתואר. שימוש Zanamivir במינונים רלוונטיים קליני בתור הוכחה של עיקרון, השירות של מודל דג זברת IAV זיהום בתרכובת הקרנה לפעילות אנטי מודגם. בנוסף, פרוטוקול להפקה מקומית, דלקת IAV אפיתל של דג הזברה לשחות שלפוחית שתן, איבר נחשב מבחינה אנטומית והן מבחינה תפקודית מקביל הריאה היונקת 21, 29, 30, 31, מתואר. שימוש זה מודל זיהום מקומי IAV, גיוס נויטרופילים לאתר של זיהום יכול להיות במעקב, המאפשר חקירות לתוך התפקיד של ביולוגיה נויטרופילים זיהום ודלקת IAV. מודלי דג זברה אלה משלימים במודלים של בעלי חיים קיימים של זיהומי אדם IAV והם שימושיים במיוחד לבדיקת מולקולות קטנות ותגובות תא חיסון בשל האפשרות של ים משופרכוח tatistical, יכולת בינונית מבחני תפוקה גבוהה, ואת היכולות לעקוב אחר התנהגות התא החיסונית ותפקוד עם מיקרוסקופ אור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל העבודה צריכה להתבצע באמצעות biosafety ברמה 2 (או BSL2) סטנדרטים המתוארים על-ידי המרכז האמריקאי לבקרת מחלות (CDC) ובהתאם להוראות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדות שימוש (IACUC). אנא להתייעץ עם הגורמים המתאימים על מנת להבטיח בטיחות ותאימות.

טיפול דג זברה 1. ותחזוקה

  1. ספון דג הזברה ולאסוף את המספר הדרוש של עוברים עבור הניסויים. בעת הצורך, טנקים רבייה המונית, כמו אלה שתיאר אדטו et al. 32, יכולים להיות מועסקים על מנת לאסוף מספר גדול של עוברים מבחינה התפתחותית-מבוימים.
  2. אפשר העוברים להתפתח עד לשלב ההתפתחותי רצוי (48 שעות לאחר הפריה עבור זיהום IAV מערכתי [סעיף 3] או 5 ימים לאחר הפריה עבור זיהום בשלפוחית ​​שתן מקומי, לשחות [סעיף 4]) במנות עמוקות פטרי בצפיפות נמוכה (< 100 עובר / צלחת) ב 28 מעלות צלזיוס במי ביצת סטרילית המכילים 60 מיקרוגרם / מיליליטר מלח ים (למשל, אושן מיידי) במים מזוקקים.
    1. הסר עוברים מתים עם pipets העברת פלסטיק ולשנות יומי במים ביצה כדי להבטיח בריאות והתפתחות אופטימלית.

2. הכנת חומרים ריאגנטים

  1. כן פתרון מניות 4 מ"ג / מיליליטר של Tricaine-S (כדי להתאים את pH 7.0-7.4) במים מזוקקים חיטוי. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. משוך נימי זכוכית בורוסיליקט עם חוטים באמצעות חולץ micropipette (למשל micropipette פולר עם ההגדרות הבאות: הגדרה לחץ = 100, חום = 550, משוך = [אין ערך], מהירות = 130, זמן = 110).
    הערה: לפני זמירת המחט, אורך מאיפת המחט מתחילה להתחדד אל קצה המחט תהיה כ 12-15 מ"מ. זה יכול להשתנות, עם זאת, על בסיס העדפה ויישום. ארוך יותר, להתחדד הדרגתי יותר עשוי להיות יותר עדיף בגלל היכולת המוגברת כדי לחדור את העובר ואת רי מופחתsk של כיפוף או שבירה מחט.
  3. ממיסים 2 גרם של agarose במים ביצה 100 מ"ל באמצעות מיקרוגל. הפוך צלחים שעליו לעמוד בתור ולהזריק את העוברים על ידי שפיכת נמס agarose לתוך מנות עמוקות פטרי המאפשרים לשמן להתמצק.
  4. הפוך מניה 10 מ"ג / מ"ל ​​של Zanamivir במים nuclease חינם. Aliquot ולהקפיא ב -20 ° C.
  5. ממיסים 0.5 גרם agarose במים ביצה 50 מ"ל באמצעות מיקרוגל לעשות העובר הרכבה agarose. לשמור באמבט מים ב 50 ° C עד מוכן לשימוש במהלך ההדמיה.

3. זיהום מערכתי IAV (48 שעות לאחר ההפריה)

זהירות: כל אנשי המחקר צריכים להתייעץ עם הממונים עליהם ורופאים לגבי חיסון לפני תחילת עבודה עם IAV.

  1. ידני dechorionate עוברים ביום של הניסוי באמצעות # 5 מלקחיים. תשמור על עצמך כדי להסיר להרדים עוברי כי נפצע בתהליך ב 200 מיקרוגרם / פתרון Tricaine מיליליטר.
  2. להכנת מי שתייהf IAV עבור Microinjection
    הערה: זנים אשר הוכחו להדביק עוברי דג הזברה הם שפעת A / PR / 8/34 (H1N1) (APR8), שפעת A X-31 A / איצ'י / 68 (H3N2) (X-31), ואת הכתב ניאון זן שפעת 33 ns1-GFP. פרטים על APR8 ו- X-31, זנים אחרים, ניתן למצוא בכתובת מאגר שפעת המחקר
    1. הפץ את זן ns1-GFP של IAV ב ביצי תרנגולת embryonated כפי שתואר לעיל 34, 35. אסוף, aliquot, ואת titer נוזל allantoic המכיל IAV, ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. טרום titered APR8 ו- X-31 וירוסים ניתן לרכוש מסחרית.
      1. רק לפני ההדבקה, במהירות להפשיר aliquot IAV בידיים עטויות כפפות ואז במהירות מניחים על קרח כדי להפחית את אובדן של כייל.
    2. דילול ויראלי
      1. אם באמצעות וירוסים APR8 או X-31, לדלל את 3.3 x 10 6 ביצים מנה זיהומיות 50% (EID50) / מ"ל ב supplem סטרילי, קר כקרח PBSented עם פנול אדום 0.25% (כדי לסייע ויזואליזציה) במנדף זרימה למינרית. במקביל הקים מלא המכיל PBS סטרילי עם פנול אדום 0.25%.
      2. אם אתה משתמש ns1-GFP זן 33, לדלל את ~ 1.5 x 10 2 יחידות פלאק ויוצרים (PFU) לכל NL ב PBS סטרילי, קר כקרח המכיל אדום 0.25% פנול (כדי לסייע ויזואליזציה) במנדף זרימה למינרית. במקביל הקים מלא המכיל נוזל allantoic מן ביצי עוף נגועות בדילול כמו הווירוס ב PBS סטרילי עם פנול אדום 0.25%.
      3. לשמור IAV על הקרח עד מוכן לשימוש.
    3. Pipet פתרון וירוס לתוך מחטים microinjection באמצעות טיפים microloader רק לפני השימוש. הכנס מחט microinjection לתוך מחזיק המתאים של מנגנון הזרקה (מערכת הזרקה בלחץ למשל MPPI-3).
    4. בעת ההצגה תחת מיקרוסקופ סטריאו, בעדינות קליפ קצה מחט microinjection עם # 5 מלקחיים חדים, מעוקרים.
      ודוק: אין מדובר recommended כי קצה microinjection להיות מקוטע בהדרגה.
    5. לחץ על דוושת הרגל של מערכת ההזרקה בלחץ ולהזריק לתוך טיפה של שמן טבילה מיקרוסקופ בשקופית מיקרומטר כיול. מדוד את הקוטר של הירידה. חשב את הנפח של הירידה באמצעות המשוואה, V = 4 / 3πr 3, כאשר V הוא נפח nl ו r הוא הרדיוס ב מיקרומטר.
      הערה: אם קוטרו הטיפה קטן מדי, כוס נוספת עשויה להיות מקוטעת או לחץ הגדרות תזמון יכולות להיות מותאמת. אם קוטרו הטיפה גדול מדי, הגדרות לחץ ועיתוי יכולות להיות מותאמות.
    6. התאם את הגדרות לחץ והעיתוי על לחץ ההזרקה ו / או reclip קצה המחט עד נפח הזרקה הרצויה מושגת (בדרך כלל 1-3 nl). לחץ הגדרות בין 20 ל -30 psi ומשך דופק הגדרות בין 40 ל 80 msec אופייניות. התאם בחזרה לחץ כך מונה לוחץ נימים אבל לא להדליף IAV (נטו אפס לחץ).
  3. יישר עובר להזרקה
    1. להרדים עוברים dechorionated ב 200 מיקרוגרם / מ"ל ​​Tricaine.
    2. לאחר התנועה נפסקת, להעביר 10-20 עוברים על צלחת 2% agarose (מוכן בסעיף 2.3) עם טפטפת פלסטיק. השתמש פיפטה פלסטיק כדי להסיר עודפי נוזלים.
    3. יישר בעדינות עוברת microinjection עם נימי אש מלוטשת וזכוכית בורוסיליקט האטומה. באמצעות מיקרוסקופ סטריאו, עובר להתמצא בעדינות כך הדביקה של קיביה או וריד הקרדינל האחורי עולה בקנה אחד עם מחט microinjection (איור 1 א).
  4. IAV Microinjection
    1. הכנס בעדינות את המחט microinjection לתוך צינור של קיביה או וריד הקרדינל האחורי. על הדוושה ברגל כדי להזריק את העוצמה הרצויה של IAV לתוך מערכת הדם של (איור 1 א) העובר. עובר ניתן להזריק יותר מפעם אחת, אם יש צורך בכך.
      הערה: בולוס ההזרקה צריכה להיסחף לתוך מחזור הדם distribהתנהגותיות בילדים בכל הגוף. אם נפח הזרקה אוסף באתר הזרקה, להסיר עובר מן הניסוי להרדים.
    2. חזור על זריקות בעוברים שונים עם פתרון שליטה ספציפי לזן של וירוס הנבחר. לקבלת APR8 ו- X-31, השתמש בשלט בסעיף 3.2.2.1; עבור ns1-GFP, להשתמש בשלט בסעיף 3.2.2.2.
  5. העברה עוברת מנות שכותרתו פטרי המכילות מי ביצה סטרילית ומניחים חממות על 33 ° C.
    הערה: עובר אינפקטד צריך להיות מבוגר על 33 ° C לתמוך שכפול נגיפי משופר. בנוסף, דגירה על 33 מעלות צלזיוס יחקה בצורה טובה יותר את הטמפרטורה של דרכי הנשימה העליונות האנושית, אשר נמצא בקשר הדוק עם טמפרטורות נמוכות יותר בסביבה החיצונית והוא שם זיהומים IAV להתרחש. עוברים יכולים להסתגל טווח טמפרטורות רחב 34.

4. מקומית, דלקת בשלפוחית השחייה IAV ב Tg (MPX: mCherry)

  1. הכנת IAV עבור Microinjection
    1. לדלל את פתרון הזרקת זן ובקרת ns1-GFP כמפורט בסעיף 3.2.
    2. הכן מחטים כמפורט בסעיף 2.2.
    3. יישר Tg (MPX: mCherry) 35 זחלים המכילים שלפוחית שחייה מנופחת כמפורטים בסעיף 3.3 למעט הבא. יישר זחלים בצורה כזאת כי המחט יכולה לנקב בשלפוחית השחייה ואת הווירוס ניתן להפקיד לתוך האחורי של בשלפוחית השחייה, כפי שתואר לעיל 36 (איור 2 א).
  2. IAV Microinjection
    1. הכנס בעדינות את המחט microinjection לתוך בשלפוחית השחייה ולהזריק את העוצמה הרצויה (למשל 5 NL) לכיוון האחורי של (איור 2 א) מבנה.
      הערה: בולוס ההזרקה צריכה לאסוף לכיוון האחורי ואת בועת האוויר של לשחות שלפוחית ​​השתן צריכה bהדואר שנעקר קדימה. ביטוי של GFP צריך להתחיל להיות שנצפה לאחר הזרקת 3 שעות.
    2. הזרקות חוזרות עם פתרון שליטה ספציפי לזן של וירוס הנבחר, כמפורט בסעיף 3.4.2.
  3. העבר הזחלים צלחות פטרי המכילות מים ביצה סטרילית ומניחים חממות על 33 ° C.

5. טיפול תרופתי אנטי

הערה: הפרוטוקול הבא מתאר את טיפול Zanamivir הראה בעבר ב גאבור et al. 19. פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי להקרין תרופות אנטי אחרות ויש לו הפוטנציאל להיות שונה כדי לסרוק תרכובות המצויות מרובות צלחת 96 היטב, בפורמט תפוקה גבוהה.

  1. בשעה 3 זיהום שעות שלאחר, להחליף מים ביצה של ns1-GFP- ודגים נגוע שליטה עם מים ביצה סטרילי המכיל 0, 16.7, או 33.3 ng / ml Zanamivir.
    הערה: ריכוזים אלו נבחרו על מנת לנסות לשכפל את הרמות הפיזיולוגיות מושגת FOllowing הממשל של Zanamivir בחולים אנושיים (100, 200, או 600 מ"ג, iv, פעמיים ביום או 10 מ"ג בשאיפה, פעמיים ביום). הריכוזים בסרום בחולים אנושיים נעים בין 9.83 כדי 45.3 ng / ml 36.
  2. במהלך 5 ימים, לשנות מי ביצה כל 12 שעות ולהחליף מי ביצת סטרילי המכילים את הכמות המתאימה של Zanamivir.
  3. עקוב אחר המסלול של זיהום.
    1. להרדים דג הזברה ב 200 מיקרוגרם / מ"ל ​​Tricaine. צג ביטוי של GFP על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו כדי להבחין בשינויים חזותיים בדפוסי זיהום בין דגים מלאים נגועים-IAV ובקרב הדגים השקועים בתוך הריכוזים השונים של תרופות.
    2. עקוב אחר תחלואה ותמותה במהלך 5 ימים.
      1. תצפיות שיא על הדינמיקה זיהום הקשורים פתולוגיה המחלה, כולל סימני עייפות הוכחה לבצקת, הבדלי פיגמנטציה, עינית ועיוותים craniofacial, ו לורדוסה. פתולוגיה מחלותבדרך כלל מתברר בדגים נגועים בקרה לאחר הזרקת 24-48 שעות, תלוי את כמות הנגיף המוזרקת. איסוף תמונות 24 שעות לאחר ההזרקה.
      2. כל 24 שעות במשך 5 ימים לאחר הדבקה, להקליט את מספר הרוגים, חולניים, ובריאים זחלים. המוות מוגדר מהיעדרם של פעימות לב ניכרת. להתוות נתונים לפי הצורך. לדוגמא, נתוני עלילה כגרף עמודות בערימה, עם אחוזי הדגים בריאים, חולניים, או מת זמם על ציר y ו בקבוצת הטיפול על ציר ה- x. 19
        הערה: תמותה יכולה להיות בקיע לפי הערכות הישרדות קפלן-מאייר. בהתאם ליישום, זה עשוי להיות מתאים לפתח גישות חלופיות לתחלואת דגי ניקוד, כוללים מטריצת ניקוד שעשוי לכמת את המעלות לתחלואה מבוססות על תכונות פתולוגיים הנ"ל ציינו.
      3. התייעץ עם סטטיסטיקאי ליישם את הניתוחים סטטיסטיים המתאימים.

6. הגירת נויטרופילים

הערה: הפרוטוקול שלהלן מתאר שיטה למעקב אחר הגירת נויטרופילים כדי בשלפוחית ​​השחייה לאחר זיהום IAV מקומי, אפיתל. השיטות שתוארו יכולות להיות שונות כדי לבדוק את ההשפעות של מניפולציות גנטיות וכימיות. באמצעות טכניקה זו, ניתן יהיה לאפיין את המנגנונים התנהגות נויטרופילים במהלך זיהום IAV.

  1. השמה דג הזברה הדמיה
    1. להרדים הזחלים להיות צילמו ב 200 מיקרוגרם / מ"ל ​​Tricaine.
    2. עבר יחיד Tg (MPX: mCherry) זחל כי נדבק בוירוס עם ns1-GFP אל באר של 24 היטב, צלחת זכוכית תחתונה טיפה קטנה של מי ביצה (~ 50-100 μl). אני חוזר עם דגים IAV נגועים ובקרה אחר.
    3. לאט לאט מוסיף עובר agarose 1% תקשורת גוברת היטב כל (סעיף 2.5), נזהר שלא להכניס בועות גדולות.
      1. בעדינות להתאים את המיקום של הזחל כך שהוא רכוב על צידו.גודי והנרי 37 לתאר איך לעשות בדיקות המתפקדים היטב בבקשה זו באמצעות סיכות חרקים כי הם רכובים נימי זכוכית בורוסיליקט עם חוטים ו superglued במקום.
    4. לאחר agarose מתקשה, בעדינות למלא את הבארות הבודדות עם מי ביצה המכילים 200 מיקרוגרם / מיליליטר Tricaine.
    5. עם מיקרוסקופ confocal, לכידת AZ סדרת ערימת תמונות brightfield קרינה באמצעות מטרת 20X התמקדה בשלפוחית ​​השחייה.
      1. הגדר את הגבולות העליונים ותחתונים, כך שהם ללכוד את כל הקרינה הירוקה ואדום הנצפית בעליל.
      2. צלמו תמונות על 2.0 μsec / פיקסל בצעדים כי הם ≤ 4 מיקרומטר. הגדלת זמן לפיקסל וצמצום מרחק בין השלבים (למשל 0.5 - 1.0 מיקרומטר) מגדילה תמונה ברזולוציה ואיכות.
      3. צור תמונה דו-ממדית על ידי מיזוג שכבות.
      4. השווה את מספר נויטרופילים MPX-mCherry חיובי אני מציגn את שלפוחית ​​שחייה של IAV נגועים ובקרה מוזרק דג הזברה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הנה, נתונים המראים כיצד מערכתי זיהום IAV דג הזברה יכול לשמש כדי לבדוק את יעילות תרופה (איור 1 א) הנם מסופקים. עובר ב 48 שעות לאחר הפריה מוזרקת עם APR8 (1C הדמוי, 1F), X-31 (1D הדמוי, 1G), או שהם ns1-GFP (איורי 1H-ט 1) דרך הצינור של קיביה ליזום זיהום ויראלי. עוקבה נוספת של עובר ב 48 שעות לאחר הפריה הוזרקה לשמש שולט על זיהום ויראלי (איורי 1B, 1E). על ידי 48 שעות לאחר הפגיעה, דג הזברה הוזרקו IAV הציג הוכחה לבצקת קרום הלב (דמויות 1C, 1D) ומעצר הדם (איור 1F), עם אריתרוציטים נוכחות ברחבי קרום הלב (איור 1G). שימוש ns1-GFP, הביטוי הראשוני של GFP על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי מוקדם ככל 3 שעות לאחר ההדבקה נצפתה. בשלב זה, דג זברה נחשפה 33.3 ng/ מ"ל ​​במינון של מעכב נורמינידאז Zanamivir. מינון זה שווה בערך במינון 200 מ"ג הניתן לחולי אדם. בקרת דגים נגועים לא נחשפו Zanamivir (1H הדמוי, 1H ') הציגו תכונות של בצקת וביטוי GFP מערכתית. מופחתת פתולוגיה ברוטו הקרינה GFP (איורים 1 ט, 1 ט ') הזחלים ns1-GFP נגועים חשופים Zanamivir נצפו. צמצום GFP היה בולט ביותר בגופם של זחלים, תוך שינוי קטן מאוד נצפה צקי החלמון. דגים שטופלו Zanamivir הציגו פחות תחלואה, כפי שמעיד תנועתיות שחי משופר רמות נמוכות של בצקת בלב, ושפרו הישרדות. ממצאים אלה משלימים מחקר מקיף יותר 19 ו להראות את הערך של מודל זה להקרנת סמים.

מודל זיהום בשלפוחית השחייה דג הזברה מקומי 31 הותאם IAV infection. וירוס ns1-GFP הוזרק שלפוחית שחייה של ד 5 לאחר ההפריה Tg (MPX: mCherry) הזחלים ליזום זיהום, אפיתל מקומי (איור 2 א). PBS הוזרק בשלפוחית ​​השחייה כביקורת להפגין את הספציפיות של גיוס נויטרופילים כלפי תאים הנגועים IAV. גיוס של נויטרופילים mCherry שכותרתו לתוך בשלפוחית ​​השחייה היה במעקב. בגיל 20 hr לאחר הפגיעה, ההגירה הניכרת של נויטרופילים לתוך שלפוחית שהחייה יחסית דגי IAV נגועים לבקרות מוזרקות PBS (2B הדמוי, 2B ', 2C, 2C') נצפה. נתונים אלה מראים כי IAV יכול לגייס נויטרופילים כדי בשלפוחית ​​השחייה, בדיוק כפי שהיא מגייסת נויטרופילים אל הריאות האנושי.

איור 1
איור 1: טיפול תרופתי אנטי מפחית את חומרת הזיהום IAV דג הזברה. (B - I) פתולוגיה גרוס GFP הקרינה של עוברי דג הזברה מוזרק לתוך צינור של קיביה עם IAV. (BG) דגים נגועים IAV ובחן ב 48 שעות שלאחר זיהום סימנים של זיהום ומחלות ויראליות. (B - D) מטוסי מוקד יחידים של שליטה או דגים נגועים IAV נאספו (צד רכוב, קדמי שמאל, למעלה הגבה, גדלת 4X, סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר). (ב) דגי בקרה הוזרקו PBS ולהציג מורפולוגיה נורמלית. (C - D) עובר נגוע APR8 (C) או X-31 (ד) בצקת קרום לב הציג נפוצה (חץ מלא). עובר גם רקמות נימקים, ניכר (C). (ה) דג הבקרה הוזרק PBS ולהציג אין עדות לפתולוגיה (סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר). (F) עובר נגוע APR8 מציג מעצר דם (חץ מחורצים, סרגל = 250 מיקרומטר). (G) העובר מוזרק עם מציג שפעת X-31 הן בצקת קרום הלב (חץ) אריתרוציטים ונקווה ברחבי קרום הלב (חץ מחורצים, סרגל = 100 מיקרומטר). (ח, ט) נציג תמונות שהראו השפעות של תרופה אנטי על דג הזברה IAV נגועים (סרגל = 200 מיקרומטר). (H) Brightfield ו (ה ') תמונת קרינת מראה עובר מוזרק עם ns1-GFP (ללא טיפול תרופתי אנטי-נגיפי). שים לב בצקת וביטוי GFP במיוחד באזור וריד הקרדינל הנפוץ. (אני, אני ') טיפול עם תרופה אנטי הפחית את להדביקיון, כפי שמעיד פתולוגיה מופחת, כולל בצקת פחתה, וביטוי GFP פחת בתוך המתווה המקווקות הלבנה של הגוף, במיוחד בכלי הדם, אשר מעיד על ניטל ויראלי מופחת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: נויטרופילים מגויסים לאתרים של זיהום מקומי IAV. (א) סכמטי הוכחת גישת הזרקת צורך ליזום זיהום IAV מקומי שלפוחית שחיית דג זברה מנופחת ב 5 ד לאחר הפריה. (B, C) גיוס נויטרופילים כדי בשלפוחית השחייה בעקבות זיהום ns1-GFP. תמונות מחסנית Z (4 מיקרומטר צעדים) נאספו על ידי מיקרוסקופ confocal (בהגדלה 20X). תמונות נותרו ללא שינויtened לשתי-ממדים (צד רכוב, קדמי שמאל, למעלה הגבה). Tg (MPX: mCherry) דג הזברה (ד 5 לאחר ההפריה) הוזרקו (B, B ') נוזל allantoic מדולל PBS ו פנול 0.25% או אדום (C, C') ns1-GFP (7.2 × 10 2 PFU / העובר) מדולל בנוזל allantoic ו PBS עם פנול אדום 0.25%. בגיל 16 hr לאחר הפגיעה, נויטרופילים היו נוכחים גם בשלפוחית שחיית IAV נגועה (C, C ': קרינה ירוקה מראה זיהום מקומי; ג': תאים אדומים הם נויטרופילים, חץ לבן מזהה נויטרופילים נציג). (B, B ') אין ראיות ביטוי GFP מעיד על זיהום IAV ואין גיוס של נויטרופילים כדי בשלפוחית השחייה נצפה הזחלים מוזרקים עם נוזל allantoic ב PBS. pleASE לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כדי למקסם את היתרונות זכו משימוש חיה קטנה מודל אינטראקציות מארח הפתוגן אנושיים, חשוב לנסח שאלות מחקר ושערות בדיקה כי לנצל את היתרונות טמונים במערכת המודל. כמודל הידבקות בני אדם IAV, דג הזברה יש מספר חוזקות, כוללים פוריות גבוהה, בהירות אופטית, amenability כדי הקרנת סמים, וזמינות של קווים מהונדסים כי לתייג תאים חיסוניים כמו נויטרופילים. דג הזברה פותחה כחלופה חזקה יותר ויותר למערכת במודל עכבר לחקר דלקת החסינות מולדת. משום שאין להם מענה אדפטיבית החיסון מתפקדת במהלך 4-6 שבועות של פיתוח הראשון, דג הזברה הר תגובות החיסון המולדת להגן מפני פגיעה וזיהום 37. במהלך התקופה המוקדמת הזאת בפיתוח, אפשר לבודד לחקור מנגנונים של התגובה נגיפים הנובעים התגובה החיסונית המולדת לבד. תיעבודה של כבר בהנחייתם של פיתוח קווי דג הזברה מהונדס כמו Tg (MPX: mCherry), אשר תוויות נויטרופילים עם חלבון פלואורסצנטי אדום.

מודלי דג זברה עבור זיהום IAV הדומות למחלות אנושיות תוארו 19 לאחרונה. זה הודגם כי דג זברה להחזיק α-2,6 צמודות שאריות חומצת sialic על לתאיהם המספקים IAV וירוסי הכמיהות לקשור, לצרף, וזן תאים. בכתב היד הזה וב גאבור et al. 19, זה הוכח כי שני זנים שונים של IAV (A / PR / 8/34 [H1N1] ו- X-31 A / איצ'י / 68 [H3N2]), כמו גם את זן ns1-GFP רקומביננטי שתוצאתו GFP התרגום בתאים נגועים, יכול להדביק, לשכפל, ותמותה הגורם כאשר הוא מוזרק לתוך מערכת הדם של דג הזברה הזחל. הזרקה של הנגיף היא קריטית שיטת זיהום זה, כחשיפת IAV באמצעות טבילה לא עובדת בצורה אמינה. דגים נגועים צריכים להיות העברהאדום חממה 33 ° C כדי להבטיח שכפול נגיפי. חשוב לציין כי מערכת הנשימה של האדם, שבו זיהומים שפעת להתרחש, הוא בדרך כלל 33 מעלות צלזיוס. דגירה על 28 מעלות צלזיוס, וזה יותר טמפרטורה טיפוסית לאינקובטורים דג זברה, מצליחה לייצר זיהום אמין. יתר על כן, זה הכרחי כדי לבדוק כל מנה קבלה מהיצרן או תצווה של IAV הפיקה לפני השימוש בניסוי בשל השתנות המשפיעה התקדמות infectivity ומחלות של דג הזברה. כאשר מינון זיהומיות הוא טיטרציה כראוי, הרוב המכריע של דג זברה נגוע זנים אלה של IAV צריך להפגין פנוטיפים מחלת ברוטו מאופיינים בצקת, מוקדם ככל 24 שעות לאחר פגיעה, כי בהדרגה להחמיר, מומי craniofacial ידי 48 שעות לאחר פגיעה, לורדוסה ב -72 שעות לאחר הדבקה, וכ 50% צריכה להיכנע את הזיהום על ידי שלאחר זיהום 5 ד. Histopathology ב 48 שעות לאחר ההדבקה צריך לכלול ראיות זימים, כליות הראש,נמק בכבד, כמו גם סימנים של נוזל קרום הלב. בקביעת ממצאים אלה כתוצר לחיזוי של זיהום IAV דג זברה, אפשר מועמדי מתחם תרופה נגד שפעת מסך מועמד. לאור זאת, פרוטוקול הוכחה של עיקרון לסינון תרופה אנטי מבוססת על ממצאים מקוריים המתואר גאבור et al. 19 הם הפגינו. שימוש מעכב נורמינידאז Zanamivir, במינון כי הוא ניבא לחקות רמות שנצפו דם אדם, תגובה מאוחרת של תחלואה מופחתת לתמותה דרך השפעה נראית לעין על התפשטות ויראלי שכפול /, כפי שנקבעו על ידי קרינת ns1-GFP, נצפה. מודל IAV דג הזברה הוא אידיאלי עבור בינונית למסכי מולקולה קטנה תפוקה גבוהה. בגלל זיהומים יכולים רק להתרחש רק באמצעות הזרקה ידנית לתוך המחזור דרך הצינור של קיביה או וריד קרדינל אחורי, את גודל המסכים מוגבלים במספר הטכנאים establishing הזיהומים ו המיומנויות שלהם בביצוע הטכניקה. אף על פי כן, אפשר להזריק לפחות 200 עוברי דג הזברה לכל טכנאי לשעה. בעוד מוצלח הוכחת פעילות אנטי עבור Zanamivir במודל זיהום דג זברה, יש להודות כי הקרנת סמים בכל במודלים של בעלי החיים, כוללים דג זברה, חייבת להיות מבוקרת 38 בזהירות. דרך תרופה נספגת מטבוליזם שונה מן החי אל-חיה, קשה לנבא. אף על פי כן, כשיטה לסינון תרופות נגד שפעת חדש, זה המודל זיהום דג הזברה IAV מציג הזדמנות מרגשת לסקור אלפים רבים של מולקולות קטנות בבעל חיים עם איברים orthologous לבני אדם עם פיזיולוגיה אינטגרטיבית-שמור ביותר.

בנוסף להיותו מודל זיהום מערכתי, דג הזברה יכול לשמש גם כמודל זיהום מקומי כאשר IAV מוזרק לתוך שלפוחית השתן לשחות 19 21, 29, 30, 31. כאשר טיטרציה כראוי, דג הזברה, כי הם נגועים זן ns1-GFP ב 5 ד לאחר ההפריה צריך להפגין ראיות של הקרינה punctate סביב האפיטל של בשלפוחית ​​השחייה ידי 1 ד לאחר הפגיעה. שימוש זה אסטרטגית זיהום מקומי, התנהגות נויטרופילים בתגובת הזיהום יכולה להיות במעקב. כמו נויטרופילים אדם, נויטרופילים דג זברה הם מתווך הסלולר עיקרי חסין מולד, מתפקדים במהלך תגובות חריפות כדי פגיע ברקמות זיהום ממלא תפקידים מהותיים במהלך דלקת כרונית 24. יש הכרה גוברת כי נויטרופילים לשחק תפקיד מכריע את התגובה החיסונית לזיהום שפעת. ואכן, זה הפך להיות ברור כי נויטרופילים לתפקד "חרבות פיפיות" בתיווך התגובה החיסונית. While החיוני לתגובה אנטי הצורך לשלוט זיהומי שפעת, נויטרופילים גם לתרום לסביבה דלקתית מוגזם הבריא שיכול לפגוע ברקמות מארחות ולהגדיל את הסיכון לתמותה 39, 40, 41, 42, 43. יש שימור ניכר synteny הגן בין דג הזברה הגנום האנושי, ועם orthology זה, יש גם שימור תפקודית משמעותית בביולוגיה נויטרופילים. נויטרופילים דג זברה לשאת דמיון רב נויטרופילים אדם, כוללים גרעין פולימורפיים, בנוכחות גרגרים יסודיים ותיכון, וכן myeloperoxidase ו NADPH התפקודית מונואמין 22. בנוסף, נויטרופילים דג הזברה יכול לבלוע חיידקים לשחרר מלכודות תאי נויטרופילים (נטס) 44. מספר קווי דג הזברה מהונדס כבר דeveloped לסיוע בזיהוי לנתח את הפונקציות של ביולוגיה נויטרופילים 27, 45, 46, 47. פרוטוקול זיהום זה הוא גמיש ויכול להיות שונה כדי לבדוק פונקציות נויטרופילים מרובות באמצעות כלים חלופיים אלה. מודל זיהום מקומי דג הזברה IAV זה מאפשר שאלות הקשורות התגובה החיסונית המארח להיות מטופל, ובמיוחד אלה מתווכת על ידי נויטרופילים.

מחקרים שנערכו במיני מודל יונקים הניבו 40 מידע רב ערך, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, אבל כמה ניסויים בזמן אמת מעורבים h זיהום IAVותעיף שבוצעה, הגבלת הבנה של יחסי הגומלין המורכבים בין מרכיבי התגובה החיסונית המולדת חוליות של המארח. בעשור האחרון, השימוש במערכת במודל חיה דג הזברה הניב פרשת המים של מידע לגבי אינטראקציות בין מאכסן לפתוגן 21, 47, 56, 57, וגם הציעה מידע חשוב ככלי לגילוי סמים. שילוב של שיטות מולקולריות מיקרוסקופיה הדמיה אפשר הבנה טובה יותר של מערכת חיסונית מולדת וכיצד אלה מתבטאים vivo 17, 18, 27. הגילוי כי דג הזברה יכול להיות נגוע IAV 19, וכי מניות דג הזברה הדמיון אימונולוגיים חשוב עם מערכות יונקים, כולל האדם, פתחה את הדלת של חדר העבודהשל פתוגן ויראלי אדם חשוב. הפרוטוקולים המתוארים ניתנים להתאמה ליישומים אחרים ויש להם הפוטנציאל להניב תגליות קריטיות לגבי אינטראקציות מאכסנות-וירוס שעשויה להיות השפעות קליניות עמוקות על בריאות אדם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instant Ocean Spectrum Brands SS15-10
100 mm x 25 mm sterile disposable Petri dishes  VWR 89107-632
Transfer pipettes  Fisherbrand 13-711-7M
Tricaine-S (MS-222) Western Chemical
Borosilicate glass capillary with filament  Sutter Instrument  BF120-69-10
Flaming/Brown micropipette puller  Sutter Instrument P-97
Agarose Lonza 50004
Zanamivir AK Scientific G939
Dumont #5 forceps  Electron Microscopy Sciences 72700-D
Microloader tips Eppendorf 930001007
Microscope immersion oil Olympus IMMOIL-F30CC
Microscope stage calibration slide  AmScope MR095
MPPI-3 pressure injector  Applied Scientific Instrumentation
Stereo microscope Olympus SZ61
Back pressure unit Applied Scientific Instrumentation BPU
Micropipette holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
Foot switch Applied Scientific Instrumentation FSW
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Magnetic base Applied Scientific Instrumentation Magnetic Base
Phenol red  Sigma-Aldrich  P-4758
Low temperature incubator VWR 2020
SteREO Discovery.V12 Zeiss
Illuminator Zeiss HXP 200C
Cold light source Zeiss  CL6000 LED
Glass-bottom multiwell plate, 24 well Mattek P24G-0-13-F
Confocal microscope Olympus IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
Fluoview software Olympus
Prism v6 GraphPad
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus  Charles River  490710
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)  Charles River  490715
Influenza NS1-GFP Referenced in Manicassamy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry) Referenced in Lam et al. 2013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. W.H.O. Influenza (Seasonal). Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/ (2014).
  2. W.H.O. W.H.O. Global Action Plan.. Available from: http://www.who.int/influenza_vaccines_plan/en/ (2011).
  3. De Clercq, E. Antiviral agents active against influenza A viruses. Nat Rev Drug Discov. 5, (12), 1015-1025 (2006).
  4. von Itzstein, M. The war against influenza: discovery and development of sialidase inhibitors. Nat Rev Drug Discov. 6, (12), 967-974 (2007).
  5. Fiore, A. E., et al. Antiviral Agents for the Treatment and Chemoprophylaxis of Influenza. Centers for Disease Control and Prevention. 1-26 (2011).
  6. Krammer, F., Palese, P. Advances in the development of influenza virus vaccines. Nat Rev Drug Discov. 14, (3), 167-182 (2015).
  7. Ren, H., Zhou, P. Epitope-focused vaccine design against influenza A and B viruses. Curr Opin Immunol. 42, 83-90 (2016).
  8. Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323, 115-139 (2014).
  9. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2, (8), 1530-1563 (2010).
  10. Ibricevic, A., et al. Influenza virus receptor specificity and cell tropism in mouse and human airway epithelial cells. J Virol. 80, (15), 7469-7480 (2006).
  11. Skehel, J. J., Wiley, D. C. RECEPTOR BINDING AND MEMBRANE FUSION IN VIRUS ENTRY: The Influenza Hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69, (1), 531 (2000).
  12. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11, (6), 567-573 (2004).
  13. Stencel-Baerenwald, J. E., Reiss, K., Reiter, D. M., Stehle, T., Dermody, T. S. The sweet spot: defining virus-sialic acid interactions. Nature Rev Microbiol. 12, (11), 739-749 (2014).
  14. Herlocher, M. L., et al. Ferrets as a Transmission Model for Influenza: Sequence Changes in HA1 of Type A (H3N2) Virus. J Infect Dis. 184, (5), 542-546 (2001).
  15. Belser, J. A., Katz, J. M., Tumpey, T. M. The ferret as a model organism to study influenza A virus infection. Dis Model Mech. 4, (5), 575-579 (2011).
  16. Cochran, K. W., Maassab, H. F., Tsunoda, A., Berlin, B. S. Studies on the antiviral activity of amantadine hydrochloride. Ann N Y Acad Sci. 130, (1), 432-439 (1965).
  17. de Oliveira, S., Boudinot, P., Calado, A., Mulero, V. Duox1-derived H2O2 modulates Cxcl8 expression and neutrophil recruitment via JNK/c-JUN/AP-1 signaling and chromatin modifications. J Immunol. 194, (4), 1523-1533 (2015).
  18. de Oliveira, S., et al. Cxcl8 (IL-8) mediates neutrophil recruitment and behavior in the zebrafish inflammatory response. J Immunol. 190, (8), 4349-4359 (2013).
  19. Gabor, K. A., et al. Influenza A virus infection in zebrafish recapitulates mammalian infection and sensitivity to anti-influenza drug treatment. Dis Model Mech. 7, (11), 1227-1237 (2014).
  20. Galani, I. E., Andreakos, E. Neutrophils in viral infections: Current concepts and caveats. J Leukoc Biol. 98, (4), 557-564 (2015).
  21. Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-kappaB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6, (5), 1260-1270 (2013).
  22. Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94, (4), 633-642 (2013).
  23. Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120, (19), 3372-3383 (2007).
  24. Shelef, M. A., Tauzin, S., Huttenlocher, A. Neutrophil migration: moving from zebrafish models to human autoimmunity. Immunol Rev. 256, (1), 269-281 (2013).
  25. Walters, K. B., Green, J. M., Surfus, J. C., Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Live imaging of neutrophil motility in a zebrafish model of WHIM syndrome. Blood. 116, (15), 2803-2811 (2010).
  26. Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Dev Cell. 18, (2), 226-236 (2010).
  27. Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J Leukoc Biol. 89, (5), 661-667 (2011).
  28. Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125, (23), 5702-5710 (2012).
  29. Winata, C. L., et al. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331, (2), 222-236 (2009).
  30. Perry, S. F., Wilson, R. J., Straus, C., Harris, M. B., Remmers, J. E. Which came first, the lung or the breath? Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 129, (1), 37-47 (2001).
  31. Gratacap, R. L., Bergeron, A. C., Wheeler, R. T. Modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection. J Vis Exp. (93), e52182 (2014).
  32. Adatto, I., Lawrence, C., Thompson, M., Zon, L. I. A New System for the Rapid Collection of Large Numbers of Developmentally Staged Zebrafish Embryos. PLoS ONE. 6, (6), e21715 (2011).
  33. Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 107, (25), 11531-11536 (2010).
  34. Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture. 269, (1), 1-20 (2007).
  35. Lam, P. -y, Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Heat Shock Modulates Neutrophil Motility in Zebrafish. PLoS ONE. 8, (12), e84436 (2013).
  36. Shelton, M. J., et al. Zanamivir pharmacokinetics and pulmonary penetration into epithelial lining fluid following intravenous or oral inhaled administration to healthy adult subjects. Antimicrob Agents Chemother. 55, (11), 5178-5184 (2011).
  37. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25, (4), 341-350 (2008).
  38. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14, (10), 721-731 (2015).
  39. Brandes, M., Klauschen, F., Kuchen, S., Germain, R. N. A systems analysis identifies a feedforward inflammatory circuit leading to lethal influenza infection. Cell. 154, (1), 197-212 (2013).
  40. Narasaraju, T., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am J Pathol. 179, (1), 199-210 (2011).
  41. Pillai, P. S., et al. Mx1 reveals innate pathways to antiviral resistance and lethal influenza disease. Science. 352, (6284), 463-466 (2016).
  42. Stifter, S. A., et al. Functional Interplay between Type I and II Interferons Is Essential to Limit Influenza A Virus-Induced Tissue Inflammation. PLoS Pathog. 12, (1), e1005378 (2016).
  43. Vlahos, R., Stambas, J., Selemidis, S. Suppressing production of reactive oxygen species (ROS) for influenza A virus therapy. Trends Pharmacol Sci. 33, (1), 3-8 (2012).
  44. Palic, D., Andreasen, C. B., Ostojic, J., Tell, R. M., Roth, J. A. Zebrafish (Danio rerio) whole kidney assays to measure neutrophil extracellular trap release and degranulation of primary granules. J Immunol Methods. 319, (1-2), 87-97 (2007).
  45. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, (13), 3976-3978 (2006).
  46. Mathias, J. R., et al. Characterization of zebrafish larval inflammatory macrophages. Dev Comp Immunol. 33, (11), 1212-1217 (2009).
  47. Pase, L., et al. Neutrophil-delivered myeloperoxidase dampens the hydrogen peroxide burst after tissue wounding in zebrafish. Curr Biol. 22, (19), 1818-1824 (2012).
  48. Drescher, B., Bai, F. Neutrophil in viral infections, friend or foe? Virus Res. 171, (1), 1-7 (2013).
  49. Iwasaki, A., Pillai, P. S. Innate immunity to influenza virus infection. Nat Rev Immunol. 14, (5), 315-328 (2014).
  50. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13, (3), 159-175 (2013).
  51. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends Immunol. 31, (8), 318-324 (2010).
  52. Tate, M. D., Brooks, A. G., Reading, P. C. The role of neutrophils in the upper and lower respiratory tract during influenza virus infection of mice. Respir Res. 9, 57 (2008).
  53. Tate, M. D., et al. Neutrophils ameliorate lung injury and the development of severe disease during influenza infection. J Immunol. 183, (11), 7441-7450 (2009).
  54. Tumpey, T. M., et al. Pathogenicity of influenza viruses with genes from the 1918 pandemic virus: functional roles of alveolar macrophages and neutrophils in limiting virus replication and mortality in mice. J Virol. 79, (23), 14933-14944 (2005).
  55. Wheeler, J. G., Winkler, L. S., Seeds, M., Bass, D., Abramson, J. S. Influenza A virus alters structural and biochemical functions of the neutrophil cytoskeleton. J Leukoc Biol. 47, (4), 332-343 (1990).
  56. de Oliveira, S., et al. Cxcl8-l1 and Cxcl8-l2 are required in the zebrafish defense against Salmonella Typhimurium. Dev Comp Immunol. 49, (1), 44-48 (2015).
  57. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. J Leukoc Biol. 98, (4), 523-537 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics