를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석 * These authors contributed equally

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., Schneider-Hohendorf, T., Schwab, N., Wiendl, H., Gross, C. C. Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (122), e55390, doi:10.3791/55390 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

중추 신경계 (CNS)에 넘쳐 림프구는 면역 감시 중요하다. 림프구의 혈관 외 유출의 질병 관련 변경은 CNS의 병태 생리 학적 변화 될 수 있습니다. 따라서, CNS에 림프구 이동의 조사 염증성 CNS 질환을 이해하고 새로운 치료 방법을 개발하는 것이 중요하다. 여기에서 우리는 림프구의 혈관 외 유출을 연구하는 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 체외 모델을 제시한다. 인간 뇌 미세 혈관 내피 세포 (HBMEC)는 confluently 혈액 - 뇌 장벽의 내피를 모방 삽입 트랜스 웰 다공성 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 상에 성장된다. 배리어 기능 zonula occludens 면역, transendothelial 전기 저항 (티이)의 측정뿐만 아니라, 에반스 블루 투과 분석에 의해 확인된다. NK 세포를 -이 모델은 / 어두워 CD56 밝은 CD16으로 드문 림프구 아형의 diapedesis의 조사를 할 수 있습니다. Furtherm철광석, 다른 세포, 사이토 카인 및 케모카인, 질병과 관련된 변경, 및 림프구의 이동성에 대한 구별 능력 치료법의 효과를 연구 할 수있다. 마지막으로, 내피 장벽의 염증성 자극의 영향뿐만 아니라, 다른 치료법이 분석 될 수있다.

Introduction

조직에 혈액에서 림프구 마이그레이션은 면역 감시 중요하다. 특정 분자 상호 작용의 시퀀스는 소장, 피부, 림프절, 중추 신경계 (CNS), 및 기타 조직으로 부위 특이 적 혈관 외 유출을 보장한다. 림프구 이동에 변화가 넓은 확산 질환이 다수의 병태 생리에 참여하고 있습니다. 면역 특권 CNS로 마이그레이션 단단히 통제 목적에 따라이 프로세스의 변화는 뇌척수염 3, 시신경 척수염, 뇌졸중, 및 다발성 경화증 (MS) 2, 4, 5, 6, 7과 같은 CNS 관련 질환에 관여한다. 따라서 더 나은 질병의 병태 생리를 이해하고 도구를 개발하는 림프구의 혈관 외 유출을 연구하는 것이 중요하다 질병 부담이 8, 9, 10, 11, 12의 간척.

림프구는 별개의 경로를 통해 중추 신경계로 이동한다. 혈액 - 뇌 장벽 맥락총 내의 전역 혈액 - 뇌척수액 장벽을 통해 거미 막밑 공간에 모세관 세정맥을 통한 혈관 외 유출 1, 13, 14, 15가 설명되었다. 뇌 혈관 장벽을 통과 마이그레이션은 내피 세포 (14)와 림프구의 상호 작용에 의해 수행된다. 주변부에서 내피 세포는 대조적으로, CNS의 내피 세포함으로써 엄격 혈액 - 뇌 장벽을 횡단 할 수있는 세포와 단백질의 양을 제한하는 단단한 접합부 분자의 높은 발현 양아가씨 = "외부 참조"> 16. 단단히 접합 염증 완화 결과 및 부착 분자의 발현을 유도한다; 따라서, CNS 1, 17, 18로 림프구 이동을 향상.

혈액 - 뇌 장벽을 통해 혈관 외로 유출 다단계 과정이다. 내피 세포 테더 림프구 다음 주로 셀렉틴 1 (15)에 의해 매개되는 과정에서 내피 굴러. 이어서, 림프구상에서 발현 내피 세포에 의해 분비 케모카인 및 각각의 케모카인 수용체 간의 상호 작용함으로써 내피 세포를 1 밀착성을 촉진 인테그린의 구조적 변화를 유도한다. 마지막으로, 혈관 주위 공간으로 transmigrating 전에 혈액의 흐름에 대한 내피 장벽을 따라 하나 크롤링을 림프구, 즉시 직접 기어 박스 실속확고한 부착 1, 19, 20의 사이트 igrate. 림프구의 혈관 외 유출의 이러한 모든 단계는 별개의 기술 (21)를 사용하여 체외에서 분석 할 수 있습니다. 시간 경과 비디오 현미경은 초기 테 더링 및 15 롤링을 연구하는 데 사용됩니다. 접착 분석은 장벽 (22) 내피 회사 체포에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 여기에서 입증 된 바와 같이 윤회 분석은 면역 세포 윤회 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29의 분석을 허용한다.

체외 혈액 뇌 장벽 모델에서 인간을 사용하여, 우리는 더 높은 마이그레이션 백분율이 보여 최근 수CD56 밝은 CD16의 atory 용량 / 어두워 - NK 세포 CD16 + 대조 물이 막내 실 21이 NK 세포 서브 세트의 우세에 의해 반사 된 희미한들은 CD56에 비해. 따라서, 우리의 실험 장치는 생체 내 상황을 모방하기에 적합한 것 같다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 셀 인간의 뇌 미세 혈관 내피 세포의 문화 (HBMEC)

  1. 세포 배양 플라스크의 코팅
    1. 상기 피브로넥틴 용액을 제조 15 mL의 원심 분리 튜브에 10 ㎖의 PBS를 추가한다. 150 μL의 피브로넥틴을 넣고 잘 섞는다.
    2. 바닥을 덮는 T-25 세포 배양 물 플라스크 피브로넥틴 용액 2 mL를 넣고. 배양기에서 37 ℃에서 적어도 3 시간 동안 세포 배양 플라스크를 인큐베이션. 피브로넥틴 코팅 된 플라스크를 37 ℃ / 5 % CO 2에서 2 주 동안 저장 될 수있다.
  2. 시드와 HBMEC의 세포 배양
    1. 세포 배양 플라스크의 바닥에서 대기음 피브로넥틴 용액. 6 mL의 ECM-B 배지에 현탁하고 7.2 × 104 HBMEC / cm² 이상 추가 (= ECM-B는 5 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 1 %의 내피 세포 성장 보충 보충). 37 ° C / 5 % CO 2에서 인큐베이션. 현미경을 사용하여 매일 세포의 성장을 확인하십시오.
    2. 3 일마다 매체를 변경합니다.수확 또는 HBMEC 약 80 %의 합류에 도달 분할 세포. HBMEC 생리적 특성의 손실을 방지하기 위해 통로 (1) 및 (15) 사이에 사용한다.
  3. 수확 HBMEC.
    1. 1의 비율로 PBS로 accutase (1X)를 혼합하여 용액을 제조 accutase 1. 추가 사용까지 수욕에서 37 ° C에서 accutase 솔루션을 유지합니다.
    2. 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포 배양 플라스크에서 ECM-B의 매체에 옮긴다. 세포 배양 플라스크의 바닥에 5 ㎖의 PBS를 추가하여 HBMEC 씻는다. 대기음 PBS 및 세척 단계를 두 번 더 반복한다.
    3. 2ml의 accutase의 미리 가온 용액을 첨가. 2 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션. 그 후, HBMEC 단단히 세포 배양 플라스크을 여러 번 눌러 다시 일시 중지됩니다. 세포 분리는 현미경을 사용하여 제어
    4. 이전에 15 ㎖의 튜브에 저장된 ECM-B 매체 빨리 HBMEC을 분리하기 시작 다시 세포 배양 플라스크에 첨가한다. 대부분의 HBMEC이 될 때까지 반복 플라스크의 바닥을 씻어다시 중단.
    5. 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송. 실온에서 10 분 동안 300 XG 원심 분리기. 상등액을 버리고 1 mL의 ECM-B 배지에서 세포를 다시 일시. 세포를 세어 용액 ECM-B 배지 당 3 × 105 HBMEC의 최종 농도를 달성하기 위해 세포 현탁액을 희석.

셀 문화 삽입 2. 준비

  1. 세포 배양 삽입의 코팅
    중요 사항 : 세포 배양 삽입의 막을 만지지 마십시오.
    1. 각 세포 배양 용 삽입 100 μL의 피브로넥틴 용액 (1.1.1 참조) (도 1a)와 96- 웰 편평 바닥 플레이트의 한 웰 (광 제어 웰)를 추가한다. 37 ℃에서 적어도 3 시간 동안 배양. 배양 대기음 피브로넥틴 솔루션 후.
    2. 100 μL HBMEC의 세포 배양 삽입 정학 잘 광학 컨트롤을 추가합니다. 셀의 하부 구획에 600 μL ECM-B 매체 추가문화 삽입합니다. 37 ° C / 5 배리어 무결성 (도 1b)까지의 CO 2 %에 도달시 사일 아니라 광 제어에 HBMEC 현미경 평가하여 세포 성장을 확인 - 3 부화. 참고 : 사일 이상 세포 성장은하지 않는 것이 좋습니다.
    3. 선택적 : 염증 상태를 모방하는 하부 구획의 매체를 흡인하고 24 시간 마이그레이션 분석 전에 500 U / ㎖의 IFN-γ / TNF-α 보충 ECM-B 배지로 교체한다.

윤회의 분석의 날에 에반스 블루 3. 품질 관리

  1. 에반스 블루 용액의 제조
    1. 15 ML의 원심 분리기 튜브를 사용하여 200 μL의 B27 보충제와 PBS / B27 솔루션 믹스 10 mL의 PBS를 준비합니다. 에반스 블루 원액을 희석 (20 ㎎ / ㎖ PBS) 1 : PBS / B27 1,000.
  2. 에반스 블루 투과성 분석
    1. 상부 구획이어서 하부 구획에서 매체 기음합류 HBMEC 단층을 함유 한 세포 배양 인서트. 세포 배양 삽입에 100 μL 에반스 블루 솔루션을 추가합니다.
    2. 상기 하부 구획에 600 μL PBS / B27을 추가하고, 37 ℃ / 5 % CO 2에서 60 분 동안 배양한다. 조심스럽게 집게를 사용하여 세포 배양 삽입을 제거합니다.
  3. 에반스 블루 측정
    1. 상기 하부 구획에서 PBS / B27를 제거하고 블랙 폴리스티렌 96- 웰 평면 바닥 플레이트의 웰에 두 100 μL를 각각 전송. 테칸 무한 M200 프로 플레이트 리더로 플레이트를 삽입하고, Z 최적의 위치를 ​​결정한다.
    2. (예 : 여기 620 nm의 방출 : 680 nm의 여기 대역 : 9 nm의 발광 대역 : 20 ㎚, 175x를 향상 25 개 깜박 통합 시간 : 20 μS) 에반스 블루 이용한 각 설정의 기준 여기.
    3. HBMEC 장벽 기능이 씨앗 후 다른 시간 지점에서 HBMEC를 통해 에반스 블루 침투를 묘사 한 표준 곡선에 수집 된 데이터를 비교할 확인하려면보내고 셀 (우측도 1b).

4. 마이그레이션 분석

  1. 말초 혈 단핵 세포 (PBMC) 제조.
    1. 15 ML의 원심 분리기 튜브에 10 mL의 RPMI를 추가하고 200 μL B27 보충제를 추가합니다. 5 분 동안 300 XG에 PBMC 세포를 원심 분리를 계산. 5 × 106 세포 / ml로 RPMI / B27 최종 농도 PBMC를 다시 일시.
  2. 마이그레이션 분석의 설정
    1. 합류 HBMEC 단층 (도 1a)을 함유하는 세포 배양 물 삽입물의 상부 구획이어서 하부 구획에서 대기음 매체. 도너 단위 당 24 웰 플레이트의 한 웰 (시험관 제어)를 또한 세포 배양 인서트 100 μL PBMC 현탁액을 각각 추가하고.
    2. 체외 제어 PBMC에 세포 배양 용 삽입 500 μL의 하부 구획에 600 μL RPMI / B27을 추가하고, 37 ℃ / 5 % CO 2에서 6 시간 동안 배양한다.
    3. 마이그레이션 된 PBMC의 수확
      1. 집게를 사용하여 세포 배양 삽입을 꺼내 조심스럽게 멤브레인을 건드리지 않고 400 μL PBS와 바닥을 씻어. 세포 배양 삽입을 폐기하십시오.
      2. 20 μL 유동 카운트 fluorospheres 추가 세포 배양의 하부 구획 (약 1,000 비즈 / μL)의 시험 관내 제어뿐만 아니라 넣고 잘 섞는다. 튜브 유동 세포 계측법 PBMC 현탁액을 수득 한 용액의 전송.

    5. 유동 세포 계측법

    1. 샘플 준비
      1. 실온에서 5 분 동안 원심 분리기 (300) XG PBMC.
      2. 100 μL에 형광 색소 - 컨쥬 게이트 항체를 첨가하여 항체 용액을 제조는 샘플 당 (PBS / 1 % BSA / 2 mM의 EDTA) 버퍼 유동 세포 계측법. 1 μL CD4-FITC 아래 제시된 결과, 1-μLCD3를 PerCP / Cy5.5, 1 μL CD56-PC7 1 μL CD8-A700, 1 μL CD16-A750은 샘플 당 사용되었다.
      3. PB를 다시 중단항체 용액 100 μL의 MC 및 4 ° C에서 30 분 동안 배양한다.
      4. 250 μL를 5 분 동안 300 XG에 버퍼 원심 유동 세포 계측법에 추가.
    2. 샘플 획득
      1. 필요한 양의 PBMC를 일시 중지 다시 버퍼의 유동 세포 계측법 (사용 사이토 흐름에 따라 다름).
      2. 유동 계수 fluorospheres를 검출 (525) 및 700 nm 파장 간의 활성 검출기 플로우 사이토 미터를 사용하여 염색 PBMC 획득 (여기 488 nm의 발광 525 - 700 ㎚).
        (다음 단계 Kaluza G 소프트웨어 동작 사이토 Gallios 흐름이 사용되는 경우의 예이다 :. (1) 컴퓨터를 시작할 작동 시스템이 완전히 로딩 될 때 (2) 버튼 "을 사이토의"를 누름으로써 플로우 사이토 시작할 . (3) "오픈 프로토콜"버튼을 누름으로써 각각 획득 프로토콜로드. (4)에 필요한 프로토콜을 선택하고 "열기"를 선택한다. (5)과 우측 클릭하여 각 시료에 대한 프로토콜 중복가상 회전 목마 "중복"필드에 왼쪽 클릭에 표시 프로토콜에 마우스 버튼을 클릭합니다. (6) 샘플에서의 각각의 샘플에 라벨. (7) 슬라이드 쇼의 표시 위치에 샘플을 전송 및 획득을 시작한다.)
    3. 샘플 분석
      1. 각각의 소프트웨어를 사용하여 데이터 흐름 계측법 열기 결과. 체외 대조군 웰의 PBMC transmigrated 대한 관심뿐만 아니라 세포 개체군의 수를 결정하고, 각 분석 소프트웨어를 사용하여 카운트 fluorospheres 흐름.
        (게이팅 전략의 예 (도 께 결과 1C가 주어진다 : 전방 산란 채널 (FSC) 플롯 대 측방 산란 채널 (SSC)에서 림프구를 선택 우선, NK 세포 서브 세트의 윤회를 분석 림프구이다. 다음 CD56 플롯 대 CD3 및 CD56 + CD3 표시 -. NK 세포가 선택 NK 세포의 부분 집합을 구별하는, NK 세포에 표시되는CD56 CD16 CD56 대 플롯 및 밝은 CD16 / 어둡게 -뿐만 아니라 CD56 + CD16 희미 NK 세포가 선택된다. 또한, 유동 계수 fluorospheres 그들의 수를 결정하는 시간에 대한 525 내지 700 nm의 사이에 발광 갖는 채널의 그래프에 표시된 후속 FSC 대 SSC 플롯으로부터 선택된다.)
      2. 각 샘플의 총 세포 수를 계산하기 위해, 유량 계수를 사용 fluorospheres 세포의 검출 수를 정규화 :
        방정식
      3. 이전 총 세포와 시험 관내 제어 총 셀 간의 비율로서 이전 셀의 비율을 결정한다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NK 세포 및 인간 혈액 - 뇌 장벽 모델 (도 1A)를 사용하여 T 세포의 서브 세트 윤회를 나타내는 대표적인 결과를 나타낸다. HBMEC 단층의 무결성은 단단히 접합 분자 ZO-1, transendothelial 전기 저항 (티이) 측정 및 에반스 블루 투과 (도 1b)의 염색에 의해 확인 하였다. 다음 3 - 사일 배양 HBMEC가 꽉 접합 분자 ZO-1 (왼쪽 그림 1B 등)를 표시했다. 또한 HBMEC (오른쪽,도 1b) 에반스 청색 transendothelial 전기 저항 (도 1b의 중앙)뿐만 아니라 감소 된 투과성을 나타내는 단층으로 성장했다. 및 CD56는 CD4 +와 CD8 + T 두 전직 등의 세포를 포함 CD16 + NK 세포 하위 집합 및 T 세포를 어둡게 - HBMEC의 단일 층은 CD56 밝은 CD16가 / 어두워을 포함하여 NK 세포의 윤회를 연구하는 데 사용되었다amples (각각도 1d + E). 이주 된 세포의 비율은 내부 제어 (도 1C)로 유세포 정규화하여 유량 계수 fluorospheres 의해 얻어지는 세포 수에 기초하여 산출 하였다. HBMEC 단층은 염증 상태를 모방하기 전에 분석 IFN-γ 및 TNF-α 24 시간에 자극 하였다. 사이토 카인 자극은 분석 된 모든 림프구 집단의 증가 된 이동의 결과. 이 때문에 ICAM-1을 포함한 부착 분자의 발현 증가에있을 (데이터는 보이지 않음). CD56 밝은 CD16은 / 희미 - 그들의 CD56에 비해 NK 세포는 높은 이동성 용량을 나타내 자극 모두 비자극 (10.88 % 0.86 %) 및 IFN-γγ / TNF-α를 통해 CD16 + NK 희미 (18.22 % 2.94 %) HBMEC (그림 1D). 그러나, 염증의 결과로서 윤회의 상대적 증가는 CD16 + CD56 희미 높았다 밝은 CD16 + 대한 3백42퍼센트 + 1백67%은 / 어두워 -). 이러한 결과는 CD56 밝은 CD16 / 어둡게하는 생체 관측 모방 - NK 세포 막내 구획에서 농축된다. 따라서, 혈액 - 뇌 장벽 모델은 CNS (21)에 드문 림프구 인구의 면역 세포 diapedesis의 기본 원리를 분석하기에 적합한 것 같다. 마지막으로, CD4 및 CD8 T 세포의 서브 세트 transmigratory 용량 (도 1E) 도시되어있다.

그림 1
그림 1 : Uninflamed 및 염증 HBMEC 단일 층에서 NK 세포 하위 집합의 차동 마이그레이션. A. 트랜스 웰 인서트 (왼쪽)과 실험 장치 (오른쪽)의 그림의 그림. HBMEC 장벽 기능의 B. 검증. 왼쪽 : 꽉 접합 몰의 면역 조직 화학 염색ecule ZO-1 토끼 항 인간 ZO-1 (압캠, 1 : 200)을 사용하여 3 일 동안 배양 HBMEC의 항 - 토끼 IgG를-Cy3가 (3001) 및 염소. 센터 : 하루 2 배양 4 일 사이 HBMEC의 transendothelial 전기 저항 (티이). 오른쪽 : 함께 ( "염증"적색) 또는없이 ( "uninflamed"검정)과 자극 HBMEC 에반스 블루에 대한 투과에 대한 표준 곡선 500 U / ㎖의 IFN-γ 및 24 시간 TNF-α. 96시간 HBMEC (흑색 화살표)에 파종 후 - 윤회 세이 72 행한다. CE. 프로토콜 절에서 설명한 바와 같이 16 건강한 사람 유래의 PBMC 마이그레이션 분석을 실시 하였다. 분석에 앞서 24 시간은 세포 배양 인서트 절반으로 자극 하였다 500 IU / ㎖의 IFN-γ 및 TNF-α. Transmigrated 세포는 수확 및 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. PBMC에 대한 주제 C. 결과도 관내 제어 (위)로부터 uninflamed HBMEC (하단)에 걸쳐 이송 후 구했다. NK의 CEL / 어두워 CD56 + 세포 및 CD56 밝은 CD16에 상기 고유 - - ( "CD56 밝은")과 CD56 + CD16 ( "CD56 희미") NK 세포 서브셋 LS 총 CD3와 같은 림프구에서 게이팅 하였다. 흐름 카운트 fluorospheres는 ( "구슬") FSC / SSC 특성에 따라 문되었고, 그 수는 시간 플롯 대 FL3에서 산출 된 것입니다. 예시적인 계산은 오른쪽에 표시되는 이전 CD56 밝은 CD56 희미 NK 세포의 비율을 결정한다. 이전 NK 세포 D. 백분율뿐만 아니라 CD56 밝은 CD56 희미 NK 세포의 서브 세트, 및 CD4 + 및 uninflamed (블랙)에 걸쳐 윤회이나 염증 (적색) 다음 CD8 + T 세포의 서브 세트를 포함 마이그레이션 T 세포 E. 백분율 HBMEC는 SEM ± 평균으로 묘사했다. P - 값 쌍의 학생 t 테스트에 의해 산출 하였다; ** p <0.01, *** p <0.001./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55390/55390fig1large.jpg "target ="_ blank "> 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

여기서 우리는 인간의 혈액 - 뇌 장벽에 걸쳐 림프구의 윤회를 조사하기 위해 기술을 제시한다. 중추 신경계에 림프구 이동의 체외 분석에서 림프구의 혈관 외 유출, 잠재적 인 질병 관련 변경 및 새로운 치료 방법의 기본 프로세스를 연구하는 것이 중요하다.

혈액 - 뇌 장벽 모델의 몇 가지 수정이 가능합니다. 예를 들어, 상기 상부 구획으로부터 세포 이주되지 않은 세포 집단의 조성을 조사하기 위해 분석 될 수있다. 또한, 24 시간 전에 분석에 IFN-γ 및 TNF-α와 HBMEC 단층 치료 염증성 CNS 장애, 21, 25의 효과를 연구하기 위해 염증이 혈액 - 뇌 장벽을 모방하는데 사용될 수있다. 마찬가지로, 다른 물질과 HBMEC 또는 림프구의 치료는 림프구의 혈관 외 유출에 미치는 영향을 조사 할 수 있습니다 (예를 들어 자신을부착 분자에 대한 효과) (30), (31). 특정 유착 분자의 참여는 인테그린 또는 그들의 리간드에 대한 차단 항체 (32)를 이용하여 연구 될 수있다. 또한, 여기에 제시된 실험 구성은 케모카인 또는 아스트로 또는 다른 셀 (33), (34) 유래의 상청액에서 화성 효과를 분석 할 수있다. 일차 인간 뇌 유래 된 상피 세포의 교체 HBMEC 혈액 - 뇌척수액 장벽 (15)의 조사를 본 실험 장치의 스펙트럼을 넓힌다. HBMEC는 모델 CNS 특이성을 유지하기 위해 다른 기관으로부터 유래 된 불멸화 세포 또는 내피 세포를 대체해서는 안된다. 그러나 다른 종에서 뇌 유래 내피 세포는 각각의 동물 (35)에 윤회를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 레티노 산 또는 히드ocortisone 장벽 기능을 높이기 위해 설명되었고, 따라서, (37) (36)을 채용 할 수있다. 우리의 모델은 PBMC (데이터 미도시) 10 6 × 5 × 10 2 내지 1 선형 회수율을 제공하기 때문에 한정된 세포 수의 경우에, 분석 대상 세포의 양이 감소 될 수있다. 윤회 다음과 같은 희귀 한 세포 집단을 분석하기는 유동 세포 계측법에 필요한 충분한 세포를 얻기 위해 여러 우물에서 풀 세포에해야 할 수도 있습니다. 마지막으로, 우리의 실험 장치는 또한 CNS (38)에 약물 전달을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 0.4 ㎛의 세공 크기 림프구 윤회 방지하지만, 약물 투여 39, 40, 41, 42을 연구 할 수있는 반면 3 ㎛의 공극 크기는 전형적으로, 림프구 윤회을 허용하기 위해 사용된다.

43에서 혈액 - 뇌 장벽의 무결성의 입증 평가로서 HBMEC 단층의 질 합류 현미경 평가뿐만 아니라, 에반스 블루 투과에 의해 분석 될 수있다. 낮은 g의 힘과 초기 구절의 사용에 HBMEC의 원심 분리 (즉,

여기에 설명 된 프로토콜을 준수 의미하고 재현 가능한 결과를 보장하지만,이 기술은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 우선, 생체 내 혈액 - 뇌 장벽을 다양한 방식으로 상호 작용하고 단단한 접합부 (1)의 형성에 영향을 미치는하여 보호막 기능을 강화 세포들에 의해 형성된다. 이 혈액 - 뇌 장벽 모델은 생체 내 상황의 좋은 근사하지만 따라서 중요한 측면이 누락되었습니다. 또한, 혈액 - 뇌 장벽을 가로 질러 CNS 내로 넘쳐 림프구는 다단계 프로세스이다. 각 단일 단계는 별도로 조사 할 수 있지만, 여기에 제시된 기술은 사람에 대한 정보를 제공하지 않습니다전단력 2, 44, 45, 46의 영향 혈관 외 유출의 제작 방법. 세포의 보통 한 자리 주파수가 윤회 때문에 마지막으로, PBMC에서 마이그레이션 세포의 분석, 관심있는 세포의 빈도에 따라 어려울 수 있습니다. 따라서, 이전의 여러 세포 배양 삽입을 통해 마이그레이션 세포의 분석 또는 풀링에 관심있는 인구의 분리는해야 할 수도 있습니다. 중추 신경계에 백혈구 이동의 분석을위한 다른 모델은 우리의 모델에서 누락 측면의 일부를 커버한다. 성상 세포, 혈관 주위 세포 및 / 또는 신경 세포와 공동 배양은 혈액 - 뇌 장벽 47 더 나은의 복잡성을 모방하는 데 사용됩니다. 같은 DIV-BBB로 전단력을 포함한 모델 림프구 diapedesis (48)의보다 정교한 분석을 가능하게하여, 더 생리적 조건을 반영한다. 요약하면, 우리는 인간의 혈액 - 뇌 장벽에 걸쳐 정성 및 정량 림프구 diapedesis의 조사에 적합한 쉽게 접근 할 수있는 방법을 제시한다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Gibco 14190-094 without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1 mg/mL Sigma F1141-5MG from bovine plasma
T-25 cell culture flask Greiner BioOne 690160
HBMEC ScienCell 1000
Pelobiotech PB-H-6023
Accutase Sigma A6964-100ML
ECM-b ScienCell 1001-b
FBS ScienCell 1001-b
Penicillin/Streptomycin ScienCell 1001-b
Endothelial cell growth supplement ScienCell 1001-b
Transwell Corning 3472 clear, 6.5 mm diameter, 3.0 µm pore size
96-well flat bottom plate Corning 3596
Evans blue Sigma E2129-10G stock solution: 1 g/50 mL PBS
B27 Gibco 17504-044 50x concentrated
Infinite M200Pro Tecan
96-well black flat bottom plate Greiner BioOne 675086
48-well plate Corning 3526
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Flow Count Fluorospheres Beckman Coulter 7547053
Na-EDTA Sigma E5134
BSA Sigma A2153
Gallios 10-color flow cytometer Beckman Coulter
Kaluza 1.5a Beckman Coulter
TNF-α Peprotech 300-01A
IFN-γ Peprotech 300-02
CD3-PerCP/Cy5.5 Biolegend 300430 clone UCHT1
CD56-PC7 Beckman Coulter A21692 clone N901
CD16-A750 Beckman Coulter A66330 clone 3G8
CD4-FITC Biolegend 300506 clone RPA-T4
CD8-A700 Beckman Coulter A66332 clone B9.11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ransohoff, R. M., Kivisakk, P., Kidd, G. Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system. Nat Rev Immunol. 3, (7), 569-581 (2003).
  2. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  3. Furtado, G. C., et al. A novel model of demyelinating encephalomyelitis induced by monocytes and dendritic cells. J Immunol. 177, (10), 6871-6879 (2006).
  4. Ransohoff, R. M. Illuminating neuromyelitis optica pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (4), 1001-1002 (2012).
  5. Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68, (5), 311-323 (2002).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochim Biophys Acta. 1862, (3), 461-471 (2016).
  7. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier, chemokines and multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812, (2), 220-230 (2011).
  8. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Kieseier, B. C., Wiendl, H. Immunotherapeutic approaches in MS: update on pathophysiology and emerging agents or strategies 2006. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 7, (1), 35-63 (2007).
  9. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Stuve, O., Kieseier, B., Wiendl, H. Multiple sclerosis therapy: an update on recently finished trials. J Neurol. 254, (11), 1473-1490 (2007).
  10. Wiendl, H., Hohlfeld, R. Multiple sclerosis therapeutics: unexpected outcomes clouding undisputed successes. Neurology. 72, (11), 1008-1015 (2009).
  11. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Breuer, J., Posevitz-Fejfar, A., Wiendl, H. JCV index and L-selectin for natalizumab-associated PML risk stratification. Journal of Neuroimmunology. 275, (1-2), 24 (2014).
  12. Schwab, N., et al. L-selectin is a possible biomarker for individual PML risk in natalizumab-treated MS patients. Neurology. 81, (10), 865-871 (2013).
  13. Takeshita, Y., Ransohoff, R. M. Inflammatory cell trafficking across the blood-brain barrier: chemokine regulation and in vitro models. Immunol Rev. 248, (1), 228-239 (2012).
  14. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Wiendl, H. Trafficking of lymphocytes into the CNS. Oncotarget. 6, (20), 17863-17864 (2015).
  15. Schneider-Hohendorf, T., et al. VLA-4 blockade promotes differential routes into human CNS involving PSGL-1 rolling of T cells and MCAM-adhesion of TH17 cells. J Exp Med. 211, (9), 1833-1846 (2014).
  16. Girard, J. P., Springer, T. A. High endothelial venules (HEVs): specialized endothelium for lymphocyte migration. Immunol Today. 16, (9), 449-457 (1995).
  17. Brown, D. A., Sawchenko, P. E. Time course and distribution of inflammatory and neurodegenerative events suggest structural bases for the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Comp Neurol. 502, (2), 236-260 (2007).
  18. Alvarez, J. I., Cayrol, R., Prat, A. Disruption of central nervous system barriers in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812, (2), 252-264 (2011).
  19. Rudolph, H., et al. Postarrest stalling rather than crawling favors CD8+ over CD4+ T-cell migration across the blood-brain barrier under flow in vitro. Eur J Immunol. (2016).
  20. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, (7269), 94-98 (2009).
  21. Gross, C. C., et al. Impaired NK-mediated regulation of T-cell activity in multiple sclerosis is reconstituted by IL-2 receptor modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (21), E2973-E2982 (2016).
  22. Gross, C. C., Brzostowski, J. A., Liu, D. F., Long, E. O. Tethering of Intercellular Adhesion Molecule on Target Cells Is Required for LFA-1-Dependent NK Cell Adhesion and Granule Polarization. Journal of Immunology. 185, (5), 2918-2926 (2010).
  23. Grutzke, B., et al. Fingolimod treatment promotes regulatory phenotype and function of B cells. Ann Clin Transl Neurol. 2, (2), 119-130 (2015).
  24. Gobel, K., et al. Blockade of the kinin receptor B1 protects from autoimmune CNS disease by reducing leukocyte trafficking. J Autoimmun. 36, (2), 106-114 (2011).
  25. Schneider-Hohendorf, T., et al. Regulatory T cells exhibit enhanced migratory characteristics, a feature impaired in patients with multiple sclerosis. Eur J Immunol. 40, (12), 3581-3590 (2010).
  26. Huang, Y. H., et al. Specific central nervous system recruitment of HLA-G(+) regulatory T cells in multiple sclerosis. Ann Neurol. 66, (2), 171-183 (2009).
  27. Dehmel, T., et al. Monomethylfumarate reduces in vitro migration of mononuclear cells. Neurol Sci. 35, (7), 1121-1125 (2014).
  28. Gastpar, R., et al. The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. J Immunol. 172, (2), 972-980 (2004).
  29. Gastpar, R., et al. Heat shock protein 70 surface-positive tumor exosomes stimulate migratory and cytolytic activity of natural killer cells. Cancer Res. 65, (12), 5238-5247 (2005).
  30. Vandermeeren, M., Janssens, S., Borgers, M., Geysen, J. Dimethylfumarate is an inhibitor of cytokine-induced E-selectin, VCAM-1, and ICAM-1 expression in human endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 234, (1), 19-23 (1997).
  31. Rubant, S. A., et al. Dimethylfumarate reduces leukocyte rolling in vivo through modulation of adhesion molecule expression. Journal of Investigative Dermatology. 128, (2), 326-331 (2008).
  32. Hamann, A., et al. Evidence for an accessory role of LFA-1 in lymphocyte-high endothelium interaction during homing. J Immunol. 140, (3), 693-699 (1988).
  33. Shamri, R., et al. Lymphocyte arrest requires instantaneous induction of an extended LFA-1 conformation mediated by endothelium-bound chemokines. Nat Immunol. 6, (5), 497-506 (2005).
  34. Didier, N., et al. Secretion of interleukin-1beta by astrocytes mediates endothelin-1 and tumour necrosis factor-alpha effects on human brain microvascular endothelial cell permeability. J Neurochem. 86, (1), 246-254 (2003).
  35. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  36. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Sci Rep. 4, 4160 (2014).
  37. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain Res. 818, (1), 65-71 (1999).
  38. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Curr Drug Metab. 9, (9), 901-910 (2008).
  39. Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31, (2), 767-777 (2011).
  40. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12, (10), 1784-1792 (2012).
  41. Eugenin, E. A., et al. CCL2/monocyte chemoattractant protein-1 mediates enhanced transmigration of human immunodeficiency virus (HIV)-infected leukocytes across the blood-brain barrier: a potential mechanism of HIV-CNS invasion and NeuroAIDS. J Neurosci. 26, (4), 1098-1106 (2006).
  42. Ubogu, E. E., Callahan, M. K., Tucky, B. H., Ransohoff, R. M. CCR5 expression on monocytes and T cells: modulation by transmigration across the blood-brain barrier in vitro. Cell Immunol. 243, (1), 19-29 (2006).
  43. Bennett, J., et al. Blood-brain barrier disruption and enhanced vascular permeability in the multiple sclerosis model EAE. J Neuroimmunol. 229, (1-2), 180-191 (2010).
  44. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nat Immunol. 8, (10), 1076-1085 (2007).
  45. Ando, J., Nomura, H., Kamiya, A. The effect of fluid shear stress on the migration and proliferation of cultured endothelial cells. Microvasc Res. 33, (1), 62-70 (1987).
  46. Lawrence, M. B., Smith, C. W., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Effect of venous shear stress on CD18-mediated neutrophil adhesion to cultured endothelium. Blood. 75, (1), 227-237 (1990).
  47. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In Vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. J Pharm Sci. 104, (9), 2727-2746 (2015).
  48. Cucullo, L., et al. Development of a humanized in vitro blood-brain barrier model to screen for brain penetration of antiepileptic drugs. Epilepsia. 48, (3), 505-516 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics