התנהגות פולשנית של תאים סרטניים בשד אדם עוברי הזברה

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כאן, אנו מתארים דגמים דג הזברה xenograft באמצעות שני אתרים הזרקה שונים, כלומר, חלל צינור perivitelline של קיביה, כדי לחקור את התנהגות פולשנית ולהעריך את הפוטנציאל intravasation ו extravasation של תאי סרטן שד אנושיים, בהתאמה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ren, J., Liu, S., Cui, C., ten Dijke, P. Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish. J. Vis. Exp. (122), e55459, doi:10.3791/55459 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

במקרים רבים, חולי הסרטן אינם מתים של גידול ראשוני, אלא בגלל גרורות. למרות במודלים של מכרסמים רבים זמינים לחקר גרורות סרטן in vivo, מודלים יעילים, אמינים, בעלות נמוכה אחרים נדרשים לגשת ההשפעות הפוטנציאליות במהירות של (EPI) שינויים גנטיים או תרכובות תרופתיות. ככזה, אנו מדגימים ומסבירים את ההיתכנות של מודלים xenograft באמצעות תאי סרטן שד אנושיים מוזרק לתוך עוברי דג הזברה כדי לתמוך ביעד זה. תחת מיקרוסקופ, חלבוני ניאון או תאי סרטן שד אנושיים שכותרתו כימית מושתלים לתוך עוברי דג הזברה מהונדס, Tg (FLI: EGFP), על שטח perivitelline או צינור של קיביה (דוק) 48 שעות לאחר ההפריה. זמן קצר לאחר מכן, בתהליך הזמן- מרחב של פלישת תאים סרטניים, הפצה, וגרורה בגוף דגי החיים הוא דמיין תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. המודלים באמצעות מוזרקים שונים, כלומר, לכלשטח או דוק ivitelline הם משלימים אחד את השני, המשקף את השלב המוקדם (שלב intravasation) ושלב מאוחר (שלב extravasation) של מפל גרורתי רב שלבי של אירועים. יתר על כן, אנגיוגנזה peritumoral ו intratumoral ניתן לצפות עם הזרקה לתוך שטח perivitelline. תקופת הניסוי כולו הוא לא יותר מ 8 ימים. שני המודלים הללו משלבים תיוג תא, מייקרו-להשתלה, וטכניקות דימות פלואורסצנטי, המאפשרים ההערכה המהירה של גרורות סרטן בתגובת מניפולציות גנטיות תרופתיות.

Introduction

גרורות סרטן גלויות המרפאה כוללות סדרה של אירועים מורכבים ורב-צעד המכונים "המפל גרורתי". האשד נבדק בהרחבה ניתנת גזור לתוך צעדים רצופים: פלישה מקומית, intravasation, הפצה, מעצר, extravasation, והקולוניזציה 1, 2. הבנה טובה יותר של הפתוגנזה של גרורות סרטן לבין ההתפתחות של אסטרטגיות טיפול פוטנציאל in vivo דורשת מודלים מארחים חזקים של התפשטות תאים סרטניים. מודלים מכרסמים מבוססים היטב והם בשימוש נרחב כדי להעריך גרורות 3, אך גישות אלה יש יעילות נמוכה ומגבלות אתיות והם יקרים כמודל חנית כדי לקבוע אם מניפולציה מסוימת יכולה להשפיע על הפנוטיפ גרורתי. מודלים יעיל, אמינה, בעלות נמוכה אחרים נדרשים לגשת ההשפעות הפוטנציאליות במהירות של (EPI) שינויים גנטיים או pharmacologתרכובות iCal. בשל ההומולוגיה הגנטית הגבוהה שלהם לבני אדם ואת השקיפות של דג הזברה עוברת שלהם (Danio rerio) צמח כמודל החולייתנים חשוב מיושמים ויותר בחקר תהליכים התפתחותיים, אינטראקציות החיידק-host, מחלות אנושיות, הקרנת סמים, וכו ' . 4. המודלים הגרורים הסרטן הוקמו בשנת דג זברה עשויים לספק תשובה לחסרונות של מודלים מכרסמים 5, 6.

למרות neoplasia הספונטנית נתפסת בקושי דג הזברה פרא 7, קיימים מספר טכניקות ארוכות שנים לגרום לסרטן רצוי דג הזברה. מוטציות גנטיות המושרה Carcinogen או הפעלת מסלול איתות יכול היסטולוגית ו סרטן מודל מולקולרי, מחקה מחלות אנושיות דג הזברה 7, 8, 9. By טאקing יתרון של מגוון קדימה לאחור מניפולציות גנטיות של אונקוגנים או מדכאי גידול, (מהונדס) דג זברה גם אפשרה מחקרים הפוטנציאל של היווצרות הסרטן ותחזוקה 6, 10. מודלי סרטן מושרה דג הזברה לכסות ספקטרום רחב, כולל עיכול, רבייה, דם, מערכת עצבים, וכן האפיתל 6.

הניצול של דג זברה בחקר הסרטן הרחיב לאחרונה בשל הקמת מודלי xenograft התא אנושיים גידולים אורגניזם זה. זה דווח לראשונה עם תאי מלנומה גרורתית אדם שהיו engrafted בהצלחה עוברי דג הזברה בשלב blastula ב 2005 11. מעבדות עצמאיות כמה אימתו את הכדאיות של עבודה חלוצית זו על ידי הצגת מגוון רחב של קווי תאים סרטניים יונקים לתוך דג הזברה באתרים שונים בשלבים התפתחותיים 5 </ Sup>. לדוגמה, זריקות ליד blastodisc ו הבלסטוציסט הבמה blastula; זריקות לתוך שק החלמון, מרחב perivitelline, צינור של קיביה (דוק), וריד הקרדינל האחורי של 6-H- עוברי 5 ימים בת; וזריקות לתוך חלל הצפק של זחלי immunosuppressed בן 30 ימים בוצעו 5, 12. בנוסף, השתלות גידול אלוגנאית גם דווחו דג הזברה 12, 13. אחד היתרונות הגדולים של שימוש xenografts היא כי תאי סרטן engrafted יכול להיות שכותרתו fluorescently בקלות ומכובדת לתאים נורמליים. לפיכך, חקירות לתוך ההתנהגויות הדינמיות של היווצרות microtumor 14, פלישת תא וגרורות 15, 16, 17, אנגיוגנזה מושרה גידולים 15, 1 8, ואת יחסי הגומלין בין תאים סרטניים לבין המארח גורמי 17 ניתן דמיינו בבירור בגוף דגים חיים, במיוחד כאשר קווי דג הזברה מהונדס מוחלים 5.

בהשראת הפוטנציאל הגבוה של מודלי xenograft דג זברה להעריך גרורות, הראינו את מאפייני extravasation transvascular של שורות תאי סרטן השד שונות באזור הסנפיר של Tg (FLI: EGFP) עוברי דג זברה דרך זריקות דוק 16. תפקידו של הפיכת גורם גדילה-β (TGF-β) 16 ועצם חלבון המוךפו"גנטי שהולך (BMP) 19 מסלולי איתות הפלישה תאים סרטניים פרו / אנטי-שד וגרורות נחקרו גם במודל זה. יתר על כן, אנחנו גם סיכם את היכולת intravasation של שורות תאים סרטניים שונים השד למחזור באמצעות מודלים דג הזברה xenograft עם זריקות מרחב perivitelline.

ss = "jove_content"> מאמר זה מציג פרוטוקולים מפורטים דגמי xenograft דג הזברה מבוסס על הזרקה של תאי סרטן שד אנושיים לחלל perivitelline או דוק. באמצעות דימות פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה, אנו מציגים את תהליך נציג intravasation לתוך כלי דם ואת ההתנהגות פולשנית של תאים סרטניים בשד אנושיים שונים, אשר עוברים כלי הדם לאזור סנפיר avascular.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל המחקר באמצעות Tg דג זברת פלורסנט המהונדסת (FLI: EGFP) זן, אשר שפר חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) שכותרתו כלי דם 20, כולל דיור וניסויים, בוצע בהתאם להנחיות הבינלאומיות אושר על ידי ועדת מוסדיים המקומית לרווחת בעלי חיים (דיר Ethische Commissie (DEC) של המרכז הרפואי של אוניברסיטת ליידן.

הערה: כפי סכם באיור 1, הפרוטוקול הוא בערך בחלוקה לארבעה שלבים: איסוף עובר (איור 1A), microinjection (איור 1B), הקרנה (איור 1C), וניתוח (איור 1D).

1. מכינים את מחטי הזרקה

  1. כן מחטי הזרקה עם microcapillaries הזכוכית בורוסיליקט. שים microcapillary לתוך מכשיר חולץ micropipette עם ההגדרות הבאות: לחץ אוויר, 500; חום, 650; למשוך, 100; מהירות, 200; זְמַן,40. שמור את מחטי הזרקה בתוך צלחת בעל מחט עד שהם משמשים עבור הזרקה.

2. מכינים את תאי סרטן השד פלורסנט, תווית גנטית עבור הזרקה

  1. תרבות סרטן השד אנושי מד"א- MB-231 תאים ב 37 ° C במדיום גלוקוז DMEM גבוהה המכיל L- גלוטמין, 10% בסרום שור העובר, וכן 1: 100 פניצילין, סטרפטומיצין (עט-סטרפטוקוקוס).
  2. תרבות שורות תאים אפיתל השד, MCF10A (M1) ו MCF10A-ראס (M2), ב 37 ° C בתקשורת DMEM / F12 המכיל L-גלוטמין עם סרום סוס 5%, 20 ng / גורם הגדילה באפידרמיס מ"ל, 10 מ"ג / מ"ל אינסולין, 100 ננוגרם / מ"ל ​​enterotoxin כולירה, 0.5 מ"ג / מ"ל ​​הידרוקורטיזון, ו 1: 100 עט-סטרפטוקוקוס.
  3. הפק lentivirus mCherry ידי שיתוף transfecting PLV-mCherry, pCMV-VSVG 21, pMDLg-RRE (איסור פרסום / POL) 22, ו pRSV-REV 22 הפלסמיד לתוך תאים HEK293T. קציר תאים supernatants 48 שעות לאחר transfection ולאחסן ב -80 °.
  4. אניnfect מד"א- MB-231, M1, ותאי M2 בנקודת המפגש 30% עבור 24 שעות עם supernatants lentiviral מדולל 1: 1 עם המדיום תרבות נורמליים בנוכחות 5 ng / mL polybrene.
  5. בחר שיבוטים תא בודד על ידי דילול התאים צלחת 96-היטב, המאפשרת תולדה של שיבוטים תא מבודד, עד קבלת שורות תאים יציבות להביע mCherry.
  6. בקבוק תרבות T75 אחד של תאים להזרקה. קציר התאים בנקודת המפגש 80% עם טיפול 0.5% טריפסין-EDTA. שוטפים את התאים עם פעמים 1x PBS 2-3.
  7. מחדש להשעות את התאים על 200 μL של PBS. חנות לעברם 4 מעלות צלזיוס למשך פחות מ 5 שעות לפני ההזרקה.

3. כן עוברים דג זברה עבור הזרקה

  1. הגדרת זוגות רבייה דג הזברה ולאסוף עוברים, כפי שמוצג במאמר יופיטר הקודם על ידי רוזן ואח '. 23.
  2. בחר את העוברים כי הם 0-4 hpf ידי הסרת העוברים המופרים נורמלים. שמור את העוברים דיס פטריh מלא מי ביצה (60 מיקרוגרם / מיליליטר מלחי ים; ~ 60 עוברים / צלחת) לדגור על 28 מעלות צלזיוס.
  3. Dechorionate העוברים עם פינצטה קנס על 48 hpf.
  4. להרדים את העוברים באמצעות העברתם 40 מיקרוגרם / מ"ל ​​tricaine (חומצה 3-aminobenzoic) המכיל מים ביצה כ 2 דקות לפני ההזרקה, אך לא יותר מ 2 שעות לפני הזרקה.
    הערה: פתרון המניות Tricaine (4 מ"ג / מ"ל, 100x) מוכן כמו 400 מ"ג של אבקת tricaine ב 97.9 מ"ל של מים פעמיים מזוקקים ו 2.1 מ"ל של 1 M טריס-בסיס (pH 9), עם pH מותאם 7.4. חנות במקפיא -20 מעלות צלזיוס.

4. תאי סרטן השד להזריק אדם לתוך שטח Perivitelline

  1. טען 15 μL של השעית התא לתוך מזרק. הר מחט על micromanipulator ולשבור את קצה המחט עם פינצטה בסדר לקבל בקוטר פתיחת טיפ של 5-10 מיקרומטר.
  2. השתמש picopump פנאומטי ו מניפולטור לבצע את microinjection. Adjuרח picopump להזריק 400 תאים בכל פעם. לפני הזריקה, לספור את המספרים התא באופן ידני על ידי הזרקת תאים על גבי צלחת פטרי שמכילה agarose 1%.
  3. בשורה מורדם עוברים (לאחר ההפריה 2-3 ימים (DPF)) על צלחת הזרקת agarose שטוח, 1%, סביב 10 עוברים כל הזמן.
  4. אוריינט הצלחת הזריקה ביד במהלך זריקות למקם את העוברים בעמדה המועדפת עבור החדרת המחט (כלומר, באלכסון).
  5. כוון את קצה המחט במקום ההזרקה בעדינות להכניס את קצה המחט לתוך שטח perivitelline בין שק החלמון ואת periderm של העובר דג הזברה (איור 2 א).
  6. להזריק כ 400 תאים סרטניים שכותרתו mCherry. ודא כי שק החלמון לא מקרע להימנע ההשתלה לתוך שק החלמון.

5. להזריק תאי סרטן השד אנושיים לתוך הדוק

  1. הכן את המזרק עוברי דג הזברה כמתואר i פרוטוקול n שלבים 1, 2, ו 3.
  2. השתמש זווית מחט ° 45 כך הדוק ניתן לגשת מהצד הגבי של העובר.
  3. הכנס את המחט לתוך נקודת המוצא של דוק (איור 3 א), רק הגב למקום שבו צינור מתחיל להרחיב על שק החלמון, ולהזריק כ 400 תאים; הזרקת נכונה אם נפח בתוך צינור מתרחב מיד לאחר הדופק ואת שק החלמון.
    הערה: זריקות רצופות כמה יכול להתבצע ללא חילוץ המחט.
  4. מעביר את עוברי דג זברה המוזרקים למי ביצה.
    הערה: כפי ניכרת וריאציה קיימת בקרב עוברי דג הזברה הפרט, וכתוצאה מותו של עוברים לאחר ההזרקה יכול להתרחש, מספר רב יחסית של עוברי דג הזברה (סביב 100) צריך להיות מוזרק עם תאים סרטניים.
  5. שמירה על עוברי דג הזברה ב 33 ° C כדי להתאים לדרישות הטמפרטורה האופטימלית עבור דגים תאי יונקים.
_title "> 6. מסך עובר המוזרק

  1. כל מסך דגים תחת סטראו הקרינה בבית 2 שעות לאחר ההזרקה (HPI) עבור הזרקה לחלל perivitelline (איור 2) או 2-24 HPI עבור הזרקת דוק (איור 2) כדי לוודא שכל העוברים מוזרקים עם מספר דומה של תאים סרטניים. הסר את העוברים עם שגיאות הזרקה, כגון קרעים (איור 2B) או זריקות (איור 3B) של צק החלמון, וכן לברור עובר עם תאים מוזרקים מתחת (2C הדמוי ו 3B) ומעלה (2D הדמוי ו 3B) סף. שמור רק את העוברים עם כ 400 תאים בתרבית.
  2. לשלול את האפשרות כי התאים הציגו ישירות למחזור במהלך תהליך ההזרקה ידי ההסרה עוברת עם תאים שכבר במחזור. כמו כן, להסיר כל עובר עם תא המוני סומך הדוק (2D איור

תמונה 7. ולנתח את תהליך גרורתי

  1. אסוף כמה עוברים הרדימו עם פיפטה פסטר רחב-טיפ ולהעביר אותם לתחתית כוס צלחת קלקר.
  2. הסרה של עודפי מים ולשמור כמות מוגבלת של מים ביצה. לתפעל את העובר לתנוחה עם כלי לולאת שיער ומקום על גבי עטיפה של הזכוכית.
  3. שימוש במיקרוסקופ confocal הפוך בשילוב עם טבילה במים או מטרות יבשות למרחקים ארוכים. מקם את העובר כך את האזור של עניין הוא קרוב המטרה ככל האפשר.
  4. בצע הדמיה מיד לאחר הרדמה כדי להפחית את הסיכון למוות עקב אידוי נוזל.
    1. אותות לכידים מ vasculature שכותרתו EGFP ותאים סרטניים שכותרתו mCherry באותו מיקום על העוברים לשתף לרשום מוזרק תאים עם כלי דם על ידי מיזוג ערוצי ההדמיה השנייה.
    2. עבור כל עובר דג זברה, לאסוף שתי קבוצות שונות של תמונותמאזור הראש באזור הזנב.
  5. לכמת את מספר התאים מופצים.
    1. עבור זריקות מרחב perivitelline, לספור את מספר התאים בכל דגים כי הפיצו ממסת התאים לכיוון גוף הדגים העוברי בתוך אזורי הראש וזנב 4, 15; המחוזות מופנה הן מעבר לגבולות של חלל הלב חזיתית, על גבי dorsally בשלפוחית ​​השחייה, ומעבר פתיחת ואברי המין caudally.
    2. עבור הזרקת דוק, לספור את מספר תאים בודדים כי פלשו סיבי הקולגן של הסנפיר מהמחזור (מד"א- MB-231) או את מספר אשכולות נוצר על ידי תאים קולקטיבי (M2) ברקמת hematopoietic הזנב (CHT) של כל דג הזברה 19.
  6. למד פלישה גרורה ביתר פירוט באמצעות מיקרוסקופיה confocal (מומלץ מאוד).
    1. השתמש בהגדלה נמוכה (אובייקטיבי 4X) לתמונה כולההגוף ולקבל סקירה של דפוס הפצת תאים סרטניים.
      הערה: גדלה גבוהה (20X ו 40X מטרות) מתאים ללמוד אנגיוגנזה תוך פרי-tumoral ואת הלוקליזציה המדויקת של תאים מופצים בגוף העובר.
    2. השתמש ליזר 488 ננומטר כדי לסרוק את כלי הדם בעובר דג זברה לבין ליזר 543 ננומטר לסרוק תאי גידול מושתלים שכותרתו עם קרינה אדומה. לקבל תמונה באיכות גבוהה על ידי סריקת כל עובר תוך שמונה עד עשרה צעדים. סרוק ממוצע בכל צעד שש פעמים.
  7. בזהירות למקם את העובר חזרה למי הביצה, אם יש צורך בניסויים נוספים.

8. לבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות ניתוח חד סטרי (ANOVA) ואחריו ניתוח פוסט הוק

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במודל דג זברת xenograft העוברי עם הזרקת מרחב perivitelline, הפצת hematogenous של תאים סרטניים שכותרתו בגוף הדג נחשבת הגירה פעילה. תהליך זה יכול להתגלות לכמת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כמתואר לעיל השיטות. כדי להמחיש מודל xenograft זו, עקבנו אחר תהליך הפצת שורות תאי סרטן השד שונים עם ידועות (או בלי) פלישה / גרורות פוטנציאליות על פי במבחנה במחקרי עכבר vivo, לרבות תאי M1 שד האפיתל נורמלי שהפיר, טרום ממאיר HRAS-טרנספורמציה תאים M2, ו מאוד תאים גרורתיים מד"א- MB-231, לאחר ההזרקה 1 יום (dpi) ואילך. תמונת מיקרוסקופ confocal ברזולוציה גבוהה הראו כי מד"א- MB-231 תאים (אדום) תערוכה פנוטיפ אגרסיבי, עם שוליים בלתי סדירים בחלל perivitelline. בליטות pseudopodia דמוי חזיתות פולשנית היו גם בתדירות נוכחיות (איור 4A, שמאל). כמה תאים המופץ לתוך מחזור הדם מוקדם ככל 1 dpi (איור 4A, מימין). בשעה 2 dpi, הפצה ברורה נצפתה החלקים המרוחקים של הדגים (איור 4 א, מימין). מספר תאי מופץ גדל עוד בבית 3 dpi (איור 4 א ו 4D). לעומת זאת, כאשר תאי M2 הותקפו דג זברה, הם הפגינו התפשטות צנועה בגוף הדג לאחר 2 dpi (איור 4 ב). הם גם הראו הפצה מוגברת לאחר שחלף הזמן (האיור 4F). כפי שניתן לראות בתרשים 4C ו 4G, תאי M1 מופצים לעתים רחוקות למחזור דג זברה, ואפילו הגירה מקומית פעילה בתוך השטח perivitelline הייתה נדירה בתקופה של התבוננות. מסת התאים M1 נעצרה כמעט במקום ההזרקה המקורית. אם הגדרת הפצה או גרורות חיוביות> 5 תאים בגוף הדגss = "Xref"> 4, מד"א-MB-231 ו- M2 גרורות תא נצפו 92% ו 57% של דגים, בהתאמה, ב 3 dpi (איור 4G). לעומת זאת, אין הפצה חיובית נצפתה עם תאי M1. לכן, מודל דג הזברה הזה של התקדמות תאים סרטניים אנושית משקף במדויק את הרמה היחסית של פוטנציאל גרורתי של התאים השונים עכברים. נאווסקולריזציה (ירוק) שצמח מקלעת subintestinal של דג הזברה העוברית וחדרה ממסת תאי מד"א- MB-231 או M2 נכחה גם לאחר ההזרקה לחלל perivitelline של תאים סרטניים ואחריו 3 ימי דגירה (איור 4 א ו -4, עזב ). עקבי עם הנכות בהפצה, נאווסקולריזציה קלה בלבד זוהתה על השתלת תאי M1 (האיור 4C).

במודל דג זברת xenograft העוברי עם mCherry שכותרתו תאי מד"א- MB-231 לבין הזרקת הדוק, במעבדהתאים סרטניים eled ב הסנפיר של דג הזברה נחשבים נציג extravasation פעיל. תאי mCherry שכותרתו מד"א- MB-231 הוזרקו ב 2 DPF. בשעה 3 dpi, התאים החלו לנדוד אל מחוץ לכלי אל הסנפיר, אשר מועשרת קולגן. מד"א- MB-231 תאים בודדים היגרו אחד אחד, במנותק כלי, אל הסנפיר הרחוק (איור 5 א). בשעה 6 dpi, הפלישה ניתן לכמת על ידי ספירת מספר התאים נדדו לתוך רקמת הסנפיר. במודל הזרקת דוק תא M2 mCherry שכותרתו, ההזרקה בוצעה גם לעבר 2 DPF. עם זאת, פנוטיפ מקובצים נצפה במהלך תהליך extravasation הפעיל. בשעה 1 dpi, תאים M2 החלו לנדוד החוצה מכלי הדם לתוך CHT של דג הזברה. בשעה 2 dpi, התאים M2 שהועברו החלו יוצרים צביר בין כלי השיט CHT (איור 5). כימות של מספר תאים אשכול פולשנית M2 באזור CHT יכולה להתנהל בבית6 dpi.

איור 1
איור 1: שלבים עיקריים על חקירת ההתנהגות פולשנית של תאים סרטניים בשד דג זברה עוברית. (א) לאחר חציית דג הזברה הורית לילה, Tg (fli1: EGFP) עוברי דג הזברה נאספו למחרת בבוקר ו נשמרו על 28 מעלות צלזיוס. (ב) העוברים היו dechorionated עם פינצטה קנס תחת ההפריה h סטראו 48 (hpf). תאי סרטן השד שכותרתו נאספו מחדש תלוי כמות קטנה של PBS. לאחר היטב כנה, תאים מושעים הועמסו מחט אחת. כ 400 תאים הוזרקו צינור של קיביה (דוק) של מרחב perivitelline תחת סטראו. עובר המוזרק נשמרו על 33 מעלות צלזיוס. (ג) 2 h לאחר ההזרקה (HPI), העוברים היו נתונים CAהקרנת reful תחת סטראו קרינה. עובר נשמרו על 33 מעלות צלזיוס למשך 3 או 6 ימים. במהלך ההפסקה, העוברים היו נתונים לטיפול תוכנן. (ד) הפצת תאים סרטניים על ידי הזרקת מרחב perivitelline או פלישה ידי הזרקת דוק זוהה, נספר, צילמו באמצעות מיקרוסקופיה confocal 3 או 6 ימים לאחר הזרקה (dpi). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: זריקת מרחב Perivitelline ואת שגיאות נפוצות. (א) כ 400 שכותרתו תאים mCherry (מד"א- MB-231) הוזרקו מרחב perivitelline. Brightfield (עליון), כלי דם ירוקים (בינונית-גבוהה), ואת מסת תאים אדומה (הבינוני נמוך) של להזריקעוברי דג הזברה ed נתפסו על ידי מיקרוסקופ confocal. התמונה הממוזגת (lowermost) של שלושת הערוצים מראה את מיקום סטריאו של מסת התאים בעובר. (ב) התאים לא למקד את חלל perivitelline כראוי. שק החלמון נקטעה. (ג) התאים מוזרקים מתחת לסף (הרבה פחות מ 400). (ד) התאים מוזרקים הסף לעיל (הרבה יותר מאשר 400). מסת התא הייתה קרובה מדי הדביק של קיביה, שבה יש זרם דם רחב. בר סולם = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: סקירה כללית של הצינור של קיביה (דוק) הזרקה. (א) סכמטי של הזרקת הדוק ב 2 ימים לאחר הפריה (דPF) עם תאי סרטן השד עוברי דג הזברה. החץ מצביע על הדוק. (ב) דוגמאות של זריקות חיוביות, עם כ 400 תאי סרטן השד; זריקות שליליות, כולל misinjection החלמון; ו מספר שגוי של התאים הוזרקו ב 4 HPI. חצים ועיגולים מצביעים תאים מוזרקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: השוואה בין יכולת להפצה בקרב שורות תאי שד שונות. כ 400 mCherry שכותרתו מד"א- MB-231, MCF10Aras (M2), או MCF10A (M1) תאים הוזרקו מרחב perivitelline של עוברי דג הזברה 48 hpf. עובר המוזרק היו במעקב במשך 3 ימים. (A, B, ו- C) High-resomicrographs lution מראה את תהליך ההעברה והפצת נציג מד"א-MB-231 (א), M2 (B), ואת M1 (C) שהתאים בגוף עוברי פרט 1, 2, ו 3 ימים לאחר הזרקה (dpi). השמאל, נדידת תאים בחלל perivitelline (אדום) ואת כלי הדם peritumoral ו intratumoral (ירוק). אותות צהובים מצביעים על החפיפה של microvessels ותאים. תיכון, את התמונה כולה של העובר. ויזואליזציה, זכות תאים מופצים האחורי של העובר. ראשי חץ צהובים מצביעים תאים מופצים אחת. בר סולם = 50 מיקרומטר. (D, E, ו- F) כימות מספר התאים מופצים בכל גוף עוברי ב 1, 2, ו 3 dpi. תוצאות באות לידי ביטוי כממוצע ± SEM. תוצאות מניתוח חד סטרי שונות (ANOVA) ואחריו ניתוח פוסט-הוק מוצגים. <P 0.05 התקבל כמשמעותי מבחינה סטטיסטית (* 0.01 <P <0.05; ** 0.001 <P <0.01; *** P <0.001. (G) השוואה בין המקרים של intravasation עבור מד"א- MB-231, M2, ותאי M1 בגוף עוברי ב 1, 2, ו 3 dpi. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: התנהגויות שונות של מד"א-MB-231 ו- M2 גרורות תא דג הזברה עם צינור של קיביה הזרקה. (א) תמונות confocal נציג של דג הזברה אחריו ב 3, 4, ו 5 dpi להראות התנהגות הנדידה תא בודד של תאים מד"א- MB-231 של דג הזברה. החצים מצביעים תאים פולשני מד"א- MB-231 אשר היגרו אל מחוץ לכלי לתוך tailfins. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר בעמודה השמאלית, 50 מיקרומטר בעמודה הימנית. נציג (B)תמונות confocal של דג הזברה אחריו ב 1, 2, ו 3 dpi להראות התנהגות הנדידה אשכול התא של תאי M2 דג הזברה. החצים מצביעים תאים M2 פולשנית כי היגרו אל מחוץ לכלי לרקמה hematopoietic הזנב (CHT) ויצרו מקבץ בין כלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הנה, תיארנו שתי שיטות לחקור את התנהגות פולשנית של תאים סרטניים בשד ב Tg (fli1: EGFP) עוברי דג הזברה, עם זריקות מרחב perivitelline ו דוק. באמצעות הזרקת תאי סרטן שכותרתו עם צבע כימי או חלבון פלואורסצנטי לתוך עוברי דג זברה מהונדסים, המאפיינים הדינמיים המרחבי של פלישה גרורה ניתן לעקוב באופן ברור בזמן אמת ברמה-התא הבודד או מקבץ תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ברוב המקרים, את ההתקדמות המהירה של גרורות דג הזברה מבטיחה כי assay יכול להתבצע בתוך 1 שבוע לאחר השתלה. יתר על כן, ניתן לקבל סטטיסטיקה רבה עצמה עם קבוצות גדולות של דגים.

מוקדם ומאוחר אירועי מפל גרורתי יכול להיות מדומה ועל סיכם על ידי הזרקת תאים סרטניים לתוך שטח perivitelline או דוק, בהתאמה. החלל perivitelline הוא שטח הכלוא בין periderm של הדג ואת שק החלמון, אשר AlloWS אחד לפקח הפצת תאים סרטניים בודדים מאתרים עיקריים בגוף החי. לאחר השתלה, התאים הסרטניים עוברים הגירה מקומית פלישה בתוך שטח perivitelline (נחשב האתר הראשי) ואז הם intravasate לתוך כלי דם ולהפיץ יחד עם הזרימה. בראש ו הסנפיר (נחשב אתרי יעד רחוקים), תאים סרטניים לצבור במיטות נימי צר extravasate. לכן, את מספר התאים המצויים באתרים המרוחקים בגוף הדג, היא מידת יכולת גרורתי. בנוסף, תאי extravasated יותר ניתן להבחין בנקודות זמן מאוחר יותר, וזה גם נכון של assay הזרקת דוק.

"לדוק הוא וריד קרדינל נפוץ מוגדל עם זרם דם נרחב 24. ישירות מיקוד הדוק כאתר הזרקה מציג תאים סרטניים לתוך מערכת הדם. בפועל, תאי סרטן השד מפוזרים בכל הגוף העוברי באמצעותזרם הדם מיד לאחר הזרקת דוק. התאים אז לעצור את אבי העורקים וריד הגב הזנב. Extravasation, פלישה, ועל היווצרות micrometastasis ניתן להבחין ברציפות בתוך 6 ימים. כפי שדווח בעבר 16, גרורתי מד"א- MB-231 תאים ותאי M2 החלב טרום ממאיר להפגין פנוטיפים שונים פולשנית. מד"א- MB-231 תאים עוברים פלישת תא הבודד של סנפיר מטריקס העשיר קולגן. לפיכך, פוטנציאל הפלישה של תאים מד"א- MB-231 ניתן למדוד על ידי ספירת מספר התאים אשר extravasated ופלשו רקמת הסנפיר. לעומת זאת, תאי M2 יוצרים אשכולות בגדלים שונים ועוברים פלישה קולקטיבית של CHT. כימות פוטנציאל הפלישה של תאי M2 ידי ספירת מספר האשכולות בפרוטוקול זה קשה והוא רצוי בביצוע יצירת תמונת 3D באמצעות מיקרוסקופיה confocal וקביעת הנפח של תאים סרטניים מקובצים.

האתגר הטכני ב מיקרו תאים סרטנייםהזרקה היא מיקוד במרחב או דוק perivitelline בהצלחה. את microinjection של מספר גדול של עוברים הוא הליך מייגע הדורש מפעיל מיומן וסבלני מאוד. גורמים שתורמים וריאציות בתוצאות בדגים בודדים כוללים את השלב ההתפתחותי של העובר כאשר מזריקים, הבדלים במספר התאים מוזרקים, ואת דליפה של תאים לתוך שק החלמון. למרות נדיר, המניפולציה יכולה שלא בכוונה לחדור בכלי הדם ולהציג תאים לתוך מערכת הדם ישירות, במיוחד הזרקת מרחב perivitelline. כדי לצמצם עוד וריאציה וכדי להבטיח את האמינות של הניתוחים, בדיקה מיקרוסקופית יש צורך לכלול דגים הוסמך בנקודות זמן לאורך כל התהליך. בנוסף, עיוור ניתוח על ידי איש מקצוע ללא ידיעת ההגדרה מומלצת מאוד להשיג כימות משוחדת.

לסיכום, שני הדגמים הצגנו כאן לשפוך אור עללדמיין את התהליכים של פלישת תא גרורות in vivo ללא הליכים פולשניים. למרות שאנו רק לומדים תאי סרטן שד בשני דגמים לגבי פוטנציאל גרורתי, הם יכולים להסיק על סוגים אחרים של הסרטן. יתר על כן, הדגמים יכולים להיות יישומים רחבים יותר בקביעת המנגנונים והיעדים מולקולריים חדשים שליטה גרורת תאים סרטניים באמצעות (EPI) מניפולציה גנטית. בשל החדירות הגבוהות של עוברי דג זברה על ידי תרכובות-מולקולה קטנה בהשוואת ההאכלה או ההזרקה של מכרסמים 25, שני המודלים שהוצגו יש גם יתרונות מבחינת הקרנת התפוקה הגבוהה של תרופות פוטנציאליות חדשות נגד פלישה / גרורות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לחשוף.

Acknowledgments

מחקרים על בני המשפחה-β TGF נתמכים על ידי הולנד המרכז Genomics סרטן. Sijia ליו ג'יאנג רן נתמכים על ידי המועצה מלגות סין עבור 4 שנות לימוד באוניברסיטת ליידן. אנו מודים לד"ר פרד מילר (ברברה אן Karmanos מכון הסרטן, דטרויט, מישיגן, ארה"ב) עבור שורות תאים MCF10A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose MP Biomedicals AGAF0500
Borosilicate glass capillary Harvard Apparatus 300038
Cholera enterotoxin  Calbiochem 227035
Confocal microscope Leica SP5 STED
DMEM-high glucose media containing L-glutamine ThermoFisher Scientific 11965092
DMEM/F-12 media containing L-glutamine ThermoFisher Scientific 21041025
Dumont #5 forceps Fine Science Tools Inc 11252-20
Epidermal growth factor Merck Millipore 01-107
Fetal bovine serum  ThermoFisher Scientific 16140071
Fluorescent stereo microscope Leica M165 FC
HEK293T cell line American Type Culture Collection CRL-1573
Hydrocortisone SigmaAldrich 227035
Horse serum ThermoFisher Scientific 26050088
Insulin SigmaAldrich I-6634
MCF10A (M1) cell line Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) 
MCF10Aras (M2) cell line Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) 
MDA-MB-231 cell line American Type Culture Collection CRM-HTB-26
Manual micromanipulator  World Precision Instruments M3301R
Micropipette puller Sutter Instruments P-97 
Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL) Eppendorf F276456I
pCMV-VSVG plasmid Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
PLV-mCherry plasmid Addgene 36084
pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Pneumatic picoPump World Precision Instruments SYS-PV820
Polybrene SigmaAldrich 107689
Prism 4 software GraphPad Software
pRSV-REV plasmid Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Stereo microscope Leica MZ16FA
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)
Tris-base SigmaAldrich 11814273001
Tricaine (3-aminobenzoic acid) SigmaAldrich A-5040
Trypsin-EDTA (0.5%) ThermoFisher Scientific 15400054
Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) SigmaAldrich P5481-500EA
Polystyrene dish with glass bottom WillCo GWST-5040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wan, L., Pantel, K., Kang, Y. Tumor metastasis: moving new biological insights into the clinic. Nat. Med. 19, (11), 1450-1464 (2013).
  2. Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a distance: Organ-specific metastasis. Trends Cancer. 1, (1), 76-91 (2015).
  3. Saxena, M., Christofori, G. Rebuilding cancer metastasis in the mouse. Mol. Oncol. 7, (2), 283-296 (2013).
  4. Teng, Y., Xie, X., Walker, S., et al. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC cancer. 13, (1), 453 (2013).
  5. Konantz, M., Balci, T. B., Hartwig, U. F., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, (1), 124-137 (2012).
  6. Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. J Exp Clin Cancer Res. 34, (1), 80 (2015).
  7. Stanton, M. F. Diethylnitrosamine-induced hepatic degeneration and neoplasia in the aquarium fish, Brachydanio rerio. J. Natl. Cancer Inst. 34, (1), 117-130 (1965).
  8. Lam, S. H., Wu, Y. L., Vega, V. B., et al. Conservation of gene expression signatures between zebrafish and human liver tumors and tumor progression. Nat. Biotechnol. 24, (1), 73-75 (2006).
  9. Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research-advantages and current limitations. Toxicol. Pathol. 31, Suppl 1. 62-87 (2003).
  10. Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27, (33), 4509-4520 (2008).
  11. Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., et al. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Dev. Dynam. 233, (4), 1560-1570 (2005).
  12. Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat. Protoc. 5, (3), 383-394 (2010).
  13. Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Res. 66, (6), 3120-3125 (2006).
  14. Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., et al. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell-vascular interface in transparent zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, (44), 17406-17411 (2007).
  15. Rouhi, P., Jensen, L. D., Cao, Z., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat. Protoc. 5, (12), 1911-1918 (2010).
  16. Drabsch, Y., He, S., Zhang, L., et al. Transforming growth factor-β signalling controls human breast cancer metastasis in a zebrafish xenograft model. Breast Cancer Res. 15, (6), R106 (2013).
  17. He, S., Lamers, G. E., Beenakker, J. W., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227, (4), 431-445 (2012).
  18. Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2, (11), 2918-2923 (2007).
  19. de Boeck, M., Cui, C., Mulder, A. A., et al. Smad6 determines BMP-regulated invasive behaviour of breast cancer cells in a zebrafish xenograft model. Sci. Rep. 6, 24968 (2016).
  20. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, (2), 307-318 (2002).
  21. Stewart, S. A., Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9, (4), 493-501 (2003).
  22. Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72, (11), 8463-8471 (1998).
  23. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  24. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat. Rev. Genet. 3, (9), 674-682 (2002).
  25. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat. Rev. Drug Discov. 4, (1), 35-44 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics