Isolatie, karakterisering en zuivering van macrofagen uit weefsels beïnvloed door zwaarlijvigheidbetrekking hebbende ontsteking

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit protocol kan een onderzoeker te isoleren en karakteriseren weefsel-ingezeten macrofagen in diverse hallmark ontstoken weefsels dieet-geïnduceerde modellen van metabolische wanorde is onttrokken.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Allen, J. N., Dey, A., Nissly, R., Fraser, J., Yu, S., Balandaram, G., Peters, J. M., Hankey-Giblin, P. A. Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation. J. Vis. Exp. (122), e55445, doi:10.3791/55445 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Obesitas bevordert een chronische inflammatoire staat die is grotendeels gemedieerd door weefsel-ingezeten macrofagen evenals monocyt-afgeleide macrofagen. Dieet-geïnduceerde obesitas (DIO) is een waardevol model bij het bestuderen van de rol van macrofaag heterogeniteit; voldoende macrofaag isolatie zijn echter moeilijk te verwerven van ontstoken weefsels. In dit protocol, duidelijk naar voren komt de isolatie stappen en de nodige richtlijnen voor troubleshooting afgeleid van onze studies voor het verkrijgen van een geschikt bevolking van weefsel-ingezeten macrofagen van muizen na 18 weken van hoog-vet (HFD) of hoog-vet/hoog-cholesterol) HFHCD) dieet interventie. Dit protocol is gericht op drie hallmark weefsels in zwaarlijvigheid en atherosclerose, met inbegrip van de lever en wit vetweefsel (WAT) de aorta bestudeerd. We benadrukken hoe dualistische gebruik van stroom cytometry kan bereiken een nieuwe dimensie van isolatie en karakterisatie van weefsel-ingezeten macrofagen. Een fundamentele deel van dit protocol adressen de fijne kneepjes onderliggende weefsel-specifieke enzymatische spijsvertering en macrofaag isolatie en latere celoppervlak antilichaam kleuring voor flow cytometrische analyse. Dit protocol adressen bestaande complexiteit onderliggende TL-activated cell sorting (FACS) en presenteert deze complexe situatie teneinde de karakterisering van de breed scala van voldoende gesorteerde cel populaties verduidelijkingen. Verrijking van de alternatieve methoden zijn opgenomen voor het sorteren van de cellen, zoals de dichte lever, waardoor flexibiliteit en time management bij het werken met FACS. Kortom, dit protocol helpt de onderzoeker te evalueren macrofaag heterogeniteit uit een veelheid van ontstoken weefsels in een bepaalde studie en biedt inzichtelijke tips voor probleemoplossing die zijn geslaagd voor gunstige cellulaire isolatie en karakterisatie van immuuncellen in DIO-gemedieerde ontsteking.

Introduction

Muismodellen zijn uitvoerig gebruikt om de dynamiek van ziekten bij de mens te bestuderen. Goede isolatie van resident weefselcellen van muizen in een zieke toestand kan een platform bieden voor het begrip van de moleculaire en cellulaire bijdragen aan de pathogenese van een ziekte1. Een stoornis die is van cruciaal belang is obesitas. De incidentie van obesitas blijft stijgen wereldwijd parallel met insulineresistentie en type 2 diabetes mellitus, hart-en vaatziekten en vette lever ziekte2,3. Overmatige consumptie van nutriënten is verder vertekend door verminderde fysieke activiteit triggering veranderde signalen afkomstig van vetweefsel, die de cellulaire omgeving van andere perifere weefsels zoals de aorta en de lever4 veranderen kan. Dergelijke verstoring van metabole homeostase resulteert in een chronische lage rang systemische ontsteking5.

Klassieke activering van macrofagen ingezetene aan de aorta en lever evenals hun aanwerving aan witte adipeus weefsel (WAT) heeft aangetoond dat niet alleen initiëren disregulatie van metabole signalen maar ook ondersteunen ontsteking6,7. De fenotypische en functionele heterogeniteit van macrofagen is sterk geassocieerd met de pathogenese van obesitas gerelateerde co-morbiditeit7. De dynamische plasticiteit in macrofaag polarisatie voorziet in deze cellen te exposeren een aantal geactiveerde fenotypen die de progressie coördineren en resolutie van ontsteking8. Terwijl klassiek geactiveerd (M1) macrofagen zijn betrokken bij de verspreiding van de ontsteking, zijn als alternatief geactiveerd (M2) macrofagen geassocieerd met resolutie en weefsel reparatie9,10.

Als het lichaam metabole stress ondergaat, witte vetweefsel abnormaal worden bij elkaar opgeteld. De uitgebreide adipeus weefsel aantrekt en behoudt ontstekingscellen die normale adipocyte functie ter bevordering van insulineresistentie, hyperglycemie en uiteindelijk diabetes mellitus type 2, insulineresistentie of hyperglykemie11, ingrijpend te veranderen 12. Parallel, witte vetweefsel vernieuwt in reactie op inflammatoire signalen vrijgegeven door geïnfiltreerd klassiek geactiveerd (M1) adipeus weefsel macrofagen (geldautomaten)13,14. Deze multi-cellulaire orgel oefent een cascade van signalen die de normale functie van andere lichaamsorganen zoals de aorta en de lever4ontspoort.

De lever is een metabole powerhouse dat zich aanpast in reactie op prikkels afkomstig van de nabijgelegen dysregulated WAT15. Hepatische macrofagen of Kupffer cellen, in reactie op metabolische veranderingen, afscheiden van inflammatoire cytokines die transformeren van beide parenchymal en niet-parenchymal cel fenotype en bevordering van de weefsel remodeling. Hepatische lipide accumulatie, ontsteking, overmatige extracellulaire matrix deposito's, necrose en uiteindelijke functie verlies volgt de inflammatoire beledigingen bij te dragen tot het brede spectrum van leverschade gekoppeld aan non-alcoholische vette leverziekte 16,17,18.

Parallel aan gecompromitteerde WAT en leverfunctie accumuleren grote arteriën lipiden binnen de arteriële muur als het lichaam chronische metabole stress19 ondergaat. Arteriële lipide accumulatie activeert de secretie van chemokines door geactiveerde endotheliale cellen en latere indienstneming van monocyten20. Zodra aangeworven, monocyten vermenigvuldigen, onderscheiden, inslikken lipoproteïnen en schuim cellen. Atherogenese is gestart en wordt ondersteund door de pro-inflammatoire activiteit van aangeworven en weefsel resident lipide-beladen macrofagen. Bezwijken aan de extracellulaire en intracellulaire stress signalen doorgegeven in dit atherogene communicatie, deelnemen deze macrofagen vervolgens aan een apoptotic cascade signalering. Als deze schuim cellen sterven, dragen zij hun lipide gevuld inhoud aan de necrotische kern van de laesie, wat vervolgens tot plaque breuk, hartinfarct en beroerte leidt.

De heterogeniteit van de macrofaag fenotypen regisseert collectief, gedeeltelijk de obesitas geïnduceerd door ontstekingsreactie waargenomen in dysregulated weefsels zoals WAT, lever en aorta8,21. Karakterisering van aangeworven en weefsel resident macrofagen kunnen inzicht geven in mogelijke moleculaire doelwitten die macrofaag fenotype1 manipuleren. Effectief karakteriseren macrofagen van obesitas-geïnduceerde ontstoken weefsels, kan een eencellige schorsing verkregen worden door enzymatische spijsvertering. Dergelijke dissociatie protocollen moet effectief in voldoende vernederende bindweefsel terwijl het minimaliseren van immuun celdood en bieden optimale cel opbrengst. Het enzym mengsel is afhankelijk van het soort weefsel en de structurele make-up. Veerkrachtig weefsel zoals de aorta vereist sterkere enzymatische activiteit, in vergelijking met de lever en WAT, om weefsel dissociatie. Uit de eencellige suspensie, kunnen het weefsel resident macrofagen ondubbelzinnig worden gekenmerkt of geïsoleerd voor verder stroomafwaarts analyses uitgevoerd, zoals transcriptionele profilering.

Hier wordt een weefsel-specifieke protocol beschreven dat collagenase-afhankelijke weefsel spijsvertering en polychromatische stroom cytometry gebruikt om effectief te isoleren en karakteriseren van weefsel-ingezeten macrofagen verkregen uit traditionele dieet geïnduceerde obesitas, atherosclerose, eenvoudige steatosis en steatohepatitis Muismodellen. Gelijktijdige kleuring van oppervlakte markeringen in een cel met antilichamen tegen leukocyten-(CD45 en/of CD11b) en macrofaag - specifieke antigenen (F4/80) wordt vaak gebruikt om te identificeren macrofaag populaties22. Fluorescentie-activated cell sorting (FACS) is een krachtige strategie gebruikt voor het sorteren van deze geïdentificeerde risicopopulaties hoge zuiverheid. De gesorteerde bevolking kan vervolgens worden geëvalueerd voor fenotype specifiek gen profielen met behulp van downstream moleculaire analyse (zoals kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie)23. Hoewel de standaard stroom cytometry en stroom cytometry gebaseerde cel Sorteren krachtige hulpmiddelen macrofagen binnen een sterk heterogene celsuspensie onderscheid aan te brengen zijn, moeten de voormalige protocollen worden geoptimaliseerd zodat succesvolle uitvoer. In deze studie worden protocollen dat effectief isoleren en karakteriseren van levensvatbare weefsel specifieke macrofagen beschreven; wat nog belangrijker is, biedt deze studie cruciaal inzicht in technische kwesties die vaak ontstaan, evenals strategieën van de proactieve en oplossen van problemen te voorkomen en/of lossen ze.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimentele protocollen (secties 1, 1.2 en 1.3) werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) aan de Pennsylvania State University.

Weefsel Dissociatie Buffers voorbereiding Eindvolume Opslag
Witte vetweefsel (WAT) Dissociatie Buffer: 2,5% HEPES, 10 mg/mL bovien serumalbumine (BSA), 3 mg/mL (0,3%) Collagenase Type II in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) met 4,5 g/L glucose zonder L-glutamine en natrium pyruvaat 500 mL minus 80° C (10 mL aliquots)
Lever 25 x perfusie Buffer concentraat (PBC): 3.55 M NaCl, 168 mM KCl, 240 mM HEPES 150 mM NaOH in overgedestilleerd gedeïoniseerd H2O 500 mL minus 20° C (40 mL aliquots)
Behoud Buffer (PRB): 1% BSA in 1 x perfusie Buffer 1 L 4 ° C
Dissociatie Buffer: 1 x perfusie Buffer aangevuld met 4.76 mM CaCl2 en 72 U/mL Collagenase Type IV 50 mL (per muis) Bereiden onmiddellijk vóór gebruik
Aorta Dissociatie Buffer: 125 U/mL Collagenase Type XI, 60 U/mL Hyaluronidase type I, 60 U/mL DNase ik, 450 U/mL Collagenase Type I, 20 mM HEPES in 1 x Phosphate Buffered Saline (PBS) 500 mL minus 80° C (10 mL aliquots)

Tabel 1: Weefsel specifieke perfusie recepten van de buffer.

1. de weefsels isolatie en dissociatie

  1. WAT isolatie en dissociatie
    1. Bereiden de weefsel-specifieke buffers volgens tabel 1en deze opslaan zoals beschreven.
    2. De volgende reagentia voor te bereiden.
      1. Bereid de spijsvertering buffer door het ontdooien van het juiste volume van WAT dissociatie buffer en bewaren bij 4 ° C tot gebruik. Onmiddellijk vóór gebruik, warm buffer tot 37 ° C. Bereiden de FACS buffer door het opstellen van 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 2% foetale runderserum (FBS).
    3. WAT isolatie
      1. Een muis in een kooldioxide (CO2) gevuld kamer euthanaseren. Selectievakje voor effectiviteit vóór voortzetting van de dissectie-fase.
      2. Dompel de euthanized muis kort in een bekerglas van 70% ethanol tot grondig geweekt en bekleed met ethanol. Plaats de muis ventrale oppervlak boven in het werkgebied van de dissectie en zet vast de muis voorgrond en het achterste poten aan het bestuur van de dissectie gebruik 21 G naalden.
      3. Middellange punt tip pincet gebruiken om te begrijpen van de buikhuid anterior to de urethrale opening, vervolgens scherpe ontleden schaar met maken van een nickname in de grasped buikhuid.
      4. Plaats het onderste blad van de schaar in de kleine incisie tussen de huid en buikvlies en maak een laterale insnijding van buik naar de ribbenkast.
      5. Voorzichtig terugtrekken van de huid om te bloot de intact peritoneale Holte en een laterale incisie via het buikvlies en ofwel vouwen terug het transparante membraan of accijnzen het weefsel om de buik WAT bloot te stellen.
      6. De dikke pads van perigonadal verzamelen zoals beschreven in Mann et al. 24
        1. De dikke pads van perigonadal bij mannelijke muizen zijn losjes gebonden aan de bijbal en de teelballen. Eerst vinden de teelballen met medium wijzen pincet, begrijpen van de greep van de bijbal hoofd en trek voorzichtig.
        2. Met behulp van scherpe ontleden schaar, accijnzen elke epididymaire vet pad door te snijden langs het oppervlak van de bijbal (hoofd, lichaam en staart) en de teelballen.
        3. Met de Tang, Trek voorzichtig op het vet pad terwijl doorsnijden het bindweefsel direct aan de bijbal-structuur gebonden.
        4. Met behulp van de verlostang, stevig greep het einde van het vet pad proximale aan de bijbal en pel voorzichtig het vet pad uit de buurt van de geslachtsklieren
        5. In vrouwelijke muizen zijn de dikke pads van perigonadal losjes bond aan het lichaam van de baarmoeder en de baarmoeder-hoorn.
        6. Met behulp van middellange punt pincet, greep het vetweefsel van de perigonadal en trek voorzichtig aan het weefsel van het lichaam van de baarmoeder en de baarmoeder-hoorn.
        7. Accijnzen elke vet pad door te snijden langs het lichaam van de baarmoeder en de baarmoeder hoorn met scherpe ontleden schaar.
      7. Plaats het vet pads in een petrischaal gevuld met PBS en houd op ijs weefsel om vochtig te houden.
    4. Dissociatie van WAT in eencellige schorsingen
      1. Verwijder overtollige PBS van de petrischaal en gebruik een scheermesje één rand aan de buik WAT in kleine stukjes gehakt.
      2. Met de scherpe rand van het scheermesje, voorzichtig schrapen de gehakt buik WAT in een gelabelde 15 mL polypropyleen collectie buis met 2 mL WAT dissociatie buffer.
      3. Incubeer dit weefsel-spijsvertering buffer mengsel onder traag continue rotatie bij 37 ° C gedurende 45 minuten.
      4. Filtreer het verteerd weefsel door een 70 µm cel zeef in een tube van 50 mL collectie terwijl het bewegen van de zuiger van de rubber van de zuiger van een injectiespuit in een cirkelvormige beweging en blijven de celsuspensie zeef door het filter.
      5. Pipetteer 2 mL van de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) een tube van 15 mL collectie, pipet zachtjes op en neer en was het filter met de eencellige schorsing.
      6. Was het filter extra tweemaal met koude DMEM en plaats de eencellige schorsing op ijs.
      7. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g bij 4 ° C voor 8 min.
      8. Gebruik een vacuüm aspirator zorgvuldig drijvende adipocytes (eerst) te verwijderen en de resterende bezinken. Zorg ervoor dat niet te verstoren de Ingehuld stromale vasculaire breuk (SVF).
      9. Pipetteer 1.000 µL zachtjes resuspendeer de pellet in ammoniumchloride-kalium (ACK) buffer lyse erytrocyten volgens de instructies van de fabrikant.
      10. Verdun de bovenstaande celsuspensie met DMEM en centrifugeren van de celsuspensie bij 300 g bij 4 ° C voor 8 min.
      11. Resuspendeer de cellen in koude PBS met 2% FBS (FACS Buffer) en de cellen in een Burker kamer/hemocytometer tellen.
      12. 1 x 106 cellen (voor elementaire stroom cytometry) of de gehele celsuspensie (voor FACS) naar het label van 5 mL ronde onderkant polystyreen buizen overbrengen. Afdeling 2 blijven voor stroom cytometry kleuring protocol.
  2. Leverweefsel isolatie en dissociatie
    Opmerking: Dit protocol werd aangepast van Smedsrød25.
    1. Voorbereiden van de weefsel-specifieke buffers volgens tabel 1 en deze opslaan zoals beschreven.
    2. De volgende reagentia voor te bereiden.
      1. 1 x perfusie Buffer (PB), door verdunnen 40 mL PBC in 960 mL ultrazuiver H2O. pre warm een spuit gevuld met PB 50 mL bij 37 ° C, net voordat perfusie begint voor te bereiden. Elimineer alle huidige luchtbellen.
        1. Omkeren om te elimineren luchtbellen, de spuit waar de leur lock tip omhoog wijst. Door te tikken of de spuit flick totdat luchtbellen aan de bovenste pf de spuit zijn. Duw voorzichtig op de plunjer tot uitzetting van de lucht
      2. Voorbereiden van de buffer van de spijsvertering door verder verdunnen van 0,5 mL van 476 mM CaCl2 oplossingaan 49,5 mL 1 x perfusie buffer. 3600U van Collagenase Type IV aan de 4.76 mM CaCl2 – PB oplossing toevoegen. Vooraf warm een spuit gevuld met 50 mL spijsvertering buffer bij 37 ° C, net voordat perfusie begint. Elimineer alle huidige luchtbellen zoals beschreven in stap 1.2.2.1.1.
      3. Bereid het behoud Buffer (PRB) door ontbinding van 2,5 g bovien serumalbumine (BSA) in 250 mL 1 x perfusie buffer. Bewaren bij 4 ° C of houd op ijs tot gebruik.
      4. Bereiden FACS Buffer met 1 x PBS en 2% FBS.
    3. Leverweefsel isolatie
      1. Een muis door CO2 verstikking euthanaseren, muis te verzadigen met 70% ethanol ter voorkoming van verontreiniging van intraabdominal organen met bont.
      2. Standpunt de ventrale zijde van de muis omhoog op een polystyreen schuim ontrafeling van de Raad van bestuur en veilig de muis fore en hind paws aan het bestuur van de dissectie gebruik 21 G naalden.
      3. Om te bloot de thoracale muur en peritoneale Holte, begrijpen de buikhuid in de buurt van de urethrale opening met behulp van een verlostang middellange punt tip. Gebruik vervolgens een scherpe ontleden schaar om te maken een kleine snede aan de grasped buikhuid.
      4. Plaats het onderste blad van de schaar in de kleine incisie tussen de huid en buikvlies en maken een laterale snede van Lies naar de kin.
      5. Voorzichtig terugtrekken van de huid om bloot de intact peritoneale Holte en thoracale muur, een laterale incisie via het buikvlies en accijnzen van de membraan.
      6. Opheffing van het borstbeen en zorgvuldig incise van het middenrif, zijn zeker niet te verstoren de vena cava (IVC), inferior. De gastro-intestinale organen naar de kant en zoek het subhepatic IVC. Gebruik hemostatische pincet om klem de suprahepatic IVC om gelokaliseerde perfusie.
        Opmerking: De buitensporige accumulatie van viscerale witte vetweefsel kan vaak het IVC maskeren. Om beter te visualiseren dit schip, kan een klein gebied van vetweefsel naast het IVC worden weggesneden. Het ingesneden venster binnen de plooibaar vetweefsel kan vervolgens worden geplaatst over het IVC bloot van het vaartuig voor cannulation.
      7. Bevestig de spuit gevuld met voorverwarmde PB naar de set die 23 G bloed collectie en infusie. Duw voorzichtig op de plunjer totdat de buis en de naald zijn gevuld met PB.
      8. Plaats de 23 G naald, parallel aan het niveau van de subhepatic IVC. Beveilig de naald in plaats met behulp van een 4 cm hemostatische klem.
        Opmerking: Cannulation van de subhepatic die IVC in dieet-gevoed muizen de voorkeur in dat het IVC beter kunnen gevisualiseerd en gecanuleerd binnen de vet gevulde holte.
      9. Duw voorzichtig op de plunjer beginnen perfusie, kleur zal snel flush van de lever (lobe eerst recht) als de naald op de juiste wijze is geplaatst in het vat. Uitbreiding van de kwabben is ook zichtbaar als de naald juist is geplaatst in het subhepatic IVC.
      10. Snel snijden de portal ader zodat de PB verkeer via de lever.
      11. Perfuse de lever tot bloed niet langer zichtbaar is. Soms zachtjes masseren lobben van de lever tussen voorgrond-vinger en duim ter vergemakkelijking van de perfusie.
        Opmerking: Het is belangrijk niet-getande botte scherpe instrumenten gebruiken om te verwerken van de lever om weefselschade te voorkomen.
      12. Wanneer 5 mL PB binnen de spuit blijft, veranderen in de spuit gevuld met voorverwarmde dissociatie buffer. De positie van de beveiligde naald niet storen tijdens dit keer.
        Opmerking: Uitgebreide levers aanzienlijk meer dan 1,5 g moet worden geperfundeerd met een groter volume van voorverwarmde spijsvertering buffer te waarborgen van de succesvolle lever dissociatie.
      13. Perfuse de lever tot volledig verteerd. Zachtjes masseren lobben van de lever om perfusie.
        Opmerking: Scheiding van Glisson de capsule parenchym is observabele in een succesvol verteerd lever. Om te beoordelen dit, kunt de botte rand van een paar pincet, zachtjes druk op de linker laterale kwab. Een indruk moet worden weergegeven op het oppervlak en de inspringing moet langzaam vullen zodra de verlostang is verwijderd.
      14. Verwijder de naald uit het subhepatic IVC. Verwijder niet de hemostatische verlostang klemmen van de suprahepatic IVC.
      15. De hele lever door het zorgvuldig snijden door het aansluiten van de ligamenten met behulp van een korte rechte mes ontrafeling van schaar accijnzen en het verwijderen van de galblaas.
      16. Plaats van de hele lever in een 10-cm-petrischaal met 10 mL ijskoud behoud Buffer en winkel op 4 оC tot klaar om te bevrijden van de cellen.
    4. Lever cel dissociatie
      1. De lever overbrengen in een 10 cm schotel met daarin 10 mL ijskoud DMEM.
      2. De afgehakte suprahepatic die IVC verbonden aan het verwijderde lever met behulp van een getande pincet greep. Middellange punt pincet gebruiken vrij te geven van de cellen van de Glisson de capsule door snelle strijkende beweging toe te passen op elke kwab.
      3. De verzadigde DMEM passeren op een 70 µm cel zeef gekoppeld aan een tube van 50 mL collectie.
      4. Pipetteer 10 mL ijskoud DMEM op de 10 cm petrischaal en herhaal de stappen 1.2.4.1 aan 1.2.4.3 tot verzadiging van de media niet langer wordt voldaan. Plaats de celsuspensie op ijs of bij 4 ° C.
      5. Meng voorzichtig de celsuspensie door het omkeren van de buis van de collectie en vervolgens Centrifugeer bij 54 x g gedurende 2 min bij 4 ° C.
      6. De bovendrijvende vloeistof in een schone 50 mL collectie buis te verzamelen. Centrifugeer dan de celsuspensie bij 54 x g gedurende 2 min bij 4 ° C.
      7. Herhaal stap 1.2.4.6 extra tweemaal voordat u verdergaat met stap 1.2.4.8.
      8. Het supernatant overbrengen in een buis schoon 50 mL-collectie samen en centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
      9. Resuspendeer de pellet van niet-parenchymal cel in FACS buffer en ze te tellen in een Burker kamer/hemocytometer.
      10. 1 x 106 cellen (voor elementaire stroom cytometry) of 15 x 106 - 20 x 106 cellen (voor FACS) naar overbrengen met polystyreen buizen van 5 mL ronde-onder het label. Afdeling 2 blijven voor stroom cytometry kleuring protocol.
  3. Aorta isolatie en dissociatie
    Opmerking: Dit protocol werd aangepast van slageret al.26
    1. Voorbereiden van de weefsel-specifieke buffers op basis van de in tabel 1 gegeven recepten en deze opslaan zoals beschreven.
    2. De volgende reagentia voor te bereiden.
      1. Bereid de spijsvertering buffer door het ontdooien van het juiste volume van WAT dissociatie buffer en bewaren bij 4 ° C tot gebruik. Onmiddellijk vóór gebruik, warm buffer tot 37 ° C.
      2. Bereiden van een oplossing van 10 x heparine door ontbinding van heparine natriumzout in 1 x bij een concentratie van 200 U/mL PBS. Verdun de 10 x heparine stockoplossing met 1 x PBS te bereiden een 1 x heparine oplossing. De 10 x en 1 x heparine oplossingen bij 4 ° C bewaren tot gebruik.
      3. Bereiden de FACS Buffer met 1 x PBS met 2% FBS.
    3. Aorta dissectie
      1. Euthanaseren een muis in een zaal van de kooldioxide-gevuld en spoelen met 70% ethanol.
      2. Plaats de muis ventrale zijde boven in het werkgebied van de dissectie, verspreid de muis voorgrond en de achterste poten en zet ze vast aan het bestuur van de dissectie gebruik 21 G naalden.
      3. Voer onmiddellijk na het euthanizing van de muis, cardiale punctie. Verwijzen naar stappen 1.3.3.4 te 1.3.3.9, indien nodig.
      4. Zoek de xiphoid process aan de onderkant van het borstbeen
      5. Om dit te doen, plaatst u het middelpunt van een vinger langs de breedte van de nek van het dier. Trek de ventral midline van nek naar het caudal einde van het borstbeen tot een kraakbeenachtige extensie wordt gevoeld.
      6. Middellange punt pincet gebruiken om te begrijpen de kraakbeenachtige extensie, en eventueel de locatie van de xiphoid process markeren door het verwijderen van de patch van haar of huid op het gebied.
      7. Gedeeltelijk invoegen een 26 G naald onder de xiphoid process in 20-30° hoek.
      8. Zachtjes negatieve druk uitoefenen op de injectiespuit door langzaam terug te trekken van de zuiger, dan de naald verder in de spouw pas bloed stromen invoegen.
      9. Als de bloedstroom stopt, langzaam draaien de naald of verplaatsen lichtjes in en uit.
      10. Gebruik de paar pincet te grijpen van de buikhuid anterior to urethrale houden openen, en gebruik een paar scherpe ontleden schaar te snijden langs de ventral midline via het buikvlies van Lies naar de kin.
      11. Terugtrekken van de huid om te bloot buikorganen en ribbenkast met vingers of botte pincet voorzichtig buikorganen verplaatsen naar de kant.
      12. Gebruik de verlostang om te grijpen houden van de xiphoid process, til het borstbeen, en incise van het middenrif.
      13. Met behulp van de ontleden schaar, doorsnijden de laterale ribben aan weerszijden. Aangrijpend het borstbeen, flip de ribbenkast omhoog en snijden door de aansluitende base. Verwijder de ribbenkast bloot van de onderliggende thoracale organen.
      14. De aorta perfuse met een 26-gauge naald gekoppeld aan een 10 mL-spuit gevuld met 1 x heparine oplossing door het injecteren van 1-2 mL van de oplossing in het linker ventrikel (LV) van het hart.
        Opmerking: Zorg ervoor dat perfuse in een langzaam tempo met lichte druk wordt uitgeoefend om ervoor te zorgen intact atherosclerotische aorta laesies.
      15. Accijnzen de zwezerik, de longen en het bindweefsel. Verwijzen naar stap 1.3.3.16 en 1.3.3.17, indien nodig.
        1. Anterior to het hart vinden de wit bi-lobed (of vlinder vormige) orgel en stevig pak greep van de zwezerik met de pincet. Beide kwabben omhoog te trekken uit de buurt van de spouw en snijd aan de basis met de schaar.
        2. De longen verwijderen, een Long kwab knijpen met de Tang, trek het weefsel uit de buurt van de borstholte en gesneden aan de basis. Herhaal voor elke resterende kwab.
      16. Gebruik een dissectie Microscoop en ontrafeling van micro tools, en verzamel die de aorta boog (inclusief de slagader van de innominate, links gemeenschappelijke halsslagader en linker subclavian slagader), de oplopende, aflopende, borst- en buikholte aorta.
        1. Zoek de oplopende aorta op het linkerventrikel van het hart.
        2. Met een paar gebogen 0.07 x 0,04 mm-tip begrijpen pincet voorzichtig het gedeelte van de oplopende aorta die voortkomen uit het linkerventrikel.
          Opmerking: In vergelijking met de omliggende geel getinte vetweefsel, zullen de aorta een helder witte vaartuig die afkomstig zijn uit de LV wanneer voldoende gespoeld met de heparine-oplossing.
          1. Als de aorta was niet goed gespoeld door cardiale perfusie, spoelen de aorta weer terwijl de aorta verbonden met de holte blijft. Om dit te doen, in de buurt van de kruising van de hart-aorta knippen, verwijderen van het hart en dan snijd horizontaal door de lagere-end van de abdominale aorta. Plaats een 26 G naald in de opening van de oplopende aorta en voorzichtig spoelen de aorta met de 1 x heparine oplossing.
          2. Sleepboot zachtjes op de oplopende aorta om beter onderscheid te maken tussen het vetweefsel en de ingesloten aorta.
          3. Nog steeds zachtjes trekken op de oplopende aorta, kunt het uiteinde van de gesloten lente ontrafeling van schaar duidelijk van het vet dat kapselen de oplopende aorta en aortaboog. Om dit te doen, het vetweefsel met het topje van gesloten scissor messen te scheuren weg het aansluitende vet te omlijnen.
            Opmerking: Onthouden middendoor elke vetweefsel door het snijden van totdat de oplopende aorta en boog kunnen duidelijk worden gevisualiseerd. Dit is om te voorkomen dat het snijden van de aorta.
          4. Als de oplopende aorta en boog kunnen worden duidelijk afgebakend uit de surround-vetweefsel, gebruikt u het voorjaar ontrafeling van schaar accijnzen overtollig vet.
          5. Zachtjes greep van de aortaboog met de pincet. Weer gebruik van de schaar van de lente tip, slag bij het vet langs de lengte van de aflopende-, borst- en buikholte aorta naar de caudal einde van de abdominale aorta, doen dat op de rechterkant van de mouw van vet.
          6. Blijven begrijpen langs de aorta wanneer het vet weg te scheuren. Zorg ervoor dat doen dus voorzichtig om te voorkomen beschadiging van de aorta.
          7. Trek voorzichtig de aorta opwaarts naar de Microscoop zodat het vet nu achter de aorta geplaatst is.
          8. Invoegen de messen van de gesloten schaar tussen de vet-aorta-interface in de buurt van het anterieure einde van de aflopende aorta, ernstige het vetweefsel gehechtheid aan de oppervlakte van de aorta door het bot met behulp van een ingrijpende motie.
            Opmerking: Grondig verwijderen van overtollig vet en aansluiten van weefsel, terwijl de aorta nog steeds binnen de holte is wordt aanbevolen.
          9. Het hart accijnzen en snijd caudal eind van de abdominale aorta dwars. Verwijder de hele aorta.
          10. Plaats van de aorta in een 35 mm-schotel en tease weg alle overtollige vet op de aorta gebruik twee 21-gauge naalden. Plaats de verwijderde aorta in 1.7 mL microcentrifuge buis op ijs.
    4. Dissociatie van de Aorta in eencellige schorsingen
      1. Pipetteer 0,2 mL aorta dissociatie buffer op de buis met de aorta. Invoegen van de lente scissor messen richting de taps toelopende uiteinde van de buis en snel gehakt van de aorta ter vergemakkelijking van de enzymatische spijsvertering.
      2. Het mengsel van weefsel-oplossing overbrengen in een 15 mL collectie buis en Pipetteer 1.8 mL aorta dissociatie buffer voor een totaal volume van 2 mL.
        Opmerking: Voor een gemakkelijke overdracht van de ophanging van het weefsel, snij de 1 cm van het tapse einde van een standaard 1000 µL pipette uiteinde. Gebruik de verkorte tip om de spoel de suspensie met een micropipet.
      3. Incubeer de gehakt aorta in de aorta dissociatie buffer voor 55 min bij 37 ° C, schudden bij 220 t/min (0.514 x-g).
      4. De schorsing passeren door 50-µm cel zeef in een tube van 15 mL polypropyleen collectie. Gebruik de rubber zuiger van de zuiger van een injectiespuit te vergemakkelijken filteren.
      5. Spoel de tube van 15 mL collectie met 1 mL FACS buffer, verzamelen de schorsing en de cel zeef passeren.
      6. Wassen van de 50 µm cel zeef extra tweemaal met 1 mL FACS buffer.
      7. Pellet de cellen door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de cellen in koude FACS Buffer. De cellen in een Burker kamer/hemocytometer tellen.
      8. 1 x 106 (voor elementaire stroom cytometry) cellen of de gehele celsuspensie (voor FACS) overbrengen in een gelabelde 5 mL ronde onderkant polystyreen buizen. Afdeling 2 blijven voor stroom cytometry kleuring protocol.

2. Stroom Cytometry en FACS kleuring

Fluorophore R-Phycoerythrin (PE) PE/Cyanine (Cy) 7 PE/Cyanine (Cy) 5 Pacific Blue (PB)
Laser (nm) Blauw (488 nm) / geel (561-570 nm) - groen (532 nm) Blauw (488 nm) / geel (561-570 nm) - groen (532 nm) Blauw (488 nm) / geel (561-570 nm) - groen (532 nm) Violet (405 nm)
ExcitatieMAX (nm) 496 496 496 401
EmissieMAX (nm) 578 785 667 455
Fenotypische Marker F4/80 CD11c CD11b CD45
EMR1, Ly71 ΑX integrine, integrine αX keten, CR4, p150, ITGAX ΑM integrine, Mac-1, Mo1, CR3, Ly-40, C3biR, ITGAM T200, Ly-5, LCA
Gerichte celtype Weefsel Resident macrofagen Klassiek geactiveerd (M1) macrofagen Monocyten / macrofagen Leukocyten (macrofagen / Granulocyten, monocyten en lymfocyten)
Subset van dendritische cellen Dendritische cellen, NK-cellen geactiveerd T-cellen en een subset van intestinale geest lymfocyten (IEL) Granulocyten, dendritische cellen, NK-cellen en deelverzamelingen van B- en T-cellen
Verdunningsfactor 1:50 1:100 1:100 1:100
Isotype-besturingselementen PE Rat IgG2a PE/Cy7 Armeense Hamster IgG PE/Cy5 Rat IgG2b Stille Oceaan blauw Rat IgG2c

Tabel 2: Lijst van fluorophore die zijn gelabeld antilichamen specifiek voor discriminerende weefsel resident macrofagen.

  1. Verzamelen en voorbereiden van de volgende items: FACS Buffer 5 mL ronde onderkant polystyreen-buizen, anti-muis CD16/32 Fc receptor antilichaam blokkeren, fluorophore geconjugeerd of primaire antilichamen, fluorophore-geconjugeerde secundaire antilichamen (als unconjugated nodig), 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
    Opmerking: Voor grote hoeveelheden cellen kleuring, antilichaam concentratie is meest kritieke in plaats van aantal cellen. Bijvoorbeeld, als de kleuring 10 x 106 cellen de kleuring buffervolume en antilichaam concentratie moet hetzelfde zijn als de kleuring van 1.0 x 10 cellen6 in 100 µL buffervolume. Voor de kleuring van 1.0 x 108 cellen, verhoging van het bedrag van de antilichaam 5-voudig wordt aanbevolen.
  2. Desgewenst extra ijskoude FACS Buffer toevoegen aan elke buis FACS, pellet cellen door centrifugeren bij 751 x g gedurende 5 min (4 ° C). Gecombineerd het supernatant volgende centrifugeren.
  3. Toevoegen van anti-muis CD16/CD32 Fc receptor antistoffen tegen alle monsters volgens de instructies van de fabrikant te blokkeren. Incubeer gedurende 15 min bij 4 ° C of op ijs.
  4. Voeg toe fluorophore-geconjugeerde primair antilichaam cocktail rechtstreeks aan de Fc receptor blokkerende antilichamen-bevattende cel schorsing en incubeer monsters bij 4 ° C gedurende 30 min. Protect monsters van licht om te minimaliseren bleken van fluorophore-geconjugeerde antilichamen.
    1. Ingeval unconjugated primaire antilichamen werden gebruikt, volgt u deze stappen na het voltooien van stap 2.4.
    2. Wassen primair antilichaam monsters gekleurd door centrifugeren bij 751 x g gedurende 5 min (4 ° C).
    3. Verwijder de bovendrijvende vloeistof door decanteren en resuspendeer de pellet in 100 µL FACS buffer.
    4. Toevoegen van geconjugeerd secundair antilichaam aan alle nodige monsters en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Ga verder met stap 2.5.
  5. Volgende antilichaam-incubatie, voeg toe 2 mL ijs koud FACS buffer dan pellet cellen bij 751 x g gedurende 5 minuten (4 ° C). Decanteren supernatant en zeker niet te verstoren, pellet.
  6. Meng voorzichtig cellen en resuspendeer met 200-400 µL van FACS buffer, vervolgens houd dit in het donker bij 4 ° C tot standaard stroom cytometry analyse of cel sorteren.
  7. Voor korte termijn fixatie van gekleurde cellen, gaat u verder met de stappen 2.8 tot 2.10. Fixatie voor standaard stroom cytometry alleen gebruiken.
  8. Onmiddellijk na stap 2.5, resuspendeer de cellen in 0,5 mL 2-4% paraformaldehyde (PFA) voor 15-30 min in de 4 ° C.
    Opmerking: Let op: PFA is een bekende irriterend met kankerverwekkende en giftige effecten. Bij het gebruik van PFA, extreem voorzichtig behandelen. Zorg ervoor dat gebruik van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en uitlaat ventilatie.
  9. Volgende fixatie, wassen van cellen door toevoeging van 2 mL FACS buffer aan alle samples samen en centrifugeer bij 751 x g in 4 ° C gedurende 5 min. verwijderen supernatant volgende centrifugeren.
  10. Resuspendeer vaste cellen in 200 µL van ijs koud FACS buffer en bewaren bij 4 ° C. Winkel fix cellen maximaal 1 week bij 4 ° C, ideaal stroom cytometry overname binnen 48 uur om te minimaliseren van de autofluorescence uit te voeren.
  11. Verwerven van stroom cytometry gegevens volgens de instructies van de stroom cytometer fabrikant of uitvoeren fluorescerende geactiveerde cel sorteren zoals beschreven door Basu et al. 23

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bij het gebruik van apolipoproteïne E gebrekkige (ApoE KO) C57BL/6 (BL6) muizen gehandhaafd op een hoog vet hoog cholesterol dieet (HCHFD of HCD) 18 weken, 1 x 104 - 2 x 104 CD45+F4/80+ aorta macrofagen kunnen worden geïsoleerd wanneer twee steekproeven behoren gebundeld. Levers van HFHCD-gevoed ApoE KO muizen, ontleed geproduceerd groter is dan 5 x 105 gesorteerd op Kupffer cellen (die afhankelijk van beschikbare sorteren tijd). Wanneer met behulp van hoog vet dieet (HFD) gevoed wild type (WT) C57BL/6 muizen, kunnen 5 x 10,5 tot en met 1 x 106 resident adipeus weefsel macrofagen (geldautomaten) worden gesorteerd uit de stromale vasculaire afvalfractie (SVF). Het genoemde totale aantal macrofagen die kunnen worden gesorteerd van een bepaald weefsel was voldoende voor het uitvoeren van gen expressie analyse met behulp van kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qPCR). Voor weefsels waar minder aantal macrofaag populaties worden hersteld, zoals de aorta, is het aanbevolen om het gebruik van co neerslagmiddelen (bijvoorbeeld glycogeen) en 's nachts neerslag wanneer isoleren van RNA is nodig voor deze analyses.

Hier, stroom de effecten van dieet-geïnduceerde metabolische wanorde op macrophage fenotype met behulp van basisverificatie cytometry, fluorescentie-geactiveerde cel sorteren (FACS) en downstream post sorteren analyses worden aangetoond. Deze bevindingen bevestigen eerder gepubliceerde opmerkingen dat muizen gevoed een HFD of HFHCD tentoonstelling verhoogd infiltratie van macrofagen van klassiek geactiveerd (M1) in de aangetaste weefsels zoals de aorta (figuur 1B). Profiteren van stroom cytometry, FACS, en gen expressie profilering (via kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR), het overheersende fenotype voor Ron receptor tyrosine kinase-uiten CD45+ F4/80+ macrofagen afgeleid van weefsels van dieet-gevoed muizen geïsoleerd werd waargenomen. Ron receptor-uiten aorta macrofagen die aangetoond van een anti-inflammatoire fenotype werden verlaagd in HFHCD-gevoed muizen (Figuur 1 c en D). Gesorteerde Ron receptor-uiten macrofagen afgeleid van verteerd aortas aangetoond dat grotere arginase 1 (Arg1) genexpressie, oftewel een gevestigde M2 macrofaag marker (1E cijfer). Pro-inflammatoire macrofagen, die werden gekenmerkt als CD45+ F4/80+ CD11c+ in aortas van HFHCD-gevoed muizen (figuur 1B en D) geïsoleerd werden verhoogd. Karakterisering van lever-ingezeten macrofagen verder toegelicht van het heersende fenotype van Ron receptor-uiten subpopulaties (figuur 2A). CD11c + pro-inflammatoire macrofaag populaties aangetoond een daling van de expressie van genen die sterk geassocieerd met een anti-inflammatoire (M2) fenotype zoals Arg1 en Ron (figuur 2B zijn). Vergelijkbare trends werden waargenomen in macrofaag populaties geïsoleerd uit verteerd witte vetweefsel (Figuur 3). Macrophage bevolking met een pro-inflammatoire handtekening toonde verminderde oppervlakte expressie van de Ron receptor (Figuur 3). Het combineren van de benaderingen, elementaire stroom cytometry en FACS, resulteerde in overtuigende gegevens die verder de Ron-receptor als een regulator voor alternatieve (M2) activation in macrofagen32 valideert. Dergelijke bias naar een anti-inflammatoire fenotype (M2) heeft aangetoond dat een beschermende rol spelen bij de ontwikkeling en de vooruitgang van zwaarlijvigheid, atherosclerose en steatohepatitis31.

Figure 1
Figuur 1: Karakterisering van de macrofagen geïsoleerd van gedissocieerde aorta verwijderd van ApoE KO muizen bijgehouden op een HCD 18 weken. (A) cellen werden eerst gated op CD45+ leukocyten, met uitzondering van cellulaire puin. (B) CD45 vlekken in combinatie met F4/80 wordt gebruikt om af te bakenen dubbele positieve populaties geacht macrofagen. Extra gating werd gebruikt om aan te tonen van het percentage van de CD11c+CD45+F4/80+ (M1) en (C) Ron+CD45+F4/80+ (potentiële M2) macrofagen in aortas afgeleid van muizen gevoed op ofwel een normale chow of hoge cholesterol dieet voor 18 weken. (D) verhoogd percentage van CD11c+CD45+F4/80+ (M1) macrofagen, evenals een verminderd percentage van Ron+CD45+F4/80+ (potentiële M2) macrofagen werden waargenomen in aortas afgeleid van muizen gevoed HCD t.o.v. muizen gevoed een normale chow dieet. (E) gen expressie analyse van gesorteerde Ron+CD45+F4/80+ macrofagen aangetoond verhoogde expressie van arginase ik (een bekende lymfkliertest M2 marker). Waarden werden verkregen met behulp van de Student t-test analyses uitgevoerd met behulp van statistische analysesoftware en vertegenwoordigd zoals bedoel ± SEM. P < 0.05 werd beschouwd als een statistisch significante (* P < 0,05, *** P < 0,001). Figuur is gewijzigd van Yu et al. (2016) 31. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Gene transcript profilering van Kupffer cel populaties gesorteerd van verteerd levers ontleed van ApoE KO muizen bijgehouden op een HCD 18 weken. (A) algemene gating regeling voor karakterisering en sorteren Kupffer cel populaties. (B) gen expressie analyse van gesorteerde Ron uitdrukken (Ron+) en niet-uitdrukken (Ron-) CD45+F4/80+ macrofagen door kwantitatieve RT-PCR. Van de student t-test analyses werden uitgevoerd met behulp van statistische software en waarden waren vertegenwoordigd zoals bedoel ± SEM. P < 0.05 werd beschouwd als een statistisch significante (* P < 0,05, *** P < 0,001). Figuur is gewijzigd van Yu et al. (2016) 31 . Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Karakterisering van geldautomaten geïsoleerd van witte vetweefsel ontleed van WT BL6 muizen gevoed een HFD 18 weken. (A) algemene gating regeling voor karakterisering en sorteren van vetweefsel afgeleid macrofaag populaties (B) Percentage van Ron + cellen binnen CD45+F4/80+CD11c- en CD45+F4/80+CD11c+ macrofaag populaties van WAT gesorteerd. Figuur is gewijzigd van Yu et al. (2016) 31 . Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dieet-geïnduceerde stofwisselingsziekte modellen die co morbiditeit zoals atherosclerose, eenvoudige steatosis, steatohepatitis nabootsen en diabetes type 2 worden uitgebreid gebruikt voor een beter begrip van de moleculaire mechanismen van progressie van de ziekte. Collagenase afhankelijke spijsvertering wordt vaak gebruikt om weefsels te bevrijden van de cellen van de extracellulaire matrix (ECM)16,27te distantiëren. Enzymen zoals collagenase verstoren collageen die structurele ondersteuning biedt voor het naburige cellen. De weefsels structurele samenstelling dicteert de weefsel matrix stijfheid (weerstand tegen vervorming) en welke ruwe collagenase product is het meest efficiënt bij het waarborgen van de succesvolle ECM verstoring28. WAT, dat is samengesteld uit "zachte matrix" wordt vaak met Collagenase Type II te bevrijden van adipocytes en resident immuuncellen gelijktijdig behoud van de integriteit van cel oppervlakte insuline receptoren29verteerd. De microarchitectuur van de fibril onderdelen van de aorta draagt bij aan de "stijve matrix", waarvoor doeltreffende aorta spijsvertering met collagenase type XI (die heeft de hoogste collagenase activiteit) wordt gebruikt in combinatie met extra enzymen. In tegenstelling tot de aorta, de lever spijsvertering gebruikt een collagenase met een zwakkere enzymatische activiteit, Collagenase Type IV, bevrijden van levensvatbare cellen van de parenchymal en niet-parenchymal30te verstoren van de matrix. Chronisch ontstoken weefsels daarvan afgeleid dieet-gevoed wild type apolipoproteïne E deficiente (ApoE KO) muizen op een C57BL6 achtergrond ondergaan vaak remodelleren waardoor goede enzymatische spijsvertering kan. Deze sectie zal bespreken strategieën te minimaliseren en/of elimineren de mogelijkheid van onjuiste weefsel dissociatie en lage cel herstel.

Een gemeenschappelijk kenmerk van weefsels afgeleid van dieet-gevoed Muismodellen die na te bootsen van obesitas, atherosclerose, en/of non-alcoholische vette leverziekte, is abnormale weefsel remodeling. In witte vetweefsel, de aorta en lever, wordt ECM samenstelling gewijzigd, wat vaak resulteert in overmatige afzetting van fibrillar componenten zoals collagens. Wild type C57BL6 muizen gehandhaafd op een hoog vet dieet voor achttien weken, ervaring van weefsel-specifieke afwijkingen zoals uitgebreide witte vetweefsel en uitgebreide vette lever (eenvoudige steatosis). Vaak deze metabole functies zijn niet lastige obstakels te overwinnen tijdens de dissociatie weefsel. Aan de andere kant, in andere modellen van het dieet geïnduceerde die spiegel meer hevige fenotypen, de uitgebreide verbouwing van het weefsel kan een probleem opleveren tijdens de vertering van het weefsel. HFHCD gevoed ApoE KO muizen zijn vaak gewend model atherosclerose en steatohepatitis. Een gemeenschappelijk kenmerk gekoppeld aan geavanceerde steatohepatitis is de overmatige afzetting van ECM in de lever (of fibrose). Fibrotische lever heeft aangetoond dat vrij problematisch tijdens enzymatische weefsel dissociatie en vaak produceert lage cel opbrengst31. Ter verbetering van rendement van de cel, is het essentieel dat de spijsvertering-protocollen worden gevolgd zonder afwijking. Hoewel de normale lever kunnen worden gehakt en ondergedompeld in spijsvertering buffer om dissociatie, maximaliseert perfusie met spijsvertering buffer contact tussen de extracellulaire matrix van de lever en de collagenase oplossing; en daarom deze aanpak is sterk aanbevolen. Bovendien, is 20-30 mL buffer van de spijsvertering vaak een voldoende volume voor succesvolle dissociatie van normale levers; echter met betrekking tot Muismodellen die ontwikkelen van uitgebreide en/of fibrotische levers, perfusie met 50 mL van spijsvertering buffer bij voorkeur wordt om goede spijsvertering terwijl het minimaliseren van de celdood. Voor levers met gewichten die aanzienlijk hoger zijn dan 1,5 g, wordt verhoging van de omvang van de buffer van de spijsvertering aangeraden te garanderen van de succesvolle spijsvertering.

Weefsel Probleem Mogelijke oorzaak Oplossing
Witte vetweefsel (WAT) Arme cel dissociatie Slechte spijsvertering Zorg ervoor dat de spijsvertering buffer bedraagt 37° C
Dood van de cel Buitensporige collagenase spijsvertering Verkorten van de spijsvertering
Verminderen van de omvang van de buffer van de spijsvertering
Aorta Arme cel dissociatie Slechte spijsvertering Zorg ervoor dat de spijsvertering buffer is bij 37 ° C
Aorta stukken in spijsvertering buffer werden te groot Zorg ervoor dat de aorta is in ongeveer 1 mm stukjes gesneden
Aorta stukken waren niet schudden in dissociatie buffer tijdens de incubatie Zorg ervoor dat de aorta stukken zijn schudden in de spijsvertering-oplossing
Dood van de cel Buitensporige collagenase spijsvertering Verkorten van de spijsvertering
Verminderen van de omvang van de buffer van de spijsvertering
Lever Arme cel dissociatie Slechte spijsvertering Zorg ervoor dat de spijsvertering buffer is bij 37 ° C
Verhoog volume van spijsvertering buffer
Onjuiste cannulation van IVC (zwelling van omliggende IVC treedt op weefsel) Zorg ervoor dat de naald juist is geplaatst in het IVC
Gescheurde IVC Goed beveiligde naald in IVC vóór perfusie
Perfusie snelheid verlagen
Gescheurde weefsel Perfusie snelheid verlagen
Dood van de cel Onjuiste versie van cellen uit de de Glisson capsule Zorg ervoor dat u distantiëren van cellen van het gebruik van de capsule eerder besproken methode aaien
Buitensporige collagenase spijsvertering Verkorten van de spijsvertering
Verminderen van de omvang van de buffer van de spijsvertering

Tabel 3: oplossen van problemen met mislukte weefsel dissociatie. Stroom cytometry gebaseerd cel sorteren of FACS is een krachtige techniek voor het isoleren van cel populaties waar hoge zuiverheid is een noodzaak. Wanneer cellen reinigende door het sorteren van de cel, vereist het bereiken van hoge cel opbrengst, maar ook een soort van hoge zuiverheid met behulp van de juiste sorteren strategieën. In deze sectie, methoden voor het verbeteren van de multi-fluorophore stroom cytometry gebaseerde cel sorteren van weefsel resident macrofaag afgeleid van muizen dieet-gevoed worden beschreven. Voor verschillende weefsel resident macrofaag isolatie is oppervlakte marker selectie een cruciale stap. Macrofagen afgeleid van WAT, aorta en lever zijn vaak onderscheiden met behulp van een CD45+, CD11b+, F4/80+ gating strategie. Extra stroom cytometrische panelen kunnen gebruikt worden voor identificatie van weefsel resident macrofagen. Deze panelen zijn antistoffen die voor de oppervlakte uitdrukking van macrofaag specifieke glycoproteïnen (CD64, CD68 en CD14), grote comptabiliteit complexen (MHCII sonde) en de apoptotic cellen tyrosine kinase receptoren (MerTK)32, 33. specifieke macrofaag fenotype kan vervolgens worden afgebakend door indringende voor de selectieve oppervlakte uitdrukking van M2 (CD163, CD209 en CD206) of M1 markeringen (CD38, interactie CD40 CD80 en CD86)34,35. Auto-fluorescentie gegenereerd door macrofagen lipide-beladen kan presenteren enkele problemen wanneer gating populaties. Met behulp van antilichamen gelabeld met fluorochromes die worden opgewekt door de geel-groene laser (zoals PE, PE/Cy5, PE/Cy7) of rode laser (zoals APC, APC Cy7) resulteert in uitgestoten fluorescentie die is aanzienlijk lichter dan de auto-fluorescentie en dus kan verbeteren resultaten36. Wanneer selecteren fluorophore met dergelijke hoge kleuring index en potentieel van emissie spectra overlapping vervoegt, is opneming van adequate controle van cruciaal belang. Bij het identificeren van gating grenzen, opneming van één vlek (SS) en isotype besturingselementen toestaan voor de afbakening van de positieve/negatieve populaties en de meting van niet-specifieke achtergrond signaal veroorzaakt door primaire antilichamen, respectievelijk 37. voor omstandigheden waar cellen schaars zijn, raden we compensatie deeltjes voor SS en isotype controles. Compensatie deeltjes uitstoten doorgaans helderder signalen dan biologische controles en hebben ook minder variantie in achtergrond fluorescentie. Bovendien, fluorescentie minus één (FMO) besturingselementen zijn ideaal voor het gating grenzen uitgezet. Door FMO controles, wordt de maximale fluorescentie verwacht voor een kleuring subset geopenbaard in een gegeven kanaal wanneer de fluorescerende-gelabeld antilichaam specifiek voor dat specifieke fluorescentie-kanaal uitgesloten38 is. In onze ervaring, naast enkele gekleurde compensatie deeltje besturingselementen, moet een onbevlekt biologische vergelijking-besturingselement worden opgenomen voor de vaststelling van nauwkeuriger positieve/negatieve grenzen.

Met uitzondering van cellulaire puin en cel aggregaten in de gating strategie is ook een extra aanpak gebruikt om te minimaliseren van auto-fluorescentie. Om te onderscheiden cellulaire puin van de bevolking van levensvatbare cellen, is met behulp van voorwaartse scatter (FSC) en kant scatter (SSC) de meest voorkomende gating strategie. Voor geïsoleerde cellen die worden gebruikt voor analyses van post sorteren en vereisen hogere levensvatbaarheid voor DNA/RNA extracties uit te voeren, is het aanbevolen dat levensvatbaarheid vlekken niet worden gebruikt met elke fixatie en/of permeabilization procedures. Formaldehyde vaststelling van cellen kan compromis nucleïnezuur integriteit als gevolg van nucleic zuur-eiwit crosslinking en dus beperken van isolatie efficiëntie, detectie en nauwkeurige kwantificering. Cel aggregaten zoals gezegd kunnen niet alleen bijdragen aan uitgestoten auto-belichting fluorescerende signalen, maar ook resulteren in "toeval aborts". Zo'n actie treedt op als u wilt behouden van hoge zuiverheid in een soort, maar als het te vaak, het vermindert de gesorteerde cel opbrengst. Sorteer buffer (FACS buffer) aangevuld met DNAse en MgCl2 tijdens de cel kleuring kunt minimaliseren cel aggregatie. Het is aanbevolen om niet in combinatie met DNAse EDTA gebruiken, zoals het remt de activiteit van het enzym. Filteren van de eencellige schorsing door een zeef cel 70 µm vóór sorteren kan ook bevrijden van cellen uit aggregaten. Het is absoluut noodzakelijk om op te merken dat u wilt minimaliseren aggregatie, cel schorsingen bij een concentratie van 5 miljoen cellen per mL in een minimale hoeveelheid 0.4 mL worden moeten. Cellen van lipide beladen weefsels geïsoleerd neigen te zijn meer vatbaar voor aggregatie en dit kan resulteren in toeval wordt afgebroken en lage soort opbrengst. Het wordt aanbevolen dat de monsters verder worden verdund als aggregatie aanhoudt. Gesorteerde macrofagen kunnen worden verzameld in polypropyleen collectie van de ronde onderkant buizen met foetale boviene rijk medium om te maximaliseren van de terugwinning van de cel. Een hoge FBS beginconcentratie zorgt voor herstel van de cel omdat de concentratie uiteindelijk wordt verdund met elke gesorteerde druppel. Voor het verzamelen van cellen die worden gebruikt voor de analyse van DNA of RNA, kunnen cellen gesorteerd worden rechtstreeks in de passende winning reagens (bv TriZol) om RNAse verontreiniging te voorkomen. Bij het sorteren van hoge volumes, wordt sorteren van cellen eerst in kweekmedia aangevuld met een lagere concentratie aan FBS, aanbevolen. Onmiddellijk na sortering, cellen moeten vervolgens worden Ingehuld en lysed voor DNA/RNA extractie. De geïsoleerde genetisch materiaal kan dan worden geprofileerd voor gewijzigde genexpressie. Pro-inflammatoire genen inclusief TNFα, IL1-β, IL-6, IL-12, 1L-23, IFNγ, Nos2 en MCP1 (CCL2) zijn vaak upregulated in macrofagen een klassiek geactiveerd (M1) fenotype39tentoonstellen. Aan de andere kant, als alternatief geactiveerd (M2) fenotype in macrofagen wordt vaak gekenmerkt door inductie van genen coderend voor Chi3l3 (Ym1), Fizz1, Arginase 1, CD206, CD163, CD209 1L-10 en TGFβ34,40. Onlangs, CD38, Fpr2 en Gpr18 zijn gevalideerd als M1-specifieke genen en c-Myc en Egr2 als M2-specifieke genen34.

Hoewel Multi-Color stroom cytometry gebaseerde cel Sorteren een waardevol instrument is voor het isoleren van macrofagen op hoge zuiverheid, kan deze aanpak worden dure. De krachtige voordelen van FACS gemedieerde sorteren zijn afhankelijk van vluchtuitvoeringspersoneel die een sorteerder van de cel naast de hoge kosten van cel sorter onderhoud reagentia kunnen manoeuvreren. Alternatieve benaderingen kunnen worden gebruikt in de vervanging van dure stroom cytometry gebaseerd cel sorteren. Zij omvatten magnetische geactiveerde cel sorteren (MACS) of dichtheid kleurovergang centrifugeren. De eerste alternatieve cel Sorteren methode vermeld omvat magnetische en/of microbead kolom isolatie kits te scheiden van de cellen van belang van bloed of stevige weefsels41. De tweede cel Sorteren benadering scheidt een heterogene celsuspensie op basis van de dichtheid en de kracht van centrifugeren. Helaas, dichtheid gemedieerde centrifugeren is niet praktisch voor het isoleren van macrofagen van de aorta - of WAT-afgeleide eencellige schorsingen. Dikwijls, het product dat wordt verkregen uit de differentiële centrifugeren is besmet, en van lage opbrengst. Kleinere weefsels (zoals de aorta of WAT) die leiden tot een paar cellen aanvankelijk na enzymatische spijsvertering zijn bijgevolg niet ideale kandidaten voor differentiële centrifugeren. Aan de andere kant, kunnen cel schorsingen afgeleid van gedissocieerde levers produceren een voldoende aantal gesorteerde macrofagen die in post sorteren experimenten en analyses uitgevoerd, zoals cultuur stimulaties, qPCR of westelijke bevlekkende analyse kan worden gebruikt. Deze alternatieve benaderingen kunnen ook worden gebruikt om te verrijken bevolking vóór FACS, waardoor voor schonere soorten. Van de nota make-up weefsel resident macrofagen een klein percentage van de bevolking van de gehele cel in WAT, lever en de aorta. Verrijking van cellen voorafgaand aan FACS sorteren is een aanpak die is gebruikt bij het isoleren van de populaties van cellen die minder frequent zijn. Een kwestie die is gebruikelijk in het isoleren van kleine populaties is die grote cel nummers moeten worden verwerkt om te verkrijgen genoeg cellen voor latere analyse. Verrijking of vooraf sorteren kan worden gebruikt om dergelijke een probleem te verhelpen. Deze methode helpt bij het verkrijgen van een beknoptere bevolking van cellen door positieve en negatieve selectie maar ook hierdoor behoud van tijd als FACS sorteren kan een blijvend proces voor dichte weefsel bronnen zoals de lever.

Recente vooruitgang in de biologie van de ontsteking wijzen op het belang van fenotypische en functionele karakterisering van macrofaag heterogeniteit ter bevordering van het begrip van de complexe rol van deze immuuncellen bij het reguleren van chronische ontsteking. Kortom, biedt dit uitgebreide protocol een multi-dimensionale benadering voor het karakteriseren van weefsel resident macrofagen uit drie hallmark weefsels in gevestigde dieet geïnduceerde obesitas en ontsteking modellen studeerde. Wat nog belangrijker is dit protocol rekening houden met de moeilijkheid en de nodige maatregelen om te isoleren schoon single cell schorsingen van dysregulated ontstoken weefsels zoals WAT, aorta plaques en vette levers. Het protocol kan de onderzoeker stroom cytometry en FACS sorteren tools in een vernieuwende dimensie te karakteriseren weefsel resident macrofagen, belangrijke regulatoren van ontsteking in obesitas toe te passen. Diepgaande karakterisering van de populatiedynamiek van de macrofaag kan inzicht geven in monocyt handel in ontstoken weefsels en zorgen voor verdere mechanistische evaluaties door een veelheid van experimentele benaderingen op gesorteerde macrofagen. Verdere karakterisering van macrofaag populaties kan een cruciale inzicht geven in de biologische onderbouwing die macrofaag heterogeniteit in gezondheid en ziekte regelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Auteurs hebben geen belangenconflict openbaar te maken.

Acknowledgments

We bedank de Stroom Cytometry Core faciliteit in de Pennsylvania State Universiteit Millennium wetenschap Complex.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26 G x 5/8 in Needles BD 305115
23 G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set BD 367297 Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion
21 G 1 1/2 in. Needles BD 305156
1 mL syringe with rubber stops BD 309659
10 mL Syringes BD 309604
1 mL Syringe BD 309659
F4/80 PE Biolegend 123110
CD11c PE/Cy7 Biolegend 117318
CD11b PE/Cy5 eBioscience 15-0112-81
Anti-mouse CD16/32 Fc Block  Biolegend 101320
CD45 Pacific Blue Biolegend 103126
PE Rat IgG2a Biolegend 400508
PE/Cy7 Armenian Hamster IgG Biolegend 400922
PE/Cy5 Rat IgG2b Biolegend 400610
Pacific Blue Rat IgG2c Biolegend 400717
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)  Cellgro 15-017-CV
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) Cellgro 21-031-CV
70 μm cell strainers Corning, Inc. 352350
1.7 mL microcentrifuge tube  Denville C2170
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16x Electron Microscopy Sciences CAS #30525-89-4
Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23 mm, Sharp  Stoelting 52132-10P Used for general dissecting purposes
Micro Forceps, 4 inches, full curve, 0.8 mm Stoelting 52102-37P  Used for general dissecting purposes
Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge  Fine Science Tool 15000-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Curved 0.07 mm x 0.04 mm Tip Forceps Fine Science Tool 11297-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Hemostatic Forceps (Curved) Fine Science Tool 13021-12
Heparin Sodium Salt Fischer Scientific 9041-08-1
35 mm Cell Culture/Petri Dishes Fischer Scientific 12-565-90
Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid Fischer Scientific 08-757-100D
15 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-959-53A
50 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-432-22
5 mL Round-Bottom Polystyrene Tubes  Fischer Scientific 14-959-5
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-Products 100-106
Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) Millipore EX0285-1
Bovine Serum Albumin Rockland BSA-50
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6885
Collagenasse Type XI Sigma-Aldrich C7657
Hyaluronidase Type I Sigma-Aldrich H3506
DNAse Sigma-Aldrich DN25
Collagenase Type I Sigma-Aldrich C0130
NaOH Sigma Aldrich 1310-73-2 
CaCl2 Sigma Aldrich 449709-10G
500 mL beaker  Sigma Aldrich 02-540M
4 cm Hemostatic clamp Stoelting 52120-40
Toothed forceps Stoelting 52104-33P
50 μm Disposable filters Systemex 04-0042-2317
Collagenase Type IV ThermoFischer Scientific 17104019
Ammonium Chloride Potassium (ACK) ThermoFischer Scientific  A1049201
Razors (0.22 mm (0.009")) VWR International 55411-050
Texas Red Live/Dead stain Red viability stain (in Figure 1A)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davies, L. C., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages: Then and Now. Immunology. 144, (4), 541-548 (2015).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, (12), 840-846 (2006).
  3. Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444, (12), 875-880 (2006).
  4. Jung, U., Choi, M. -S. Obesity and Its Metabolic Complications: The Role of Adipokines and the Relationship between Obesity, Inflammation, Insulin Resistance, Dyslipidemia and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Int J Mol Sci. 15, (4), 6184-6223 (2014).
  5. Emanuela, F., Grazia, M., Marco, D. R., Maria Paola, L., Giorgio, F., Marco, B. Inflammation as a link between obesity and metabolic syndrome. Nutr Metab. 2012, 1-7 (2012).
  6. Vieira-Potter, V. J. Inflammation and macrophage modulation in adipose tissues. Cell Microbiol. 16, (10), 1484-1492 (2014).
  7. Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. S. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11, (11), 738-749 (2011).
  8. Dey, A., Allen, J., Hankey-giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation : blood monocytes versus tissue macrophages. Front Immunol. 5, (1), 1-15 (2015).
  9. Mills, C. D., Lenz, L. L., Ley, K. Macrophages at the fork in the road to health or disease. Front Immunol. 6, (2), 1-6 (2015).
  10. Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Front Immunol. 5, (8), 1-22 (2014).
  11. Guilherme, A., Virbasius, J. V., Vishwajeet, P., Czech, M. P. Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, (5), 367-377 (2008).
  12. Cummins, T. D., Holden, C. R., et al. Metabolic remodeling of white adipose tissue in obesity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307, (3), 262-277 (2014).
  13. Fujisaka, S., Usui, I., et al. Regulatory Mechanisms for Adipose Tissue M1 and M2 Macrophages in Diet Induced Obese Mice. Diabetes. 58, (9), 2574-2582 (2009).
  14. Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotipic switch in adipose tissue macrophage polarization. J Clin Invest. 117, (1), 175-184 (2007).
  15. Qureshi, K., Abrams, G. A. Metabolic liver disease of obesity and role of adipose tissue in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 13, (26), 3540-3553 (2007).
  16. Bedossa, P., Paradis, V. Liver extracellular matrix in health and disease. J Pathol. 200, (4), 504-515 (2003).
  17. Tilg, H., Moschen, A. R. Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease: The multiple parallel hits hypothesis. Hepatology. 52, (5), 1836-1846 (2010).
  18. Milic, S., Lulic, D., Stimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: Biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20, (28), 9330-9337 (2014).
  19. Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. Int J Obesity. 26, (12), 754-764 (2002).
  20. Mestas, J., Ley, K. Monocyte-Endothelial Cell Interactions in the Development of Atherosclerosis. Trends Cardiovasc Med. 18, (6), 228-232 (2008).
  21. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496, (7446), 445-455 (2013).
  22. Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nat Rev Immunol. 14, (10), 986-995 (2013).
  23. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), e1546 (2010).
  24. Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. J Vis Exp. (94), e52174 (2014).
  25. Smedsrød, B. Protocol for preparation of mouse liver Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells. 1, Available from: http://munin.uit.no/handle/10037/4575 1-10 (2012).
  26. Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J Vis Exp. (53), e2848 (2011).
  27. Salamone, M., Saladino, S., Pampalone, M. Tissue Dissociation and Primary Cells Isolation Using Recombinant Collagenases Class I and II. Chemical Engineering Transactions. 38, Matsushita 1994 247-252 (2014).
  28. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, (4), 1394-1400 (2008).
  29. Fain, J. N. Isolation of Free Brown and White Fat Cells. Diabetologia. 375, (1964), 555-561 (1968).
  30. Seglen, P. Preparation of isolated rat liver cells. Method Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
  31. Yu, S., Allen, J. N., et al. The Ron Receptor Tyrosine Kinase Regulates Macrophage Heterogeneity and Plays a Protective Role in Diet-Induced Obesity, Atherosclerosis, and Hepatosteatosis. J Immunol. 197, (1), 256-265 (2016).
  32. Yu, Y. R. A., O'Koren, E. G., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS ONE. 11, (3), 1-23 (2016).
  33. Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires "M2c" polarization and MerTK induction. J Immunol. 100, (2), 130-134 (2012).
  34. Jablonski, K. A., Amici, S. A., et al. Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages. PLoS ONE. 10, (12), 5-11 (2015).
  35. Rőszer, T. Understanding the Mysterious M2 Macrophage through Activation Markers and Effector Mechanisms. Mediators of Inflamm. 2015, 1-16 (2015).
  36. Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow Cytometry Analysis of Adipose Tissue Macrophages. Methods Enzymol. 4, (164), 297-314 (2011).
  37. Kim, Y. -J., Brox, T., Feiden, W., Weickert, J. Technical Note: Flow Cytometry Controls, Instrument Setup, and the Determination of Positivity. Cytometry A. 71, (1), 8-15 (2007).
  38. Tung, J. W., Heydari, K., et al. Modern Flow Cytometry: A Practical Approach. Clin Lab Med. 27, (3), 453-468 (2007).
  39. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000. 6, (3), 13 (2014).
  40. Porcheray, F., Viaud, S., et al. Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation. Clin Exp Immunol. 142, (3), 481-489 (2005).
  41. Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment. Rep Prog Phys. 1, (78), 1-6 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics