בידוד, אפיון, טיהור של מקרופאגים רקמות מושפעות על ידי דלקת הקשורות להשמנת יתר

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

פרוטוקול זה מאפשר חוקר לבודד ולאפיין רקמות תושב מקרופאגים שונות הולמרק רקמות מודלק שחולצו מן הדיאטה-induced מודלים של הפרעות מטבוליות.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Allen, J. N., Dey, A., Nissly, R., Fraser, J., Yu, S., Balandaram, G., Peters, J. M., Hankey-Giblin, P. A. Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation. J. Vis. Exp. (122), e55445, doi:10.3791/55445 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

השמנת יתר מקדמת מדינה דלקתית כרונית בעיקר מתווך על ידי רקמת תושב מקרופאגים, כמו גם נגזר מונוציט מקרופאגים. דיאטה-induced השמנת יתר (דיו) הוא מודל ערך לומד את התפקיד של הטרוגניות מקרופאג; עם זאת, ומשום מקרופאג נאותה קשים לרכוש רקמות מודלק. ב פרוטוקול זה, אנו מכינים את הצעדים בידוד ואת ההנחיות הדרושות לפתרון בעיות נגזר מן המחקרים שלנו להשגת אוכלוסייה מתאימים של מקרופאגים רקמות תושב של עכברים לאחר 18 שבועות עתירת שומן (HFD) או שומן/תיכון-כולסטרול ( התערבות תזונה HFHCD). פרוטוקול זה מתמקד שלוש רקמות הולמרק למד ב השמנת יתר, טרשת עורקים, כולל הכבד, רקמות adipose לבן (וואט) של העורקים. אנחנו להדגיש השימוש איך דואלית של זרימה cytometry ניתן להשיג מימד חדש של בידוד ואפיון של רקמות תושב מקרופאגים. מקטע יסוד של פרוטוקול זה מטפל המורכבות הבסיסית digestions אנזימטי רקמות ספציפיות מקרופאג בידוד, ואת הבאים נוגדן תא-פני מכתים לניתוח cytometric זרימה. פרוטוקול זה מטפל המורכבות הקיימת בבסיס תא לפעיל על-פלורסנט מיון (FACS) ומציגה הבהרות על המורכבות כדי להשיג אפיון במגוון רחב של אוכלוסיות תאים ממוינים כראוי. שיטות חלופיות העשרה הינם כלולים למיון תאים, כגון הכבד צפופה, ומאפשר גמישות וניהול זמן בעת עבודה עם FACS. בקצרה, פרוטוקול זה מסייע החוקר להעריך מקרופאג הטרוגניות של שפע של רקמות מודלק במחקר נתון, ומספק עצות לפתרון בעיות תובנה כי כבר מוצלח עבור בידוד תאית חיובית ואפיון של תאים חיסוניים בדלקת בתיווך דיו.

Introduction

העכבר מודלים היו בשימוש נרחב ללמוד את הדינמיקה של מחלות אנושיות. בידוד תקין של רקמות תאים תושב עכברים בתוך מדינה חולה יכול לספק פלטפורמה להבנת מולקולרית, תאית התרומות בפתוגנזה של המחלה1. הפרעה אחת זה חשיבות קריטית היא השמנת יתר. שכיחות ההשמנה ממשיכה לעלות בכל העולם במקביל לאינסולין סוג 2 סוכרת מחלות לב וכלי דם, מחלת כבד שומני2,3. צריכת מזון נוסף מוטה על ידי ירידה פעילות גופנית מפעילה שינו אותות שמקורם רקמת שומן, אשר יכול לשנות את חצרו הסלולר של רקמות היקפיים אחרים כגון אב העורקים ואת הכבד4. כזה שיבוש הומאוסטזיס המטבולית גורמת לדלקת מערכתית כרונית נמוך בכיתה5.

הפעלה קלאסית של מקרופאגים תושב העורקים ואת הכבד, כמו גם את הגיוס שומן לבן (וואט) הוכח ליזום dysregulation של אותות מטבולי אלא גם לקיים דלקת6,7. הטרוגניות פנוטיפי ופונקציונליים של מקרופאגים קשורה חזק בפתוגנזה של השמנת יתר הקשורים לעבודה morbidities7. הפלסטיות דינמי ב מקרופאג קיטוב מאפשר תאים אלה שהפגינו מגוון פנוטיפים מופעל זה לתאם את התקדמות והרזולוציה של דלקת8. בעוד בסגנון קלאסי מופעל מקרופאגים (M1) הם מעורבים על התפשטות של דלקת, לחלופין מופעל מקרופאגים (M2) קושרו עם רזולוציה ורקמות תיקון9,10.

כפי הגוף עובר מתח מטבולית, שומן לבן מצטבר באופן חריג. רקמת שומן המורחב מושך, שומר על תאים דלקתיים שמשנות עמוקות adipocyte רגילה פונקציה כדי לקדם את תנגודת לאינסולין, היפרגליקמיה, בסופו של דבר סוכרת סוג 2, תנגודת לאינסולין או היפרגליקמיה11, 12. במקביל, remodels שומן לבן בתגובה אותות דלקתיים שפורסמו על ידי הסתננו מופעל באופן קלאסי (M1) רקמת שומן מקרופאגים (כספומטים)13,14. איבר זה רב תאית מפעילה מפל של אותות זה תוקע את התיפקוד הרגיל של איברים אחרים בגוף כגון אבי העורקים, כבד4.

הכבד הוא עוצמתי מטבולית המסתגל בתגובה לגירויים שמקורם dysregulated הסמוך וואט15. מקרופאגים כבדית או תאים Kupffer, כתגובה לשינויים מטבוליים, מפרישים ציטוקינים דלקתיים שהופכים שניהם parenchymal ו תא הלא-parenchymal פנוטיפ ולקדם רקמות. הצטברות שומנים בדם הכבד, דלקת, פיקדונות מופרז מטריצה חוץ-תאית, נמק, הפונקציה בסופו של דבר אובדן כדלקמן העלבונות דלקתיות לתרום ספקטרום רחב של פגיעה בכבד הקשורים אלכוהוליים מחלת כבד שומני 1617,,18.

במקביל וואט פרוץ, תפקודי כבד, עורקים גדולים לצבור שומנים בתוך קיר עורקים כפי הגוף עובר מתח מטבולית כרונית19. הצטברות שומנים בדם עורקי מפעיל את הפרשת נוגדנים על ידי תאי אנדותל מופעל והגיוס עוקבות של monocytes20. ברגע גייס, ומונוציטים להתרבות, להבדיל, להבלע lipoproteins, להפוך לתאי קצף. Atherogenesis יזם, נגרם על ידי פעילות הפרו דלקתיים גייס ו רקמות לאדן השומנים תושב מקרופאגים. להיכנע האותות חוץ-תאית, תאיים סטרס נמסר ב- microenvironment atherogenic הזה, מקרופאגים האלה ואז לעסוק מוות איתות בהתאם להיררכית הקשרים. כאשר תאים אלה קצף מתים, הם תורמים את תוכנם השומנים מלא אל ליבה נמק של הנגע, מה שמוביל ואז קרע פלאק, אוטם שריר הלב ושבץ.

באופן קולקטיבי, הטרוגניות של פנוטיפים מקרופאג האחראית בחלקו השמנת יתר הנגרמת על ידי שינויים דלקתיים שנצפתה dysregulated רקמות כגון וואט, הכבד, אבי העורקים8,21. אפיון גייס, מקרופאגים תושב רקמות יכול לספק תובנות פוטנציאליים מטרות מולקולריות שמטפלות מקרופאג פנוטיפ1. לאפיין ביעילות מקרופאגים רקמות מודלק השמנת יתר-induced, ניתן לקבל השעיה תא בודד באמצעות עיכול אנזימטי. פרוטוקולים דיסוציאציה כזה חייב להיות יעיל דיו משפילים רקמת חיבור תוך מזעור מוות של תאים חיסוניים, מתן תשואה אופטימלית בתא. התערובת אנזים הוא תלוי בסוג הרקמה איפור המבני שלה. רקמות גמיש כמו אבי העורקים דורש פעילות אנזימטי חזק יותר, לעומת הכבד ו וואט, כדי להשיג רקמה דיסוציאציה. מן התליה תא בודד, מקרופאגים תושב רקמות ניתן חד משמעית מאופיין או מבודדים עבור נוסף במורד הזרם ניתוחים כגון יצירת פרופיל תעתיק.

כאן פרוטוקול רקמות ספציפיות מתואר המשתמשת תלויי-collagenase רקמות לעיכול, cytometry זרימה צבעוני לבודד ביעילות לאפיין את רקמת תושב מקרופאגים המתקבל השמנה דיאטה מסורתי המושרה, טרשת עורקים, פשוט steatosis ומודלים steatohepatitis העכבר. סימולטני מכתים של סמני פני שטח התא עם נוגדנים נגד ליקוציט-(CD45 או CD11b) וגם מקרופאג - אנטיגנים ספציפיים (F4/80) משמשת לעתים קרובות כדי לזהות אוכלוסיות מקרופאג22. תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) היא אסטרטגיה רב עוצמה המשמש למיון אוכלוסיות אלה שזוהו על טוהר גבוהה. אז ניתן להעריך האוכלוסייה ממוינים לפרופילי גנים ספציפיים פנוטיפ באמצעות אנליזה מולקולרית במורד הזרם (כגון תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת כמותית)23. למרות cytometry זרימה רגילה ומיון תא מבוססי cytometry זרימה כלים רבי-עוצמה בהבחנה מקרופאגים בתוך השעיה תא הטרוגנית מאוד, הפרוטוקולים לשעבר חייב להיות מוטבת כדי להבטיח פלט מוצלחת. במחקר זה, פרוטוקולים של ביעילות לבודד, לאפיין את רקמת קיימא מקרופאגים ספציפיים מתוארים; חשוב יותר, מחקר זה מספק תובנה מכריע בנושאים טכניים הנובעים לעתים קרובות, כמו גם אסטרטגיות פרואקטיבית וגישה לפתרון בעיות כדי למנוע ו/או לפתור אותן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפרוטוקולים ניסיוני (סעיפים 1, 1.2, 1.3) אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת פנסילבניה.

רקמה דיסוציאציה מאגרי הכנה נפח סופי אחסון
שומן לבן (וואט) מאגר דיסוציאציה: 2.5% HEPES, 10 מ"ג/מ"ל אלבומין שור (BSA), 3 מ"ג/מ"ל (0.3%) Collagenase מסוג II של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) עם 4.5 g/L גלוקוז ללא פירובט-גלוטמין ו נתרן 500 מ מינוס 80° C (10 מ ל aliquots)
הכבד 25 x זלוף מאגר להתרכז (ות ת): 3.55 M NaCl, 168 מ"מ אשלגן כלורי, 240 מ"מ HEPES, 150 מ"מ NaOH באופן מזוקק יונים H2O 500 מ מינוס 20° C (40 מ ל aliquots)
שימור מאגר (PRB): BSA 1% 1 x מאגר זלוף 1 ליטר 4 ° C
מאגר דיסוציאציה: 1 x זלוף מאגר בתוספת מ מ 4.76 CaCl2 ו- 72 IV סוג Collagenase U/mL 50 מ ל (לכל עכבר) להכין מיד לפני השימוש
אבי העורקים מאגר דיסוציאציה: 125 U/mL Collagenase סוג XI, Hyaluronidase U/mL 60 סוג אני, 60 DNase U/mL, 450 U/mL Collagenase מסוג I, 20 מ מ HEPES 1 x פוספט תמיסת מלח Buffered (PBS) 500 מ מינוס 80° C (10 מ ל aliquots)

טבלה 1: רקמות ספציפיות זלוף מאגר מתכונים.

1. רקמות בידוד, דיסוציאציה

  1. בידוד וואט, דיסוציאציה
    1. להכין את מאגרי רקמות ספציפיות לפי טבלה 1, לאחסן אותן כמתואר.
    2. הכינו את ריאגנטים הבאים.
      1. הכן המאגר לעיכול על ידי מפשיר נפח מתאים של וואט דיסוציאציה מאגר וחנות ב 4 ° C עד השימוש. מיד לפני השימוש, לחמם את המאגר ל- 37 מעלות צלזיוס. להכין מאגר FACS על-ידי הכנת 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) המכיל 2% סרום שור עוברית (FBS).
    3. בידוד וואט
      1. המתת חסד תא העכבר פחמן דו-חמצני (CO2) מלא. בדוק את האפקטיביות לפני שתמשיך לשלב ניתוח.
      2. טובלים את העכבר לאללה בקצרה בתוך המכיל אתנול 70% עד ביסודיות ספוג מצופה עם אתנול. המקום (גחוני) העכבר על הבמה לנתיחה והדקו את העכבר הפורה ואת כפות הרגליים האחוריות אל לוח חיתוך באמצעות מחטים 21 G.
      3. השתמש בינוני נקודת קצה מלקחיים להבין בעור בטן והשתרשה עמוק בלבה פתח השופכה, ואז להשתמש במספריים חדים ויבתר לעשות חתך בעור בטן grasped.
      4. להכניס את הלהב התחתון של המספריים חתך קטן בין העור לבין הצפק, עושים חתך לרוחב מהבטן אל כלוב הצלעות.
      5. משוך בעדינות בחזרה את העור כדי לחשוף את חלל הצפק שלם לרוחב חתך דרך של הצפק, גם לקפל חזרה קרום שקוף או לסלק את הרקמה כדי לחשוף הוואט בטן.
      6. לאסוף את הידיות perigonadal fat כפי שמתואר מאן. et al. 24
        1. הידיות perigonadal fat בעכברים זכרים מאוגדים באופן רופף יותרת האשך ואת האשכים. תחילה לאתר את האשכים, ואז בינונית הצבע מלקחיים, להחזיק ראש יותרת האשך ומשוך בעדינות.
        2. באמצעות מספריים ויבתר חדות, לסלק כל משטח שמן epididymal על ידי גזירה לאורך פני השטח של יותרת האשך (ראש, גוף וזנב) ואת האשכים.
        3. עם המלקחיים, משוך בעדינות על משטח השמן בזמן חיתוך דרך רקמת חיבור ישירות קשורות למבנה יותרת האשך.
        4. עם המלקחיים, לאחוז בחוזקה בסוף מקורב אל האשך fat pad ולהתקלף בעדינות כרית השומן מן הגונדות
        5. בעכברים הנשי, הידיות perigonadal fat הן באופן רופף בונד גוף הרחם, הרחם הורן.
        6. בעזרת מלקחיים נקודת בינוני, אחיזה רקמת השומן perigonadal ומשוך בעדינות את הרקמה הרחק גוף הרחם ואת הרחם קרן.
        7. לסלק כל כרית השומן על ידי גזירה לאורך גוף הרחם, הרחם קרן באמצעות מספריים ויבתר חדות.
      7. מקם את השומן רפידות בצלחת פטרי-מלא עם PBS ולשמור על קרח כדי לשמור על לחות לרקמות.
    4. דיסוציאציה של וואט לתוך תא בודד השעיות
      1. להסיר את עודף PBS הפטרי ולהשתמש תער קצוות יחיד מינצ הוואט בטן לחתיכות קטנות.
      2. עם חוד הסכין גילוח, לגרד בעדינות הוואט בטן טחון לתוך צינור פוליפרופילן אוסף תוויות 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל וואט דיסוציאציה מאגר.
      3. דגירה תערובת מאגר זו רקמה-עיכול תחת סיבוב איטי רציפה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
      4. לסנן את הרקמה מתעכל דרך מסננת תא מיקרומטר 70 לתוך צינור אוסף 50 מ ל בעת הזזת את הבוכנה מגומי של פומפה מזרק בתנועה סיבובית ולהמשיך ניפוי התליה תא דרך המסנן.
      5. Pipet 2 מ של Dulbecco של המדיום נשר שונה (DMEM) כדי צינור אוסף 15 מ"ל, בעדינות pipet למעלה ולמטה ולשטוף את המסנן עם התליה תא בודד.
      6. רוחצים את המסנן שתי שעות נוספות עם DMEM קרים ומניחים התליה תא בודד על קרח.
      7. Centrifuge התליה תא ב g x 300 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות.
      8. להשתמש ליניקת אבק בזהירות להסיר את adipocytes צף (קודם), הנותרים supernatant. ודא שלא להפריע השבר בכלי הדם סטרומה pelleted (SVF).
      9. עם פיפטה 1,000 µL, בעדינות מחדש להשעות את צניפה במאגר אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK) כדי lyse אריתרוציטים בהתאם להוראות היצרן.
      10. לדלל התליה תא לעיל עם DMEM, centrifuge התליה תא ב 300 גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות.
      11. מחדש להשעות את התאים ב- PBS קר המכיל 2% FBS (FACS מאגר) ולספור התאים קאמרית/hemocytometer Burker.
      12. העברה או עונה 1 פרק 106 תאים (עבור cytometry זרימה בסיסי) או ההשעיה התא כולו (עבור FACS) כדי הנקרא מ ל צינורות פוליסטירן סיבוב המדרגה. המשך סעיף 2 עבור cytometry זרימה מכתים פרוטוקול.
  2. בידוד רקמת הכבד, דיסוציאציה
    הערה: פרוטוקול זה הותאם Smedsrød25.
    1. להכין את מאגרי רקמות ספציפיות לפי טבלה 1 ולאחסן אותן כמתואר.
    2. הכינו את ריאגנטים הבאים.
      1. להכין 1 x זלוף-מאגר (PB), על ידי המדללת 40 מ ל נכסים ובנין לתוך 960 מ ל הנדסה גנטית H2O. חם מראש של מזרק מלא 50 מ של PB ב 37 מעלות צלזיוס, בדיוק לפני זלוף מתחיל. לחסל את כל בועות האוויר הנוכחי.
        1. לחסל בועות אוויר, היפוך המזרק איפה קצה נעל ופסאר מצביע כלפי מעלה. הקש או לסתור את המזרק עד בועות אוויר הן pf בראש המזרק. דחף בעדינות על הבוכנה לגרש את האוויר
      2. להכין המאגר לעיכול על ידי דילול 0.5 מ"ל של 476 מ פתרון2 CaCl49.5 מ ל 1 x מאגר זלוף. להוסיף 3600U של Collagenase הסוג הרביעי מ מ 4.76 CaCl2 – פתרון PB. לחמם מזרק מלא 50 מ של עיכול מאגר ב 37 מעלות צלזיוס לפני זלוף מתחיל. לחסל את כל בועות האוויר הנוכחי כפי שמתואר בשלב 1.2.2.1.1.
      3. להכין שימור מאגר (PRB) על ידי המסת 2.5 g אלבומין שור (BSA) במאגר זלוף 1 x 250 מ. ב 4 ° C או לשמור על הקרח עד השימוש.
      4. להכין מאגר FACS עם FBS PBS ו- 2% 1 x.
    3. רקמת הכבד בידוד
      1. המתת חסד עכבר בעזרת2 CO, להרוות את העכבר עם 70% אתנול למניעת זיהום של האיברים intraabdominal עם פרווה.
      2. מיקום העכבר הגחון בצד של למעלה פוליסטירן מוקצף לנתח לוח ולאבטח העכבר פור, האחוריות הכפות ללוח לנתיחה באמצעות מחטים 21 G.
      3. כדי לחשוף את קיר בית החזה ואת חלל הצפק, לאחוז בעור בטן ליד הפתח השופכה באמצעות מלקחיים עצה של נקודת בינוני. מספריים חדות ויבתר להשתמש כדי ליצור חתך קטן על העור בטן grasped.
      4. להכניס את הלהב התחתון של המספריים חתך קטן בין העור לבין הצפק, עושים חתך לרוחב מהארבה עד הסנטר.
      5. משוך בעדינות בחזרה את העור כדי לחשוף את חלל הצפק ללא פגע בקיר בית החזה, עושים חתך לרוחב דרך הצפק, לסלק את הקרום.
      6. הרם את החזה היטב תחתכי את הסרעפת, להיות בטוח שלא להפריע הכלילי התחתון (IVC). להעביר את האיברים במערכת העיכול לצד ואתר של IVC subhepatic. להשתמש מלקחיים hemostatic כדי לצבוט את suprahepatic IVC לשמור זלוף לשפות אחרות.
        הערה: הצטברות יתר של רקמת שומן לבנים הקרביים לעיתים קרובות מטשטשים את IVC. כדאי להמחיש את כלי השיט הזה, אפשר להוציא שטח קטן של רקמת שומן לצד IVC. החלון חרות בתוך רקמת השומן גמיש יכול ואז למקם מעל IVC לחשוף את כלי הקיבול. של תעלות.
      7. לצרף את המזרק מלא מראש ומחוממת PB לסט 23 גרם דם אוסף, אינפוזיה. דחף בעדינות על הבוכנה עד צינורות ואת המחט מלאים PB.
      8. הכנס את המחט 23 גרם, מקביל לרמה של IVC subhepatic. אבטח את המחט במקום באמצעות מלחציים hemostatic 4 ס מ.
        הערה: תעלות של subhepatic ש-IVC מועדף בעכברים דיאטה-fed בכך IVC יכול להיות טוב יותר, דמיינו, לצינוריות בתוך החלל מלא שומן.
      9. דחף בעדינות על הבוכנה כדי להתחיל זלוף, צבע יתאפס במהירות מן הכבד (נכון האונה קודם) אם המחט ממוקם כראוי בתוך הכלי. הגדלה של האונות מוצגת גם אם המחט הוכנס כהלכה לתוך IVC subhepatic.
      10. מיד לחתוך וריד שער הכבד כדי לאפשר את PB לזרום בחופשיות דרך הכבד.
      11. Perfuse הכבד עד דם אינה גלויה. לעסות בעדינות מדי פעם אונות הכבד בין קידמה-האצבע והאגודל להקל זלוף.
        הערה: חשוב להשתמש שאינם משונן בכלים להב קהה כדי להתמודד עם הכבד כדי למנוע נזק לרקמות.
      12. כאשר 5 מ ל חמאת בוטנים נותר בתוך המזרק, לשנות המזרק מלא עם מאגר דיסוציאציה ומחוממת מראש. נא לא להפריע את המיקום של המחט מאובטח במהלך תקופה זו.
        הערה: להגדיל כבדי באופן משמעותי העולה על 1.5 g צריך להיות perfused עם נפח גדול יותר של מאגר עיכול ומחוממת מראש כדי להבטיח דיסוציאציה הכבד מוצלחת.
      13. Perfuse הכבד עד מלא מתעכל. לעסות בעדינות אונות הכבד כדי להקל על זלוף.
        הערה: פרידה של הקפסולה של גליסון parenchyma היא נצפות בכבד בהצלחה מעוכל. כדי להעריך את זה, משתמש הקצה הקהה של זוג מלקחיים, ללחוץ בעדינות על האונה השמאלית לרוחב. רושם אמור להופיע על פני השטח ולמלא כניסת צריכים באיטיות ברגע המלקחיים מוסר.
      14. הסר את המחט IVC subhepatic. אל תסיר את המלקחיים hemostatic מחבר חובק למעקה suprahepatic של IVC.
      15. לסלק את כל הכבד על ידי חיתוך בזהירות דרך חיבור הרצועות באמצעות להב ישר קצר לנתח מספריים ולהסיר את כיס המרה.
      16. למקם את הכבד כל ס מ 10-פטרי המכיל 10 מ"ל כקרח שימור מאגר וחנות ב 4 оC עד מוכן לשחרר תאים.
    4. תאי הכבד דיסוציאציה
      1. להעביר את הכבד צלחת 10 ס מ המכיל 10 מ"ל DMEM קר כקרח.
      2. לאחוז את suprahepatic קטועה ש-IVC מצורף אל הכבד נכרת באמצעות מלקחיים במיתולגיות. השתמש בנקודה בינונית מלקחיים כדי לשחרר את התאים כמוסה של גליסון על-ידי החלת הביציות מהירה בכל האונה.
      3. עוברים את DMEM רוויות דרך מסננת תא מיקרומטר 70 מחובר צינור אוסף 50 מ.
      4. Pipet קר כקרח 10 מ"ל DMEM פטרי 10 ס מ, חזור על שלבים 1.2.4.1 עד 1.2.4.3 עד רוויה מדיה נצפית כבר לא. המקום התליה תא על קרח או ב- 4 מעלות צלזיוס.
      5. בעדינות לערבב התליה תא על-ידי היפוך הצינור אוסף, ואז צנטריפוגה ב g x 54 למשך 2 דקות ב 4 º C.
      6. לאסוף את תגובת שיקוע בשפופרת איסוף נקי 50 מ. ואז centrifuge התליה תא ב g x 54 למשך 2 דקות ב 4 º C.
      7. חזור על שלב 1.2.4.6 פעמיים נוספות לפני שתמשיך לשלב 1.2.4.8.
      8. להעביר את תגובת שיקוע צינור נקי 50 מ"ל-אוסף של centrifuge התליה תא ב 300 גרם x 10 דקות ב 4 º C.
      9. מחדש להשעות בגדר תא הלא-parenchymal במאגר FACS, לספור אותם ב קאמרית/hemocytometer Burker.
      10. להעביר עונה 1 פרק 106 תאים (עבור cytometry זרימה בסיסי) או 15 x 106 - 20 x 106 תאים (FACS) הנקרא 5-mL למטה לסיבוב צינורות פוליסטירן. המשך סעיף 2 עבור cytometry זרימה מכתים פרוטוקול.
  3. אבי העורקים בידוד, דיסוציאציה
    הערה: פרוטוקול זה היה ממאמרו של הקצבet al.26
    1. להכין את מאגרי רקמות ספציפיות בהתבסס על המתכונים הניתנים טבלה 1 ולאחסן אותן כמתואר.
    2. הכינו את ריאגנטים הבאים.
      1. הכן המאגר לעיכול על ידי מפשיר נפח מתאים של וואט דיסוציאציה מאגר וחנות ב 4 ° C עד השימוש. מיד לפני השימוש, לחמם את המאגר ל- 37 מעלות צלזיוס.
      2. להכין פתרון הפארין 10 x על ידי המסת הפארין נתרן מלח 1 x PBS ב ריכוז של 200 U/mL. לדלל את 10 x הפארין פתרון מניות עם 1 x PBS להכין 1 x פתרון הפארין. חנות ה-x 10 ו- 1 x הפארין פתרונות ב 4 ° C עד השימוש.
      3. הכנת המאגר FACS עם PBS 1 x המכיל 2% FBS.
    3. דיסקציה של אבי העורקים
      1. המתת חסד עכבר קאמרית פחמן דו-חמצני מלא ולאחר שטיפה עם 70% אתנול.
      2. המקום הצד הבטני העכבר על הבמה לנתיחה, התפשטה העכבר הפורה על כפות הרגליים האחוריות, להדק אותם ללוח לנתיחה באמצעות מחטים 21 G.
      3. מיד לאחר המתות חסד העכבר, לבצע ניקוב הלב. עיין צעדים 1.3.3.4 כדי 1.3.3.9, אם יש צורך בכך.
      4. לאתר הסרעפת בקצה התחתון של עצם החזה
      5. לשם כך, מקם את נקודת אמצע האצבע לרוחב הצוואר של החיה. מעקב לאורך הקו האמצעי הגחון מהצוואר עד הסוף סימטרית של עצם החזה עד סיומת הסחוס מורגשת.
      6. להשתמש מלקחיים נקודת בינוני לתפוס את הסיומת הסחוס, אם יש צורך לסמן את המיקום של הסרעפת על-ידי הסרת התיקון של שיער או עור באזור.
      7. חלקית הכנס מחט 26 גרם תחת הסרעפת בזווית של 20-30 מעלות.
      8. בעדינות להחיל לחץ שלילי על המזרק על ידי לאט נסיגה הבוכנה, ולאחר מכן להוסיף עוד יותר את המחט לתוך החלל עד זורם דם.
      9. אם זרימת הדם נפסק, לאט לסובב את המחט או להזיז מעט פנימה והחוצה
      10. השתמש זוג מלקחיים לתפוס החזק של עור בטן והשתרשה עמוק בלבה השופכה פתיחה של השימוש זוג מספריים ויבתר חדה לחתוך לאורך הקו האמצעי הגחון דרך הצפק מהארבה עד הסנטר.
      11. להפשיל את העור כדי לחשוף אברי הבטן ואת הצלעות עם האצבעות או מלקחיים בוטה בעדינות העבר אברי הבטן בצד.
      12. שימוש המלקחיים לתפוס החזק של הסרעפת, הרם את החזה, תחתכי את הסרעפת.
      13. בעזרת המספריים ויבתר, לחתוך לרוחב הצלעות משני הצדדים. כשתפסת עצם החזה, הפוך את כלוב הצלעות כלפי מעלה, לחתוך הבסיס מחברים. הסר את הצלעות חשיפת האברים בית החזה המשמש כבסיס.
      14. Perfuse העורקים עם מחט 26-מד המצורפת 10 מ"ל-מזרק מלא 1 x הפארין פתרון על ידי הזרקת 1-2 מ של פתרון לתוך החדר השמאלי (LV) של הלב.
        הערה: הקפד perfuse בקצב איטי עם לחץ כדי להבטיח שלמות התרדמה אבי העורקים.
      15. בלו התימוס, בריאות, רקמת חיבור. עיין שלבים 1.3.3.16 ו- 1.3.3.17, במידת הצורך.
        1. והשתרשה עמוק בלבה בלב אתר את הלבן bi אונות (או בצורת פרפר) עוגב ו בחוזקה. להחזיק של בלוטת התימוס עם המלקחיים. . שתי אונות כלפי מעלה לעזוב החלל וחותכים בבסיס עם המספריים.
        2. כדי להסיר את הריאות, קמצוץ של האונה ריאות עם המלקחיים, משוך את הרקמה הרחק בחלל בית-החזה ו חתך בבסיס. חזור על כל באונה נותרת.
      16. השתמש מיקרוסקופ לנתיחה לנתח מיקרו כלים ו לאסוף שאבי העורקים קשת (כולל העורק innominate, עורק תרדמני שמאל בעורק בריחי השמאלי), את עולה, יורד, אבי העורקים החזי ועל הבטן.
        1. אתר של אבי העורקים על החדר השמאלי של הלב.
        2. עם זוג 0.07 מעוקל x מ מ 0.04-טיפ מלקחיים לאחוז בעדינות את החלק של העורקים העולה מן החדר השמאלי.
          הערה: בהשוואה שמסביב ומילא את-צהוב רקמת השומן, אבי העורקים יהיה כלי לבן בהיר שמקורם LV בעת ריקון מספיק עם הפתרון הפארין.
          1. אם אבי העורקים לא הסמיקו כראוי על ידי הלב זלוף, ריקון העורקים שוב בעוד העורקים נשאר מחובר החלל. כדי לעשות זאת, לחתוך ליד צומת לב-העורקים להסיר את הלב, ואז לחתוך אופקית דרך הקצה התחתון של העורק. להכניס מחט 26 גרם הפתיחה של העורקים ותוציאו בעדינות את העורקים עם ה 1 x פתרון הפארין.
          2. בעדינות תבצע אבי העורקים יותר להפלות בין רקמת השומן לבין אבי העורקים מוטבעים.
          3. מושך עדיין בעדינות על העורקים, השתמש קצה סגור באביב לנתח מספריים כדי לנקות את השומן הכומסים את אבי העורקים עולה ואת קשת אבי העורקים. כדי לעשות זאת, קו רקמת השומן עם קצה להבי מספריים סגור כדי לנתק את השומן המחבר.
            הערה: להימנע excising כל רקמת שומן על ידי חיתוך עד אבי העורקים עולה ואת קשת ניתן בבירור לאבחן. זה כדי למנוע חיתוך אבי העורקים.
          4. אם אבי העורקים עולה ואת קשת יכול בבירור מאפשרת של רקמת השומן סראונד, השתמש המעיין לנתח מספריים לסלק עודף שומן.
          5. בעדינות. תפוס את קשת אבי העורקים עם המלקחיים. שוב באמצעות המספריים האביב של העצה, משיכה השומן לאורכו של העורקים יורד, בטן, מותניים עד הסוף סימטרית של אבי העורקים בבטן, עושה זאת על הצד הימני של השרוול של שומן.
          6. ממשיכים להיאחז לאורך העורקים כאשר קורעים משם את השומן. הקפד לעשות בעדינות כדי למנוע פגיעה אבי העורקים.
          7. משוך בעדינות את העורקים כלפי מעלה לכיוון המיקרוסקופ כך השומן ממוקם כעת מאחורי אבי העורקים.
          8. הכנס להבי מספריים סגור בין הממשק שומן-האאורטה ליד הקצה הקדמי של העורקים, חמור המצורף של רקמת השומן אל השטח של אבי העורקים באמצעות תנועה גורף בלשון בוטה.
            הערה: הסרת שומן עודף וחיבור רקמות בעוד העורקים הוא עדיין בתוך החלל הוא מומלץ ביסודיות.
          9. לסלק את הלב וחותכים בקצה סימטרית של העורק הראשי באופן רוחבי. הסר את כל העורקים.
          10. למקם את העורקים בקערה 35 מ מ, להקניט משם כל עודף שומן על העורקים באמצעות שתי מחטים 21-מד. הצב העורקים נכרת בצינור microcentrifuge 1.7 mL על קרח.
    4. דיסוציאציה של אבי העורקים אל תא בודד השעיות
      1. Pipet 0.2 מ"ל העורקים דיסוציאציה מאגר אל הצינור המכיל אבי העורקים. הוסף את להבי מספריים האביב לקראת סוף הצינור מחודדות, במהירות מינצ העורקים כדי להקל על עיכול אנזימטי.
      2. להעביר את התערובת רקמות-פתרון 15 מ"ל אוסף שפופרת, פיפטה 1.8 mL העורקים דיסוציאציה מאגר עבור הנפח הכולל של 2 מ.
        הערה: להעברה קלה של המתלה רקמות, חותכים 1 ס מ מסוף מחודדות טיפ פיפטה 1,000 µL רגיל. שימוש בקצה מקוצר כדי להעביר את הבולם עם micropipette.
      3. דגירה העורקים טחון במאגר דיסוציאציה של אבי העורקים במשך 55 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, רועדת-220 סל"ד (0.514 x g).
      4. עוברים את המתלים 50-מיקרומטר תא מסננת לתוך צינור פוליפרופילן אוסף 15 מ"ל. השתמש את הבוכנה מגומי של פומפה מזרק כדי להקל על סינון.
      5. שטוף הצינורית אוסף 15 מ"ל עם מאגר 1 מ"ל FACS, לאסוף את המתלים ומעבירים דרך מסננת התא.
      6. לשטוף את מסננת תא 50 מיקרומטר שתי שעות נוספות עם מאגר FACS 1 מ"ל.
      7. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב g x 300 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. להשעות מחדש תאים במאגר FACS קר. לספור התאים קאמרית/hemocytometer Burker.
      8. להעביר צינורות פוליסטירן סיבוב המדרגה שכותרתו מ ל 1 x 106 (עבור cytometry זרימה בסיסי) תאים או ההשעיה התא כולו (עבור FACS). המשך סעיף 2 עבור cytometry זרימה מכתים פרוטוקול.

2. flow Cytometry, FACS מכתים

Fluorophore R-Phycoerythrin (PE) PE/Cyanine (Cy) 7 PE/Cyanine (Cy) 5 פסיפיק בלו (PB)
לייזר (אן אם) כחול (488 ננומטר) / צהוב (561-570 ננומטר) - ירוק (532 ננומטר) כחול (488 ננומטר) / צהוב (561-570 ננומטר) - ירוק (532 ננומטר) כחול (488 ננומטר) / צהוב (561-570 ננומטר) - ירוק (532 ננומטר) ויולט (405 ננומטר)
עירורמקס (אן אם) 496 496 496 401
פליטהמקס (אן אם) 578 785 667 455
סמן פנוטיפי F4/80 CD11c CD11b CD45
EMR1, Ly71 אינטגרין αX, אינטגרין p150 שרשרת, CR4, αX, ITGAX ΑM אינטגרין, Mac-1, Mo1, CR3, Ly-40, C3biR, ITGAM T200, Ly-5, LCA
סוג יישוב התא מקרופאגים תושב רקמות מקרופאגים מופעל באופן קלאסי (M1) ומונוציטים / מקרופאגים לויקוציטים (מקרופאגים / ומונוציטים לימפוציטים, גרנולוציטים)
ערכה של תאים דנדריטים תאים דנדריטים, תאי NK, תאי T מופעל, תת-קבוצה של לימפוציטים intraepithelial הנרתיק מעיים (אישור IEL) גרנולוציטים, תאים דנדריטים, תאי NK, קבוצות משנה של תאי T ו- B
גורם לדילול 1:50 בטחונות בטחונות בטחונות
Isotype שולט PE חולדה IgG2a אוגר ארמני PE/Cy7 אג PE/Cy5 חולדה IgG2b עכבר כחול פסיפיק IgG2c

טבלה 2: רשימת fluorophore מתויג נוגדנים ספציפיים עבור מקרופאגים תושב מפלה של רקמות.

  1. לאסוף ולהכין את הפריטים הבאים: FACS מאגר 5 מ"ל סיבוב המדרגה פוליסטירן צינורות, העכבר אנטי Fc CD16/32 קולטן חסימת נוגדן, fluorophore מצומדת או unconjugated נוגדנים העיקרי, fluorophore מצומדת נוגדנים משניים (אם 1 הצורך), x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
    הערה: עבור צביעת כמויות גדולות של תאים, ריכוז נוגדן הוא הקריטי ביותר במקום מספר הטלפון הנייד. לדוגמה, אם 10 x 10 מכתימים6 תאים האחסון מאגר מוכתמים, ריכוז נוגדן צריכה להיות זהה כאילו מכתים 1.0 x 106 תאים בכרך מאגר 100 µL. עבור צביעת 1.0 x 10 מומלץ8 תאים, הגדלת כמות נוגדנים 5 פי.
  2. להוסיף המאגר הנוסף FACS כקרח כל שפופרת FACS במידת הצורך, גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב g 751 x במשך 5 דקות (4 ° C). וארוקן את צנטריפוגה הבאים supernatant.
  3. הוסף העכבר אנטי Fc CD16/CD32 קולטן חסימת נוגדן ל כל הדגימות בהתאם להוראות היצרן. תקופת דגירה של 15 דקות ב 4 ° C או על קרח.
  4. הוסף fluorophore מצומדת קוקטייל ישירות לקולטן Fc המכיל נוגדנים חסימה תא ההשעיה, דגירה העיקרי נוגדן דוגמאות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות הגן על דגימות אור כדי למזער את הלבנה של נוגדנים fluorophore מצומדת.
    1. במקרה unconjugated נוגדנים העיקרי שימשו, בצע את הפעולות הבאות מיד לאחר השלמת שלב 2.4.
    2. שטיפת נוגדן ראשוני מוכתמת דגימות צנטריפוגה-751 g x עבור 5 דקות (4 ° C).
    3. להסיר את תגובת שיקוע על ידי decanting והשהה מחדש צניפה במאגר FACS 100 µL.
    4. להוסיף נוגדנים משניים מצומדת כל דוגמאות הכרחי, תקופת דגירה של 30 דקות ב 4 º C. המשך לשלב 2.5.
  5. הדגירה נוגדן הבאים, להוסיף 2 מ של מאגר FACS קר קרח מכן הצניפה תאים ב 751 x g במשך 5 דקות (4 ° C). Decant תגובת שיקוע ולהיות בטוח שלא להפריע. גלולה.
  6. מערבבים בעדינות תאים להשעות מחדש עם 200-400 µL מאגר FACS, ואז לשמור את זה בחושך ב 4 ° C עד ניתוח cytometry זרימה רגילה או מיון תא.
  7. עבור קיבעון לטווח קצר של תאים מוכתם, המשך 2.8 צעדים כדי 2.10. השתמש קיבוע עבור cytometry זרימה רגילה בלבד.
  8. מחדש מיד לאחר שלב 2.5, להשעות את התאים ב- 0.5 מ ל 2-4% paraformaldehyde (PFA) למשך 15-30 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: זהירות: PFA הוא מגרה ידוע עם השפעות מסרטנים רעילים. בעת שימוש מחברים, לטפל בזהירות מרבית. הקפד להשתמש בציוד מגן אישי המתאים, למצות אוורור.
  9. קיבוע הבאים, לשטוף תאים על-ידי הוספת 2 מ"ל FACS מאגר הדוגמאות, צנטריפוגה-751 g x ב- 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק הסר צנטריפוגה הבאים supernatant.
  10. Resuspend התאים קבוע ב- µL 200 של מאגר FACS קר קרח וחנות ב 4 º C. חנות לתקן תאים עד שבוע 1-4 ° C, אידיאלי לבצע רכישה cytometry זרימה בתוך 48 שעות כדי למזער את autofluorescence.
  11. נתוני cytometry זרימה לפי ההוראות של היצרן cytometer זרימה או לבצע מיון פלואורסצנטי תא מופעל כפי שתואר על ידי Basu et al. 23

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעת שימוש לקוי אפוליפופרוטאין E עכברים (ספקיות KO) C57BL/6 (BL6) שמרו על דיאטה גבוה כולסטרול גבוה שמן (HCHFD או HCD) 18 שבועות, עונה 1 פרק 10-4 - 2 x 104 CD45+F4/80+ מקרופאגים אבי העורקים ניתן לבודד בעת ששתי הדגימות במאגר. כבדי גזור מן HFHCD-fed ספקיות KO עכברים, הפיק גדול מ- 5 x 105 ממוין Kupffer תאים (אשר תלוי זמן פנוי המיון). בעת שימוש בשומן (HFD) ניזון פראי סוג (WT) עכברים C57BL/6, 5 x 105 ל 1 x 106 תושב רקמת שומן מקרופאגים (כספומטים) ניתן למיין מן השבר בכלי הדם סטרומה (SVF). המספר הכולל שהוזכרו של מקרופאגים זה ניתן למיין בין רקמות נתון היה הולם לביצוע ניתוח ביטוי גנטי באמצעות תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת כמותית (qPCR). בשביל לרקמות איפה פחות מספרים של אוכלוסיות מקרופאג התאוששו, כגון אבי העורקים, מומלץ להשתמש precipitants משותף (למשל גליקוגן) והמשקעים לילה כאשר לבודד את ה-RNA נדרשת עבור ניתוחים אלה.

. כאן, ההשפעות של תזונה-induced הפרעות מטבוליות על פנוטיפ מקרופאג שימוש בסיסי לזרום cytometry תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS), מיון במורד הזרם פוסט ניתוחי מוצגים. ממצאים אלה לאמת תצפיות שפורסמו בעבר כי עכברים נמאס של חדירה בנספח גדל HFD או HFHCD של מקרופאגים (M1) מופעל באופן קלאסי ברקמות המושפע כגון אבי העורקים (איור 1B). ניצול של cytometry זרימה FACS, פרופיל ביטוי גנטי (via כמותיים תגובת שרשרת פולימראזית (qPCR), פנוטיפ הבולטות עבור רון קולטן טירוזין קינאז-לבטא CD45+ F4/80+ מקרופאגים נגזר רקמות מבודד מן הדיאטה-fed עכברים נצפתה. רון מביע קולטן אבי העורקים מקרופאגים אשר הפגינו של פנוטיפ אנטי דלקתיות ירדו בעכברים HFHCD-fed (איור 1C ו- D). מקרופאגים לבטא קולטן רון ממוינים נגזר arginase מוגברת והפגינו aortas מתעכל 1 ביטוי גנים (Arg1), המהווה סמן מקרופאג M2 ומבוססת (איור 1E). מקרופאגים הפרו דלקתי אשר מאופיינים כמו CD45+ F4/80+ CD11c+ היו עלה ב aortas מבודד HFHCD-fed עכברים (איור 1B ו- D). אפיון הכבד תושב מקרופאגים נוספים מבואר על פנוטיפ הרווחת של רון מביע קולטן subpopulations (איור 2 א). CD11c + מקרופאג הפרו דלקתיים אוכלוסיות הדגים ביטוי ירידה של גנים הקשורים חריפה פנוטיפ (M2) אנטי דלקתיות כגון Arg1 ורון (איור 2B). מגמות דומות נצפו באוכלוסיות מקרופאג מבודד מתעכל שומן לבן (איור 3). מקרופאג אוכלוסייה עם חתימה הפרו דלקתיים הראה ירידה בביטוי משטח של הקולטן רון (איור 3). שילוב של גישות, cytometry זרימה בסיסיים, FACS, הביא נתונים חד משמעי יותר מאמת את הקולטן רון כרגולטור של הפעלת חלופי (M2) ב מקרופאגים32. כזה הטיה לכיוון פנוטיפ (M2) אנטי דלקתיות הוכח לשחק תפקיד מגן התפתחות והתקדמות של השמנת יתר, טרשת עורקים, steatohepatitis31.

Figure 1
איור 1: אפיון של מקרופאגים מבודד מן העורקים הפומבית יוסר ספקיות KO עכברים לתחזק HCD 18 שבועות. (א) התאים היו קודם מגודרת על CD45+ לויקוציטים, למעט פסולת הסלולר. CD45 (B) צביעת בשיתוף עם F4/80 משמש ניסחו זוגי אוכלוסיות חיובי אוכל מקרופאגים. Gating נוספים השתמשו כדי להדגים את אחוז CD11c+CD45+F4/80+ (M1) ורון (C)+CD45+F4/80+ (פוטנציאל M2) מקרופאגים ב aortas נגזר מן העכברים ניזונו גם צ'או נורמלי או תזונה כולסטרול גבוה עבור 18 שבועות. (ד) גדל אחוז CD11c+CD45+F4/80+ (M1) מקרופאגים, כמו גם אחוז ירידה של רון+CD45+F4/80+ (פוטנציאל M2) מקרופאגים נצפתה aortas נגזר עכברים שקיבלו HCD לעומת עכברים שקיבלו תזונה נורמלית צ'או. (E) ביטוי ניתוח גנטי של רון ממוינים+CD45+מקרופאגים F4/80+ הפגינו ביטוי מוגבר של arginase אני (ידועים מאתר M2 סמן). ערכים התקבלו באמצעות מבחן t ניתוחים הסטודנט שבוצעו באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי ומיוצגים אומר ± P ב- SEM < 0.05 נחשב משמעותי סטטיסטית (* P < 0.05, * * * P < 0.001). דמות שונה מיו. et al. (2016) 31. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ג'ין התעתיק פרופיל של אוכלוסיות תא Kupffer מיון של כבדי מתעכל ביתר של עכברים ספקיות KO לתחזק HCD 18 שבועות. (א) סכימת חסימה כללית אפיון ומיון אוכלוסיות תאים Kupffer. (B) ניתוח ביטוי גנטי של מיון רון מביע (רון+) ולבטא ללא-(רון) CD45+F4/80+ מקרופאגים מאת RT-PCR כמותי. מבחן t ניתוחים של סטודנט בוצעו באמצעות תוכנה סטטיסטית ואת הערכים היו מיוצגים אומר ± < 0.05 נחשב סטטיסטית P ב- SEM (* P < 0.05, * * * P < 0.001). דמות שונה מיו. et al. (2016) 31 . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: אפיון של כספומטים מבודד שומן לבן גזור מן WT BL6 עכברים האכיל HFD של 18 שבועות. ערכת חסימה כללית (A) אפיון ומיון רקמת שומן נגזר מקרופאג אוכלוסיות (B) אחוז של רון + תאים בתוך CD45+F4/80+CD11c, CD45+F4/80+CD11c+ אוכלוסיות מקרופאג ממוין של וואט. דמות שונה מיו. et al. (2016) 31 . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

דיאטה-induced הפרעות מטבוליות בדגמי לחקות morbidities שיתוף כגון טרשת עורקים, steatosis פשוטה, steatohepatitis ואף סוכרת מסוג 2 נמצאים בשימוש נרחב כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס של התקדמות המחלה. עיכול תלויים collagenase משמש לעתים קרובות מביצועם רקמות לשחרר תאים16,מטריצה חוץ-תאית (ECM)27. אנזימים כמו collagenase לשבש קולגן אשר מספק תמיכה מבנית השכנה תאים. הקומפוזיציה של הרקמות מבנית מכתיבה את הקשיחות מטריקס רקמות (התנגדות דפורמציה), איזה מוצר collagenase גולמי היעילה ביותר להבטיח ECM מוצלחת הפרעה28. וואט, אשר מורכב של "מטריקס רך" מתעכלת לעתים קרובות עם Collagenase Type II לשחרור adipocytes ו תאי מערכת החיסון תושב תוך שמירה על שלמות התא לאינסולין משטח קולטנים29בו זמנית. המיקרו-ארכיטקטורה של הרכיבים fibril של אבי העורקים תורמת למטריקס"נוקשה", אשר משמש יעיל לעיכול אבי העורקים עם סוג collagenase XI (אשר הפעילות collagenase הגבוהה ביותר) בשילוב עם אנזימים נוספים. בניגוד העורקים, העיכול הכבד משתמש של collagenase עם פעילות אנזימטי חלש יותר, Collagenase הסוג הרביעי, כדי לשבש את המטריקס, לשחרר תאים parenchymal ו- parenchymal קיימא30. רקמות דלקתי כרוני נגזר דיאטה-fed פראי סוג או לקויה אפוליפופרוטאין E (ספקיות KO) עכברים על C57BL6 רקע עוברים לעיתים שיפוץ שיכול למנוע עיכול אנזימטי נאותה. בסעיף זה נדון אסטרטגיות כדי למזער או לבטל את האפשרות של רקמות פסולים דיסוציאציה ושחזור תא נמוך.

תכונה נפוצה של רקמות נגזר מודלים העכבר דיאטה-fed המחקים השמנה, טרשת עורקים, ו/או מחלת כבד שומני לא אלכוהוליים, היא רקמה נורמלית שיפוץ. שומן לבן, האאורטה ולאחר הכבד, ECM הרכב משתנה, לעיתים קרובות כתוצאה בעדות מוגזמת של רכיבים fibrillar כגון collagens. עכברים C57BL6 פראי סוג המתוחזקים על דיאטה שומן גבוהה במשך עשרה שבועות, לחוות רקמות ספציפיות חריגות כגון שומן לבן המורחב למונוגרפיה כבד שומני (steatosis פשוטה). לעתים קרובות פעמים תכונות מטבוליות אלה אינם מכשולים בעייתי להתגבר במהלך תהליך דיסוציאציה רקמות... מצד שני, דגמים אחרים-דיאטה המושרה במראה יותר פנוטיפים החמירה, שיפוץ נרחב של רקמת יכול להוות בעיה במהלך העיכול רקמות. HFHCD ניזונים עכברים ספקיות KO משמשות לעתים קרובות כדי דגם טרשת עורקים, steatohepatitis. תכונה נפוצה המשויך steatohepatitis מתקדם היא בתצהיר מוגזמת של ECM הכבד (או פיברוזיס). הכבד שהותירה הוכח להיות די בעיתיים במהלך רקמות אנזימטי דיסוציאציה ומייצרת לעיתים קרובות תשואה נמוכה תא31. כדי לשפר את התשואה תא, חיוני כי הפרוטוקולים עיכול להיות אחריו ללא סטייה. למרות כבדי נורמלי יכול להיות טחון, שקוע בתוך מאגר לעיכול כדי להשיג דיסוציאציה, זלוף עם מאגר עיכול הגדלת מגע בין מטריצות של הכבד לבין הפתרון collagenase; ולכן גישה זו מומלצת מאוד. בנוסף, 20-30 מ של עיכול מאגר לעתים קרובות אמצעי אחסון נאותים על דיסוציאציה מוצלחת של כבדי נורמלי; עם זאת, לגבי העכבר בדגמי לפתח מוגדלת ו/או שהותירה כבדי, זלוף עם 50 מ של עיכול מאגר העדיף כדי להבטיח ולעיכול תקין תוך מזעור מוות של תאים. כבדים עם משקולות החורגות באופן משמעותי 1.5 g, הגדלת הנפח של מאגר העיכול מומלץ כדי להבטיח מערכת העיכול מוצלחת.

רקמה הבעיה סיבה אפשרית פתרון
שומן לבן (וואט) דיסוציאציה תא המסכן עיכול ודא מאגר עיכול-37° C
מוות תאי עיכול collagenase מוגזמת לקצר את זמן העיכול
להפחית את עוצמת הקול של עיכול מאגר
אבי העורקים דיסוציאציה תא המסכן עיכול ודא מאגר עיכול הוא ב 37 ° C
אבי העורקים חתיכות במאגר עיכול היו גדולים מדי ודא כי אבי העורקים הוא לחתוך לחתיכות 1 מ מ
אבי העורקים-חתיכות רעדו לא במאגר דיסוציאציה במהלך הדגירה להיות בטוח העורקים-חתיכות רועדות בפתרון מערכת העיכול
מוות תאי עיכול collagenase מוגזמת לקצר את זמן העיכול
להפחית את עוצמת הקול של עיכול מאגר
הכבד דיסוציאציה תא המסכן עיכול ודא מאגר עיכול הוא ב 37 ° C
להגביר את עוצמת הקול של עיכול מאגר
תעלות פסולים של IVC (הנפיחות של הרקמות שמסביב IVC מתרחשת) להיות בטוח המחט הוכנס כהלכה לתוך IVC
IVC קרע מחט מאובטח כראוי ב- IVC לפני זלוף
להפחית מהירות זלוף
רקמות קרע להפחית מהירות זלוף
מוות תאי שחרור לא תקין של תאים הכמוסה של גליסון הקפד מביצועם תאים באמצעות קפסולה שכבר שוחחנו ללטף שיטה
עיכול collagenase מוגזמת לקצר את זמן העיכול
להפחית את עוצמת הקול של עיכול מאגר

טבלה 3: פתרון בעיות רקמות לא מוצלח דיסוציאציה. Flow cytometry המבוסס על מיון תא או FACS היא טכניקה חזקה לבידוד תא אוכלוסיות היכן טוהר גבוהה היא הכרח. כאשר לטיהור תאים על-ידי התא מיון, להשגת תשואה גבוהה תא, אלא גם סוג טוהר גבוהה מחייבת שימוש אסטרטגיות המיון הנכון. בסעיף זה, שיטות לשיפור רב-fluorophore זורמים מיון מבוססי cytometry תא של רקמת מקרופאג תושב נגזר עכברים דיאטה-fed מתוארים. לבידוד מקרופאג תושב רקמות שונות, משטח סמן הבחירה היא שלב קריטי. מקרופאגים נגזר וואט, אבי העורקים, והם כבד לעיתים קרובות מכובד באמצעות CD45 של+, CD11b+, F4/80+ gating אסטרטגיה. לוחות cytometric זרימה נוספים יכול לשמש לזיהוי רקמת תושב מקרופאגים. לוחות אלה כוללים נוגדנים אשר מנצלים הביטוי משטח של macrophage glycoproteins ספציפיים (CD64, CD68, CD14), מרכזי histocompatibility מתחמי (MHCII), מוות תא טירוזין קינאז רצפטורים (MerTK)32, 33. פנוטיפ ספציפי מקרופאג אז יכול להיות המותווית על ידי בודק את הביטוי משטח סלקטיבי של M2 (CD163, CD209 ו- CD206) או M1 סמנים (CD38, CD40, CD80 ו CD86)34,35. Auto-זריחה שנוצר על ידי מקרופאגים עמוסי השומנים יכול להציג כמה בעיות כאשר gating אוכלוסיות. באמצעות נוגדנים מתויג עם fluorochromes זה נרגשים על ידי לייזר ירוק-צהוב (כמו PE, PE/Cy5, PE/Cy7) או לייזר אדומה (כמו APC, APC Cy7) גורמת קרינה פלואורסצנטית הנפלט זה משמעותי בהיר יותר האוטומטי-זריחה, וכך ניתן לשפר תוצאות36. בעת בחירת fluorophore conjugates עם כזה גבוהה מכתימים אינדקס ופוטנציאל ספקטרום הפליטה חפיפה, ההכללה של הפקדים המתאימים הוא קריטי. בשעת זיהוי גבולות המגביל, הכללת פקדי יחיד כתם (הה) ופקדי isotype לאפשר את התיחום של אוכלוסיות חיובי/שלילי, מדידת אות שאינם ספציפיים רקע הנגרמת על ידי נוגדנים העיקרי, בהתאמה 37. בנסיבות שבו תאים נדירים, מומלץ להשתמש חלקיקים פיצוי עבור האס. אס ו- isotype. חלקיקי פיצוי בדרך כלל פולטים אותות בהירים יותר פקדים ביולוגית, יש גם פחות סטיה רקע זריחה. בנוסף, זריחה מינוס אחד פקדים (FMO) הינם אידיאליים עבור בהתוויית גבולות חסימה. מאת כולל פקדי FMO, פלורסצנטיות המקסימלי הצפוי תת-קבוצה מכתימים מתגלה בערוץ נתון מתויג fluorochrome נוגדן ספציפי על הערוץ פלורסצנטיות המסוים הזה הוא שלא נכללו38. מניסיוננו, בנוסף פקדים חלקיק יחיד פיצוי מוכתם, פקד מוכתם השוואה ביולוגי צריך להיות כלולות עבור הצבת גבולות חיובי/שלילי מדויקת יותר.

למעט פסולת הסלולר תא אגרגטים באסטרטגיית המגביל הוא גם גישה נוספת המשמשת להקטנת אוטומטי-זריחה. כדי להבחין פסולת הסלולר לבין האוכלוסייה קיימא תא, באמצעות פיזור קדמי (FSC) ופיזור צד (האס) הוא המגביל האסטרטגיה השכיחה ביותר. עבור תאים מבודדים זה ישמש עבור ניתוחים מיון פוסט ודורשים הכדאיות גבוה יותר עבור ה-DNA/RNA עקירות, מומלץ כי כתמי הכדאיות לא לשמש בהליכים קיבוע ו/או permeabilization. פורמלדהיד תיקון של תאים ניתן להתפשר חומצת גרעין היושרה עקב חומצות גרעין-חלבון crosslinking, ובכך להגביל את יעילות בידוד, זיהוי, כימות מדויק. תא אגרגטים כפי שהוזכר קודם לכן לא יכול רק לתרום שנפלטת רכב-פלורסנט אותות, אך גם התוצאה ב- "ביטול של מקרים". פעולה כזו מתרחשת כדי לשמור על טוהר גבוהה במיון אבל אם יותר מדי תכופות, זה מפחית את התשואה הסלולרי ממויינת. מאגר מיון (FACS מאגר) בתוספת DNAse ו MgCl2 במהלך צביעת תאים באפשרותך למזער תא צבירה. מומלץ לא להשתמש EDTA בשילוב עם DNAse כפי שהיא מעכב הפעילות של האנזים. סינון התליה תא בודד דרך מסננת תא מיקרומטר 70 לפני מיון יכול לשחרר גם תאים אגרגטים. חשוב לציין כי כדי למזער צבירה, המתלים התא צריך להיות בריכוז של 5 מיליון תאים לכל מ ל נפח מינימלי של 0.4 mL. תאים מבודדים מן השומנים לאדן רקמות נוטים יותר נוטה צבירת ואת התוצאה יכולה להיות צירוף מקרים ביטול של ועם תשואה נמוכה מיון. מומלץ כי דגימות נוספות הן מדולל אם צבירת נמשכת. מקרופאגים ממוינים ניתן לאסוף צינורות פוליפרופילן סיבוב המדרגה אוסף המכיל עוברית בינוני עשיר שור כדי ששחזור התא. ריכוז FBS גבוה הראשונית מבטיחה התאוששות תא מאז הריכוז בסופו של דבר הופך להיות מדולל עם כל droplet הממוין. איסוף תאים אשר ישמשו לצורך ניתוח DNA או RNA, ניתן למיין תאים ישירות לתוך הכימית החילוץ המתאים (למשל TriZol) כדי למנוע זיהום RNAse. בעת מיון העוצמות הגבוהות, מיון תאים לתוך תרבות המדיה עם ריכוז נמוך יותר של FBS, מומלץ תחילה. מיד לאחר מיון, תאים צריך להיות מגורען ואז lysed להפקת DNA/RNA. החומר הגנטי מבודד יכול אז שיהיה עליי פרופיל עבור ביטוי גנים שהשתנו. גנים פרו דלקתיים כולל TNFα, IL1-β, IL-6, IL-12, 1 ליטר-23, IFNγ, Nos2 ו- MCP1 (CCL2) הם לעתים קרובות upregulated של מקרופאגים מפגין פנוטיפ (M1) מופעל באופן קלאסי39. מצד שני, לחלופין מופעל פנוטיפ (M2) ב מקרופאגים מסומן לעתים קרובות על ידי אינדוקציה של גנים קידוד Chi3l3 (Ym1),34,Fizz1, Arginase 1, CD206, CD163, CD209 1 ליטר-10 ו- TGFβ40. לאחרונה, CD38, Fpr2 ו- Gpr18 יש כבר תוקף גנים ספציפיים M1 ו c-Myc. Egr2 כמו גנים ספציפיים M234.

למרות מיון תא מבוססי cytometry זרימה צבע רב הוא כלי רב ערך עבור בידוד מקרופאגים-טוהר גבוהה, גישה זו עשויה להיות יקרה. יתרונות עוצמה FACS מתווכת מיון תלויות אנשי תפעול יכול לתמרן עם סדרן התא בנוסף העלות הגבוהה של ריאגנטים תחזוקה סדרן התא. גישות אלטרנטיביות יכול לשמש תחליף של זרימה יקר cytometry המבוסס על התא מיון. הם כוללים מגנטי התא מופעל מיון (מקינטוש) או צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות. התא הראשון חלופה מיון שיטת הזכירה מקיפה מגנטית ו/או microbead עמודה אלייזה תאים עניין להפריד דם או רקמות מוצק41. התא השני מיון גישה מפרידה השעיה תא הטרוגנית בהתבסס על צפיפות וכוח צנטריפוגה. למרבה הצער, צפיפות מתווכת צנטריפוגה אינה מעשית לבידוד מקרופאגים מן העורקים או וואט-נגזר המתלים תא בודד. לעיתים קרובות, התוצר המתקבל צנטריפוגה דיפרנציאלית מזוהם, תשואה נמוכה. כתוצאה מכך, רקמות קטנים יותר (כגון האאורטה או וואט) לגרום לכמה תאים בתחילה בעקבות עיכול אנזימטי אינם מועמדים אידיאליים עבור צנטריפוגה דיפרנציאלית. מצד שני, המתלים תא נגזר הפומבית כבדי יכול לייצר מספר מקרופאגים ממוינים יכול לשמש פוסט מיון ניסויים וניתוחים כגון תרבות stimulations, qPCR או ניתוח סופג המערבי. גישות חלופיות אלה יכולים לשמש גם להעשיר את אוכלוסיות לפני FACS, המאפשר ניקוי מיני. ראוי לציין, מקרופאגים תושב רקמות מהווים אחוז קטן מהאוכלוסיה התא כולו וואט, הכבד, אבי העורקים. העשרה של תאים לפני מיון FACS כבר גישה כאשר בידוד אוכלוסיות של תא בתדירות נמוכה. בעיה אחת זה משותף לבודד אוכלוסיות קטנות היא תא גדול זה מספרים חייב להיות מעובד להשיג מספיק תאים לצורך ניתוח מאוחר יותר. העשרה או -מיון יכול לשמש כדי לפתור בעיה כזו. שיטה זו מסייעת בהשגת אוכלוסיה יותר תמציתי של תאים דרך הבחירה חיוביים ושליליים אך זה גם מאפשר שימור של זמן כמו FACS מיון יכול להיות תהליך הנמשך לאורך זמן עבור מקורות רקמה צפופה כמו הכבד.

התפתחויות אחרונות בביולוגיה דלקת להדגיש את החשיבות של אפיון פנוטיפי ופונקציונליים של הטרוגניות מקרופאג כדי לקדם את ההבנה של תפקיד מורכב של תאים חיסוניים אלה בוויסות דלקת כרונית. בקצרה, פרוטוקול זה מקיף מספק גישה רב ממדית כדי אפיון רקמות מקרופאגים תושב רקמות הולמרק שלוש למד ב השמנה דיאטה הוקמה המושרה ומודלים דלקת. יותר חשוב פרוטוקול זה לוקח בחשבון את הקושי, האמצעים הדרושים לבודד נקי ופנויה המתלים תא מ dysregulated דלקתי ברקמות כגון וואט, שלטי אבי העורקים, כבד שומני. הפרוטוקול מאפשר החוקר להחיל cytometry זרימה FACS כלי המיון במימד חדשנית לאפיון מקרופאגים תושב רקמות, הרגולטורים מפתח דלקת ההשמנה. אפיון מעמיק של מקרופאג המלאכותיות יכולה לספק תובנות מונוציט סחר ברקמות מודלק ולאפשר המשך הערכות מכניסטית דרך מספר רב של גישות ניסיוניות ב מקרופאגים הממוין. אפיון נוסף של אוכלוסיות מקרופאג יכול לספק תובנה של מרכזי ביולוגי. הפסיכולוגי המסדירים הטרוגניות מקרופאג על בריאות ומחלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לעורכים יש אינטרסים לא לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות על המתקן הליבה Cytometry זרימה ב- פנסילבניה המדינה אוניברסיטת המילניום מדע מורכבים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26 G x 5/8 in Needles BD 305115
23 G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set BD 367297 Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion
21 G 1 1/2 in. Needles BD 305156
1 mL syringe with rubber stops BD 309659
10 mL Syringes BD 309604
1 mL Syringe BD 309659
F4/80 PE Biolegend 123110
CD11c PE/Cy7 Biolegend 117318
CD11b PE/Cy5 eBioscience 15-0112-81
Anti-mouse CD16/32 Fc Block  Biolegend 101320
CD45 Pacific Blue Biolegend 103126
PE Rat IgG2a Biolegend 400508
PE/Cy7 Armenian Hamster IgG Biolegend 400922
PE/Cy5 Rat IgG2b Biolegend 400610
Pacific Blue Rat IgG2c Biolegend 400717
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)  Cellgro 15-017-CV
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) Cellgro 21-031-CV
70 μm cell strainers Corning, Inc. 352350
1.7 mL microcentrifuge tube  Denville C2170
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16x Electron Microscopy Sciences CAS #30525-89-4
Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23 mm, Sharp  Stoelting 52132-10P Used for general dissecting purposes
Micro Forceps, 4 inches, full curve, 0.8 mm Stoelting 52102-37P  Used for general dissecting purposes
Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge  Fine Science Tool 15000-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Curved 0.07 mm x 0.04 mm Tip Forceps Fine Science Tool 11297-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Hemostatic Forceps (Curved) Fine Science Tool 13021-12
Heparin Sodium Salt Fischer Scientific 9041-08-1
35 mm Cell Culture/Petri Dishes Fischer Scientific 12-565-90
Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid Fischer Scientific 08-757-100D
15 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-959-53A
50 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-432-22
5 mL Round-Bottom Polystyrene Tubes  Fischer Scientific 14-959-5
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-Products 100-106
Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) Millipore EX0285-1
Bovine Serum Albumin Rockland BSA-50
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6885
Collagenasse Type XI Sigma-Aldrich C7657
Hyaluronidase Type I Sigma-Aldrich H3506
DNAse Sigma-Aldrich DN25
Collagenase Type I Sigma-Aldrich C0130
NaOH Sigma Aldrich 1310-73-2 
CaCl2 Sigma Aldrich 449709-10G
500 mL beaker  Sigma Aldrich 02-540M
4 cm Hemostatic clamp Stoelting 52120-40
Toothed forceps Stoelting 52104-33P
50 μm Disposable filters Systemex 04-0042-2317
Collagenase Type IV ThermoFischer Scientific 17104019
Ammonium Chloride Potassium (ACK) ThermoFischer Scientific  A1049201
Razors (0.22 mm (0.009")) VWR International 55411-050
Texas Red Live/Dead stain Red viability stain (in Figure 1A)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davies, L. C., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages: Then and Now. Immunology. 144, (4), 541-548 (2015).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, (12), 840-846 (2006).
  3. Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444, (12), 875-880 (2006).
  4. Jung, U., Choi, M. -S. Obesity and Its Metabolic Complications: The Role of Adipokines and the Relationship between Obesity, Inflammation, Insulin Resistance, Dyslipidemia and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Int J Mol Sci. 15, (4), 6184-6223 (2014).
  5. Emanuela, F., Grazia, M., Marco, D. R., Maria Paola, L., Giorgio, F., Marco, B. Inflammation as a link between obesity and metabolic syndrome. Nutr Metab. 2012, 1-7 (2012).
  6. Vieira-Potter, V. J. Inflammation and macrophage modulation in adipose tissues. Cell Microbiol. 16, (10), 1484-1492 (2014).
  7. Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. S. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11, (11), 738-749 (2011).
  8. Dey, A., Allen, J., Hankey-giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation : blood monocytes versus tissue macrophages. Front Immunol. 5, (1), 1-15 (2015).
  9. Mills, C. D., Lenz, L. L., Ley, K. Macrophages at the fork in the road to health or disease. Front Immunol. 6, (2), 1-6 (2015).
  10. Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Front Immunol. 5, (8), 1-22 (2014).
  11. Guilherme, A., Virbasius, J. V., Vishwajeet, P., Czech, M. P. Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, (5), 367-377 (2008).
  12. Cummins, T. D., Holden, C. R., et al. Metabolic remodeling of white adipose tissue in obesity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307, (3), 262-277 (2014).
  13. Fujisaka, S., Usui, I., et al. Regulatory Mechanisms for Adipose Tissue M1 and M2 Macrophages in Diet Induced Obese Mice. Diabetes. 58, (9), 2574-2582 (2009).
  14. Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotipic switch in adipose tissue macrophage polarization. J Clin Invest. 117, (1), 175-184 (2007).
  15. Qureshi, K., Abrams, G. A. Metabolic liver disease of obesity and role of adipose tissue in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 13, (26), 3540-3553 (2007).
  16. Bedossa, P., Paradis, V. Liver extracellular matrix in health and disease. J Pathol. 200, (4), 504-515 (2003).
  17. Tilg, H., Moschen, A. R. Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease: The multiple parallel hits hypothesis. Hepatology. 52, (5), 1836-1846 (2010).
  18. Milic, S., Lulic, D., Stimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: Biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20, (28), 9330-9337 (2014).
  19. Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. Int J Obesity. 26, (12), 754-764 (2002).
  20. Mestas, J., Ley, K. Monocyte-Endothelial Cell Interactions in the Development of Atherosclerosis. Trends Cardiovasc Med. 18, (6), 228-232 (2008).
  21. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496, (7446), 445-455 (2013).
  22. Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nat Rev Immunol. 14, (10), 986-995 (2013).
  23. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), e1546 (2010).
  24. Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. J Vis Exp. (94), e52174 (2014).
  25. Smedsrød, B. Protocol for preparation of mouse liver Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells. 1, Available from: http://munin.uit.no/handle/10037/4575 1-10 (2012).
  26. Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J Vis Exp. (53), e2848 (2011).
  27. Salamone, M., Saladino, S., Pampalone, M. Tissue Dissociation and Primary Cells Isolation Using Recombinant Collagenases Class I and II. Chemical Engineering Transactions. 38, Matsushita 1994 247-252 (2014).
  28. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, (4), 1394-1400 (2008).
  29. Fain, J. N. Isolation of Free Brown and White Fat Cells. Diabetologia. 375, (1964), 555-561 (1968).
  30. Seglen, P. Preparation of isolated rat liver cells. Method Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
  31. Yu, S., Allen, J. N., et al. The Ron Receptor Tyrosine Kinase Regulates Macrophage Heterogeneity and Plays a Protective Role in Diet-Induced Obesity, Atherosclerosis, and Hepatosteatosis. J Immunol. 197, (1), 256-265 (2016).
  32. Yu, Y. R. A., O'Koren, E. G., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS ONE. 11, (3), 1-23 (2016).
  33. Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires "M2c" polarization and MerTK induction. J Immunol. 100, (2), 130-134 (2012).
  34. Jablonski, K. A., Amici, S. A., et al. Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages. PLoS ONE. 10, (12), 5-11 (2015).
  35. Rőszer, T. Understanding the Mysterious M2 Macrophage through Activation Markers and Effector Mechanisms. Mediators of Inflamm. 2015, 1-16 (2015).
  36. Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow Cytometry Analysis of Adipose Tissue Macrophages. Methods Enzymol. 4, (164), 297-314 (2011).
  37. Kim, Y. -J., Brox, T., Feiden, W., Weickert, J. Technical Note: Flow Cytometry Controls, Instrument Setup, and the Determination of Positivity. Cytometry A. 71, (1), 8-15 (2007).
  38. Tung, J. W., Heydari, K., et al. Modern Flow Cytometry: A Practical Approach. Clin Lab Med. 27, (3), 453-468 (2007).
  39. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000. 6, (3), 13 (2014).
  40. Porcheray, F., Viaud, S., et al. Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation. Clin Exp Immunol. 142, (3), 481-489 (2005).
  41. Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment. Rep Prog Phys. 1, (78), 1-6 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics