Yalıtım, karakterizasyonu ve obezite ile ilgili iltihap tarafından etkilenen dokular makrofajlar arıtma

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu iletişim kuralı ayırmak ve karakterize bir araştırmacı doku yerleşik sağlar makrofajlar içinde çeşitli metabolik bozuklukların diyet kaynaklı modellerinden çıkarılan iltihaplı dokulara hallmark.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Allen, J. N., Dey, A., Nissly, R., Fraser, J., Yu, S., Balandaram, G., Peters, J. M., Hankey-Giblin, P. A. Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation. J. Vis. Exp. (122), e55445, doi:10.3791/55445 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Obezite büyük ölçüde doku yerleşik makrofajlar gibi monosit kaynaklı makrofajlar tarafından aracılık ettiği kronik bir enflamatuar devlet teşvik etmektedir. Diyet kaynaklı obezite (DIO) makrofaj heterojenite rolü eğitim değerli bir modeldir; Ancak, yeterli makrofaj izolasyonların iltihaplı dokulara elde etmek zordur. Bu protokol için biz yalıtım adımları ve doku yerleşik makrofajlar uygun nüfusu yüksek yağlı (HFD) veya yüksek yağ/yüksek kolesterol (18 hafta takip fareler elde etmek için çalışmalarımız elde gerekli hata giderme kılavuzu anahat HFHCD) diyet müdahale. Bu iletişim kuralı obezite ve karaciğer, beyaz yağ dokuları (WAT) ve aort damarı da dahil olmak üzere ateroskleroz okudu üç hallmark dokular üzerinde duruluyor. Biz nasıl ikici kullanımı vurgulayın Akış Sitometresi yalıtım yeni bir boyut ve doku yerleşik makrofajlar karakterizasyonu elde edebilirsiniz. Bu iletişim kuralının temel bir bölümünü doku özgü Enzimatik sindirim ve makrofaj yalıtım ve akış sitometrik çözümlemesi için boyama sonraki hücre yüzeyine antikor temel inceliklerini giderir. Bu iletişim kuralı mevcut karmaşıklığı floresan aktif hücre (FACS) sıralama temel giderir ve geniş karakterizasyon yeterli sıralanmış hücre gruplarından elde etmek için bu karmaşıklığı için açıklamalar sunar. Alternatif zenginleştirme yöntemleri gibi FACS ile çalışırken esneklik ve zaman yönetimi için izin yoğun karaciğer hücreleri sıralamak için dahil edilir. Kısacası, bu iletişim kuralı çok sayıda belirli bir çalışma içinde iltihaplı doku makrofaj heterojenite değerlendirmek için araştırmacı yardımcıları ve olumlu hücresel yalıtım ve karakterizasyonu için başarılı olmuştur anlayışlı sorun giderme ipuçları sağlar iltihap DIO-aracılı bağışıklık hücrelerinin.

Introduction

Fare modelleri yoğun insan hastalıkları dinamiklerini incelemek için kullanılmaktadır. Fareler hastalıklı bir durumda doku yerleşik hücre uygun yalıtım Patogenez moleküler ve hücresel katkılar hastalığı1anlamak için bir platform sağlar. Kritik önemi olan bir obezite bozukluğudur. Obezite sıklığı 2 diyabet, kalp-damar hastalıkları ve yağlı karaciğer hastalığı2,3yazın ve insülin direnci ile paralel olarak dünya çapında yükselmeye devam ediyor. Aşırı besin tüketimi daha da azalmış fiziksel aktivite olan aort ve karaciğer4gibi diğer periferik dokuların hücresel ortamı değiştirmek Yağ dokusundan kaynaklanan değişmiş sinyalleri tetikleyen tarafından çarpık. Bu tür bozulma metabolik homeostazı sonuçları bir kronik düşük dereceli sistemik inflamasyon5.

Klasik makrofajlar aorta ve karaciğer gibi beyaz Yağ dokusundan (WAT) onların işe alım için ikamet aktivasyonu sadece bozukluk metabolik sinyallerin başlatmak ama aynı zamanda iltihabı6,7sürdürmek için gösterilmiştir. Makrofajlar fenotipik ve fonksiyonel heterojen şiddetle obezite patogenezi ile ilişkilidir ilgili komorbiditeler7. Makrofaj polarizasyon dinamik plastisite bu hücreler bir dizi ilerleme koordine aktif fenotipleri ve inflamasyon8çözünürlüğe sergilemek sağlar. Klasik aktif (M1) makrofajlar iltihap yayılmasında karıştığı iken, alternatif olarak aktif (M2) makrofajlar çözünürlük ve doku onarımı9,10ile ilişkilendirilmiştir.

Vücudun metabolik stres uğrar gibi beyaz yağ dokusu anormal derecede birikir. Genişletilmiş yağ dokusu çeker ve derinden insülin direnci, hiperglisemi ve sonuçta tip 2 diabetes mellitus, insülin direnci veya hiperglisemi11tanıtmak için normal adipocyte işlevini değiştirme inflamatuar hücreleri korur, 12. Buna paralel olarak, beyaz yağ dokusu değişikler yanıt inflamatuar sinyalleri tarafından yayımlanan olarak klasik aktif (M1) yağ doku makrofajlar (TYS)13,14sızmış. Çok hücreli bu organ aort ve karaciğer4gibi diğer vücut organlarının normal fonksiyon raydan çıktı bir çağlayan sinyal yayıyor.

Karaciğer yakındaki dysregulated WAT15kaynaklanan uyaranlara yanıt olarak uyum sağlar metabolik bir elektrik santrali var. Hepatik makrofajlar veya Kupffer hücreleri, metabolik değişiklikler, hem parenkima dönüşümü inflamatuar sitokinlerin ve parenkimal olmayan hücre fenotip salgılar ve doku remodeling teşvik. Karaciğer lipid birikimi, iltihap, aşırı hücre dışı matriks mevduat, nekroz ve karaciğer hasarı geniş yelpazede katkıda inflamatuar hakaret non alkolik yağlı karaciğer hastalığı ile ilgili nihai işlev kaybı aşağıdaki gibidir 16,17,18.

Vücudun kronik metabolik stres19uğrar gibi güvenliği aşılan WAT ve karaciğer fonksiyon için paralel olarak büyük arterlerin lipidler Arteryel duvardaki içinde birikir. Arteryel lipid birikimi kemokinler aktive endotel hücreleri tarafından salgılanmasını ve monosit20sonraki işe alım tetikler. Bir kez işe, monosit çoğalırlar, ayırt etmek, lipoproteinler yutmayın ve köpük hücreleri haline. Atherogenesis başlatılan ve pro-inflamatuar etkinliği tarafından sürekli işe ve doku ikamet lipid yüklü makrofajlar. Bu aterojenik microenvironment geçirilen ekstraselüler ve hücre içi stres sinyallerini succumbing, bu makrofajlar sonra art arda sıralı sinyal bir apoptotik meşgul. Bu köpük hücreleri ölürken dolu lipid içeriklerini daha sonra plak rüptürü, miyokard enfarktüsü ve inme için neden lezyon nekrotik çekirdeğini katkıda bulunur.

Topluca, makrofaj fenotipleri heterojen kısmen enflamatuar degisimler WAT, karaciğer ve aort8,21gibi dysregulated dokularda gözlenen tarafından indüklenen obezite orchestrates. Karakterizasyonu işe ve ikamet makrofajlar doku makrofaj fenotip1işlemek potansiyel moleküler hedeflerin içgörü sağlayabilir. Etkili bir şekilde gelen obezite kaynaklı iltihaplı doku makrofajlar karakterize etmek için bir tek hücre süspansiyon Enzimatik sindirim elde edilebilir. Böyle ayrılma iletişim kurallarının yeterince bağ dokusu bağışıklık hücre ölümü en aza indirilmesi ve optimum hücre verim sağlayan aşağılayıcı içinde etkili olması gerekir. Enzim karışımı doku ve yapısal onun makyaj türüne bağlıdır. Aort damarı gibi esnek doku karaciğer ve WAT doku ayrılma elde etmek için kıyasla daha güçlü enzimatik aktivite gerektirir. Tek hücre süspansiyon, doku ikamet makrofajlar olabilir belirsizliğe yer bırakmadan ile karakterize veya transkripsiyon profil oluşturma gibi daha da aşağı akım analizleri için izole.

Burada bir doku özel iletişim kuralı etkin bir şekilde izole ve doku yerleşik makrofajlar indüklenen geleneksel beslenme obezite elde edilen karakterize için collagenase bağlı doku sindirim ve renkliden Akış Sitometresi kullanan anlatılan, ateroskleroz, basit yağlanma ve steatohepatitis fare modelleri. Eşzamanlı lökosit-(CD45 ve/veya CD11b) ve makrofaj - karşı antikor ile hücre yüzey işaretlerinin boyama (F4/80) belirli antijenleri kez makrofaj nüfus22tanımlamak için kullanılır. Floresans aktif hücre (FACS) sıralama yüksek saflıkta, saptanan bu nüfus sıralamak için kullanılan güçlü bir stratejidir. Sıralanmış nüfus daha sonra aşağı akım moleküler analizi (gibi nicel gerçek zamanlı Polimeraz zincir reaksiyonu)23kullanarak fenotip belirli bir gen profilleri için değerlendirilebilir. Standart Akış Sitometresi ve Akış Sitometresi tabanlı cep sıralama makrofajlar içinde büyük ölçüde türdeş olmayan hücre süspansiyon ayrım içinde güçlü araçlar olmakla birlikte, eski protokoller başarılı çıkış sağlamak için optimize edilmiş olması gerekir. Bu çalışmada, etkili bir şekilde izole etmek ve uygun doku belirli makrofajlar karakterize protokolleri açıklanmıştır; daha da önemlisi, bu çalışmada, önlemek ve/veya bunları çözmek için proaktif ve LNB'ler stratejileri yanı sıra sık sık ortaya çıkan teknik sorunları içine çok önemli bilgiler sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneysel protokoller (Bölüm 1, 1.2 ve 1.3) kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Pennsylvania State Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

Doku Ayrılma arabellekleri hazırlık Son hacim Depolama
Beyaz Yağ dokusundan (WAT) Ayrılma tampon: %2.5 HEPES, 10 mg/mL sığır serum albumin (BSA), 3 mg/mL (% 0.3) Collagenase tip II içinde Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) L-glutamin ve sodyum pyruvate olmadan 4,5 g/M glikoz ile 500 mL eksi 80° C (10 mL aliquots)
Karaciğer 25 x perfüzyon arabellek konsantresi (PBC): 3,55 M NaCl, 168 mM KCl, 240 mM HEPES, 150 mM NaOH buna deiyonize H2O distile 500 mL eksi 20° C (40 mL aliquots)
Koruma arabellek (PRB): % 1 BSA perfüzyon arabellek x 1 1 L 4 ° C
Ayrılma arabellek: 1 x perfüzyon arabellek 4,76 mM CaCl2 ve 72 U/mL Collagenase tip IV ile desteklenmiş (fare) başına 50 mL Hazırlamak hemen önce kullanım
Aort Ayrılma arabellek: 125 U/mL Collagenase XI 60 U/mL Hyaluronidase yazın, ben 60 U/mL Dnaz ben, 450 U/mL Collagenase tip ı, 20 mM HEPES fosfat Buffered Saline (PBS) x 1 500 mL eksi 80° C (10 mL aliquots)

Tablo 1: Doku belirli perfüzyon arabellek tarifleri.

1. doku yalıtım ve ayrılma

  1. WAT yalıtım ve ayrılma
    1. Tablo 1aynı derecede doku özel arabellekleri hazırlamak ve açıklandığı gibi depolayabilirsiniz.
    2. Aşağıdaki reaktifler hazırlayın.
      1. Sindirim arabellek kadar kullanmak uygun hacmi WAT ayrılma arabellek ve mağaza 4 ° C'de çözdürme tarafından hazırlayın. Kullanımdan hemen önce tampon ile 37 ° c sıcak 1 x %2 fetal sığır serum (FBS) içeren fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) hazırlayarak FACS arabellek hazırlayın.
    3. WAT yalıtım
      1. Bir dolu fare bir karbondioksit (CO2) odası ötenazi. Diseksiyon Sahne Alanı'na devam etmeden önce etkinliğini denetleyin.
      2. İyice ıslanmış ve etanol ile kaplı kadar % 70 etanol içeren bir ölçek kısaca euthanized fare daldırma. Fare menfez yüzey diseksiyon Sahne Alanı'nda yeri ve fare ön ve arka paws için diseksiyon kurulu 21 G iğneler kullanarak bağlayın.
      3. Orta noktası uç forseps üretral açılış anterior karın deri kavramak için kullanın, sonra keskin diseksiyon makası kavranabilir karın deride bir nick yapmak için kullanın.
      4. Cilt ve Periton arasında küçük kesi makası alt bıçak yerleştirin ve göğüs kafesi için yanal bir kesi karın üzerinden yapmak.
      5. Yavaşça geri bozulmamış Periton boşluğu ortaya çıkarmak ve geri şeffaf membran katlamayın veya karın WAT ortaya çıkarmak için doku tüketim bir yan kesi aracılığıyla Periton ve ya yapmak için cilt çekin.
      6. Perigonadal yağ yastıkları Mann ve ark. içinde açıklandığı gibi toplamak 24
        1. Erkek farelerde perigonadal yağ yastıkları gevşek testis ve epididim bağlıdır. İlk testis bulun ve sonra Forseps ile orta noktası, epididim kafa tutun kavramak ve yavaşça çekin.
        2. Keskin diseksiyon makası kullanarak, testis ve epididim (baş, gövde ve kuyruk) yüzey boyunca keserek her epididimal yağ yastığı tüketim.
        3. Bağ dokusu ile kesme doğrudan epididim yapısına bağlı iken Forseps ile yağ yastığı üzerinde yavaşça çekin.
        4. Forseps kullanarak, yağ yastığı için epididimlerden proksimal sonu sıkıca kavrama ve hafifçe yağ yastığı gonads uzak kabuğu
        5. Dişi farelerde perigonadal yağ yastıkları gevşek bağ rahim boynuz ve rahim beden var.
        6. Orta noktası forseps kullanarak, perigonadal yağ dokusu kavrama ve doku rahim vücut ve rahim boynuz yavaşça çekin.
        7. Rahim vücut ve rahim boynuz keskin diseksiyon makası kullanarak boyunca keserek her yağ yastığı tüketim.
      7. Bir petri yastıkları PBS ile dolu ve doku nemli tutmak için buza tutmak yağ koyun.
    4. WAT ayrılma tek hücre süspansiyonlar içine
      1. Aşırı PBS petri kabına kaldırmak ve karın WAT küçük parçalar halinde kıyma için tek uçlu jilet kullanın.
      2. Tıraş bıçağı keskin kenar ile hafifçe 2 mL WAT ayrılma arabellek içeren etiketli 15 mL polipropilen toplama tüp içine kıyılmış karın WAT kazı.
      3. Bu doku-sindirim arabellek karışımı yavaş sürekli rotasyon için 45 dk 37 ° C'de altında kuluçkaya.
      4. Sindirilir doku 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla bir 50 mL koleksiyonu tüpüne enjektör pompası lastik piston dairesel hareketlerle hareket ederken filtre ve hücre süspansiyon filtreden elek devam ediyor.
      5. Dulbecco 2 mL damlalıklı modifiye kartal orta (DMEM) bir 15 mL toplama tüp, yavaşça damlalıklı yukarı ve aşağı 's ve filtrenin tek hücre süspansiyon ile yıkayın.
      6. Filtre ile soğuk DMEM iki ek kez yıkama ve tek hücre süspansiyon Buza koyun.
      7. Hücre süspansiyon 300 x g 8 dk 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi.
      8. Dikkatle kayan adiposit (ilk) kaldırmak için bir vakum aspiratör kullanın ve süpernatant kalan. Pelleted stromal vasküler kesir (SVF) rahatsız değil emin olun.
      9. 1000 µL pipet ile hafifçe Pelet eritrositler üreticinin yönergelerine uygun koşullar için amonyum klorür-potasyum (ACK) arabelleği yeniden askıya alma.
      10. DMEM ile yukarıdaki hücre süspansiyon sulandırmak ve hücre süspansiyon 300 g 8 dk 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi.
      11. Soğuk PBS % 2 içeren hücrelerde yeniden askıya FBS (FACS arabellek) ve bir Burker odası/hemasitometre hücreleri saymak.
      12. 1 x 106 hücreler (için temel Akış Sitometresi) veya tüm hücre süspansiyon (FACS için) etiketli 5 mL yuvarlak alt polistren tüpler aktarın. Akış Sitometresi Protokolü boyama için Bölüm 2'ye geçin.
  2. Karaciğer dokusu yalıtım ve ayrılma
    Not: Bu protokol Smedsrød25uyarlanmıştır.
    1. Tablo 1 aynı derecede doku özel arabellekleri hazırlamak ve açıklandığı gibi depolayabilirsiniz.
    2. Aşağıdaki reaktifler hazırlayın.
      1. 1 x sadece perfüzyon başlamadan önce perfüzyon arabellek (PB), sulandrarak 40 mL PBC 960 mL ultrasaf H2O. öncesi sıcak bir şırınga içine tarafından PB 50 mL 37 ° C'de dolu hazırlayın. Herhangi bir mevcut hava kabarcıkları ortadan kaldırmak.
        1. Hava kabarcıkları ortadan kaldırmak için nerede leur kilit ipucu yukarı işaret ediyor şırınga tersine çevirin. Dokunun veya hava kabarcıkları şırınga üst pf olana şırınga hafifçe vur. Hava çıkarmak için yavaşça push pistonu
      2. 476 mm CaCl2 çözüm 0.5 mL sulandrarak sindirim arabellek hazırlamakperfüzyon arabellek x 49,5 ml 1. 3600U Collagenase türü IV 4,76 mM CaCl2 -PB çözüm ekleyin. Sadece perfüzyon başlamadan önce sindirim arabelleği 37 ° C'de 50 mL dolu bir şırınga önceden ısıtmak. Herhangi bir mevcut hava kabarcıkları ortadan kaldırmak 1.2.2.1.1 adımda anlatıldığı gibi.
      3. Koruma arabellek (PRB) 2.5 g sığır serum albumin (BSA) çözülerek 250 mL 1 x perfüzyon arabellekte hazırlayın. 4 ° C'de depolayın veya buz üzerinde kullanımda kadar devam.
      4. 1 x PBS ve % 2 FBS önbellekle FACS hazırlayın.
    3. Karaciğer dokusu yalıtım
      1. Bir fare CO2 boğulma tarafından ötenazi, fare kürk ile intraabdominal organlar önlemek amacıyla % 70 etanol ile emdirmek.
      2. Fare ventral tarafta yukarı bir polistiren köpük kurulu anatomi ve fare ön ve arka güvenli pozisyon diseksiyon kurulu 21 G iğneler kullanarak paws.
      3. Göğüs duvarı ve Periton boşluğuna duyurmak, bir orta nokta uç forseps kullanarak üretral açılış yakınındaki karın deri kavramak. O zaman keskin diseksiyon makası kavranabilir karın cilt için küçük bir insizyon attım oluşturmak için kullanın.
      4. Cilt ve Periton arasında küçük kesi makası alt bıçak yerleştirin ve kasığından çene için yanal bir kesi yapmak.
      5. Yavaşça geri bozulmamış Periton boşluğu ve göğüs duvarı açığa, karın zarını aracılığıyla yanal bir kesi yapmak ve membran tüketim için cilt çekin.
      6. Göğüs kemiği kaldırmak ve dikkatle diyafram deşmek, inferior vena kava (IVC) rahatsız değil emin olun. Gastrointestinal organ kenara çek ve subhepatic IVC bulun. Kan durdurucu sargı forseps IVC yerelleştirilmiş perfüzyon korumak için suprahepatic kelepçe için kullanın.
        Not: Visseral beyaz yağ dokuları aşırı birikimi kez IVC maske yapabilirsiniz. Bu gemi daha iyi görmek için yağ dokusu IVC yanındaki küçük bir alanı eksize. Bükülebilir yağ dokusu içinde kazıma pencere o zaman cannulation için gemi ortaya çıkarmak için IVC üzerinde konumlandırılmış olabilir.
      7. 23 G kan toplama ve infüzyon seti için Önceden ısıtılmış PB ile dolu şırınga iliştirin. Boru ve iğne PB ile doldurulur kadar pistonu üzerinde hafifçe itin.
      8. 23 G iğne, subhepatic IVC düzeyine paralel yerleştirin. İğne 4 cm Kan durdurucu sargı kelepçe kullanarak yerine sabitleyin.
        Not: IVC daha iyi olabilir bu diyet beslenen farelerde IVC tercih subhepatic Cannulation görüntülenir ve yağ dolu kavite içinde cannulated.
      9. Yavaşça perfüzyon başlamak için pistonu üzerinde itin, renk hızla karaciğer floş (LOB ilk düzgün) iğne uygun şekilde taşıyıcıyı içinde konumlandırılmış. Genişleme LOB da iğneyi düzgün subhepatic IVC eklediyseniz görünür.
      10. Derhal portal ven karaciğer serbestçe akmaya PB izin vermek için kesti.
      11. Kan görünene kadar karaciğer sıvı. Zaman zaman hafifçe masaj karaciğer lobları arasında ön-parmak ve başparmak perfüzyon kolaylaştırmak için.
        Not: Doku hasarı önlemek için karaciğer işlemek için tırtıklı sigara künt kenarlı araçları kullanmak önemlidir.
      12. PB 5 mL şırınga içinde kalır, Önceden ısıtılmış ayrılma arabellek ile dolu şırınga için değiştirmek. Güvenli iğne konumunu bu dönemde rahatsız etmeyin.
        Not: 1.5 g önemli ölçüde aşan başarılı karaciğer ayrılma güvence altına almak için Önceden ısıtılmış sindirim arabellek büyük bir hacim ile periosteum karaciğerleri genişlemiş.
      13. Tamamen sindirilmiş kadar karaciğer sıvı. Yavaşça perfüzyon kolaylaştırmak için karaciğer lobları masaj.
        Not: Glisson'ın kapsül parankimi üzerinden gözlemlenebilir başarıyla sindirilir karaciğerde ayrılmasıdır. Bu değerlendirmek için forseps, bir çift kör kenarını hafifçe bastırın üzerinde sol yan lob için kullanın. Bir izlenim yüzeyinde görünür ve bir kez forseps çıkarmak girintileme yavaş yavaş doldurmalıdır.
      14. İğne subhepatic IVC kaldırın. Suprahepatic IVC sıkma Kan durdurucu sargı forseps kaldırmaz.
      15. Bütün karaciğer dikkatle makas dissekan kısa düz bıçak kullanarak bağ bağlantı üzerinden kesim tarafından tüketim ve safra kesesi kaldırma.
      16. Bütün karaciğer bir 10 cm-kabında yer 10 mL içeren buz gibi koruma tamponu ve 4 оC kadar mağaza hücreleri kurtarmak için hazır.
    4. Karaciğer hücre ayrılma
      1. Karaciğer 10 mL içeren bir 10 cm çanak transfer buz gibi DMEM.
      2. Tutunma IVC dişli bir forseps kullanarak eksize karaciğere bağlı kesik suprahepatic. Orta noktası forseps Glisson'ın kapsül hücrelerden her LOB için hızlı okşayarak hareket uygulayarak serbest bırakmak için kullanın.
      3. Doymuş DMEM 50 mL toplama tüp bağlı 70 µm hücre süzgeç geçişi.
      4. Damlalıklı 10 mL buz gibi DMEM 10 cm petri kabına ve medya doygunluğu artık görülmektedir kadar 1.2.4.3 1.2.4.1 arasındaki adımları yineleyin. Yer buz üzerinde veya 4 ° C'de hücre süspansiyon
      5. Hücre süspansiyon toplama tüp ters çevirme karışımı yavaşça ve, 54 x g 4 ° C'de 2 dk santrifüj kapasitesi
      6. Süpernatant temiz 50 mL toplama tüp içinde toplamak. Hücre süspansiyon, 54 x g 4 ° C'de 2 dk santrifüj kapasitesi
      7. 1.2.4.6 adım 1.2.4.8 geçmeden önce iki ek kez yineleyin.
      8. Süpernatant temiz 50 mL-toplama tüp aktarmak ve hücre süspansiyon vasıl 300 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi
      9. Parenkimal olmayan hücre Pelet FACS arabellekte yeniden askıya alma ve bunları bir Burker odası/hemasitometre kabul.
      10. 1 x 106 hücreler (için temel Akış Sitometresi) veya 15 x 106 - 20 x 106 hücreler (için FACS) 5 mL yuvarlak alt polistren tüpler etiketli aktarın. Akış Sitometresi Protokolü boyama için Bölüm 2'ye geçin.
  3. Aort yalıtım ve ayrılma
    Not: Bu protokol kasap uyarlanmıştıret al.26
    1. Tablo 1 ' de sağlanan tarifleri temel doku özel arabellekleri hazırlamak ve açıklandığı gibi depolayabilirsiniz.
    2. Aşağıdaki reaktifler hazırlayın.
      1. Sindirim arabellek kadar kullanmak uygun hacmi WAT ayrılma arabellek ve mağaza 4 ° C'de çözdürme tarafından hazırlayın. Kullanımdan hemen önce tampon ile 37 ° c sıcak
      2. 10 x heparin çözüm heparin çözülerek sodyum tuzu 1 x PBS, 200 U/mL bir konsantrasyon içinde hazırlamak. 10 x 1 x 1 x Heparin çözüm hazırlamak için PBS heparin hisse senedi Çözümle sulandırmak. 10 x ve 1 x 4 ° C'de Heparin çözümleri kullanmak kadar saklamak.
      3. %2 içeren 1 x PBS FACS önbellekle hazırlamak FBS.
    3. Aort
      1. Bir fare bir karbon dioksit dolu odası ve durulama ile % 70 etanol ötenazi.
      2. Fare ventral yan diseksiyon sahnede yer, fare ön ve arka paws yaymak ve onları diseksiyon kurulu 21 G iğneler kullanarak bağlayın.
      3. Hemen-den sonra fareyi, ötenazi kardiyak ponksiyon gerçekleştirin. Adımları 1.3.3.4 1.3.3.9 için bakın.
      4. Göğüs kemiğinin alt ucundaki xiphoid işlemi bulun
      5. Bunu yapmak için bir parmak orta nokta hayvanın boyun genişliği boyunca yerleştirin. Kıkırdak bir uzantısı hissedene göğüs kemiği Kaudal sonuna boynundan midline ventral izleyin.
      6. Orta noktası forseps kıkırdak uzantısı kavramak için kullanın ve gerekiyorsa saç veya deri vasıl belgili tanımlık alan düzeltme ekini kaldırarak xiphoid işleminin konumunu işaretleyin.
      7. Kısmen 26 G iğne xiphoid işleminin altında 20-30 ° açıyla yerleştirin.
      8. Yavaşça pistonu yavaş yavaş çekilerek şırınga için negatif basınç uygulayın, sonra iğne daha fazla kan akar kadar boşluğa yerleştirmek.
      9. Kan akışı durursa, yavaş yavaş iğne döndürmek veya biraz olarak taşımak ve dışarı.
      10. Üretral anterior karın deri forseps kapmak için çift tutun kullanım açma ve karın zarını aracılığıyla ventral orta çizgi boyunca kasığından çene için kesin için keskin diseksiyon makası kullanın.
      11. Geri çekin karın organları ve göğüs kafesi ile parmak duyurmak cilt veya künt forseps yavaşça karın organları kayar mı.
      12. Xiphoid işlemi, kapmak için forseps tutun kullanım göğüs kemiği kaldırın ve diyafram deşmek.
      13. Her iki tarafta yanal kaburga kesmek diseksiyon makası kullanarak. Göğüs kemiği sürükleyici, göğüs kafesi yukarı doğru çevirmek ve bağlantı Bankası kesti. Göğüs kafesi temel torasik organları açığa çıkarın.
      14. Aort kalp sol ventrikül (LV) 1-2 mL çözeltisi enjekte edilerek 1 x heparin çözüm dolu 10 bir mL şırınga bağlı 26 lik bir iğne ile sıvı.
        Not: sağlam aterosklerotik aort lezyonlar emin olmak için baskı ile yavaş bir hızda sıvı emin olun.
      15. Timus, akciğerler ve bağ dokusu tüketim. Adım 1.3.3.16 ve 1.3.3.17, bakın.
        1. Beyaz iki loblu (veya kelebek şeklinde) anterior kalp bulun organ ve sıkıca Forseps ile timus kapmak tutun. Her iki loblari yukarı doğru uzak kavite çekin ve tabanda makasla kesme.
        2. Akciğerleri kaldırmak için bir Akciğer lobu Forseps ile çimdik, doku göğüs boşluğuna uzak çekin ve tabanında kesti. Kalan her LOB için yineleyin.
      16. Diseksiyon mikroskop ve mikro-anatomi araçları ve aort (innominate arter, sol ortak Karotid arter ve sol subklavyan arter dahil), artan, azalan, torasik ve abdominal aort kemer toplamak kullanın.
        1. Kalbin sol ventrikül, artan aort bulun.
        2. Eğri 0.07 x 0.04 mm-uç bir çift ile forseps hafifçe sol ventrikül ortaya çıkan artan aort bölümünü kavramak.
          Not: için çevredeki sarı tinged yağ dokusu karşılaştırıldığında, aort LV yeterince heparin çözüm ile boşaltılan kaynaklanan bir parlak beyaz gemi olacak.
          1. Aort düzgün kardiyak perfüzyon tarafından temizlendi değil, aorta için boşluğuna bağlı kalırken aort tekrar sifonu çek. Bunu yapmak için kalp-aort Kavşağı kesme, kalp kaldırmak ve sonra yatay olarak abdominal aort alt uç ile kesti. Artan aort açılış 26 G iğne yerleştirin ve nazikçe heparin çözüm x 1 ile aort floş.
          2. Daha iyi yağ dokusu ve katıştırılmış aort arasında ayırımcılık için artan Aortası üzerine hafifçe tug.
          3. Artan aort hala hafifçe çekerek, kapalı bahar makas dissekan ucu artan aort ve aort saklanması yağ temizlemek için kullanın. Bunu yapmak için ucu kapalı makas bıçaklarının bağlanan yağ yıkmak yağ dokusu inme.
            Not: artan aort ile kemer açıkça görüntülenmeyecektir kadar kesim tarafından herhangi bir yağ dokusu bilincin kaçınmalıdır. Aort kesme önlemek için bu.
          4. Artan aort ile kemer surround Yağ dokusundan açıkça tarif, aşırı yağ tüketim için makas dissekan bahar kullanın.
          5. Yavaşça aort tutun Forseps ile. Yine bahar makas'ın ucu, inme, azalan, torasik ve abdominal aort Kaudal abdominal aort sonuna uzunluğu boyunca yağ kullanarak benzeri yağ kol sağ tarafında.
          6. Aort yağ hayata sarılıyorsan zaman kavramak devam edin. Nazikçe aorta zarar önlemek için yapmanız gerekir.
          7. Böylece yağ şimdi aort yerleştirilir yavaşça aort mikroskop yukarı doğru çekin.
          8. Kapalı makas bıçakları inen aorta, şiddetli ön sonuna yakın yağ-aort arabirimi arasında yağ dokusu'nın eki aorta'nın yüzeyine açık açık bir süpürme hareketi kullanarak ekleme.
            Not: İyice aşırı yağ kaldırma ve aort hala boşluğu içinde iken doku bağlantı önerilir.
          9. Kalp tüketim ve Kaudal abdominal aort sonuna kemiği kesti. Bütün aort kaldırın.
          10. Aort bir 35 mm tabak yerleştirin ve uzakta herhangi bir aşırı yağ iki 21'lik iğne kullanarak Aortası üzerine alay. Eksize aort 1.7 mL microcentrifuge tüp buz koyun.
    4. Tek hücre süspansiyonlar içine aort ayrılma
      1. Damlalıklı 0.2 mL aort ayrılma arabelleğe aort içeren tüp. Bahar makas bıçakları sonuna doğru konik tüp takın ve hızla aort enzimatik sindirimi kolaylaştırmak için bin dereden su getirmek.
      2. Doku-çözüm karışımı 15 mL toplama tüp ve pipet 1,8 mL aort ayrılma için bir tampon 2 mL toplam hacmi aktarın.
        Not: doku süspansiyon kolay aktarımı için bir standart 1000 µL pipet ucu konik sonu kapalı 1 cm kesti. Bir micropipette ile süspansiyon aktarmak için kısaltılmış ipucu kullanın.
      3. 55 dk. 37 ° C'de 220 rpm'de (0.514 x g) sallayarak, aort ayrılma arabellekte kıyılmış aort kuluçkaya.
      4. Süspansiyon 50 µm hücre süzgeç aracılığıyla 15 mL polipropilen toplama tüp içine geçmek. Bir şırınga dalgıç lastik piston filtreleme kolaylaştırmak için kullanın.
      5. 15 mL toplama tüp 1 mL FACS arabelleği ile durulayın, süspansiyon toplamak ve hücre süzgeç aracılığıyla geçmek.
      6. 50 µm hücre süzgeç iki ek kez 1 mL FACS arabelleği ile yıkayın.
      7. Hücreleri tarafından Santrifüjü 300 x g 4 ° C'de 5 min için de cips Soğuk FACS arabellek hücrelerde yeniden askıya alma. Bir Burker odası/hemasitometre hücreleri saymak.
      8. 1 x 106 (Temel Akış Sitometresi) hücreleri veya tüm hücre süspansiyon (FACS için) etiketli 5 mL yuvarlak alt polistren tüpler aktarın. Akış Sitometresi Protokolü boyama için Bölüm 2'ye geçin.

2. Akış Sitometresi ve FACS boyama

Fluorophore R-Phycoerythrin (PE) PE/siyanür (Cy) 7 PE/siyanür (Cy) 5 Pasifik mavi (Türkçe)
Lazer (nm) Mavi (488 nm) / (561-570 nm) - sarı yeşil (532 nm) Mavi (488 nm) / (561-570 nm) - sarı yeşil (532 nm) Mavi (488 nm) / (561-570 nm) - sarı yeşil (532 nm) Violet (405 nm)
UyarmaMAX (nm) 496 496 496 401
EmisyonMAX (nm) 578 785 667 455
Fenotipik Marker F4/80 CD11c CD11b CD45
EMR1, Ly71 αx Integra, integrin αX zinciri, CR4, p150, ITGAX αm Integra, Mac-1, Mo1, CR3, Ly-40, C3biR, ITGAM T200, Ly-5, LCA
Hedef hücre tipi Doku ikamet makrofajlar Klasik aktif (M1) makrofajlar Monosit / makrofajlar Lökosit (makrofajlar / monosit, lenfositler ve granülosit)
Dendritik hücre alt grubunu Dendritik hücreler, NK hücreleri, aktive T hücreleri ve bir alt bağırsak intraepitelyal lenfositlerin (IEL) Granülosit, dendritik hücreler, NK hücreleri ve T ve B hücreleri alt kümeleri
Seyreltme faktörü 1:50 1: 100 1: 100 1: 100
İzotip denetimleri PE sıçan Igg2a PE/Cy7 Ermeni Hamster IgG PE/Cy5 sıçan Igg2b Pasifik mavi sıçan IgG2c

Tablo 2: Antikor öğesini fluorophore ayrımcı doku ikamet makrofajlar için belirli listesi.

  1. Toplamak ve aşağıdaki öğeleri hazırlamak: FACS arabellek 5 mL yuvarlak alt polistiren tüpler, antikor engelleme Anti-fare CD16/32 Fc reseptör, fluorophore Birleşik veya birincil antikorlar, ikincil antikorlar (Eğer fluorophore Birleşik çekimsiz gerekli), 1 x fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS).
    Not: hücreler büyük miktarda boyama için antikor konsantrasyon cep numarası yerine en çok önemlidir. Örneğin, boyama 10 x 106 boyama arabellek cilt hücreleri ve antikor konsantrasyon aynı sanki 1.0 x 10 boyama olmalıdır6 100 µL arabellek hacmindeki hücreler. 1.0 x 10 boyama için8 hücreleri, 5-fold antikor miktarı artan tavsiye edilir.
  2. Ek buz gibi FACS arabellek her FACS tüp ekleyin, hücreleri tarafından Santrifüjü 751 x g 5 min (4 ° C) için de cips. Süpernatant aşağıdaki Santrifüjü Aspire edin.
  3. Anti-fare CD16/CD32 Fc reseptör antikor üretici yönergelerine göre tüm örnekleri engelleme ekleyin. 15 dakika 4 ° C'de veya buz üzerinde kuluçkaya.
  4. Birincil antikor doğrudan Fc reseptör için engelleme antikor içeren süspansiyon hücre ve kuluçkaya kokteyl fluorophore Birleşik 30 dakika süreyle 4 ° C'de fluorophore Birleşik antikorlar ağartma en aza indirmek için ışık koruma örnekleri örnekleri ekleyin.
    1. Olay çekimsiz birincil antikorlar kullanıldı, adım 2.4 tamamladıktan sonra aşağıdaki adımları izleyin.
    2. Yıkama birincil antikor Santrifüjü 751 x g 5 min (4 ° C) için de tarafından örnekleri lekeli.
    3. Decanting tarafından süpernatant kaldırmak ve Pelet 100 µL FACS arabellekte yeniden askıya alma.
    4. Konjuge ikincil antikor için tüm gerekli örnekleri eklemek ve 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya 2.5 adıma geçin.
  5. Aşağıdaki antikor kuluçka, buz soğuk FACS arabellek 2 mL ekleyin sonra 5 dakika (4 ° C) 751 x g hücreleri cips. Süpernatant dikkatle boşaltmak ve Pelet rahatsız değil emin olun.
  6. Hücreleri hafifçe karıştırın ve sonra ile 200-400 µL FACS arabelleği yeniden askıya sonra bu kadar standart Akış Sitometresi Analizi veya hücre sıralama 4 ° C'de karanlıkta bırakın.
  7. Lekeli hücreleri kısa vadeli fiksasyonu için adımları 2.8 2.10 için devam edin. Fiksasyon standart Akış Sitometresi için kullanın.
  8. Adım 2.5, hemen ardından yeniden askıya 0.5 mL % 2-4 paraformaldehyde (PFA) 15-30 dk 4 ° c için hücrelerde
    Not: Dikkat: PFA değil kanserojen ve toksik etkileri ile bilinen bir tahriş edici. İngiltere'de yılın kullanırken, aşırı dikkatli başa. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanımı ve havalandırma egzoz emin olun.
  9. Aşağıdaki fiksasyon, tüm örnekleri için 2 mL FACS arabelleği ekleyerek hücreleri yıkama ve vasıl 751 x g 5 dk. Kaldır süpernatant aşağıdaki Santrifüjü için 4 ° C'de santrifüj kapasitesi.
  10. Sabit buz soğuk FACS arabellek ve mağaza 4 ° C'de 200 µL hücrelerde resuspend Mağaza düzeltme 4 ° C'de 1 hafta kadar hücreleri, ideal olarak Akış Sitometresi edinme autofluorescence en aza indirmek için 48 saat içinde gerçekleştirin.
  11. Akış Sitometresi veri akış sitometresi üreticinin yönergelerine uygun elde etmek veya floresan aktif hücre Basu ve arktarafından açıklandığı gibi sıralama gerçekleştirir. 23

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Apolipoprotein E eksik (ApoE KO) C57BL/6 (BL6) fareler yüksek yağ yüksek kolesterol diyet (HCHFD veya HCD) 18 hafta, 1 x 104 - 2 x 104 CD45 tutulan kullanırken+F4/80+ ne zaman iki örnek aortik makrofajlar izole olabilir havuza alınmış. HFHCD beslenen ApoE KO fareler disseke ciğeri üretilen (ki mevcut sıralama zaman bağlıdır) 5 x 10 göre5 Kupffer hücreleri daha büyük. Ne zaman yüksek yağlı diyet (HFD) kullanarak beslenen farelerde vahşi tip (WT) C57BL/6, 5 x 105 ' e 1 x 106 ikamet yağ doku makrofajlar (TYS) stromal vasküler kesir (SVF) sıralayabilirsiniz. Verilen dokudan sıralanabilir makrofajlar belirtilen toplam sayısı nicel gerçek zamanlı Polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) kullanarak gen ifade analizi gerçekleştirmek için yeterli. Nerede daha az sayıda makrofaj nüfus, aort gibi kazanılmaktadır dokular için bu ortak precipitants (örneğin glikojen) ve gece yağış RNA izole bu analizleri için gerekli olduğunda kullanmak için tavsiye edilir.

Burada, temel kullanarak makrofaj fenotip metabolik bozukluklar diyet kaynaklı etkilerini sitometresi, Floresans aktif hücre sıralama (FACS) ve akış aşağı posta sıralama analizleri gösterilir akışı. Bu bulgular daha önce yayımlanmış gözlemler fareler etkilenen dokularda aort (şekil 1B) gibi bir HFD veya HFHCD arttı sergi infiltrasyonu klasik aktif (M1) makrofajlar beslenen doğrulamaktadır. Akış Sitometresi, FACS ve gen ifade profilleme yararlanarak (nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), Ron reseptör tirozin kinaz-CD45 ifade etmek için predominating fenotip ile+ F4/80+ makrofajlar elde edilen diyet beslenen farelerin izole doku görülmektedir. Hangi anti-inflamatuar bir fenotip gösterdi Ron reseptör ifade aort makrofajlar HFHCD beslenen farelerde (şekil 1 c ve D) azalma. Sıralanmış Ron makrofajlar reseptör ifade bir iyi kurulmuş M2 makrofaj marker (1E rakam) 1 (Arg1) gen ekspresyonu sindirilmiş aortas gösterdiği artan arginase türetilmiş. CD45 karakterize pro-inflamatuar makrofajlar+ F4/80+ CD11c+ aortas HFHCD beslenen farelerin (şekil 1B ve D) izole olarak artış göstermiştir. Karaciğer yerleşik makrofajlar karakterize daha fazla Ron reseptör ifade altgrupları (şekil 2A) hakim fenotip aydınlatılmamıştır. CD11c + pro-inflamatuar makrofaj nüfusu azalma ifade güçlü bir anti-inflamatuar (M2) fenotip Arg1 ve Ron (şekil 2B) gibi ile ilişkili genlerin gösterdi. Benzer eğilimler sindirilir beyaz Yağ dokusundan (şekil 3) izole makrofaj nüfus tespit edildi. Pro-inflamatuar bir imza ile makrofaj nüfus azaldı yüzey ifade Ron reseptör (şekil 3) gösterdi. Yaklaşımlar, temel Akış Sitometresi ve FACS birleştirerek, daha fazla bir regülatör alternatif (M2) etkinleştirme makrofajlar32' olarak Ron reseptör doğrular kesin veri sonuçlandı. Böyle önyargı bir anti-inflamatuar (M2) fenotip doğru gelişme ve ilerleme obezite, ateroskleroz ve steatohepatitis31koruyucu bir rol oynamak için gösterilmiştir.

Figure 1
Şekil 1: Disosiye aort izole makrofajlar karakterizasyonu ApoE KO fareler üzerinde bir PİLGRİM6A 18 hafta boyunca tutulan kaldırıldı. (A)hücreleri ilk kapı üzerinde CD45+ lökosit, hücresel enkaz hariç. (B) CD45 F4/80 ile birlikte boyama makrofajlar olduğu tahmin Çift Kişilik olumlu nüfus betimlemek için kullanılır. Ek çoğunluğuna CD11c yüzdesini göstermek için kullanılan+CD45+F4/80+ (M1) ve (C) Ron+CD45+F4/80+ (potansiyel M2) fareler türetilmiş aortas makrofajlar ya beslenen bir normal yemek veya yüksek kolesterol diyet 18 hafta için. (D) artış yüzdesi CD11c+CD45+F4/80+ (M1) makrofajlar gibi Ron+CD45+F4/80+ (potansiyel M2) azalan yüzdesi makrofajlar içinde aortas gözlendi normal yemek diyet beslenen fareler için karşılaştırıldığında PİLGRİM6A beslenen farelerde elde. (E) F4/80+ makrofajlar gösterdi arginase artan ifade gen ifade analizi sıralanmış Ron+CD45+ben (bir iyi bilinen fare M2 marker). Değerleri < 0,05 olarak istatistiksel olarak anlamlı kabul istatistiksel analiz yazılımı kullanılarak yapılır ve demek gibi ± SEM P temsil Öğrenci t-Testi analizleri kullanarak elde (* P < 0,05, *** P < 0.001). Şekil Yu ve ark. değiştirildi (2016) 31. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: gen transkript Kupffer hücre popülasyonlarının sindirilir karaciğerleri göre profilleme disseke ApoE KO fareler üzerinde bir PİLGRİM6A 18 hafta boyunca muhafaza--dan. Karakterize ve Kupffer hücre popülasyonlarının sıralama için(a)genel gating düzeni. (B) gen ifade analizi sıralanmış Ron (Ron+) ifade ve sigara-ifade (Ron-) CD45+F4/80+ makrofajlar tarafından kantitatif RT PCR. Öğrenci t-Testi analizleri gerçekleştirilen istatistik yazılımı kullanarak ve değerler temsil demek gibi ± SEM < 0,05 olarak istatistiksel olarak anlamlı kabul P (* P < 0,05, *** P < 0.001). Şekil Yu ve ark. değiştirildi (2016) 31 . Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: WT BL6 fareler disseke beyaz Yağ dokusundan izole ATM'ler karakterizasyonu beslenen bir HFD 18 hafta. (A)genel gating düzeni karakterize ve yağ dokusu sıralama için türetilmiş makrofaj nüfus (B) yüzde in Ron + hücrelerde CD45+F4/80+CD11c- ve CD45+F4/80+CD11c+ WAT göre makrofaj nüfus. Şekil Yu ve ark. değiştirildi (2016) 31 . Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Komorbiditeler ateroskleroz, basit yağlanma, steatohepatitis gibi taklit ve tip 2 diyabet diyet kaynaklı metabolik bozukluk modelleri temel moleküler mekanizmaları hastalık progresyon daha iyi anlamak için yaygın olarak kullanılır. Collagenase bağımlı sindirim genellikle doku hücreleri hücre dışı Matriks (ECM)16,27den kurtarmak için ayırmak için kullanılır. Collagenase gibi enzimler hücre komşu için yapısal destek sağlayan kolajen bozabilir. Belgili tanımlık doku yapısal kompozisyon doku matris sertlik (deformasyon direnci) belirler ve hangi ham collagenase başarılı ECM bozulma28sağlamada en etkili bir üründür. "Yumuşak matrisi" oluşan WAT, sık sık aynı anda hücre yüzey insülin reseptörleri29bütünlüğünü koruyarak adiposit ve yerleşik bağışıklık hücreleri kurtarmak için Collagenase tip II ile sindirilir. Aort Fibriller bileşenlerinin mikro mimarisi "(en yüksek collagenase etkinliği olan) etkili aort sindirim collagenase türü XI ile ek enzimler ile birlikte kullanıldığı sert matrix", katkıda bulunur. Aort, karaciğer sindirim matrix bozabilir ve parenkimal ve parenkimal olmayan hücrelerin30kurtarmak için zayıf bir enzimatik aktivite ile Collagenase tip IV, bir collagenase kullanır. Kronik iltihaplı dokulara diyet beslenen yabani türü veya apolipoprotein E (ApoE KO) eksik fareler üzerinde doğru Enzimatik sindirim engelleyen arka plan kez geçmesi remodeling bir C57BL6 türetilmiş. Bu bölümde en aza indirmek ve/veya uygun olmayan doku ayrılma ve düşük hücre kurtarma olasılığını ortadan kaldırmak için stratejileri tartışmak.

Bir ortak, obezite, ateroskleroz ve/veya non alkolik yağlı karaciğer hastalığı, taklit diyet beslenen fare modellerden elde edilen dokularda anormal doku remodeling özelliğidir. Beyaz yağ dokusu, aort ve karaciğer, collagens gibi fibriler bileşenleri aşırı birikimi kez sonuçlanan ECM kompozisyon değiştirilmez. C57BL6 farelerde yüksek yağlı diyet üzerinde on sekiz hafta boyunca tutulan vahşi tip doku özgü anormallikler genişletilmiş beyaz yağ dokusu gibi deneyim ve yağlı karaciğer (basit yağlanma) büyütülmüş. Çoğu zaman bu metabolik özellikler doku ayrılma sürecinde üstesinden gelmek için zahmetli engel yoktur. Öte yandan, daha şiddetlenir fenotipleri ayna diğer diyet indüklenen modellerinde, geniş doku remodeling bir sorun doku sindirim sırasında-ebilmek poz vermek. ApoE KO fareler beslenen HFHCD için kullanılan çoğu modeli ateroskleroz ve steatohepatitis. Gelişmiş steatohepatitis ile ilişkili ortak özelliğidir ECM aşırı birikimi karaciğer (veya fibrozis). Fibrotik karaciğer enzim doku ayrışma sırasında oldukça sorunlu olduğu gösterilmiştir ve sık sık düşük hücre verim31üretir. Hücre verimi artırmak için sindirim protokolleri sapma takip edilmesi önemlidir. Her ne kadar kıyılmış ve ayrılma ulaşmak için sindirim arabellekte sular altında normal karaciğer, perfüzyon sindirim arabelleği ile karaciğer hücre dışı matriks ve collagenase çözüm arasında temas en üst düzeye çıkarır; ve bu nedenle bu yaklaşım önerilir. Ayrıca, 20-30 mL sindirim arabelleği kez bir yeterli normal karaciğerleri başarılı ayrılma için birimidir; Ancak, genişlemiş ve/veya fibrotik karaciğer geliştirmek fare modelleri gelince sindirim arabelleği 50 mL ile perfüzyon hücre ölümü en aza indirirken doğru sindirim sağlamak için tercih edilir. 1.5 g önemli ölçüde aşan ağırlıkları ile karaciğerleri için sindirim arabellek hacmi artan başarılı sindirim güvence altına almak için tavsiye edilir.

Doku Sorun Olası neden Çözüm
Beyaz Yağ dokusundan (WAT) Zavallı hücre ayrılma Zavallı sindirim Sindirim arabellek 37, olduğundan emin olun° C
Hücre ölümü Aşırı collagenase sindirim Sindirim süresini azaltmak
Sindirim arabellek hacmini azaltmak
Aort Zavallı hücre ayrılma Zavallı sindirim Sindirim arabellek 37 ° C'de olduğundan emin olun
Aort parçaları sindirim arabelleği çok büyük Aort yaklaşık 1 mm parçalar halinde kesin emin olun
Aort parçalara ayrılma arabellekte kuluçka sırasında titriyordu değil Aort parçaları sindirim çözümde titriyor emin olun
Hücre ölümü Aşırı collagenase sindirim Sindirim süresini azaltmak
Sindirim arabellek hacmini azaltmak
Karaciğer Zavallı hücre ayrılma Zavallı sindirim Sindirim arabellek 37 ° C'de olduğundan emin olun
Sindirim arabellek hacmini
IVC (çevreleyen IVC oluşur doku şişmesi) yanlış cannulation İğne IVC düzgün takıldığından emin olun
Rüptüre IVC Düzgün IVC iğne perfüzyon önce güvenli
Perfüzyon hız azaltmak
Rüptüre doku Perfüzyon hız azaltmak
Hücre ölümü Glisson'ın kapsül hücrelerden yanlış sürümü Daha önce tartışılan yöntem okşayarak kapsül kullanarak hücreleri ayırmak için emin olun
Aşırı collagenase sindirim Sindirim süresini azaltmak
Sindirim arabellek hacmini azaltmak

Tablo 3: başarısız doku ayrılma sorun giderme. Akış Sitometresi dayalı hücre sıralama ya da FACS hücre popülasyonlarının izole için güçlü bir teknik nerede yüksek saflıkta bir zorunluluktur. Hücreleri hücre sıralayarak arındırıcı, yüksek hücre verim aynı zamanda yüksek saflıkta sıralama elde uygun sıralama stratejileri kullanarak gerekir. Bu bölümde, multi-fluorophore geliştirmek için yöntemleri sitometresi tabanlı cep ikamet makrofaj diyet beslenen farelerde elde edilen açıklanmıştır dokusunun sıralama akışı. Farklı doku ikamet makrofaj yalıtım için yüzey marker seçimi kritik bir adımdır. WAT, aort ve karaciğer are sık sık elde makrofajlar seçkin bir CD45 kullanarak+, CD11b+, F4/80+ strateji geçişi. Ek akış sitometrik panelleri doku ikamet makrofajlar tanımlamak için kullanılabilir. Bu paneller makrofaj belirli glikoproteinlerin (CD64, CD68 ve CD14) MHC kompleksi (MHCII) yüzey ifade için yoklama antikorları içerir ve apoptotik hücre tirozin kinaz reseptörleri (MerTK)32, 33. belirli makrofaj fenotip sonra belirlenen M2 seçici yüzey ifade için yoklama tarafından (CD163, CD209 ve CD206) veya M1 işaretleri (CD38, CD40, CD80 ve CD86)34,35. Otomatik Floresans lipid yüklü makrofajlar tarafından oluşturulan nüfus çoğunluğuna zaman bazı sorunlarına yol açabilir. Sarı-yeşil lazer (PE PE/Cy5, PE/Cy7) gibi heyecanlı fluorochromes antikorları kullanarak takip veya kırmızı lazer (APC, APC Cy7 gibi) önemli ölçüde otomatik Floresans parlak verilmiş Floresans sonuçlanır ve böylece artırabilir sonuçlar36. Fluorophore seçme conjugates böyle yüksek boyama dizin ve potansiyel emisyon spectra örtüşme ile uygun kontrollerin eklenmesi önemlidir. Perdeleme sınırları tanımlarken, tek leke (SS) denetimleri ve izotip denetimleri dahil izin pozitif/negatif nüfus tarif ve birincil antikorlar tarafından sırasıyla neden belirsiz arka sinyal ölçümü için 37. hücreleri nerede kıt durumlar için tazminat parçacıklar SS ve izotip denetimlerini kullanmanızı öneririz. Tazminat parçacıklar genellikle biyolojik denetimlerden daha parlak sinyallerini tüketici ürünleri üretir ve daha az varyans arka plan Floresans da mevcuttur. Ayrıca, Floresans eksi bir (FMO) denetimleri gating sınırları operasyona için ideal. Fluorochrome etiketiyle işaretlenmiş antikor belirli Floresans kanal için belirli dışlanan38olduğunda FMO denetimleri ekleyerek, belirli bir kanalda boyama alt için beklenen en fazla Floresans ortaya çıkıyor. Bizim deneyim, tek lekeli tazminat parçacık denetimleri, ek olarak bir günahı biyolojik karşılaştırma denetimi daha kesin pozitif/negatif sınırları ayarlamak için dahil edilmelidir.

Hücresel enkaz ve hücre toplamları gating stratejisinde hariç otomatik Floresans en aza indirmek için kullanılan ek bir yaklaşım da. Hücresel enkaz uygun hücre nüfusunun den ayırt etmek için ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) kullanarak en yaygın gating stratejisidir. Post sıralama analizleri için kullanılacak olan ve daha yüksek canlılık DNA/RNA çekimi için gerektiren izole hücreler için canlılığı lekeleri ile fiksasyon ve/veya permeabilization yordamlarla kullanılmaması önerilir. Formaldehit hücreleri tamir nükleik asit bütünlük nükleik asit-protein crosslinking nedeniyle güvenliğini aşmasına ve böylece yalıtım verimliliği, algılama ve doğru miktar sınırı. Daha önce belirtildiği gibi hücre toplamları yalnızca verilmiş otomatik floresan sinyallerini katkıda bulunmakla da neden "tesadüf iptalleri" içinde. Bir sıralamada yüksek saflıkta korumak için böyle bir eylem oluşur ama eğer çok sık, sıralanan hücre verim azaltır. Hücre boyama sırasında Dnaz ve MgCl2 ile desteklenmiş bir sıralama arabellek (FACS arabellek) hücre toplama en aza indirebilirsiniz. Bu enzim aktivitesi inhibe gibi EDTA Dnaz ile birlikte kullanmamanız önerilir. Tek hücre süspansiyon sıralama öncesinde bir 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtreleme toplamları hücrelerden de kurtarmak. Toplama en aza indirmek için hücre süspansiyonlar, 0.4 mL minimum hacmi mL başına 5 milyon hücre bir konsantrasyon olması unutmayın zorunludur. Lipid yüklü dokulardan izole hücreleri toplamak için daha fazla eğilimli olma eğilimindedir ve bu tesadüflere sonuçlanabilir iptalleri ve düşük sıralama verim. Bu toplama devam ederse örnekleri daha fazla sulandırılmış önerilir. Sıralanmış makrofaj hücre kurtarma en üst düzeye çıkarmak için fetal sığır zengin Orta içeren polipropilen yuvarlak alt koleksiyonu tüplerde toplanabilir. Konsantrasyonu sonunda her sıralanmış damlacık ile seyreltilmiş olur bu yana bir ilk yüksek FBS konsantrasyonu hücre kurtarma sağlar. DNA veya RNA analizi için kullanılacak hücreleri toplamak için hücreleri RNAse kontaminasyonu önlemek için doğrudan uygun ayıklama reaktif (örneğin TriZol) sıralayabilirsiniz. Yüksek miktarlar sıralarken, hücreleri sıralama ilk kültür FBS, düşük konsantrasyonlarda ile desteklenen medya içine önerilir. Hemen ardından sıralama, hücreleri olmalıdır sonra pelleted ve DNA/RNA çıkarma için lysed. İzole genetik materyal sonra değiştirilmiş gen ekspresyonu için profiled. Pro-inflamatuar genler TNFα, IL1-β, Il-6, IL-12, 1 L-23, IFNγ, Nos2 ve MCP1 gibi (CCL2) upregulated bir klasik aktif (M1) fenotip39sergilenmesi makrofajlar içinde çoğu kez. Öte yandan, alternatif olarak aktif (M2) fenotip makrofajlar içinde sık sık Chi3l3 kodlama genlerin indüksiyon tarafından işaretlenir (Ym1), Fizz1, Arginase 1, CD206, CD163, CD209 1L-10 ve TGFβ34,40. Son zamanlarda, CD38, Fpr2 ve Gpr18 M1 özel genler ve c-Myc ve Egr2 M2 özel genler34olarak olarak doğrulandıktan.

Çok renkli Akış Sitometresi tabanlı cep sıralama makrofajlar, yüksek saflıkta izole için değerli bir araç olsa da, bu yaklaşım pahalıya mal olabilir. Aracılı FACS sıralama güçlü avantajları hücre sıralayıcısı bakım Kimyasalları yüksek maliyet ek olarak bir hücre sıralayıcısı manevra Operasyonlar personel bağlı. Alternatif yaklaşımlar pahalı Akış Sitometresi dayalı hücre sıralama yerine kullanılabilir. Onlar manyetik aktif hücre (Mac) sıralama veya yoğunluk gradient Santrifüjü içerir. Sıralama yöntemi belirtilen ilk alternatif hücre manyetik kapsar ve/veya kan ya da sağlam dokulara41ayrı hücreler ilgi için microbead sütun izolasyon kitleri. Yaklaşım sıralama ikinci hücre yoğunluğu ve Santrifüjü gücüne dayalı bir türdeş olmayan hücre süspansiyon ayırır. Ne yazık ki, yoğunluk aracılı Santrifüjü makrofajlar tek hücre süspansiyonlar aort ya da WAT türetilmiş gelen yalıtmak için pratik değildir. Oftentimes, farklı aralıklarla elde edilen ürün bozulmuş ve düşük verim. Sonuç olarak, başlangıçta Enzimatik sindirim takip birkaç hücrelerde neden daha küçük dokuları (aort veya WAT gibi) farklı aralıklarla için ideal aday değildir. Öte yandan, Disosiye karaciğerleri türetilmiş hücre süspansiyonlar post sıralama deneyleri ve analizleri kültür elektrodlar, qPCR veya western Blot analizi gibi kullanılabilir sıralanmış makrofajlar yeterli sayıda üretebilir. Bu alternatif yaklaşımlar FACS, temiz sıralar için izin önce nüfus zenginleştirmek için kullanılabilir. Not, doku ikamet makrofajlar tüm hücre nüfus WAT, karaciğer ve aort damarı içinde küçük bir yüzdesi kadar alın. Zenginleştirme FACS sıralama önce hücre hücre daha seyrek olan nüfus izole kullanılan bir yaklaşım oldu. Küçük nüfus yalıtmaya ortak olan bir sayı daha sonraki analiz için yeterli hücre elde etmek için işlenmesi gereken o büyük hücreli konudur. Zenginleştirme veya önceden sıralama böyle bir sorunu gidermek için kullanılabilir. Bu yöntem ile pozitif ve negatif seçim arasında yer alan daha kısa bir nüfusa elde etmek yardımcı olur ama FACS sıralama yoğun doku kaynak öyle aynı derecede karaciğer için kalıcı bir işlem olabilir gibi aynı zamanda zaman koruma sağlar.

İltihap Biyoloji son gelişmeler için kronik inflamasyon düzenlenmesinde Bu bağışıklık hücrelerinin karmaşık rolünün anlaşılması daha fazla makrofaj heterojenite fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu önemini vurgulamak. Kısaca, bu kapsamlı iletişim kuralı indüklenen kurulan beslenme obezite ve inflamasyon modelleri üç hallmark dokulara gelen yerleşik makrofajlar okudu doku karakterize çok boyutlu bir yaklaşım sağlar. Daha da önemlisi bu protokolü zorluk dikkate alır ve temiz yalıtmak gerekli önlemleri hücre süspansiyonlar dysregulated üzerinden tek iltihaplı dokulara WAT, aort plaklar ve yağlı karaciğerleri gibi. İletişim kuralı araştırmacı Akış Sitometresi ve doku ikamet makrofajlar, inflamasyon obezite anahtar düzenleyiciler karakterize etmek için yenilikçi bir boyut FACS sıralama araçları uygulamak izin verir. Makrofaj nüfus dinamikleri derinlemesine karakterizasyonu iltihaplı dokulara kaçakçılığı monosit içgörü sağlamak ve deneysel yaklaşımlar sıralanmış makrofajlar üzerinde çok sayıda aracılığıyla devam eden mekanik değerlendirme için izin verebilirsiniz. Daha fazla makrofaj nüfus karakterizasyonu makrofaj heterojenite sağlık ve hastalığında düzenleyen biyolojik temelleri çok önemli bir içgörü sağlayabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa etmek yok çatışması var.

Acknowledgments

Akış Sitometresi çekirdek tesis Pennsylvania State Üniversitesi Millennium bilim Complex adlı teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26 G x 5/8 in Needles BD 305115
23 G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set BD 367297 Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion
21 G 1 1/2 in. Needles BD 305156
1 mL syringe with rubber stops BD 309659
10 mL Syringes BD 309604
1 mL Syringe BD 309659
F4/80 PE Biolegend 123110
CD11c PE/Cy7 Biolegend 117318
CD11b PE/Cy5 eBioscience 15-0112-81
Anti-mouse CD16/32 Fc Block  Biolegend 101320
CD45 Pacific Blue Biolegend 103126
PE Rat IgG2a Biolegend 400508
PE/Cy7 Armenian Hamster IgG Biolegend 400922
PE/Cy5 Rat IgG2b Biolegend 400610
Pacific Blue Rat IgG2c Biolegend 400717
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)  Cellgro 15-017-CV
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) Cellgro 21-031-CV
70 μm cell strainers Corning, Inc. 352350
1.7 mL microcentrifuge tube  Denville C2170
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16x Electron Microscopy Sciences CAS #30525-89-4
Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23 mm, Sharp  Stoelting 52132-10P Used for general dissecting purposes
Micro Forceps, 4 inches, full curve, 0.8 mm Stoelting 52102-37P  Used for general dissecting purposes
Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge  Fine Science Tool 15000-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Curved 0.07 mm x 0.04 mm Tip Forceps Fine Science Tool 11297-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Hemostatic Forceps (Curved) Fine Science Tool 13021-12
Heparin Sodium Salt Fischer Scientific 9041-08-1
35 mm Cell Culture/Petri Dishes Fischer Scientific 12-565-90
Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid Fischer Scientific 08-757-100D
15 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-959-53A
50 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-432-22
5 mL Round-Bottom Polystyrene Tubes  Fischer Scientific 14-959-5
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-Products 100-106
Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) Millipore EX0285-1
Bovine Serum Albumin Rockland BSA-50
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6885
Collagenasse Type XI Sigma-Aldrich C7657
Hyaluronidase Type I Sigma-Aldrich H3506
DNAse Sigma-Aldrich DN25
Collagenase Type I Sigma-Aldrich C0130
NaOH Sigma Aldrich 1310-73-2 
CaCl2 Sigma Aldrich 449709-10G
500 mL beaker  Sigma Aldrich 02-540M
4 cm Hemostatic clamp Stoelting 52120-40
Toothed forceps Stoelting 52104-33P
50 μm Disposable filters Systemex 04-0042-2317
Collagenase Type IV ThermoFischer Scientific 17104019
Ammonium Chloride Potassium (ACK) ThermoFischer Scientific  A1049201
Razors (0.22 mm (0.009")) VWR International 55411-050
Texas Red Live/Dead stain Red viability stain (in Figure 1A)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davies, L. C., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages: Then and Now. Immunology. 144, (4), 541-548 (2015).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, (12), 840-846 (2006).
  3. Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444, (12), 875-880 (2006).
  4. Jung, U., Choi, M. -S. Obesity and Its Metabolic Complications: The Role of Adipokines and the Relationship between Obesity, Inflammation, Insulin Resistance, Dyslipidemia and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Int J Mol Sci. 15, (4), 6184-6223 (2014).
  5. Emanuela, F., Grazia, M., Marco, D. R., Maria Paola, L., Giorgio, F., Marco, B. Inflammation as a link between obesity and metabolic syndrome. Nutr Metab. 2012, 1-7 (2012).
  6. Vieira-Potter, V. J. Inflammation and macrophage modulation in adipose tissues. Cell Microbiol. 16, (10), 1484-1492 (2014).
  7. Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. S. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11, (11), 738-749 (2011).
  8. Dey, A., Allen, J., Hankey-giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation : blood monocytes versus tissue macrophages. Front Immunol. 5, (1), 1-15 (2015).
  9. Mills, C. D., Lenz, L. L., Ley, K. Macrophages at the fork in the road to health or disease. Front Immunol. 6, (2), 1-6 (2015).
  10. Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Front Immunol. 5, (8), 1-22 (2014).
  11. Guilherme, A., Virbasius, J. V., Vishwajeet, P., Czech, M. P. Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, (5), 367-377 (2008).
  12. Cummins, T. D., Holden, C. R., et al. Metabolic remodeling of white adipose tissue in obesity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307, (3), 262-277 (2014).
  13. Fujisaka, S., Usui, I., et al. Regulatory Mechanisms for Adipose Tissue M1 and M2 Macrophages in Diet Induced Obese Mice. Diabetes. 58, (9), 2574-2582 (2009).
  14. Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotipic switch in adipose tissue macrophage polarization. J Clin Invest. 117, (1), 175-184 (2007).
  15. Qureshi, K., Abrams, G. A. Metabolic liver disease of obesity and role of adipose tissue in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 13, (26), 3540-3553 (2007).
  16. Bedossa, P., Paradis, V. Liver extracellular matrix in health and disease. J Pathol. 200, (4), 504-515 (2003).
  17. Tilg, H., Moschen, A. R. Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease: The multiple parallel hits hypothesis. Hepatology. 52, (5), 1836-1846 (2010).
  18. Milic, S., Lulic, D., Stimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: Biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20, (28), 9330-9337 (2014).
  19. Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. Int J Obesity. 26, (12), 754-764 (2002).
  20. Mestas, J., Ley, K. Monocyte-Endothelial Cell Interactions in the Development of Atherosclerosis. Trends Cardiovasc Med. 18, (6), 228-232 (2008).
  21. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496, (7446), 445-455 (2013).
  22. Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nat Rev Immunol. 14, (10), 986-995 (2013).
  23. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), e1546 (2010).
  24. Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. J Vis Exp. (94), e52174 (2014).
  25. Smedsrød, B. Protocol for preparation of mouse liver Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells. 1, Available from: http://munin.uit.no/handle/10037/4575 1-10 (2012).
  26. Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J Vis Exp. (53), e2848 (2011).
  27. Salamone, M., Saladino, S., Pampalone, M. Tissue Dissociation and Primary Cells Isolation Using Recombinant Collagenases Class I and II. Chemical Engineering Transactions. 38, Matsushita 1994 247-252 (2014).
  28. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, (4), 1394-1400 (2008).
  29. Fain, J. N. Isolation of Free Brown and White Fat Cells. Diabetologia. 375, (1964), 555-561 (1968).
  30. Seglen, P. Preparation of isolated rat liver cells. Method Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
  31. Yu, S., Allen, J. N., et al. The Ron Receptor Tyrosine Kinase Regulates Macrophage Heterogeneity and Plays a Protective Role in Diet-Induced Obesity, Atherosclerosis, and Hepatosteatosis. J Immunol. 197, (1), 256-265 (2016).
  32. Yu, Y. R. A., O'Koren, E. G., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS ONE. 11, (3), 1-23 (2016).
  33. Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires "M2c" polarization and MerTK induction. J Immunol. 100, (2), 130-134 (2012).
  34. Jablonski, K. A., Amici, S. A., et al. Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages. PLoS ONE. 10, (12), 5-11 (2015).
  35. Rőszer, T. Understanding the Mysterious M2 Macrophage through Activation Markers and Effector Mechanisms. Mediators of Inflamm. 2015, 1-16 (2015).
  36. Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow Cytometry Analysis of Adipose Tissue Macrophages. Methods Enzymol. 4, (164), 297-314 (2011).
  37. Kim, Y. -J., Brox, T., Feiden, W., Weickert, J. Technical Note: Flow Cytometry Controls, Instrument Setup, and the Determination of Positivity. Cytometry A. 71, (1), 8-15 (2007).
  38. Tung, J. W., Heydari, K., et al. Modern Flow Cytometry: A Practical Approach. Clin Lab Med. 27, (3), 453-468 (2007).
  39. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000. 6, (3), 13 (2014).
  40. Porcheray, F., Viaud, S., et al. Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation. Clin Exp Immunol. 142, (3), 481-489 (2005).
  41. Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment. Rep Prog Phys. 1, (78), 1-6 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics