Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung * These authors contributed equally

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., Schneider-Hohendorf, T., Schwab, N., Wiendl, H., Gross, C. C. Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (122), e55390, doi:10.3791/55390 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Lymphocyte Extravasation in das zentrale Nervensystem (ZNS) ist entscheidend für die Immunüberwachung. Krankheitsbedingte Veränderungen der Lymphozyten-Extravasation könnten in pathophysiologischen Veränderungen im ZNS führen. So Untersuchung der Lymphozytenmigration in das ZNS ist wichtig, entzündlichen ZNS-Erkrankungen zu verstehen und neue Therapieansätze zu entwickeln. Hier präsentieren wir ein in vitro - Modell der menschlichen Blut-Hirn - Schranke Lymphozyten - Extravasation zu studieren. Human brain mikrovaskuläre Endothelzellen (HBMEC) sind konfluent auf einem porösen Polyethylenterephthalat gewachsenen Transwell einzufügen das Endothel der Blut-Hirn-Schranke zu imitieren. Barrierefunktion durch Zonula occludens Immunhistochemie, transendotheliale elektrischen Widerstand (TEER) Messungen sowie Analyse von Evans-Blau-Permeation validiert. Dieses Modell ermöglicht Untersuchung der Diapedese von seltenen Lymphozytteilmengen wie CD56 hell CD16 dim / - NK - Zellen. FurthermErz, die Auswirkungen von anderen Zellen, Zytokinen und Chemokinen, krankheitsbedingte Veränderungen und unterschiedliche Behandlungsschemata auf die Migrationsfähigkeit von Lymphozyten untersucht werden. Schließlich kann die Wirkung von Entzündungsreizen sowie unterschiedliche Behandlungsschemata auf der endothelialen Barriere analysiert werden.

Introduction

Lymphozytenmigration aus dem Blut in das Gewebe ist von entscheidender Bedeutung für die Immunüberwachung. Eine Folge von spezifischen molekularen Wechselwirkungen stellt sicher , ortsspezifische Extravasation in Dünndarm, Haut, Lymphknoten, das zentrale Nervensystem (ZNS) und andere Gewebe 1. Veränderungen in der Lymphozytenmigration sind in der Pathophysiologie einer Reihe von weit verbreiteten Krankheiten 2 beteiligt. Migration in die Immunprivilegierten CNS ist streng reguliert und entsprechend Veränderungen dieses Verfahrens sind in CNS-bedingten Krankheiten wie Enzephalomyelitis 3, Neuromyelitis optica, Schlaganfall und Multiple Sklerose (MS) , 2, 4, 5, 6, 7 beteiligt. Daher ist es wichtig, Lymphozyten-Extravasation besser zu verstehen Krankheit Pathophysiologie und Entwicklung von Instrumenten für ein Studium Melioration von Krankheitsbelastung 8, 9, 10, 11, 12.

Lymphozyten wandern in das ZNS über verschiedene Routen. Extravasation durch postkapillaren Venolen in den Subarachnoidalraum über die Blut-Liquor - Schranke innerhalb des Plexus choroideus und über die Blut-Hirn - Schranke hat 1 beschrieben worden ist , 13, 14, 15. Migration durch die Blut-Hirn - Schranke wird durch die Wechselwirkung von Lymphozyten mit Endothelzellen 14 durchgeführt. Im Gegensatz Zellen in der Peripherie, Endothelzellen des ZNS äußern an endotheliale hohe Mengen an tight junction-Moleküle, um dadurch genau die Menge von Zellen und Proteinen Begrenzen der Lage Überquerung der Blut-Hirn-Schrankelass = "xref"> 16. Entzündung führt Lockerung der tight junctions und induziert die Expression von Adhäsionsmolekülen; Somit verbessert Lymphozytenmigration in das ZNS 1, 17, 18.

Extravasation über die Blut-Hirn-Schranke ist ein mehrstufiger Prozess. Haltegurt - Lymphocyten an die Endothelzellen und dann entlang dem Endothel in einem Fertigungsrolle hauptsächlich durch Selectine 1, 15 vermittelt. Anschließend Wechselwirkungen zwischen durch das Endothel sekretiert Chemokine und Chemokin den jeweiligen auf Lymphozyten induzieren Konformationsänderungen exprimierten Rezeptoren der Integrine, wodurch feste Adhäsion an die Endothelzellen 1 zu fördern. Schließlich, Lymphozyten entweder Durchforstungs entlang der endothelialen Barriere gegen den Blutstrom, bevor sie in den perivaskulären Raum transmigrating oder abgewürgt sofort und direkt transmigrate an der Stelle der festen Haftung 1, 19, 20. All diese Schritte der Lymphozyten Extravasation kann in vitro unter Verwendung von unterschiedlichen Techniken 21 analysiert werden. Zeitraffer-Videomikroskopie verwendet , um das anfängliche Tethering zu studieren und Walzen 15. Adhäsions - Assays bieten detaillierte Informationen über feste Verhaftung Barrieren endothelialer 22. Transmigrationsassays als 21 hier erlauben Analyse von Immunzellen - Transmigrations demonstriert, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.

Unter Verwendung der humanen in vitro - Modell Blut - Hirn - Schranke, konnten wir kürzlich zeigen , dass eine höhere migrAtory Kapazität von CD56 hell CD16 dim / - NK - Zellen im Vergleich zu ihrem CD56 dim CD16 + Pendants durch ein Vorherrschen dieser NK - Zell - Untergruppe in der intrathekalen Kammer 21 reflektiert wurde. So ist unser Versuchsaufbau scheint geeignet zu sein , die in vivo - Situation zu imitieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Zellkultur von Human Brain mikrovaskulären Endothelzellen (HBMEC)

  1. Beschichtung von Zellkulturflaschen
    1. Um die Fibronektin-Lösung vorbereitet, mit 10 ml PBS in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. In 150 & mgr; l Fibronektin und gut mischen.
    2. Zur Abdeckung des Bodens einer T-25-Zellkulturflasche 2 mL der Fibronektin-Lösung. Inkubieren der Zellkultur-Kolben bei 37 ° C im Inkubator mindestens 3 h. Fibronectin beschichteten Kolben können für 2 Wochen bei 37 ° C / 5% CO 2 aufbewahrt werden.
  2. Säen und Zellkultur von HBMEC
    1. Aspirat Fibronektin-Lösung aus dem Boden der Zellkulturflasche. Hinzufügen 7,2 x 10 4 HBMEC / cm² suspendiert in 6 ml ECM-B - Medium (= ECM-B mit 5% fötalem Rinderserum, 1% Penicillin / Streptomycin und 1% Endothelzellwachstum Ergänzung). Inkubieren bei 37 ° C / 5% CO 2. Überprüfen Sie das Zellwachstum täglich mit einem Mikroskop.
    2. Ändern Sie das Medium alle 3 Tage.Ernte oder Teile von Zellen, wenn HBMEC etwa 80% Konfluenz erreichen. HBMEC sollte zwischen dem Kanal 1 und 15 verwendet werden, Verlust der physiologischen Eigenschaften zu vermeiden.
  3. Ernte HBMEC.
    1. Bereiten Accutase Lösung durch Mischen Accutase (1x) mit PBS in einem Verhältnis von 1: 1. Halten Accutase-Lösung bei 37 ° C in einem Wasserbad bis zur weiteren Verwendung.
    2. Übertragen ECM-B-Medium von der Zellkulturflasche in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Waschen HBMEC durch Zugabe von 5 ml PBS, um den Boden der Zellkulturflasche. Absaugen PBS und wiederholen Sie den Waschschritt noch zwei weitere Male.
    3. In 2 ml vorgewärmten Accutase Lösung. für 2 min bei 37 ° C inkubieren. Danach HBMEC werden durch fest Antippen der Zellkulturflasche mehrmals wieder suspendiert. Zellablösung wird gesteuert unter Verwendung eines Mikroskops
    4. Das ECM-B-Medium, die zuvor in einem Rohr 15 mL gespeichert wird zurück in die Zellkulturflasche hinzugefügt, sobald HBMEC abzulösen beginnen. Spülen Sie den Boden des Kolbens wiederholt, bis die meisten HBMEC sinderneut suspendiert.
    5. Übertragen der Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen und resuspendieren Zellen in 1 ml ECM-B-Medium. Zählen von Zellen und verdünne die Zellsuspension zu einer Endkonzentration von 3 × 10 5 pro mL HBMEC ECM-B - Medium zu erreichen.

2. Herstellung der Zellkultur-Einsätze

  1. Beschichtung von Zellkultureinsätzen
    Wichtiger Hinweis: Vermeiden Sie die Membran der Zellkultur - Einsätze zu berühren.
    1. Füge 100 & mgr; l Fibronektin - Lösung (siehe Abschnitt 1.1.1) zu jedem Zellkultureinsatz (1A) und eine Vertiefung einer 96-Well - Flachbodenplatte (optischen Kontrolle gut). Inkubieren bei 37 ° C für mindestens 3 h. Nach der Inkubation absaugen Fibronektinlösung.
    2. 100 l HBMEC Suspension auf die Zellkultur-Einsätze und die optische Kontrolle gut. Hinzufügen 600 ul ECM-B-Medium mit dem unteren Bereich der ZelleKultureinsätze. Inkubieren für 3 - 4 Tage bei 37 ° C / 5% CO 2 , bis Barrierenintegrität (1B) erreicht ist , das Zellwachstum kontrolliert durch mikroskopische Auswertung des HBMEC in der optischen Kontrollvertiefung. Hinweis: Das Zellwachstum über 4 Tage wird nicht empfohlen.
    3. Optional: entzündliche Bedingungen nachahmen aspirieren das Medium aus dem unteren Fach und ersetzen sie durch ECM-B-Medium, ergänzt mit 500 U / ml IFN-γ / TNF-α 24 h vor der Migrationstest.

3. Qualitätskontrolle mit Evans Blue am Tag des Auswanderungs Assay

  1. Herstellung von evans blaue Lösung
    1. PBS / B27-Lösung der Mischung 10 ml PBS mit 200 & mgr; l B27 Ergänzung unter Verwendung einer 15 ml-Zentrifugenröhrchen herzustellen. Verdünnte Evans-Blau-Stammlösung (20 mg / ml PBS) 1: 1000 mit PBS / B27.
  2. Evans-Blau-Assay Permeabilität
    1. Anzusaugen, das Medium aus dem unteren Abteil durch die obere Kammer gefolgtvon einer Zellkultureinsatzes eine konfluente Monoschicht HBMEC enthält. 100 l evans blaue Lösung des Zellkultureinsatzes.
    2. Hinzufügen 600 & mgr; l PBS / B27 zu dem unteren Abteil und Inkubation für 60 min bei 37 ° C / 5% CO 2. Entfernen Sie vorsichtig den Zellkultureinsatz Pinzette.
  3. Evans-Blau-Messung
    1. Entfernen PBS / B27 aus dem unteren Abteil und übertragen wurden jeweils 100 ul zu zwei Vertiefungen einer schwarzen 96-Napf-Polystyrol-Platte mit flachem Boden. Legen Sie Platte in einem Tecan Infinite M200 Pro-Plattenleser und bestimmen die optimale z-Position.
    2. Measure Anregung von Evans-Blau unter Verwendung von entsprechenden Einstellungen (zum Beispiel: Anregung: 620 nm, Emission: 680 nm, Anregungsbandbreite: 9 nm, Emissionsbandbreite: 20 nm, 175x Verbesserung, 25 blinkt, Integrationszeit: 20 us).
    3. HBMEC Barrierefunktionen vergleichen erfassten Daten zu einer Standardkurve zeigt evans blau Permeation durch HBMEC zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Samen zu bestimmening Zellen (1B, rechts).

4. Migration Assay

  1. Präparation von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC).
    1. Fügen Sie 10 ml RPMI in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen eingewogen und 200 & mgr; L B27 Ergänzung. Graf PBMC und zentrifugieren Zellen bei 300 · g für 5 min. Resuspendieren PBMC in einer Endkonzentration von 5 x 10 6 Zellen / ml RPMI / B27.
  2. Aufbau des Migrationstest
    1. Aspirat Medium aus der unteren Kammer , gefolgt von der oberen Kammer aus dem Zellkultur - Inserts enthalten konfluenten Monolayern HBMEC (1A). Spender pro 100 uL PBMC - Suspension jeweils mit den Zellkultureinsätzen hinzufügen und auch eine Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen pro (in vitro - Kontrolle).
    2. Hinzufügen 600 & mgr; l RPMI / B27 zum unteren Kompartiment der Zellkultureinsätze und 500 & mgr; l auf die PBMC der in vitro - Steuerung und inkubieren 6 h bei 37 ° C / 5% CO 2.
    3. Ernten von migrierten PBMC
      1. Nehmen Sie den Zellkultureinsatz aus einer Pinzette vorsichtig den Boden mit 400 ul PBS spülen, ohne die Membranen zu berühren. Entsorgen Sie den Zellkultureinsatz.
      2. Fügen Sie 20 & mgr; l Fließzahl Fluorospheres (etwa 1.000 Perlen / ul) zu dem unteren Abteil des Zellkultureinsatzes sowie an die in - vitro - Kontrolle und gut mischen. 1 ml der resultierenden Suspension PBMC Cytometry Rohre zu fließen.

    5. Durchflusszytometrie

    1. Probenvorbereitung
      1. Zentrifuge PBMC bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
      2. Bereiten Antikörperlösung durch Zugabe von Fluorochrom-konjugierten Antikörpern zu 100 & mgr; l Durchflusszytometrie-Puffer (PBS / 1% BSA / 2 mM EDTA) pro Probe. Für die Ergebnisse präsentiert unter 1 & mgr; l CD4-FITC, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 & mgr; l CD56-PC7, 1 & mgr; l CD8-A700 und 1 ul CD16-A750 wurden pro Probe verwendet.
      3. Resuspendieren PBMC in 100 & mgr; l der Antikörperlösung und bei 4 ° C für 30 min inkubieren.
      4. Nach Eintragen von 250 & mgr; L Durchflusszytometrie-Puffer und Zentrifugieren bei 300 xg für 5 min.
    2. Probennahme
      1. Resuspendieren PBMC in der erforderlichen Menge (variiert in Abhängigkeit von dem Durchflusszytometer verwendet wird) der Durchflusszytometrie-Puffer.
      2. Acquire stained PBMC unter Verwendung eines Durchflusszytometers mit einem aktiven Detektors zwischen 525 und 700 nm Wellenlängen-Durchflusszahl Fluorospheres (Anregung 488 nm, Emission 525 bis 700 nm) zu erfassen.
        (Die folgenden Schritte sind ein Beispiel, wenn ein Gallios Durchflusszytometer betrieben mit Kaluza G-Software verwendet wird. (1) Starten der Computer (2) Wenn das Betriebssystem vollständig geladen ist, startet das Durchflusszytometer durch den „Zytometer auf“ Drücken der Taste das jeweilige Erfassungsprotokoll Laden von „open-Protokoll“ drücken. (4) wählen Sie das gewünschte Protokoll und wählen Sie „öffnen“. (5) Duplizieren Sie das Protokoll für jede Probe mit der rechten Taste anklicken. (3)Maustaste auf das Protokoll sichtbar im virtuellen Karussell und einem Linksklick auf das Feld „Duplikat“. (6) Beschriften jede Probe in der Probenliste. (7) übertragen, die Proben zu den angegebenen Positionen des Karussells und die Übernahme beginnen.)
    3. Probenanalyse
      1. Öffnen resultierende Durchflusszytometriedaten die jeweilige Software. Bestimmt Anzahl von Subpopulationen von Interesse für transmigrierten PBMC sowie Zellen , die von in vitro - Kontrollvertiefungen und Zählung Fluorospheres fließt die jeweilige Analyse - Software.
        (Ein Beispiel für die Gating - Strategie wird im Ergebnisteil (Abbildung 1 C gegeben: die Transmigration von NK-Zell - Untergruppen zu analysieren, zunächst auswählen Lymphozyten in einer Seitwärtsstreuungskanals (SSC) gegen Vorwärtsstreuung Kanal (FSC) Plot Lymphocyten ist. dann in einem CD3 gegen CD56 Plot angezeigt und CD56 + CD3 -. NK - Zellen ausgewählt werden , zu unterscheiden zwischen NK-Zell - Untergruppen, NK - Zellen angezeigt inein CD56 gegen CD16 Grundstück und CD56 hell CD16 dim / - sowie CD56 dim CD16 + NK - Zellen ausgewählt. Außerdem Zählung Strömungs Fluorospheres werden aus einem FSC gegen SSC Stück ausgewählt und anschließend in einem Grundstück eines Kanals mit einer Emission zwischen 525 und 700 nm gegenüber der Zeit angezeigt, deren Anzahl zu bestimmen.)
      2. Um die Gesamtzellzahl jeder Probe zu berechnen, normalisieren die erfasste Anzahl von Zellen unter Verwendung von Flusszahl Fluorospheres:
        Gleichung
      3. Bestimmen Prozentsatz der migrierten Zellen als Verhältnis zwischen dem gesamten migrierten Zellen und den Gesamtzellen in der in - vitro - Kontrolle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repräsentative Ergebnisse zeigen Transmigration von NK-Zell- und T-Zell - Untergruppen mit dem menschlichen Blut-Hirn - Schranke - Modell (1A) gezeigt. Die Integrität der HBMEC Monoschicht wurde durch Anfärben des tight junction Moleküls ZO-1, transendotheliale elektrischen Widerstand (TEER) Messungen validiert, und Evans - Blau - Permeation (1B). Folgende 3 - 4 Tage Kultur ausgedrückt HBMEC das tight junction Molekül ZO-1 (1B, links). Außerdem wuchs HBMEC in Monolayern transendotheliale elektrischen Widerstand (1B Mitte) sowie reduzierte Permeation für Evans - Blau (1B, rechts) aufweist. HBMEC Monoschichten wurden verwendet , um die Transmigration von NK - Zellen zu studieren , einschließlich CD56 hell CD16 dim / - und CD56 dim CD16 + NK-Zell - Untergruppen und T - Zellen , einschließlich CD4 + und CD8 + T - Zellen als zwei examples (1D + E, jeweils). Der prozentuale Anteil der migrierten Zellen wurde durch Strömung basierend auf Zellzahl erhalten wurde , berechnet und normiert Zytometrie unter Verwendung von Durchflusszahl Fluorospheres als eine interne Kontrolle (Abbildung 1C). Die HBMEC Monoschicht wurde mit IFN-γ und TNF-α 24 h vor dem Assay stimuliert entzündlicher Zustände nachahmen. Cytokinstimulierung führte zu einer erhöhten Migration aller analysierten Lymphozyten-Populationen. Dies könnte durch eine erhöhte Expression von Adhäsionsmolekülen, einschließlich ICAM-1 (Daten nicht gezeigt). CD56 hell CD16 dim / - NK - Zellen eine höhere Migrationskapazität zeigten im Vergleich zu ihrem CD56 dim CD16 + NK über beide unstimulierten (10,88% vs. 0,86%) und IFN-γγ / TNF-α stimulierte (18,22% vs. 2,94%) HBMEC (1D). Allerdings war die relative Zunahme der Seelenwanderung als Folge der Entzündung höher für die CD56 dim CD16 + gegenüber + 167% für CD56 hell CD16 dim / -). Diese Ergebnisse ahmen die in - vivo - Beobachtungen , dass CD56 hell CD16 dim / - NK - Zellen werden in dem intrathekalen Fach angereichert. So scheint das Blut-Hirn - Schranke Modell geeignet zu sein , um Grundlagen der Immunzellen Diapedese von seltenen Lymphozyten - Populationen in die 21 ZNS zu analysieren. Schließlich wird die Transmigratory Kapazität von CD4 und CD8 - T-Zell - Untergruppen gezeigt (Figur 1E).

Abbildung 1
Abbildung 1: differentielle Migration von NK-Zell - Subpopulationen in uninflamed und entzündeten HBMEC Monoschichten. A. Ein Bild von Transwell - Einsätzen (links) und Darstellung des experimentellen Aufbaus (rechts). B. Validierung von HBMEC Barrierefunktionen. Links: immunhistochemischen Färbung der tight junction molecule ZO-1 unter Verwendung von Kaninchen anti-human-ZO-1 (Abcam, 1: 200) und Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Cy3 (1: 300) auf HBMEC für 3 Tage kultiviert. Center: transendothelialer elektrischer Widerstand (TEER) von HBMEC zwischen Tag 2 und Tag 4 der Kultivierung. Recht: Standardkurve für Evans Blau Permeation für HBMEC mit ( "entzündet", rot) oder ohne ( "uninflamed", Schwarz) Stimulation mit 500 U / ml IFN-γ und TNF-α für 24 Stunden. 96 Stunden nach der Aussaat der HBMEC (schwarzer Pfeil) - Trans Assays werden 72 durchgeführt. CE. PBMC von 16 gesunden Individuen abgeleitet wurden Migrationstests unterzogen, wie in dem Protokoll beschrieben. 24 h vor dem Assay wird die Hälfte der Zellkultur-Inserts wurden stimuliert mit 500 IU / ml IFN-γ und TNF-α. Transmigrierten Zellen wurden durch Flusszytometrie geerntet und analysiert. C. Repräsentative Ergebnisse für PBMC abgeleitet von der in vitro Kontrollvertiefung (oben) und nach der Migration über uninflamed HBMEC (unten). NK cel CD56 + Zellen und weiter unterscheidet in CD56 hell CD16 dim / - - ( "CD56 hell ") und CD56 dim CD16 + (" CD56 dim") NK-Zell - Untergruppen ls wurden aus Gesamt - Lymphozyten als CD3 gated. Flow Count Fluorospheres ( „Perlen“) wurde gated basierend auf FSC / SSC Eigenschaften und ihre Zahl wurde in einer FL3 gegen die Zeit Handlung bestimmt. Beispielhafte Berechnung des Prozentsatzes der migrierten CD56 hell und CD56 dim NK - Zellen zu bestimmen , werden auf der rechten Seite gezeigt. D. Prozentsatz der migrierten NK - Zellen sowie CD56 hell und CD56 dim NK-Zell - Untergruppen, und E. Prozentsatz der migrierten T - Zellen , einschließlich CD4 + und CD8 + T-Zell - Untergruppen folgender Transmigrations über uninflamed (schwarz) oder entzündete (rot) HBMEC dargestellt als Mittelwert ± SEM. P-Werte wurden durch gepaarten Student t-Test berechnet; ** p <0,01, *** p <0.001./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55390/55390fig1large.jpg“target =‚_ blank‘> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier präsentieren wir eine Technik, um die Seelenwanderung von Lymphozyten über die menschliche Blut-Hirn-Schranke zu untersuchen. In - vitro - Analyse von Lymphozyten - Migration auf das ZNS ist wichtig , grundlegende Prozesse der Lymphozyten - Extravasation, potentielle krankheitsbedingte Veränderungen und neue therapeutische Ansätze zu studieren.

Mehrere Modifikationen der Blut-Hirn-Schranke Modell möglich. So könnten beispielsweise Zellen aus dem oberen Kompartiment analysiert werden, um die Zusammensetzung der nicht-umgelagerten Zellpopulation zu untersuchen. Weiterhin kann die Behandlung der HBMEC Monoschicht mit IFN-γ und TNF-α 24 Stunden vor dem Test kann verwendet werden , um eine entzündete Blut-Hirn - Schranke , um ahmte die Wirkung von entzündlichen ZNS - Störungen 21, 25 zu untersuchen. In ähnlicher Weise Behandlung von HBMEC oder Lymphozyten mit anderen Substanzen erlaubt , ihre Auswirkungen auf die Lymphozyten - Extravasation zu untersuchen (zB ihreWirkung auf die Adhäsionsmoleküle) 30, 31. Die Beteiligung bestimmter Adhäsionsmoleküle kann unter Verwendung von blockierenden Antikörpern für Integrine oder ihre Liganden 32 werden untersucht. Weiterhin hier präsentierte Der experimentelle Aufbau ermöglicht die Analyse von chemotaktischen Wirkungen von Chemokinen oder von Astrozyten oder anderen Zellen abgeleiteten Überständen 33, 34 auf . Ersatz von HBMEC mit primärem menschlichem Gehirn stamm Epithelzellen erweitert das Spektrum dieser Versuchsanordnung zur Untersuchung der Blut-Liquor - Schranke 15. HBMEC sollte nicht mit immortalisierten Endothelzellen oder Zellen von anderen Organen abgeleitet ersetzt wird ZNS-Spezifität des Modells zu erhalten. Jedoch brain-derived endothelial Zellen von anderer Spezies verwendet werden könnten Transmigrations in den jeweiligen Tieren 35 zu analysieren. Zusätzlich Retinsäure oder hydrocortisone wurden zu erhöhen Barrierefunktionen beschrieben und könnten somit 36 eingesetzt werden, 37. Im Fall einer begrenzten Zellzahl der Menge der das Assay unterzogen Zellen könnte reduziert werden, weil unser Modell Raten lineare Wiederherstellung bietet zwischen 2 x 10 5 und 1 x 10 6 PBMC (Daten nicht gezeigt). Zur Analyse seltenen Zellpopulationen folgende Transmigrations könnte es zu Pool-Zellen aus mehreren Brunnen erforderlich sein, um eine ausreichende Zellen zu erhalten, die für die Durchflusszytometrie. Schließlich unsere Versuchsanordnung auch verwendet werden, um die Arzneimittelabgabe in das ZNS 38 zu studieren. Eine Porengröße von 3 & mgr; m wird verwendet , typischerweise Lymphozytentransmigrations zu ermöglichen, während eine Porengröße von 0,4 um Lymphozyten Transmigrations verhindert, aber erlaubt , 39 Arzneimittelabgabe zu studieren, 40, 41, 42.

43 gezeigt. Zentrifugation von HBMEC bei niedrigeren g - Kräften und Nutzung von frühen Passagen (dh

Obwohl die Einhaltung der hier beschriebenen Protokoll sinnvolle und reproduzierbare Ergebnisse gewährleistet, hat diese Technik einige Einschränkungen. Erstens, in vivo die Blut-Hirn - Schranke wird durch eine Anzahl von Zellen gebildet ist , die 1 durch Beeinflussung der Bildung von tight junctions in verschiedener Weise und zur Stärkung der Barrierefunktion in Wechselwirkung treten. Daher wird , obwohl dieses Blut-Hirn - Schranke Modell eine gute Annäherung an die in - vivo - Situation ist, fehlen wichtige Aspekte. Zusätzlich Lymphozyten Extravasation in das CNS durch die Blut-Hirn-Schranke ist ein mehrstufiger Prozess. Während jeder kann einzelne Schritt separat untersucht werden, präsentiert die Technik hier bietet keine Informationen über die, diele Prozess der Extravasation unter dem Einfluss von Scherkräften , 2, 44, 45, 46. Schließlich Analyse der migrierten Zellen aus PBMC könnte in Abhängigkeit von der Frequenz der Zellen von Interesse einer Herausforderung sein, da in der Regel nur einstellige Frequenzen von Zellen transmigrieren. Daher wird die Trennung der Populationen von Interesse vor dem Test oder Bündelung von Zellen über mehrere Zellkultureinsätze migriert erforderlich sein. Andere Modelle für die Analyse von Leukozyten-Migration in das ZNS decken einige der Aspekte in unserem Modell fehlen. Co-Kultur mit Astrozyten, Perizyten und / oder Neuronen verwendet , um die Komplexität der Blut-Hirn - Schranke 47 besser zu imitieren. Modelle einschließlich Scherkräfte wie DIV-BBB reflektieren mehr die physiologischen Bedingungen, damit eine komplexere Analyse von Lymphozyten - Diapedese 48 ermöglicht. Zusammenfassend stellen wir eine leicht zugängliche Technik geeignet für die Untersuchung von qualitativen und quantitativen Lymphozyten Diapedesis über das menschliche Blut-Hirn-Schranke.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Gibco 14190-094 without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1 mg/mL Sigma F1141-5MG from bovine plasma
T-25 cell culture flask Greiner BioOne 690160
HBMEC ScienCell 1000
Pelobiotech PB-H-6023
Accutase Sigma A6964-100ML
ECM-b ScienCell 1001-b
FBS ScienCell 1001-b
Penicillin/Streptomycin ScienCell 1001-b
Endothelial cell growth supplement ScienCell 1001-b
Transwell Corning 3472 clear, 6.5 mm diameter, 3.0 µm pore size
96-well flat bottom plate Corning 3596
Evans blue Sigma E2129-10G stock solution: 1 g/50 mL PBS
B27 Gibco 17504-044 50x concentrated
Infinite M200Pro Tecan
96-well black flat bottom plate Greiner BioOne 675086
48-well plate Corning 3526
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Flow Count Fluorospheres Beckman Coulter 7547053
Na-EDTA Sigma E5134
BSA Sigma A2153
Gallios 10-color flow cytometer Beckman Coulter
Kaluza 1.5a Beckman Coulter
TNF-α Peprotech 300-01A
IFN-γ Peprotech 300-02
CD3-PerCP/Cy5.5 Biolegend 300430 clone UCHT1
CD56-PC7 Beckman Coulter A21692 clone N901
CD16-A750 Beckman Coulter A66330 clone 3G8
CD4-FITC Biolegend 300506 clone RPA-T4
CD8-A700 Beckman Coulter A66332 clone B9.11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ransohoff, R. M., Kivisakk, P., Kidd, G. Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system. Nat Rev Immunol. 3, (7), 569-581 (2003).
  2. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  3. Furtado, G. C., et al. A novel model of demyelinating encephalomyelitis induced by monocytes and dendritic cells. J Immunol. 177, (10), 6871-6879 (2006).
  4. Ransohoff, R. M. Illuminating neuromyelitis optica pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (4), 1001-1002 (2012).
  5. Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68, (5), 311-323 (2002).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochim Biophys Acta. 1862, (3), 461-471 (2016).
  7. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier, chemokines and multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812, (2), 220-230 (2011).
  8. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Kieseier, B. C., Wiendl, H. Immunotherapeutic approaches in MS: update on pathophysiology and emerging agents or strategies 2006. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 7, (1), 35-63 (2007).
  9. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Stuve, O., Kieseier, B., Wiendl, H. Multiple sclerosis therapy: an update on recently finished trials. J Neurol. 254, (11), 1473-1490 (2007).
  10. Wiendl, H., Hohlfeld, R. Multiple sclerosis therapeutics: unexpected outcomes clouding undisputed successes. Neurology. 72, (11), 1008-1015 (2009).
  11. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Breuer, J., Posevitz-Fejfar, A., Wiendl, H. JCV index and L-selectin for natalizumab-associated PML risk stratification. Journal of Neuroimmunology. 275, (1-2), 24 (2014).
  12. Schwab, N., et al. L-selectin is a possible biomarker for individual PML risk in natalizumab-treated MS patients. Neurology. 81, (10), 865-871 (2013).
  13. Takeshita, Y., Ransohoff, R. M. Inflammatory cell trafficking across the blood-brain barrier: chemokine regulation and in vitro models. Immunol Rev. 248, (1), 228-239 (2012).
  14. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Wiendl, H. Trafficking of lymphocytes into the CNS. Oncotarget. 6, (20), 17863-17864 (2015).
  15. Schneider-Hohendorf, T., et al. VLA-4 blockade promotes differential routes into human CNS involving PSGL-1 rolling of T cells and MCAM-adhesion of TH17 cells. J Exp Med. 211, (9), 1833-1846 (2014).
  16. Girard, J. P., Springer, T. A. High endothelial venules (HEVs): specialized endothelium for lymphocyte migration. Immunol Today. 16, (9), 449-457 (1995).
  17. Brown, D. A., Sawchenko, P. E. Time course and distribution of inflammatory and neurodegenerative events suggest structural bases for the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Comp Neurol. 502, (2), 236-260 (2007).
  18. Alvarez, J. I., Cayrol, R., Prat, A. Disruption of central nervous system barriers in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812, (2), 252-264 (2011).
  19. Rudolph, H., et al. Postarrest stalling rather than crawling favors CD8+ over CD4+ T-cell migration across the blood-brain barrier under flow in vitro. Eur J Immunol. (2016).
  20. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, (7269), 94-98 (2009).
  21. Gross, C. C., et al. Impaired NK-mediated regulation of T-cell activity in multiple sclerosis is reconstituted by IL-2 receptor modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (21), E2973-E2982 (2016).
  22. Gross, C. C., Brzostowski, J. A., Liu, D. F., Long, E. O. Tethering of Intercellular Adhesion Molecule on Target Cells Is Required for LFA-1-Dependent NK Cell Adhesion and Granule Polarization. Journal of Immunology. 185, (5), 2918-2926 (2010).
  23. Grutzke, B., et al. Fingolimod treatment promotes regulatory phenotype and function of B cells. Ann Clin Transl Neurol. 2, (2), 119-130 (2015).
  24. Gobel, K., et al. Blockade of the kinin receptor B1 protects from autoimmune CNS disease by reducing leukocyte trafficking. J Autoimmun. 36, (2), 106-114 (2011).
  25. Schneider-Hohendorf, T., et al. Regulatory T cells exhibit enhanced migratory characteristics, a feature impaired in patients with multiple sclerosis. Eur J Immunol. 40, (12), 3581-3590 (2010).
  26. Huang, Y. H., et al. Specific central nervous system recruitment of HLA-G(+) regulatory T cells in multiple sclerosis. Ann Neurol. 66, (2), 171-183 (2009).
  27. Dehmel, T., et al. Monomethylfumarate reduces in vitro migration of mononuclear cells. Neurol Sci. 35, (7), 1121-1125 (2014).
  28. Gastpar, R., et al. The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. J Immunol. 172, (2), 972-980 (2004).
  29. Gastpar, R., et al. Heat shock protein 70 surface-positive tumor exosomes stimulate migratory and cytolytic activity of natural killer cells. Cancer Res. 65, (12), 5238-5247 (2005).
  30. Vandermeeren, M., Janssens, S., Borgers, M., Geysen, J. Dimethylfumarate is an inhibitor of cytokine-induced E-selectin, VCAM-1, and ICAM-1 expression in human endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 234, (1), 19-23 (1997).
  31. Rubant, S. A., et al. Dimethylfumarate reduces leukocyte rolling in vivo through modulation of adhesion molecule expression. Journal of Investigative Dermatology. 128, (2), 326-331 (2008).
  32. Hamann, A., et al. Evidence for an accessory role of LFA-1 in lymphocyte-high endothelium interaction during homing. J Immunol. 140, (3), 693-699 (1988).
  33. Shamri, R., et al. Lymphocyte arrest requires instantaneous induction of an extended LFA-1 conformation mediated by endothelium-bound chemokines. Nat Immunol. 6, (5), 497-506 (2005).
  34. Didier, N., et al. Secretion of interleukin-1beta by astrocytes mediates endothelin-1 and tumour necrosis factor-alpha effects on human brain microvascular endothelial cell permeability. J Neurochem. 86, (1), 246-254 (2003).
  35. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  36. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Sci Rep. 4, 4160 (2014).
  37. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain Res. 818, (1), 65-71 (1999).
  38. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Curr Drug Metab. 9, (9), 901-910 (2008).
  39. Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31, (2), 767-777 (2011).
  40. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12, (10), 1784-1792 (2012).
  41. Eugenin, E. A., et al. CCL2/monocyte chemoattractant protein-1 mediates enhanced transmigration of human immunodeficiency virus (HIV)-infected leukocytes across the blood-brain barrier: a potential mechanism of HIV-CNS invasion and NeuroAIDS. J Neurosci. 26, (4), 1098-1106 (2006).
  42. Ubogu, E. E., Callahan, M. K., Tucky, B. H., Ransohoff, R. M. CCR5 expression on monocytes and T cells: modulation by transmigration across the blood-brain barrier in vitro. Cell Immunol. 243, (1), 19-29 (2006).
  43. Bennett, J., et al. Blood-brain barrier disruption and enhanced vascular permeability in the multiple sclerosis model EAE. J Neuroimmunol. 229, (1-2), 180-191 (2010).
  44. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nat Immunol. 8, (10), 1076-1085 (2007).
  45. Ando, J., Nomura, H., Kamiya, A. The effect of fluid shear stress on the migration and proliferation of cultured endothelial cells. Microvasc Res. 33, (1), 62-70 (1987).
  46. Lawrence, M. B., Smith, C. W., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Effect of venous shear stress on CD18-mediated neutrophil adhesion to cultured endothelium. Blood. 75, (1), 227-237 (1990).
  47. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In Vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. J Pharm Sci. 104, (9), 2727-2746 (2015).
  48. Cucullo, L., et al. Development of a humanized in vitro blood-brain barrier model to screen for brain penetration of antiepileptic drugs. Epilepsia. 48, (3), 505-516 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics