Identifikasjon av Plasmodesmal lokalisering sekvenser i proteiner i Planta

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Anlegget intercellulære tilkoblinger, plasmodesmata (Pd), spille sentrale roller i anlegget fysiologi og plante-virus interaksjoner. Kritisk til Pd transport sorterer signaler som direkte proteiner til Pd. Vår kunnskap om disse sekvensene er imidlertid fortsatt i sin barndom. Vi beskriver en strategi for å identifisere Pd lokalisering signaler i Pd-målrettet proteiner.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta. J. Vis. Exp. (126), e55301, doi:10.3791/55301 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Plasmodesmata (Pd) er celle til celle tilkoblinger som fungerer som inngangsporter gjennom små og store molekyler transporteres mellom anlegget celler. Mens Pd transport av små molekyler, som ioner og vann, antas å oppstå passivt, celle-til-celle transport av biologiske makromolekyler, slik proteiner, sannsynligvis skjer via en aktiv mekanisme som involverer målretting sender på den transporteres molekylet. Knapphet på identifiserte plasmodesmata (Pd) lokalisering signaler (PLSs) har sterkt begrenset forståelse av protein-sortering trasé involvert i plante celle til celle macromolecular transport og kommunikasjon. Fra et vell av endogene og virale proteiner kjent trafikk gjennom Pd, bare tre PLSs er rapportert til dags dato, alle av dem fra endogene anlegget proteiner. Det er derfor viktig å utvikle en pålitelig og systematisk eksperimentelle strategi for å identifisere en funksjonell PLS sekvens, som er både nødvendig og tilstrekkelig for Pd målretting, direkte i levende anlegget celler. Her beskriver vi en slik strategi med som et paradigme celle til celle bevegelse protein (MP) av tobakk mosaikk virus (TMV). Disse eksperimentene, som identifisert og preget første anlegget viral PLS, kan tilpasses for oppdagelse av PLS sekvenser i mest Pd målrettede proteiner.

Introduction

Plasmodesmata (Pd) fungere som kanaler for intercellulære transport av viktige regulatorer anlegget og morphogenesis, alt fra transkripsjonsfaktorer mRNA og små RNA molekyler. Videre er benyttes denne macromolecular kapasitet av Pd av de fleste plante virus for deres intercellulære spredning under infeksjon; Hvis du vil flytte Pd, har plante virus utviklet spesialiserte proteiner, kalt bevegelse proteiner (MPs), som spesifikt mål Pd1,2,3,4,5,6 , 7. molekylær veier av Pd transport sannsynligvis er nært sammen med bestemte sekvensene som mål transportert proteiner i disse veiene. Identifikasjon av disse Pd lokalisering signaler (PLSs) kan dermed være diagnostiske av den tilsvarende Pd transport veien. Dette er ved analogi Pd transport8, for eksempel å forskjellige kjernefysiske import trasé, som kan være spesifikke for ulike kjernefysiske lokalisering signal (NLS) sekvenser9,10. Konseptuelt, representerer både NLSs og PLSs ikke-cleavable subcellular målretting sekvenser som er nødvendig og tilstrekkelig for målretting. Men i motsetning til NLSs11er sekvens informasjon om PLSs sterkt begrenset. Spesielt, er bare fire protein sekvenser involvert i Pd målretting rapportert, med alle av dem fra endogene anlegget proteiner. Den første som representeres av et homeobox-domene KN112 -en transkripsjon faktor som flytter fra indre lag til overhuden anlegg blad13 -og dens KNOX homologs14. Andre er også fra en transkripsjon faktor, Dof, som inneholder en antatte PLS beskrevet som intercellulære smugling (IT) motiv15. Den tredje sekvensen er fra PDLP1 plasmodesmata-bolig type 1 membran protein, og det er representert ved en transmembrane domene16. Til slutt, fjerde Pd målretting sekvensen ble nylig rapportert for glycosylphosphatidylinositol (GPI)-forankret proteiner og det er representert ved glycosylphosphatidylinositol (GPI) endring signal17.

Interessant, har ingen PLSs inntil ganske nylig, er rapportert for viral MPs. Tidligere studier angitt tilstedeværelsen av antatte PLS sekvenser i anlegget viral MPs18,19, men ingen sanne PLS, dvsen minimal aminosyresekvens både nødvendig og tilstrekkelig for Pd målretting av en urelaterte Last molekyl ( f.eks., CFP) har blitt identifisert i en viral MP. Enda var en av disse proteinene, MP av tobakk mosaikk virus (TMV), først som Pd lokalisering og transport har vært demonstrert20.

For å dekke dette gapet, utviklet vi en eksperimentell strategi for å identifisere TMV MP PLS. Denne strategien var basert på tre konsepter. (i) vi definert PLS som en minimal aminosyresekvens som er både nødvendig og tilstrekkelig for protein målretting til Pd21. (ii) fordi TMV MP først mål Pd og deretter translocates gjennom disse kanalene22, rettet vi mot uncoupling disse to aktivitetene og identifisere bona fide PLS, som fungerer bare for Pd målretting, og ikke for påfølgende transport. (iii) vi analysert de identifiserte PLS for aminosyre rester viktig for sin Pd målretting aktivitet, enten strukturelt eller funksjonelt. Bruker denne tilnærmingen, avgrenset vi en 50-amino acid rester sekvens på amino-terminus av TMV MP som fungerer som bona fide PLS. Dette ble gjort ved å produsere en rekke TMV MP fragmenter som mettet hele lengden av protein, merking deres carboxyl-termini med CFP og transiently uttrykker dem i anlegget vev. PD lokalisering av testet fragmenter ble bestemt av coexpressing dem med en Pd markør protein, PDCB1 (Pd callose binding protein 1)23. Minste fragmentet som fortsatt lokalisert til Pd, men ikke går Pd, ble ansett som representerer PLS. Endelig var PLS alanin skannet å finne viktig aminosyre rester kreves for sin struktur og funksjon.

Mens her vi illustrere denne tilnærmingen ved å beskrive identifikasjon av TMV MP PLS, kan det brukes å oppdage PLSs i noen andre Pd-målrettet proteiner, om kodet av plante-patogener eller planter selv; Dette er fordi vår metode ikke dra nytte av viral MPs med hensyn til deres evne til å målrette unike funksjoner Pd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. plantemateriale

  1. Valg av plantearter
  2. Bruk plantearter innfødt til protein av interesse, dvs., som kodes dette proteinet for endogene proteiner eller som representerer naturlig vert for patogen for virale proteiner. Valgte plantearter må i tillegg være mottakelig for den valgte metoden forbigående genetisk transformasjon.
    Merk: Studier rutinemessig ansette Nicotiana benthamiana, som representerer en god vert for TMV og omdannes effektivt ved Agrobacterium-mediert genetisk transformasjon teknikk, dvs, agroinfiltration (se trinn 3). N. benthamiana planter også dyrkes lett og har store blader, som er lett inokulert av Agrobacterium og enkelt analysert av AC confocal mikroskopi.
  3. Plantevekst
    1. Plant N. benthamiana frø i våt jord på høy tetthet. Oppbevar dem i et kontrollert miljø kammer på 20-25 grader under 16 h lys i ~ 75 µmol fotoner m-2 s-1 og 8 h mørke. Etter diameteren på euphyll når 0,5 cm, nøye overføre seedlings til større Potter og fortsette vekst i samme kammer under like forhold.
    2. Opprettholde plantene før de vokser til 4-8-leaf scenen innen 4 uker når største bladene er 4-6 cm i diameter; på denne tiden, kan de brukes til agroinfiltration (se trinn 3).
      Merk: Viktigere, aldri bruke planter hvis de begynte å blomst fordi på denne utviklingsstadiet, blad arkitekturen varierer ofte24,25, noen ganger fører til inkonsekvente resultater.

2. uttrykk vektor konstruksjon

  1. Valg av uttrykket system
    1. Velg uttrykket system, dvs., vektorer og vektor leveringsmåte, best egnet for uttrykket av proteinet interesse plantearter studerte.
      Merk: Noen ganger slik bestemte kombinasjoner av testet protein/plantearter kan kreve bestemte vektorer og vektor Leveringsmetode for optimal uttrykk og funksjonen av protein av interesse. For mest dicotyledonous planter, men velge binære plasmider uttrykk vektorer og agroinfiltration som leveringssystem.
  2. Protein fluorescerende merking
    1. Fluorescently merke hvert uttrykt protein for analyse av den subcellular fordelingen22, inkludert Pd lokalisering.
      Merk: Benytter autofluorescent proteiner, som CFP og DsRed2, som koder. Tag testet protein med CFP og coexpress det med en gratis DsRed2. CFP funksjoner både kode og som et virus-relatert Last molekyl. DsRed2 funksjoner å kalibrere virkningsgraden i forbigående uttrykk og, fordi det er celle-autonome, identifisere først transformert cellen; Denne siste funksjonen er viktig når vurdere celle til celle bevegelse av potensielt ikke-celle-autonome testet proteiner. For coexpression med Pd markøren PDCB1, som også er cellen autonome, tag testet protein CFP og PDCB1 med DsRed2.
    2. Som en tommelfingerregel, sikring autofluorescent koden til carboxyl-endestasjonen til uttrykt protein. Men hvis merket full lengde testet protein utstillinger kompromittert Pd målretting, overføre koden til amino-endestasjonen til protein.
    3. Klone koding sekvenser av proteiner skal testes i en egnet anlegget uttrykk vektor.
      Merk: Det finnes mange forskjellige anlegg uttrykk vektorer at fluorescerende merking. Vi bruker en rekke pSAT plasmider26 eller noen av deres derivater27,28, som passer for kloning av sekvensen av interesse direkte i rammen med foreslåtte autofluorescent kodene (se trinn 2.2.1) i begge amino- og carboxyl-terminal orientering.
    4. Overføre hver uttrykk kassett i en Agrobacterium binære vektor.
      Merk: Selv om pSAT-baserte konstruksjoner er egnet for direkte biolistic levering i anlegget vev, agroinfiltration, som er transformasjon metoden anbefalt her (se trinn 3), krever at uttrykket kassetten ligger mellom T-DNA kantlinjene i en binær vektor29.
      Merk: Alle pSAT vektorer er utformet for at slik overføring til pPZP-RCS2 multigene uttrykk binære vektor26,30 av en enkeltsteg kloning bruker sjelden kutte nucleases ASCII-PpoI-SceI, jeg-CeuI, PI-PspI og PI-TliI 26. forskere som foretrekker å benytte recombinatorial kloning, f.eksbruke heterologous lox nettsteder31, kan bruke pSAT vektor varianter26,27.
    5. For coexpression, overføre både uttrykk kassetter, f.eks, testet protein-CFP og DsRed2 eller testet protein-CFP og PDCB1-DsRed2 (se trinn 2.1), til samme pPZP-RCS2 binære vektor.
      Merk: Alternativt Agrobacterium kulturer skjuler individuelle binary skjemaopprettelser kan blandes sammen for infiltrasjon i N. benthamiana (se trinn 3.1).

3. Agroinfiltration

  1. Legge til 1 µg av en pPZP-RCS2-baserte plasmider fra trinn 2.2.5 til 100 µL kultur av kompetente celler Agrobacterium tumefaciens belaste EHA105 eller GV3101 utarbeidet som beskrevet32, ruge på is 30 min, flash-fryse i flytende nitrogen for 1 min, og ruge på 28 ° C i 15 min.
    1. Deretter legge 1 mL av LB medium (10 g/L tryptone, 5 finans gjærekstrakt og 10 g/L NaCl) kompetente celle blandingen og ruge på 28 ° C i 2 h. spinn ned cellene på 3000 × g for 1 min, å avbryte dem 0,2 mL LB , og plate dem på LB agar supplert med aktuelle antibiotika (f.eks, 100 mg/L spectinomycin og 50 mg/L og for pPZP-RSC2-baserte vektorer26,30). Vokse i 28 ° C i 48 timer til enkelte koloniene er synlige.
  2. Plukke og plate flere individuelle kolonier på en fersk LB agar plate (se trinn 3.1), vokser på 28 ° C i 48 timer, og ta en liten mengde bakterier for analyse av kolonien PCR33 å bekrefte tilstedeværelse av de spesifikke binære konstruksjoner.
  3. Vokse hver Agrobacterium kolonien med konstruere rundt overnatting på 28 ° C i 5 mL av LB medium med aktuelle antibiotika (se trinn 3.1.1). Sentrifuge cellene på 3000 × g og å utsette dem til OD600= 0,5 agroinfiltration buffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES (pH 5.6), 150 µM acetosyringone). Inkuber for 2 timer ved romtemperatur.
    1. Hvis bruker en blanding av binære plasmider i stedet for en enkelt multigene uttrykk plasmider for protein coexpression, bland de tilsvarende cellekulturer på 1:1 v/v forholdet før infiltrasjon. Deretter ruge cellene på 28 ° C i 2 timer.
  4. Legg til inoculum i en 1 mL plastsprøyte og trykk munnstykket av (ingen p) mot lavere (abaxial) epidermis fullt moden N. benthamiana blader. Holde bladet med en hansker finger på adaxial ansiktet34,35.
    1. Introdusere Agrobacterium i infiltrasjon medium av langsom injeksjon. For statistisk betydning, infiltrere flere blader på hver plante.
      Merk: Vær oppmerksom på at eldste bladene ikke brukes som de ikke gir konsekvent uttrykk nivåer.
    2. Vaksinere alle blader i situ. Opprettholde infiltrere anlegget til observasjon som beskrevet i trinn 1.2.

4. AC confocal mikroskopi

  1. Bruk en kniv til å kutte hvert blad i fragmenter mellom venene 24-48 h etter infiltrasjon, (avhengig av effektiviteten av forbigående uttrykk for bestemte testet protein); størrelsen på hver vev slice bør være slik at stykket er helt dekket av dekket glasset (22 x 40 mm) for mikroskopi.
  2. Stedet blad skiver på objektet lysbilde med abaxial blad overflaten vendt opp, Plasser en dråpe vann på blad sektoren og dekke det med cover glasset. Nakkens dekket glasset med små biter av tape på hver side.
  3. Observere agroinfiltrated vev under en laserskanning AC confocal mikroskop og registrere bildene.
    1. Først bruker en 10 X linsen til å identifisere celler med signalet, og deretter bruke 63 x linsen for nærmere observasjoner.
    2. Bruk 458 nm wavelength fra en argon ion laser å opphisse CFP og 543 nm å opphisse DsRed2. Beholde alle innstillinger for bildeopptak, dvs, laser intensitet og photomultiplier rør (avdrag) innstillinger, mellom eksperimenter. Gjennomsnittlig undersøke 100-120 celler for hver eksperimentelle tilstand.

5. identifikasjon av PLS

  1. Diagnostisere lokalisering av testet protein med AC confocal mikroskop (del 4). Sjekk Hvis testet protein har karakteristiske perifere vises punctate mønster25,36,37,38,39,40,41 og colocalizes med Pd markøren PDCB123. Dette angir at testet protein sannsynligvis inneholder PLS sekvenser.
  2. Etter bekreftelse av PLS aktiviteten testet protein, dele gradvis åpent lesing rammen (ORF) (genbank tiltredelse nummer BAF93925.1) i mindre fragmenter, autofluorescently, (f.eksCFP,) kode hver av dem, og analysere deres subcellular lokalisering som beskrevet i trinn 4. Først anbefales størrelsen på 100 aminosyre rester for hver inndelt fragment.
  3. Videre dele avkortet fragmenter som har PLS aktiviteten og sjekk deres subcellular lokalisering som beskrevet i trinn 4 minste fragmentet som fortsatt regionaliserer til Pd, er dvs tilstrekkelig til å transportere autofluorescent tag lasten til Pd, er identifisert. Denne fragment antas å representere PLS sekvensen.
  4. Slett den antatte PLS fra full lengde testet protein, dvs sikring den gjenværende delen av testen protein uten antatte PLS autofluorescent merke, og finne den subcellular lokaliseringen av resulterende mutant protein som beskrevet i trinn 4. Hvis denne mutant protein som mangler den antatte PLS ikke lokalisere til Pd, vil dette indikere at de identifiserte PLS ikke er bare nok (se trinn 5.3), men også nødvendig for Pd transport av testet protein.
  5. Agroinfiltrate bladene med en blanding av Agrobacterium kulturer skjuler uttrykket konstruere for CFP-merket PLS og gratis DsRed2 (se trinn 3.3). Observere infiltrere vev AC confocal mikroskop med linsen 10 x ved hjelp av de samme innstillingene i trinn 4.3.
  6. Score celler som inneholder både CFP og DsRed2 signaler som opprinnelig infiltrere celler, og score de tilstøtende cellene som inneholdt bare CFP signalet som denne utstillingen bevegelsen.
    Merk: Dette trinnet undersøker den identifiserte PLS for sin potensielle celle til celle bevegelse evne til; Dette er fordi mange proteiner som mål Pd (inkludert de fleste plante viral MPs) også gå gjennom Pd til nabokommunene cellene. Konsentrasjonen av Agrobacterium brukt for infiltrasjon avhenger uttrykk effektiviteten av ulike strukturer henholdsvis. For agroinfiltration, sørg for å bruke celle kultur fortynning som sikrer (i) transformasjon av enkeltceller, forlater de tilstøtende cellene transformeringsinstruksjonene, (ii) oppnår lignende effektiviteten av uttrykk. For eksempel vil benytte vår eksperimenter OD600 0,01 og 0.005 for uttrykk for CFP-merket PLS og gratis DsRed2, henholdsvis.

6. identifikasjon av nøkkel PLS rester bruker alanin skanning42

  1. Bruk standard PCR-protokoller til å forsterke PLS koding sekvens ansette et par primere utformet for å inneholde den ønskede mutasjon, dvs, substitusjon av målet aminosyre resten med alanin, rundt den sentrale regionen i hver primer som beskrevet 21. utføre primer utforming og bruk område-rettet mutagenese kit for området-rettet mutagenese i henhold til produsentens instruksjoner.
  2. Rense de resulterende PCR produktene med alle standard DNA rensing kit og fordøye dem på 37 ° C med DpnI å eliminere foreldrekontrollkoden (dvs.ikke-mutert) denaturert og hemimethylated DNA. Avkjøl dette i 5 minutter ved romtemperatur (ikke på ice). Deretter forvandle blandingen direkte til E. coli kompetent celler43og identifisere kolonier med de ønskede mutant konstruksjoner som beskrevet i trinn 3.2.
  3. Innføre de muterte konstruksjoner i binær vektoren som beskrevet i trinn 2.2.4, utfører agroinfiltration som beskrevet i trinn 3, og vurdere Pd målretting som beskrevet i trinn 4 og 5.1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representant dataene, som trofast illustrerer resultatene fra beskrevet protokollene og identifisere TMV MP PLS, er tilpasset fra Yuan et al. 21. figur 1A først summerer store konstruksjoner uttrykke full lengde TMV MP (1-268), TMV MP PLS (bestående av de første 50 aminosyre rester av protein, 1-50), og dens alanin skanning V4A derivater del CFP (generert som beskrevet i trinnene 2.2, 5.2 og 6) mens figur 1B oppsummerer og kvantifiserer den subcellular lokaliseringen av disse merket proteiner. Figur 1 c illustrerer karakteristiske perifere vises punctate Pd lokalisering mønstrene observert for TMV MP-CFP og for TMV MP PLS-CFP så vel som for den coexpressed Pd markøren, PDCB1-DsRed2 (se trinn 5.1). Figur 2A illustrerer Pd målretting av TMV MP-CFP og for TMV MP PLS-CFP og nucleocytoplasmic distribusjon av coexpressed gratis DeRed2 (se trinn 5.1). Til slutt, figur 2B illustrerer tap av Pd målretting av både TMV MP og TMV MP PLS med en enkelt alanin substitusjon V4A, som indikerer at denne rester er viktig for PLS strukturen eller funksjon; i samme celler coexpressed Pd markøren PDCB1 fortsatt regionaliserer til Pd (se trinn 6).

Disse dataene viser at denne konseptuelt og teknisk enkel prosedyre for systematisk produksjon av proteinfragmenter, fusion en autofluorescent markør-Last protein og testing for evnen å lokalisere til Pd kan identifisere en minimal protein sekvens nødvendig og tilstrekkelig for Pd målretting, dvsPLS. For riktig tolking av disse lokalisering data, er det avgjørende å utføre colocalization eksperimenter med et kjent Pd protein, f.eks, PDLP eller PDCB familiemedlemmer16,23 eller en av anlegget viral MPs sorterer å Pd44 . Colocalization har åpenbart ikke være fullstendig, som ikke alle P-lokalisere proteiner kan rettes mot samme Pd, men en statistisk signifikant grad av colocalization med minst ett av Pd markør proteiner er nødvendig for å definere PLS aktiviteten.

Figure 1
Figur 1: identifisering av TMV MP PLS. (A) Sammendrag av viktigste CFP-fusion konstruksjoner brukes til å identifisere TMV MP PLS. TMV MP sekvenser, grønne feltene. CFP, boksene; P, formidler; T, terminator. Tall til venstre angir aminosyre rester i hver TMV MP-fragment. (B) Sammendrag av subcellular lokalisering av fusion proteiner i (A). PD lokalisering eller nucleocytoplasmic lokalisering identifiserte basert på lokaliseringen av de tilsvarende subcellular markørene, PDCB1-DsRed2 og gratis DsRed2, henholdsvis. Prosentandelen av celler viser hver lokalisering mønster vises basert på scoring 100 uttrykke celler per konstruere i tre uavhengige eksperimenter. Dataene er gjennomsnittlig ± standardfeil (SE). (C) Pd målretting TMV MP-CFP, TMV MP PLS-CFP og Pd merket PDCB1-DsRed2. CFP er i blått. DsRed2 er i lilla; plastid autofluorescence ble filtrert ut. Bilder er enkelt AC confocal deler. Skalere barer = 10 µm. DIC, differensial forstyrrelser kontrast mikroskop-bilde. Dette tallet er tilpasset fra Yuan et al. 21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Pd målretting av TMV MP, TMV MP PLS og deres alanin-skanning mutanter. (A) Subcellular lokalisering TMV MP-CFP, TMV MP PLS-CFP og nucleocytoplasmic markøren DsRed2. (B) tap av Pd målretting evne til V4A alanin-skanning mutanter TMV MP-CFP og TMV MP PLS-CFP. PD var visualisert ved coexpression av Pd merket PDCB1-DsRed2. CFP er i blått. DsRed2 er i lilla; plastid autofluorescence ble filtrert ut. Bilder er enkelt AC confocal deler. Skalere barer = 10 µm. DIC, differensial forstyrrelser kontrast mikroskop-bilde. Dette tallet er tilpasset fra Yuan et al. 21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen har fire core bestanddeler: begrepet identifisere en sekvens som er både nødvendig og tilstrekkelig for målretting for Pd, systematisk arbeidsdeling protein av interesse i fragmenter som gradvis reduseres i lengde, blander den testet fragmenter til en autofluorescent protein som tjener både som koden og macromolecular Last og funksjonelle analysen for Pd målretting i levende plante vev etter forbigående uttrykk for testet fusion proteiner. Merk at Agrobacterium-mediert forbigående uttrykk genererer data i en relativt kort tid, dvs, flere dager, i forhold til måneder kreves for produksjon av transgene planter som ofte brukes i lignende studier15.

Coexpression av proteinet rundt med subcellular lokalisering indikatorer, f.eksPDCB1 eller gratis DsRed2, vanligvis utføres fra en multigene uttrykk vektor. Imidlertid hvis overføring av flere uttrykk kassetter i en enkelt vektor er teknisk problematisk, coexpression kan gjøres ved å overføre hver kassett til en separat binær konstruksjon og kombinere tilsvarende mengder væske kulturer av de resulterende Agrobacterium stammer for agroinfiltration. Fordi denne protokollen utnytter forbigående uttrykk, trenger binære vektoren ikke bære markørene for stabil transformasjon, men deres tilstedeværelse ikke er skadelig for uttrykket effektiviteten.

Denne protokollen er optimalisert for protein uttrykk og målretting i N. benthamiana; men kan det brukes i andre plantearter, inkludert Arabidopsis45,46, mottakelig for genetisk transformasjonen av Agrobacterium. For andre plantearter, eller eventuelt ellers denne protokollen kan tilpasses å utnytte biolistic levering41 for forbigående uttrykket direkte fra pSAT-baserte vektorer, slik at du slipper å overføre uttrykk kassettene til binære vektorer.

Et kritisk punkt i denne protokollen er konsekvent fysiologiske og utviklingsmessige tilstanden av plantemateriale. Spesielt, alle planter må være sunn gjennom hele eksperimentet, og for agroinfiltration, N. benthamiana planter må være mindre enn 4 uker gamle og på 4-8-leaf scenen med største leaf som 4-6 cm i diameter. Hvis plantene er for ung, bli effekten av agroinfiltration for alvorlig, forstyrrer uttrykk og lokalisering av merket proteiner. På den annen side, utstilling eldre plantene ofte variabel arkitektur Pd24,25, også påvirke konsistensen av Pd målretting mønstre.

Likevel, på grunn av varierende fysiologiske forhold anlegget som helhet og transformert cellene spesielt, effektiviteten av Pd målretting i hvert eksperiment noe variere. Det er derfor viktig å analysere et relativt stort antall celler (> 100) per eksperimentet og utføre minst tre biologiske gjenskapninger av hvert eksperiment. Vanligvis vurdere vi et testet fragment skal inneholde Pd målretting aktivitet, hvis det utstillinger Pd lokalisering i minst 70% av transformert cellene. Forskjeller i Pd målretting effektiviteten til hver fragment, f.eks, prosent av transformert cellene viser Pd-spesifikke vises punctate akkumulering mønsteret, bør analyseres av Student t-test, og p-verdier < 0,05-0.01, tilsvarer den Statistisk sannsynlighet større enn 95-99%.

En annen viktig sak er plasseringen av fluorescerende tag/lasten i fusion molekylet. Noen Pd-målrettet proteiner også knytte til det endoplasmatiske retikulum (ER), og denne tilknytningen kreve uhindret amino-terminal sekvensen. I disse tilfellene, amino-terminal fusjoner, der carboxyl-terminus av protein fragment av interesse er smeltet til amino-endestasjonen til fluorescerende koden, bør f.eksCFP eller DsRed2, brukes. Denne standard plasseringen av koden kan endres i følgende tilfeller. (i) hvis amino-terminal fusjoner ikke kan brukes- dvsde ikke viser meningsfull subcellular lokalisering mønstre, uttrykkes dårlig eller ikke generere fluorescerende signal tilstrekkelig for pålitelig gjenkjennings- og hvis protein rundt inneholder ikke amino-terminal signal sekvenser eller carboxyl-terminal fusjoner som amino-terminus av testet fragment sammenblandes for å carboxyl-terminus av koden, de bør forsøkes. (ii) carboxyl-terminal fusjoner bør også brukes hvis protein rundt inneholder signal sekvenser på sin carboxyl-terminus. (iii) hvis protein rundt har begge amino - og carboxyl-terminal-signaler, som finnes i GPI-forankret proteiner, eller hvis det inneholder et amino-terminal signal peptid likevel sin amino-terminal fusjon er ikke brukbar, plasseres koden internt) enten nedstrøms av amino-terminal eller oppstrøms av carboxyl-terminal). Noen nyttige prosedyrer for interne fluorescerende merking av proteiner er beskrevet i våre tidligere publikasjoner47,48.

I dag finnes det ingen kjent konsensus sekvens for PLS. Slik (i trinn 5.2) anbefaler vi først subdividing protein i sammenhengende ~100-200 rester lange fragmenter. Disse kan da gjøres stadig kortere basert på observerte Pd målretting aktiviteten eller mangelen derav. Man bør være oppmerksom på andre potensielle målretting signaler i protein (f.eksNLS, signalet peptider, etc.). Potensielle overlappingen av slike sekvenser med PLS sekvenser er ukjent, bør imidlertid disse protein regionene inkluderes i denne mutational analysen.

Så langt ble denne protokollen brukt til å identifisere en enkelt PLS i protein molekyl21. Muligens kan et protein imidlertid inneholde flere signal sekvens; faktisk flere NLSs har blitt beskrevet i mange kjernefysiske proteiner, inkludert GATA transkripsjon faktorer49. Dermed når analyserer ulike fragmenter av testet protein for Pd målretting, er det mulig at flere slike fragment blir identifisert, indikerer tilstedeværelse av flere PLSs som kan opptre uavhengig eller synergi.

Den viktigste begrensningen av denne protokollen er at etter agroinfiltration, visualisering subcellular lokalisering av transiently uttrykt proteiner av interesse er best oppnås i epidermal celler og relativt smale vekst stadium. Når det er nødvendig, kan denne begrensningen overvinnes ved å produsere transgene planter som stabilt express hver av testet proteinene i de fleste av deres vev og celletyper. Også vil denne protokollen ikke være nyttig for studier av viral MPs eller andre Pd-målrettet proteiner som fungerer bare i plantearter som ikke er mottakelig for forbigående genetisk transformasjon.

Mens vi utviklet denne teknikken for identifikasjon av en PLS av TMV MP, kan den brukes for oppdagelsen av PLSs i noen annen plante viral MPs eller plante endogene proteiner som Lokaliser til Pd, transiently eller permanent. Videre, hvis kombinert med passende subcellular lokalisering markører47, denne protokollen er egnet for identifikasjon av mange andre målretting signaler i proteiner interesse planter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Vi sitert det meste oversiktsartikler av mangel på plass, og vi beklager til våre kolleger som originale arbeider ikke ble nevnt. Arbeidet i V.C. laboratorium støttes av tilskudd fra NIH, NSF, USDA/NIFA, BARD og BSF til V.C. og delefilter laboratoriet støttes av NIH og midler fra avdelinger av anlegget patologi og plante-mikrobe biologi til delefilter

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM5 Any CLSM with similar capabilities is appropriate
Zen software for confocal microscope imaging Zeiss 2009 version The software should be compatible with the CLSM used
Quickchange II site-directed mutagenesis kit  Agilent 200523
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406
MES Sigma-Aldrich 69892
Syringes without needles BD 309659
MgCl2 FisherScientific M33-500
Spectinomycin  Sigma-Aldrich S4014
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501
Ampicillin  Sigma-Aldrich A0166

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, J. Y. Plasmodesmata: a signaling hub at the cellular boundary. Curr. Opin. Plant Biol. 27, 133-140 (2015).
  2. Kumar, D., Kumar, R., Hyun, T. K., Kim, J. Cell-to-cell movement of viruses via plasmodesmata. J. Plant Res. 128, 37-47 (2015).
  3. Kitagawa, M., Paultre, D., Rademaker, H. Intercellular communication via plasmodesmata. New Phytol. 205, 970-972 (2015).
  4. Jackson, D. Plasmodesmata spread their influence. F1000Prime Rep. 7, 25 (2015).
  5. Brunkard, J. O., Runkel, A. M., Zambryski, P. C. The cytosol must flow: intercellular transport through plasmodesmata. Curr. Opin. Cell Biol. 35, 13-20 (2015).
  6. Yadav, S. R., Yan, D., Sevilem, I., Helariutta, Y. Plasmodesmata-mediated intercellular signaling during plant growth and development. Front. Plant Sci. 5, 44 (2014).
  7. Sager, R., Lee, J. Y. Plasmodesmata in integrated cell signaling: insights from development and environmental signals and stresses. J. Exp. Bot. 65, 6337-6358 (2014).
  8. Jans, D. A., Xiao, C. Y., Lam, M. H. Nuclear targeting signal recognition: a key control point in nuclear transport? BioEssays. 22, 532-544 (2000).
  9. Miyamoto, Y., et al. Different modes of nuclear localization signal (NLS) recognition by three distinct classes of NLS receptors. J. Biol. Chem. 272, 26375-26381 (1997).
  10. Nair, R., Carter, P., Rost, B. NLSdb: database of nuclear localization signals. Nucleic Acids Res. 31, 397-399 (2003).
  11. Lee, J. Y., Yoo, B. C., Lucas, W. J. Parallels between nuclear-pore and plasmodesmal trafficking of information molecules. Planta. 210, 177-187 (2000).
  12. Kim, J. Y., Rim, Y., Wang, J., Jackson, D. A novel cell-to-cell trafficking assay indicates that the KNOX homeodomain is necessary and sufficient for intercellular protein and mRNA trafficking. Genes Dev. 19, 788-793 (2005).
  13. Lucas, W. J., et al. Selective trafficking of KNOTTED1 homeodomain protein and its mRNA through plasmodesmata. Science. 270, 1980-1983 (1995).
  14. Chen, H., Jackson, D., Kim, J. Y. Identification of evolutionarily conserved amino acid residues in homeodomain of KNOX proteins for intercellular trafficking. Plant Signal. Behav. 9, e28355 (2014).
  15. Chen, H., Ahmad, M., Rim, Y., Lucas, W. J., Kim, J. Y. Evolutionary and molecular analysis of Dof transcription factors identified a conserved motif for intercellular protein trafficking. New Phytol. 198, 1250-1260 (2013).
  16. Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLOS Biol. 6, e7 (2008).
  17. Zavaliev, R., Dong, X., Epel, B. L. Glycosylphosphatidylinositol (GPI) modification serves as a primary plasmodesmal targeting signal. Plant Physiol. 172, 1061-1073 (2016).
  18. Sasaki, N., Park, J. W., Maule, A. J., Nelson, R. S. The cysteine-histidine-rich region of the movement protein of Cucumber mosaic virus contributes to plasmodesmal targeting, zinc binding and pathogenesis. Virology. 349, 396-408 (2006).
  19. Kaido, M., Funatsu, N., Tsuno, Y., Mise, K., Okuno, T. Viral cell-to-cell movement requires formation of cortical punctate structures containing Red clover necrotic mosaic virus movement protein. Virology. 413, 205-215 (2011).
  20. Creager, A. N. H., Scholthof, K. B. G., Citovsky, V., Scholthof, H. B. Tobacco mosaic virus: pioneering research for a century. Plant Cell. 11, 301-308 (1999).
  21. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell movement protein. mBio. 7, e02052-e02015 (2016).
  22. Ueki, S., Citovsky, V. To gate, or not to gate: regulatory mechanisms for intercellular protein transport and virus movement in plants. Mol. Plant. 4, 782-793 (2011).
  23. Simpson, C., Thomas, C. L., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. Plant Cell. 21, 581-594 (2009).
  24. Maule, A. J. Plasmodesmata: structure, function and biogenesis. Curr. Opin. Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
  25. Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
  26. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
  27. Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: probing Nicotiana benthamiana-virus interactions. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 740-750 (2007).
  28. Chung, S. M., Frankman, E. L., Tzfira, T. A versatile vector system for multiple gene expression in plants. Trends Plant Sci. 10, 357-361 (2005).
  29. Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
  30. Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
  31. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
  32. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Mol. Biol. Rep. 15, (3), 219-235 (1997).
  33. Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 42, (3D), 1-7 (2016).
  34. Kapila, J., De Rycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. 101-108 (1997).
  35. Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
  36. Boyko, V., Ferralli, J., Ashby, J., Schellenbaum, P., Heinlein, M. Function of microtubules in intercellular transport of plant virus RNA. Nat. Cell Biol. 2, 826-832 (2000).
  37. Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
  38. Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Santa-Cruz, S., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Gating of epidermal plasmodesmata is restricted to the leading edge of expanding infection sites of tobacco mosaic virus (TMV). Plant J. 12, 781-789 (1997).
  39. Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
  40. Kotlizky, G., et al. A dysfunctional movement protein of Tobacco mosaic virus interferes with targeting of wild-type movement protein to microtubules. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 895-904 (2001).
  41. Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat. Protoc. 4, 71-77 (2009).
  42. Giesman-Cookmeyer, D., Lommel, S. A. Alanine scanning mutagenesis of a plant virus movement protein identifies three functional domains. Plant Cell. 5, 973-982 (1993).
  43. Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley-Interscience. New York. (1987).
  44. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit. Rev. Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
  45. Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods Mol. Biol. 323, 225-229 (2006).
  46. Burch-Smith, T. M., Schiff, M., Liu, Y., Dinesh-Kumar, S. P. Efficient virus-induced gene silencing in Arabidopsis. Plant Physiol. 142, 21-27 (2006).
  47. Tian, G. W., et al. High-throughput fluorescent tagging of full-length Arabidopsis gene products in planta. Plant Physiol. 135, 25-38 (2004).
  48. Tian, G. W., Chen, M. H., Zaltsman, A., Citovsky, V. A pollen-specific pectin methylesterase involved in pollen tube growth. Dev. Biol. 294, 83-91 (2006).
  49. Hunter, C. C., et al. Multiple nuclear localization signals mediate nuclear localization of the GATA transcription factor AreA. Eukaryot. Cell. 13, 527-538 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics