Mikrofluidik-Geräte mit Measure Lebensdauer und Cellular Phänotypen in Einzel Budding Hefezellen

Published 3/30/2017
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Biology

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Summary

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Herstellung von Mikrofluidik-Chips und der Aufbau von mikrofluidischen Experimenten optimiert, um die Lebensdauer und zellulären Phänotypen einzelner Hefezellen zu messen.

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Zou, K., Ren, D. S., Ou-yang, Q., Li, H., Zheng, J. Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells. J. Vis. Exp. (121), e55412, doi:10.3791/55412 (2017).

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Abstract

Introduction

Bäckerhefe ist ein leistungsfähiger Modellorganismus in der Altersforschung. Jedoch beruht eine herkömmliche Assay Lebensdauer in Hefe auf Mikrodissektion, was nicht nur arbeitsintensiv , sondern auch geringen Durchsatz gleich 1, 2. Darüber hinaus ist die traditionelle microdissection Ansatz bieten nicht eine detaillierte Ansicht der verschiedenen zellulären und molekularen Merkmalen in den einzelnen Mutterzellen, während sie altern. Die Entwicklung von Mikrofluidik - Vorrichtungen ist ein automatisiertes Verfahren zur Messung der Lebensdauer Hefe sowie zu folgen molekularen Marker und verschiedene zelluläre Phänotypen in der gesamten Lebensdauer der Mutterzellen 3, 4, 5, 6, 7, 8 freigegeben. Nach Hefezellen in eine Mikrofluidik-Vorrichtung geladen werden, können sie unter einem Mikroskop automatische zeit Runden unter Verwendung nachgeführte Bildgebung. Mit Hilfe von Bildverarbeitungswerkzeugen können verschiedene zelluläre und molekulare Phänotypen 3 extrahiert werden, 6, 8, einschließlich der Lebensdauer, Größe, Fluoreszenz - Reporter, Zellmorphologie, Zellzyklus - Dynamik usw., von denen viele schwer oder unmöglich zu erhalten ist unter Verwendung von die traditionellen Mikrodissektionsverfahren. Mikrofluidik - Vorrichtungen haben Prominenz in Hefe - Aging Forschung seit ihrer erfolgreichen Entwicklung gewonnen vor einigen Jahren 3, 4, 6, 7. Mehrere Gruppen haben auf Variationen der früheren Entwürfen 5 und viele Hefe - Labors haben mikrofluidischen Vorrichtungen anschließend veröffentlicht für ihre Studie beschäftigt.

In einer Zellkultur exponentielles Wachstum erfährt, die Zahl der im Alter von Mutterzellen, die für die Beobachtung verfügbar sind, ist miniscule. Daher ist das allgemeine Konstruktionsprinzip der Mikrofluidik-Vorrichtung für Lebensdauer-Messungen Mutterzellen zu binden und Tochterzellen zu entfernen. Eine solche Konstruktionen machen Gebrauch von der Tatsache, dass Hefe Teilung asymmetrische Zelle unterzogen wird. Die Strukturen in dem Gerät Fall größere Mutterzellen und ermöglichen kleinere Tochterzellen weggespült werden. Der Mikrofluidik - Chip in diesem Artikel beschrieben ist, verwendet ein weiches Polydimethylsiloxan (PDMS) pad (vertikale pensile Spalten) abzufangen Mutterzellen (Abbildung 1). Geräte ähnlicher Bauart wurden bereits 3, 4, berichtet 6, 7. Dieses Protokoll verwendet ein einfacheres Verfahren mikrofluidischen Vorrichtungen herzustellen und eine einfache zellLadeVerfahren, die für die Zeitraffer-Imaging Experimente optimiert ist. Einer der wichtigsten Parameter in der Mikrofluidik-Vorrichtung ist die Breite der zu stoppen Mutterzellen verwendet PDMS-Pads. unsere device verwendet breitere Pads, die mehr Mutterzellen unter jedem Pad halten können, darunter ein großer Anteil der frischen Mutterzellen, die während ihrer gesamten Lebensdauer verfolgt werden können. Neben Lebensdauer Messungen ist dieses Protokoll für einzelne Zelle Zeitraffer-Imaging Experimente nützlich, wenn die Zellen während der gesamten Lebensdauer für viele Generationen oder wenn eine Beobachtung verfolgt werden müssen, ist notwendig.

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Protocol

1. Silizium-Wafer-Form Fabrication

HINWEIS: Die Photomaske mit AutoCAD-Software und hergestellt von einem kommerziellen Unternehmen entwickelt wird. Dieser Entwurf enthält drei Schichten von verschiedenen Mustern ( Zusatzdatei 1 ). Die Höhen der ersten, zweiten und dritten Schichten sind etwa 4 um, 10 um und 50 um betragen. Die Siliziumwafer Form wurde von der Photomaske unter Verwendung von Softlithographie 9, 10 geschaffen.

  1. Bake einen Siliziumwafer bei 200 ° C für 10 min des Wasserdampf zu verdampfen. Schleuderbeschichtungs negativer Photoresist SU-8 auf den Siliziumwafer.
    HINWEIS: Schleuderbeschichtung SU-8 3005 bei 5000 rpm für 30 s, die erste Schicht zu erzeugen, SU-8 2010, um 3.000 Umdrehungen pro Minute für 30 s, die zweite Schicht und SU-8 3025 bei 2000 Umdrehungen pro Minute zu erzeugen, für 30 s die erzeugen dritte Schicht.
  2. Soft-Backen des beschichteten Wafers vor ter Musterübertragung. Richten und den Wafer in „direkten Kontakt“ -Modus mit einer Mask Aligner aus.
    HINWEIS: Soft-bake des Wafer für 2 min bei 95 ° C für die erste Schicht, 3 min bei 95 ° C für die zweite Schicht, und 15 min bei 95 ° C für die dritte Schicht. Verwenden , um die Belichtungsdosis bei 100 mJ / cm 2 für die erste Schicht, 130 mJ / cm 2 für die zweite Schicht, und 200 mJ / cm 2 für die dritte Schicht.
  3. Nach der Belichtung Nacherwärmung des Wafers und entwickelt es SU-8-Entwickler verwendet. Trocknen der Wafer ein N 2 -Pistole und hart bake der Wafer bei 200 ° C für 30 min verwendet wird .
    HINWEIS: Der Siliziumwafer Form ist an einem 15 cm-Durchmesser-Petrischale aus Kunststoff Scotch Klebeband, mit dem Muster Seite nach oben weist. Normalerweise stellen wir mehrere identische Chipstrukturen auf der gleichen Form, die mehrere Mikrofluidik-Chips ermöglicht, zur gleichen Zeit hergestellt werden. Jede Form kann wiederverwendet werden viele Male Mikrofluidik-Chips herzustellen.

2. MikrofluidikChip-Herstellung

  1. Ein sauberes Wiegeschiffchen auf einer Waage und tariert. Gießen Sie 50 g PDMS Base in das Boot wiegen.
  2. 5 g des PDMS Härtungsmittels zu dem Wiege Boot (w / w-Verhältnis von 1:10 bis das PDMS Base).
    Hinweis: Dieses Volumen wird basierend auf einem 15 cm-Durchmesser-Petrischale mit der Form. Justieren der Menge an Reagenz, wenn eine Petrischale mit einer anderen Größe verwendet wird.
  3. Rühre das PDMS Base und des Härtungsmittels mit einer Einwegpipette. Beginnen vom Rand des Wägeschiffchen und langsam nach innen bewegen. Rühren Sie gründlich mehrere Minuten, bis kleine Blasen in der Mischung zu bilden; Durchmischung ist für PDMS Polymerisation von wesentlicher Bedeutung.
  4. Die Mischung langsam in die Petrischale; Die Mischung muss die Siliziumwafer Form vollständig bedecken.
  5. Platzieren Sie die Petrischale in einem Vakuum für 10 min alle Luftblasen aus der PDMS-Gemisch zu entfernen. Wenn Blasen auf der Oberfläche des Gemisches bleiben, verwenden Sie eine Pipette sie auszublasen.
  6. Inkubieren des SiliziumsWafer-Form mit PDMS in einem Ofen bei 75 ° C für ca. 2 h.
  7. abschälen sanft die Schicht aus polymerisiertem PDMS aus der Siliziumwafer Form, eine Beschädigung der Konstruktion der Waferform zu vermeiden. Alternativ dazu schneiden die PDMS direkt aus dem Siliziumwafer Form mit einer mindestens 5 mm-Rand um das Muster einer einzigen Kante industriellen Rasierklinge; leicht schälen die PDMS-Schicht von der Waferform.
  8. Platzieren Sie die PDMS-Schicht auf der Bank mit der Musterseite nach oben weist. Sorgfältig schnitt den einzelnen Chip mit einer einzigen Kante industrieller Rasierklinge aus, eine ausreichende Marge von der Kante eines jeden einzelnen Chips Haltekonstruktion Schäden zu vermeiden.
  9. Mit dem Muster Seite nach oben, mit einem Stanzstift (0,75 mm ID) Löcher stanzen gerade nach unten durch die Einlass- und Auslass-Kreise auf jeder Seite der Kanäle.
    HINWEIS: Diese Löcher den Weg für den Fluss des Mediums erstellen. Daher ist es entscheidend, durch die Kreise zu gehen und den ganzen Weg durch die PDMS-Schicht stanzen. Stellen Sie sicher, dassdie PDMS Spalten aus dem Loch entfernen.
  10. Prüfen jedes gestanzte Loch durch den Stempel Pen-Nadel wieder Einsetzen in das Loch. Achten Sie darauf, die Nadel von der anderen Seite herauskommen kann, was darauf hinweist, dass es keine Blockade. Klebeband am Musteroberfläche, dann vorsichtig abzuschälen das Band Staubpartikel zu reinigen. Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens dreimal. Lassen Sie ein sauberes Stück Klebeband auf dem PDMS Sterilisation zu pflegen.
  11. Wiederholen Sie diesen Vorgang auf der gegenüberliegenden Seite des PDMS und lassen auf als auch das letzte Stück Klebeband.
  12. Vorbereiten einer 24 mm x 30 mm Deckglas mit einer Dicke von 0,13-0,17 mm. Spray 70% igem Ethanol auf dem Glas und trocken mit Staubentferner die Oberfläche zu sterilisieren; Zusätzlich kann das Glas mit autoklaviertem Wasser gewaschen und mit Staubentferner gewaschen werden.
  13. Überträgt das Abdeckglas und PDMS auf eine Kunststoffplatte. Entfernen Sie das Klebeband von dem PDMS und legen Sie das Muster nach oben. Vermeiden Sie jeden Kontakt mit der Musteroberfläche während der Übertragung.
  14. Legen Sie das PDMS auf das Deckglas, sowohl hydrophile Oberflächen (die Oberflächen, die während der Plasmabehandlung konfrontiert up) verbindet. Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen zwischen dem PDMS und dem Deckglas.
  15. Inkubieren des PDMS-Chip in einem Ofen bei 75 ° C für mindestens 2 h.
    HINWEIS: Mangelhafte Mikrofluidik während des Experiments Flüssigkeitsleckage auf das Mikroskop führen kann. Daher ist es wichtig, durch leichte die Bindung zwischen dem PDMS und dem Deckglas zu überprüfen, die PDMS von den Kanten mit einer Pinzette angehoben wird. Anheben sanft die PDMS sollte es aus dem Deckglas nicht trennen, eine erfolgreiche Bindung anzeigt.

3. Vorbereitung für das Experiment

  1. Unterzutauchen die Eingangs- und Ausgangsrohre in 70% Ethanollösung separat 1 Tag vor dem PDMS-Chip Zubereitung.
  2. Füllen Sie eine 5-ml-Spritze mit autoklaviertem Wasser, um die Rohre zu waschen. Wäscht jedes Rohr durch an der Spritze das Rohr verstopfen und das Rohr mit Wasser zu spülen.
  3. Wiederholen des Waschschritt mindestens 3 mal Ethanol Rückstand zu reinigen.
  • Untersuchen Sie die PDMS-Kanäle unter einem optischen Mikroskop mit einem 10X-Objektiv, um sicherzustellen, ist die Struktur konsistent und intakt. Stabilisierung des PDMS-Chips auf dem Mikroskopplattform unter Verwendung eines Scotch-Band.
    HINWEIS: Stellen Sie mehrere Chips auf einmal in Schritt 2, um sicherzustellen, dass es Backup-Chips, vor allem, wenn das Gerät zum ersten Mal machen.
  • Füllen Sie eine 5-ml-Spritze mit autoklaviertem Wasser. Sichern der Spritze an eine Spritzenpumpe und legen die entsprechenden Eingangs- und Ausgangsröhren. Stellen Sie die Waschgeschwindigkeit auf 750 & mgr; l / h, den Chip für etwa 10 Minuten zu spülen. Die Luftblasen in den Zweigkanälensollte in dieser Zeit weggespült werden; wenn verbleibenden Blasen sind, stellen Sie manuell die Geschwindigkeit der Blasen zu beseitigen.
  • Hefe-Probenvorbereitung.
    1. 1 ml der vorbereiteten Hefeprobe (OD 600 0,6-0,8) in zwei 1,5 ml - Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugiert für 5 min bei 3.000 x g.
    2. Entfernen Sie die Mehrheit des Überstandes aus jedem Röhrchen und den Rest kombinieren, um eine 0,5 ml Probe zu bilden.
  • Pause, um die Spritzenpumpe und entfernen die Eingangsrohre von dem PDMS-Chip.
  • Manuell Umkehren der Spritzenpumpe eine kleine Luftblase (1 bis 2 cm in der Länge) in jedes Eingangsrohr zu saugen. Bewegen auf in der Hefe Probe zu saugen; die Luftblase wird die Probe Grenze zeigen, und zeigt, wie viel Probe gezogen wurde.
    HINWEIS: Vermeiden Sie die Probe in die Spritze zu saugen.
  • Setzen Sie das Eingangsrohr zurück in den PDMS-Chip und starten die Pumpe die Zellen mit einer Geschwindigkeit von 750 & mgr; l / h zu laden.
  • Lassen Sie die Spritzenpumpe über 10 min dern und untersucht die Zellenbelastung Progression unter dem Mikroskop; ein erfolgreicher Laden wird Trap-Zellen, die unter mehr als 60% der Säule suspendieren.
  • Wechseln Sie zu Ernährung Lösung und stellen Sie die Geschwindigkeit auf 400 & mgr; l / h für die Zellkultur.
  • Wählen Beobachtungspositionen für das Mikroskop.
    HINWEIS: Für Lebensdauer Messungen wurden Bilder einmal mit einem 40x-Objektiv alle 15 min durch ein optisches Mikroskop aufgenommen. Für die fluoreszierende Reporter Analyse wurden Bilder, die einmal mit einem 60X Öl Ziel alle 15 min durch ein Fluoreszenzmikroskop entnommen.
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    Representative Results

    Nach den Experimenten können die Lebensdauer der Zellen und viele zelluläre und molekulare Phänotypen aus den aufgezeichneten Zeitraffer-Bilder extrahiert werden. Da es eine Reihe von verschiedenen Funktionen, die von jeder Zelle entnommen werden kann, ist der erste Schritt der Analyse der Zellen und Ereignisse mit Anmerkungen zu versehen, einschließlich der Positionen und Grenzen der Zellen und dem Timing der verschiedenen Ereignisse, die verfolgt werden, wie beispiels wie die angehenden Ereignisse. Diese Annotationen werden es einfacher, auf den gleichen Satz von Zellen zurückzukehren und verschiedene Funktionen in der Zukunft zu analysieren. Unter Verwendung der aufgezeichneten Annotationen der Zellen unter Verwendung von Bildanalysesoftware, wie ImageJ 11 und dem zugehörigen Plugins kann eine Liste von Phänotypen dann aus den Bilddaten extrahiert werden.

    Im Folgenden sind einige Beispiele für mit der Mikrofluidik-Vorrichtung gemessen Phänotypen. Die Lebensdauer Phänotyp der Hefekann durch Zählen die Anzahl von Knospen von jeder eingeschlossenen Mutterzelle und die Schätzung mit der Kaplan-Meier-Schätzer erzeugt, erhalten werden. Die Zellen zunächst in den mikrofluidischen Vorrichtungen gefangen sind von unbekanntem Alter. Um die Vorspannung der Lebensdauer Messungen stammen von diesem unbekannten Alter, frühere Verfahren verwendet , um die durchschnittliche Anzahl von bud Narben auf den eingeschlossenen Zellen zu minimieren , die Lebensdauer 4, 7 zu kalibrieren. Jedoch erfordern bud scar Messungen die zusätzliche Färbung von Zellen und liefern nur eine indirekte Abschätzung der Vorspannung. Unter Verwendung dieses Protokolls einfängt das Gerät häufig frische Tochterzellen, die aus bereits gefangen Zellen geknospt ab. Diese Zellen werden dann wiederum in Mutterzellen. Solche Zellen können unter Verwendung unserer Downstream - Bildanalyse - Software (Movie 1) identifiziert werden. Diese frischen Mutterzellen eine genauere Lebensdauer Messung. Wie in Abbildung 2 gezeigt, waren die Lebensdauer Kurven von frischen Mutterzellen compadiejenigen der Zellen unbekannten Alters rot mit. In diesem Experiment war die durchschnittliche Lebensdauer der frischen Mutterzellen etwas länger (etwa 2 Generationen Unterschied in der medianen Lebensdauer).

    Zusätzlich zu der Anzahl von Knospen, anderen interessanten Phänotypen, wie beispielsweise das Zeitintervall zwischen zwei aufeinanderfolgenden Ereignissen Knospung, wie in Figur 3 dargestellt ist , kann aus den Bilddaten 3, 7, 8 , extrahiert werden. Die Zellen in eine Phase von schnellen Austrieb folgenden ein paar langsameren Anfängen buddings. Die angehende verlangsamte dramatisch gegen Ende ihrer Lebensdauer, den ungesunden Zustand dieser im Alter von Zellen anzeigt. Die Zellzyklusdynamik enthält sehr nützliche Informationen über den zellulären Zustand der jungen und alten Zellen und verwendet worden, beispielsweise Telomerase - Mutanten 12 zu charakterisieren. Wichtig ist, dass dieses Gerät seinverwendete zum Messen von Fluoreszenzsignalen während der gesamten Lebensspanne (Abbildung 4), so dass für die Verfolgung von molekularen Markern , die der Fahrer des Alterungsprozesses sein können.

    Abbildung 1
    Abbildung 1: Eine schematische Darstellung der Konstruktion der Mikrofluidik - Vorrichtung. Das Gerät besteht aus 6 unabhängigen Funktionsmodulen, die parallel arbeiten können. Jedes Modul besteht aus einem Hauptkanal verbunden ist, um zwei Seitenkanäle vorgenommen. Jeder Seitenkanal hat pensile 113 Spalten. Eine weitere Brücke ist in der Mitte hinzugefügt, um den Hauptkanal mit den beiden Seitenkanälen zu verbinden. Mutter-Zellen werden unter den pensile Säulen, während die kleineren Tochterzellen durch die Strömung weggespült werden gefangen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.


    Abbildung 2: Frische Mutterzellen länger leben als Zellen mit unbekannter Geschichte. Die replikative Lebensdauer von frischen Mutterzellen im Vergleich zu Zellen unbekannter Geschichte in SD-Medien, 30 Grade (Zellen vom Beginn des Experiments gefangen). Im Durchschnitt leben frische Mutterzellen etwa 2 Generationen länger. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Abbildung 3
    Abbildung 3: Die Länge der gealterten Intervallen ändert als Zell Knospung. Angehende Abständen gemessen als Zeitrahmen zwischen buddings wurden farbcodiert, wurden die Zellen durch ihre Replikation Lebensdauer bestellt und frische Mutterzellen waren Septemberarated aus Zellen unbekannten Geschichte. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Abbildung 4
    Abbildung 4: Messung der Aktivität von Hitzeschockfaktor 1 (HSF1) einer Mikrofluidik - Vorrichtung verwendet. Die HSF1-Aktivität Reporter werden durch ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) fusionierte mit einem verkrüppelten CYC1 Promotor mit HSE Upstream 13 aufgebaut. Fluoreszenzbilder wurden alle 30 Minuten genommen. GFP Intensität wurde dann quantifiziert eine angepasste MATLAB - Code 14 verwendet wird . Die Datenpunkte für jede einzelne Zelle verbunden sind, und mit einer farbigen Linie angedeutet. In diesem Experiment wurde der Stamm in SD-Medium mit 2% Glucose (wt / vol) bei 30 ° C über Nacht wachsen gelassen; es wurde dann mit dem gleichen Medium für die Wiederherstellung verdünnt. Nachher,SD-Medium mit 0,05% Glucose (G / V) wurde verwendet, um Zellen in dem mikrofluidischen Chip während der Fluoreszenzmessung zu wachsen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Abbildung 4
    Film 1: Ein Beispiel für frische Mutterzellen innerhalb der Einrichtung für die gesamte Lebensdauer gefangen zu sein. Der Film zeigt eine frische Mutterzelle von einer gefangenen Zelle geboren. Der rote Pfeil am Anfang des Films markiert die Position der frischen Mutterzelle und ihren ersten Austrieb. Diese Mutterzelle wurde in der Mikrofluidik-Vorrichtung für seine gesamte Lebensdauer gefangen. Bitte klicken Sie hier , um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download bereit .)

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    Discussion

    Das PDMS-Gerät muss frisch hergestellt werden. Andernfalls werden die Luftblasen, die durch Rohre in die Vorrichtung eingefügt schwer zu entfernen. Schritt 3.4 ist wichtig, um die Zellbeladungseffizienz zu verbessern, indem die Zellen konzentriert. Um den Durchsatz des Experimentes zu erhöhen, 4 bis 6-Module auf dem gleichen Chip verbunden PDMS unabhängig arbeitende Pumpen typischerweise verwendet werden, durchzuführen 4 bis 6 verschiedene Experimente (verschiedene Stämme oder Medienzusammensetzungen) gleichzeitig.

    Im Vergleich zu der herkömmlichen Hefe replikativen Alterungstest (die Mikrodissektion verwendet), die mikrofluidische hier vorgestellte Verfahren ist weniger arbeitsintensiv und zeitraubend. Darüber hinaus ermöglicht die Mikrofluidik-Vorrichtung für die detaillierte Quantifizierung der verschiedenen zellulären oder molekularer Parameter, einschließlich der Zellgröße, Zellzyklus-Dynamik, die Zellmorphologie und verschiedenen molekularen Marker. Dieses Mikrofluidik-Verfahren erreicht Langzeit Zelle mit dem hochauflösenden Mikroskopie Nachführung durch HaltMutterzellen unter PDMS Mikro-Pads als Tochterzellen werden automatisch gespült.

    Dieses Gerät verwendet weiche PDMS Mikro-Pads zu stoppen Mutterzellen 4 mit der Grundstruktur ähnlich, wie Huberts et al. in seinem Werk 7 beschrieben. Es gibt eine Reihe von Unterschieden in dem Gerätedesign und experimentelle Protokollen. Der breitere PDMS - Pad in diesem Gerät kann einige newborn Tochterzellen aufgefangen und analysiert (Figuren 2 und 3, Film 1) werden. Um solche Zellen zu identifizieren, wir kommentierten geknospt die Tochterzellen aus bereits gefangen Mutterzellen, die Tochterzellen zu ignorieren, die ohne Knospung weggespült. Im Durchschnitt, wir haben etwa 2 frische Mutterzellen pro PDMS-Pad. Das Verhältnis dieser frischen Mutterzellen zu den Zellen unbekannter Geschichte war etwa 1: 2, von denen etwa ein Drittel wurden in der Einrichtung für die gesamte Lebensdauer gehalten. Diese Zellen ermöglichen eine genauere Lebensdauer Messung eind macht es möglich, Korrelationen zwischen Mutter und Tochterzellen zu analysieren. In dieser Vorrichtung wird ein tieferer Hauptkanal an zwei flacheren Seitenkanälen verbunden, in dem die Beobachtungen gemacht werden; dieser Entwurf hilft, die Möglichkeit der Seitenkanäle zu reduzieren, indem große Luftblasen blockiert. Für mikrofluidischen Chip-Produktion verwendet dieses Protokoll auch ein einfaches Verfahren die PDMS und Deckglas zu binden, nur Plasma-Exposition mit und Backen im Ofen, die die Erfolgsquote erhöht.

    Bei diesem Protokoll ist die mikrofluidische Vorrichtung zu robust Falle mindestens eine Zelle (3-5 Zellen im Mittel) pro Lage PDMS - Pad zu Beginn des Experiments für den Wildtyp - haploide Hefestämme (dh BY4741 oder BY4742). Etwa 30% der Zellen in ihrer ganzen Lebensdauer beibehalten werden. Es ist erwähnenswert, dass die Leistung des PDMS Geräts auf dem Spaltmaß hängt zwischen den pensile Säulen und dem Glas und der Größe der Hefezellen. Für haploide Hefestämme Wildtyp, diegeeignete Größe für den Spalt ist 3,5-4,5 um auf. Außerhalb dieses Bereichs stark die Ladeeffizienz und Zellrückhalterate Rückgang. So wird neue Vorrichtungen für Hefestämme mit vielen größeren oder kleineren Zellgrößen 7 muss in Schritt 1 hergestellt durch Modifizierung der Höhe der ersten Schicht hergestellt werden.

    Zusammengefasst ist das Gerät und das Protokoll in diesem Artikel beschrieben wird, nicht nur für Hefe-Aging-Studien geeignet ist aber auch für andere Experimente, die die Verfolgung von Mutterzellen und die Überwachung von molekularen Markern für viele Generationen oder die ganze Lebensdauer erfordern.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    3'' <111> silicon wafer Addison Engineering
    SU-8 2000 and 3000 Series MicroChem
    Sylgard® 184 Silicone Elastomer Kit ellsworth 2065622 Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent
    Petri dishes VWR 391-1502
    Harris Uni-core™ punch (I.D. 0.75 mm) Sigma-Aldrich 29002513
    24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass Thermo Fisher Scientific 102440
    3M Scotch Tape ULINE S-10223
    VWR® Razor Blades VWR 55411-050
    Pure Ethanol, Koptec VWR 64-17-5
    Whoosh-Duster™ VWR 16650-027
    5 mL BD Syringe (Luer-Lock™ Tip) Becton, Dickinson and Company 309646
    PTFE Standard Wall Tubing (100 ft, AWG Size: 22, Nominal ID: 0.028) Component Supply Company SWTT-22
    Needle Assortment Component Supply Company NEKIT-1
    Desiccator HACH 2238300
    Lab Oven Fisher Scientific 13246516GAQ
    Nikon TE2000 microscope with 40X and 60X objective Nikon
    Zeiss Axio Observer Z1 with 40X and 60X objective Zeiss
    Syringe Pump Longerpump TS-1B

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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