صبغة الفلورسنت وصفها من كرات الدم الحمراء والكريات البيض لدراسة ديناميات التدفق في الماوس دوران الشبكية

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

التصوير الخلية الحية من خلايا الدم المسمى في الدورة الدموية العين يمكن أن توفر معلومات عن التهاب ونقص التروية في اعتلال الشبكية السكري والانحطاط البقعي المرتبط بالعمر. ويرد وصف بروتوكول لتسمية خلايا الدم وصورة الخلايا المسمى في الدورة الدموية في شبكية العين.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Agrawal, R., Balne, P. K., Tun, S. B., Sia Wey, Y., Khandelwal, N., Barathi, V. A. Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation. J. Vis. Exp. (125), e55495, doi:10.3791/55495 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

قد توفر ديناميات تدفق الدم الشبكية والمشيمية نظرة ثاقبة على الفيزيولوجيا المرضية وعقابيل أمراض العين المختلفة، مثل الزرق، اعتلال الشبكية السكري، الضمور البقعي المرتبط بالعمر (أمد) وغيرها من الظروف الالتهابية العين. وقد يساعد أيضا على رصد الاستجابات العلاجية في العين. وضع العلامات المناسبة لخلايا الدم، إلى جانب التصوير خلية حية من الخلايا المسمى، ويسمح للتحقيق في ديناميات تدفق في شبكية العين و الدورة الدموية المشيمية. هنا، نحن تصف بروتوكولات موحدة من 1.5٪ الإندوسيانين الأخضر (إيسغ) و 1٪ الصوديوم فلوريسئين وصفها من الكريات الحمراء الفئران والكريات البيض، على التوالي. تم تطبيق المسح الضوئي منظار العين الليزر (سلو) لتصور الخلايا المسمى في الدورة الدموية في شبكية العين من الفئران C57BL / 6J (نوع البرية). أظهر كلا الأسلوبين الخلايا فلورزنتلي المسمى متميزة في الدورة الدموية في شبكية العين الماوس. هذه الطرق وضع العلامات يمكن أن يكون تطبيقات أوسع في مختلف أمراض العينعارضات ازياء.

Introduction

دراسة ديناميات تدفق خلايا الدم في الدورة الدموية في شبكية العين والمشيمية أمر حتمي لفهم التسبب في الأمراض التي يحتمل أن تكون مهددة الرؤية الرؤية وغيرها من الظروف الالتهابية العين. ومع ذلك، فإن تقنيات تصوير الأوعية التقليدية، والتي تنطوي على ملزمة الأصباغ الفلورية للبروتينات البلازما، لا توفر أي معلومات بشأن ديناميات كرات الدم الحمراء أو الكريات البيض 1 . ديناميات تدفق الشبكية كرات الدم الحمراء مهمة لدراسة الدورة الدموية كفاءة الأيض في شبكية العين، وديناميات تدفق الكريات البيض، لفهم الهجرة الخلية، والاعتراف، والتصاق والدمار في مختلف الظروف الالتهابية 2 . هناك العديد من جزيئات الفلورسنت المستخدمة في تحديد وتوصيف أنواع الخلايا المختلفة 3 . يمكن قياس ديناميكا الدم من خلايا الدم عن طريق تلطيخها مع فلوريس المناسبةسنت الأصباغ وتطبيق تقنيات التصوير المناسبة 4 .

وجود الاستجابات الالتهابية في أمراض العين مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر (أمد) واعتلال الشبكية السكري (در) تنطوي على تراكم الخلايا الليمفاوية في المنطقة المريضة 5 ، 6 . تتبع الخلايا المناعية في الأنسجة يمكن أن تساعد على فهم الأحداث المعقدة المشاركة في آلية المرضية المرضية. استخدمت النظائر المشعة مثل 51 كر و 125 أنا كما تتبع الخلايا في الدراسات المبكرة. هذه الأصباغ هي سامة وتؤثر على بقاء الخلية. على الرغم من أن العلامات المشعة 3 H و 14 C هي أقل سمية للخلايا، نظرا لطاقات انبعاثها أقل، فمن الصعب للكشف عن إشاراتها في النظام 7 ، 8 . تم إدخال عدد من الأصباغ اللامعة للتغلب على المشاكل المحتملة المرتبطة ثإيث علامات المشعة وتتبع هجرة الخلايا الليمفاوية في المختبر باستخدام المجهر الفلورسنت وتدفق الخلوي 9 ، 10 . هوشست 33342 وثيازول البرتقال هي الحمض النووي ملزمة الأصباغ الفلورية، والتي تستخدم لتعقب الخلايا الليمفاوية في الجسم الحي. هويشت 33342 يربط إلى المناطق الغنية في أت في الحمض النووي، هو غشاء نفاذية، يحتفظ إشارات الفلورسنت لمدة 2-4 أيام ومقاومة لتبريد 9 ، 10 . عيوب هويشت 33342 وثيازول البرتقال هي تثبيط انتشار الخلايا الليمفاوية 11 ونصف عمر قصير، على التوالي 9 .

كالسين-آم، فلوريسئين دياسيتات (فدا)، 2 '، 7'- مكرر (2-كاربوكسيثيل) -5- (و -6) -carboxy فلورسين، استر أسيتوكسيميثيل (بسكف-آم)، 5- (و -6) كاربوكسيفلورسين دياسيتات (كفدا)، و 5- (و -6) -carboxyfluorcein ديسيتات أسيتوكسيميثيل استر (كفدا-آم)هي الأصباغ الفلورية السيتوبلازمية المستخدمة للدراسات الهجرة اللمفاوية. ومع ذلك، فدا، كفدا و كفدا-آم ديك الاحتفاظ أقل في الخلايا 9 . بسيف-آم يقلل من الاستجابة التكاثري ويؤثر على الكيميائي وإنتاج الفائق 6 ، 12 . كالسين-آم هو صبغة الفلورسنت ومفيدة على المدى القصير في دراسات الهجرة اللمفاويات الجسم الحي . تنبعث منها إشارات فلورية قوية، لا تتداخل مع معظم الوظائف الخلوية وتحتفظ بإشارات الفلورسنت لمدة تصل إلى 3 أيام 12 ، 13 . فلوريسئين إيسوثيوسيانات (فيتس) و كاربوكسيفلورسين دياسيتات سوتسينيميديل استر (كفدا-سي) هي التساهمية اقتران الأصباغ الفلورية، والتي تستخدم للدراسات الهجرة اللمفاوية. فيتس المعارض أي تأثير على بقاء الخلية ولها تقارب أقوى مع الخلايا الليمفاوية B من الخلايا الليمفاوية T 14 ، 15 في الجسم الحي لأكثر من 8 أسابيع وتصل إلى 8 الانقسامات الخلية 9 ، 16 . C1 دي (1،1'-ديوكتاديسيل-3،3،3 '، 3'-تيتراميثيليندوكاربوسيانين بيركلورات)، ديو (3،3'- ديوكتاديسيلوكساكاربوسيانين بيركلورات)، بول كارل هوران (يخ) 2، PKH3، و PKH26 هي غشاء- إدراج الأصباغ الكاربوسيانين الفلورسنت محبة للدهون المستخدمة لتسمية الكريات البيض والكريات الحمراء. C18 ديل و ديو المعرض إشارات أعلى عند دمجها في غشاء الخلية وغير نسبيا غير سامة 12 ، 17 . PKH2، PKH3 و PKH26 الخلايا المسمى تحمل الاحتفاظ الجيد للإشارات الفلورسنت مع أقل سمية 18 ، 19 ، 20 ، 21 ، 22 . ومع ذلك، PKH2 أسفل ينظم التعبير CD62L ويقلل من لي بقاء خلية مبوية 23 .

وقد أجريت معظم الدراسات المذكورة أعلاه لتتبع هجرة الخلايا الليمفاوية وانتشار في اللمفاويات ودراسة الكريات الحمراء المسمى في الدورة الدموية غير العين. هناك عدد قليل جدا من الدراسات تطبيق تقنيات وضع العلامات لدراسة خلايا الدم في الدورة الدموية العين. تطبيق المسح الضوئي منظار العين ليزر (سلو) لديه ميزة كبيرة في دراسة الخلايا المسمى في شبكية العين والدورة الدموية المشيمية في الجسم الحي بواسطة قاع الأوعية تصوير 24 . هناك عدة أصباغ الفلورسنت، مثل إيسغ، أكريدين البرتقال، فيتس، فلوريسئين الصوديوم، و كفدا التي تستخدم لدراسة الكريات البيض في الدورة الدموية في شبكية العين من قبل سلو 25 ، 26 ، 27 ، 28 ، 29 ، 30 ،كلاس = "كريف"> 31 ، 32 ، 33 ، 34 . السمية الضوئية والسرطانية من أكريدين البرتقال 26 ، 27 ، تدخل فيتس مع النشاط الخلوي، ومتطلبات عامل تباين داخل الأوعية لحل الأوعية الدموية في شبكية العين والأوعية الدموية المشيمية يحد من تطبيقها في التجارب الحيوانية في الجسم الحي 29 . فلوريسئين الصوديوم و إيسغ هي غير سامة، التي وافقت عليها إدارة الغذاء والدواء، وآمنة لاختبار على البشر 32 ، 35 . ترتبط معظم الدراسات الديناميكية تدفق إلى وضع العلامات من الكريات البيض أو كرات الدم الحمراء والتصور لها في شبكية العين والأوعية الدموية المشيمية 36 ، 37 ، 38 ، 39

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكولات الحيوانية المستخدمة في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية من سينغهيلث، سنغافورة وهي وفقا للمبادئ التوجيهية للجمعية للبحوث في الرؤية وعلم العيون (أرفو) بيان لاستخدام الحيوانات في العيون والرؤية ابحاث.

1. وصفها من كرات الدم الحمراء والكريات البيض مع الأصباغ الفلورية

  1. إعداد الكواشف
    1. إعداد إيسغ (1.5 ملغ / مل) عن طريق إذابة 3 ملغ من إيسغ في 1800 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم. إضافة 200 ميكرولتر من 10X الفوسفات مخزنة المالحة (بس).
    2. إعداد 40٪ برنامج تلفزيوني 1X عن طريق إضافة 4 مل من برنامج تلفزيوني 1X إلى 6 مل من الماء المقطر تعقيمها. إعداد 1٪ ألبومين المصل البقري (بسا) في برنامج تلفزيوني عن طريق إضافة 100 ملغ من بسا إلى 10 مل من برنامج تلفزيوني 1X. تخلط جيدا حتى يتم حل بسا.
  2. عزل كريات الدم الحمراء والكريات البيض باستخدام كثافة الطرد المركزي التدرج
    1. تخدير الفئران (تي البريةبي C57BL / 6) باستخدام مزيج من هيدروكلوريد الكيتامين (50 ملغم / كغم) وهيدروكلوريد زيلازين (0.5 ملغم / كغم) (وفقا للجدول 1، تحت مبادئ أرفو التوجيهية). تأكيد التخدير عن طريق دواسة الانسحاب منعكس ( أي اصبع القدم قرصة).
    2. إدراج ببطء إبرة قياس 29 (تعلق على حقنة 1 مل) في زاوية الساحلية موجهة نحو القلب. للتأكد من أن الإبرة داخل القلب، اسحب المكبس قليلا وتحقق من سحب الدم إلى المحقنة. إكسانغينات 0.8 - 1 مل من الدم مباشرة من القلب.
    3. نقل الدم على الفور إلى الإيثيلين ديامين تيترا حمض الخليك (إدتا) (1.8 ملغ / مل من الدم) التي تحتوي على أنبوب جمع الدم وتخلط بلطف لمنع تخثر الدم.
    4. الموت ببطء الفئران عن طريق إدارة بينتوباربيتال (80 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن داخل الصفاق.
    5. طبقة الدم كله على رأس بوليسكروس وحل دياتريزوات الصوديوم (1: 1 نسبة؛ الكثافة 1.077 ز / ​​مل) في أنبوب ميكروسنتريفوج 2 مل و سنتريفوج (450 x ج، 30 دقيقة) للسماح للفصل بين الكريات البيض والكريات الحمراء من البلازما.
    6. إزالة وتجاهل طاف (البلازما) باستخدام ماصة. نقل بعناية معطف منتفخ (الكريات البيض) والكريات الحمراء (طبقة خلايا الدم الحمراء) في أنابيب جديدة ومنفصلة باستخدام ماصات.
  3. إيسغ (1.5٪) وضع العلامات من كرات الدم الحمراء
    1. غسل كرات الدم الحمراء مع برنامج تلفزيوني 1X لإزالة أي ملوثات. ريسوسبيند كرات الدم الحمراء في برنامج تلفزيوني 1X (1: 1) لجعل الهيماتوكريت 50٪. قسامة 0.5 مل من 50٪ الهيماتوكريت (~ 250 ميكرولتر معبأة كريات الدم الحمراء) في أنابيب ميكروسنتريفوج. الطرد المركزي الكريات الحمراء (750 x ج، 5 دقائق) وتجاهل طاف.
    2. إضافة 200 ميكرولتر من 40٪ برنامج تلفزيوني 1X إلى كرات الدم الحمراء مكعبات، وتخلط جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. إضافة 100 ميكرولتر من إيسغ (1.5 ملغ / مل) إلى تعليق كرات الدم الحمراء، وتخلط بلطف عن طريق قلب الأنبوب، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. إضافة 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X واحتضان في37 درجة مئوية في حاضنة شاكر لمدة 60 دقيقة.
    3. الطرد المركزي الناقل كرات الدم الحمراء (750 x ج، 3 دقائق) و ريسوسبيند في 1 مل 1X بس.
    4. غسل الخلايا ~ 3 - 5 مرات مع برنامج تلفزيوني 1X حتى طاف واضح (الخطوة 1.3.3). بعد غسل الماضي، صب طاف وإضافة 1٪ بسا بس (1: 1) إلى الكريات الحمراء قبل تضخيم المسمى لتحقيق هيماتوكريت 50٪ (1.25 × 10 8 خلية / مل) من إيسغ المسمى كرات الدم الحمراء.
  4. فلوريسئين الصوديوم (1٪) وسم الكريات البيض
    1. بعد فصل معطف منفوش من الدم باستخدام الطرد المركزي التدرج الكثافة (من الخطوة 1.2.6)، وغسل الخلايا مرة واحدة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني 1X بواسطة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 10 دقيقة لإزالة أي ملوثات. ريسوسبيند بيليه في 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X.
    2. إضافة 100 ميكرولتر من 10٪ فلوريسئين الصوديوم إلى 900 ميكرولتر من تعليق الكريات البيض واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. غسل الخلايا المسمى ثلاث مرات مع 10 مل 1X بس بواسطة سنتريفوجينانوغرام (450 x ج، 10 دقيقة). ريسوسبيند الخلايا إلى 100 ميكرولتر 1X بس.

2. لايف التصوير من الخلايا فلورزنتلي المسمى

  1. تصوير الخلايا الحية من إيسغ المسمى كرات الدم الحمراء
    1. لإعداد خلايا للحقن عبر الوريد الذيل أو الطريق المدارية الرجعية، وتمييع الهيماتوكريت 50٪ من إيسغ المسمى كرات الدم الحمراء بنسبة 10 أضعاف و 50 أضعاف مع برنامج تلفزيوني 1X لجعل 5٪ و 1٪ هيماتوكريت الخلايا، على التوالي.
    2. ضع الماوس تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء (كثافة 250W) لمدة 5 دقائق للسماح للوريد الذيل تمدد. تخدير الماوس مع هيدروكلوريد الكيتامين (50 ملغ / كلغ) وهيدروكلوريد زيلازين (0.5 ملغ / كلغ) من خلال الحقن داخل الصفاق (هنا، وفقا للجدول 1، تحت المبادئ التوجيهية أرفو).
    3. تمدد كل تلميذ من العينين مع قطرة من 0.5٪ تروبيكاميد و 2.5٪ فينيليفرين هيدروكلوريد.
    4. ضع العدسة اللاصقة فوق عين واحدة للتصوير. استخدام هلام العيون كوسيلة للتصوير ومنع دريفنسق القرنية. إصلاح متحد البؤر ليزر المسح الضوئي منظار العين (سلو) الكاميرا مع +25 عدسة الديوبتر للتعويض عن انكسار العين الماوس.
    5. ضع الماوس على منصة التصوير سلو. تأكد من أن قرنية الماوس تواجه مباشرة نحو الرأس البصري للآلة سلو.
    6. قم بتشغيل وحدة التصوير. باستخدام برنامج وحدة التصوير المرتبطة بها، انقر على زر "المريض الجديد" وإضافة تفاصيل تحديد الحيوان مثل الماوس الأذن رقم العلامة وتاريخ الميلاد، والنسبة المئوية لصبغ الفلورسنت ونوع الخلية المسمى.
      1. وضع العصب البصري للحيوان في وسط الشاشة التصوير عن طريق المناورة وحدة التصوير. باستخدام برنامج وحدة التصوير المصاحبة، انقر على زر "اكتساب" لالتقاط صور قاع الأشعة تحت الحمراء (إر) مع 30 درجة أو 15 درجة زاوية الرؤية الإعداد. ضمان محاذاة مركز شبكية العين، التلميذ والمسار البصري للليزر لتحقيق أفضل جودة الصورة.
    7. خذ فيديو قاع إيسغ.
      1. قم بتشغيل مرشح إيسغ) 790 نانومتر (، قم بتعيين الكاميرا على وضع السرعة العالية باستخدام طريقة عرض زاوية 30 درجة أو 15 درجة وقم بتعيين شدة إيسغ عند 85 لكل قراءات التوحيد القياسي. على لوحة التحكم، انقر على زر "اكتساب" لاتخاذ الفيديو (مراقبة خط الأساس) في 8.8 / 15 لقطة / ثانية لمدة 1 دقيقة.
    8. تحميل 100 ميكرولتر من إيسغ المسمى الكريات الحمراء في حقنة الأنسولين تعلق على إبرة قياس 30.
      1. للحقن عبر طريق الوريد الذيل، إدراج شطبة إبرة تصل إلى الوريد الذيل. تأكيد الوصول عن طريق الوريد عن طريق التحقق من ارتجاع الدم في حقنة وحقن الخلايا المسمى في الدورة الدموية.
      2. للحقن عبر الطريق الرجعية المدارية، إدراج الإبرة المتاخمة للعين في سباك الرجعية المداريةه. تأكيد الوصول الرجعية المدارية عن طريق التحقق من ارتجاع الدم في حقنة وحقن الخلايا المسمى في الدورة الدموية.
    9. بعد الحقن، أعد وضع الماوس وأخذ صور قاع الأشعة تحت الحمراء (انظر الخطوة 2.1.6.1) والفيديو باستخدام فلتر إيسغ (انظر الخطوة 2.1.7.1). يمكن وصف الخلايا المسمى في الدورة الدموية في شبكية العين مباشرة بعد حقن الخلايا.
    10. بعد الحصول على إطارات الفيديو، استخراج الصور .tiff من تسلسل الفيديو عن طريق اختيار تنسيق .tiff عند تصدير الفيديو باستخدام برنامج وحدة عرض سلو. احفظ الملفات في المجلد المطلوب.
    11. إزالة العدسات اللاصقة، ووضعه على العين الأخرى، واستكمال التصوير كما هو موضح في الخطوات 2.1.4 - 2.1.7.
    12. بعد التصوير، ووضع الحيوان تخدير تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء (250W) للحفاظ على درجة حرارة الجسم حتى يتعافى من التخدير. عندما يتم استرداد الحيوان تماما، ضع الماوس مرة أخرى في قفص عقد.
  2. يعيش خلية التصوير من 1٪ فلوريسئين الصوديوم المسمى الكريات البيض
    1. إعداد الماوس وإعداد الصك كما هو موضح في القسم 2.1.
    2. ضع الماوس وتأخذ الصور قاع الأشعة تحت الحمراء كما هو موضح في الخطوات 2.1.4 - 2.1.6.
      1. الحصول على تصوير الأوعية فلوريسئين من الماوس باستخدام فلتر فلوريسئين (488 نانومتر) مع وضع الكاميرا عالية السرعة مع 30 درجة أو 15 درجة زاوية الرؤية وكثافة فلوريسئين في 85 لجميع قراءات للتوحيد القياسي. تسجيل الفيديو (مراقبة خط الأساس) في 8.8 / 15 لقطة / ثانية (انظر الخطوة 2.1.7.1).
        ملاحظة: هنا، تم الحصول على مسارات متعددة من أشرطة الفيديو (1 دقيقة أشرطة الفيديو) على فترات زمنية مختلفة.
    3. حقن 100 ميكرولتر الكريات البيض المسمى في الماوس من خلال الوريد الذيل أو الحقن الرجعية المدارية كما هو موضح في القسم 2.1.8.
    4. مباشرة بعد الحقن، ووضع الماوس واتخاذ الصور قاع الأشعة تحت الحمراء (انظر الخطوات 2.1.5 و 2.1.6) والفلوتصوير أنسيوغرام من الماوس (انظر القسم 2.2.2).
    5. مراقبة الخلايا المسمى في شبكية العين أو الأوعية الدموية المشيمية عن طريق ضبط النقطة المحورية للليزر المسح الضوئي عن طريق تحويل مقبض التركيز على وحدة التصوير.
    6. الحصول على إطارات الفيديو والصور باستخدام سلو وحدة عرض البرمجيات (انظر الخطوة 2.1.10) وحفظه في المجلد المطلوب.
    7. بعد الإجراء، اتبع الخطوة 2.1.12 لرعاية الحيوانات.
  3. تحليل الصور من قبل برنامج متراك
    1. فتح تسلسل الصورة في إيماجيج عن طريق النقر على "ملف". حدد "استيراد" واختر "تسلسل صورة"، حدد مجلد الصورة المطلوبة، وانقر فوق "فتح". ستظهر نافذة منبثقة تسمى "خيارات التسلسل" على الشاشة. انقر فوق موافق"؛ سيتم فتح تسلسل الصورة.
    2. تعيين الفاصل الزمني للصورة من الفيديو صورة عن طريق النقر على "صورة" وحدد "خصائص" لقياس السرعة. هنا، هو 8.8 فراموفاق / ثانية.
    3. افتح البرنامج المساعد متراجي عن طريق اختيار "الإضافات". حدد "تتبع" ثم حدد "متراك". يجب أن تظهر قائمة.
    4. لضبط إعدادات التتبع، حدد "التتبع" (ضمن القائمة) وحدد المربع "الانتقال إلى فهرس الإطار الزمني التالي بعد إضافة نقطة".
    5. تتبع الخلية الأولى.
      1. حدد موقع خلية واحدة وتتبع الخلية نفسها في الإطارات اللاحقة. في القائمة انقر فوق "إضافة" لإضافة مسار جديد.
      2. مرر المؤشر فوق الصورة (علامة +) وانقر على الخلية المناسبة.
        ملاحظة: سوف متراكج القفز تلقائيا إلى الإطار الزمني التالي وإضافة دائرة صغيرة، بمناسبة موقف النقطة الأولى في مسار.
      3. تابع النقر على الموضع الحالي للخلية أثناء التنقل عبر إطارات تسلسل الصورة.
        ملاحظة: في بعض الأحيان، الدوائر بمناسبة النقاط السابقة في مسار تتداخل مع القدرة على عرض الموقع الحالي. وإذا حدث ذلك،انتقل إلى الخطوة 2.3.5.3.1.
        1. تغيير خيار العرض للمسار من خلال النقر على "عرض" في القائمة وتحديد الخيار "عرض نقاط المسار فقط في الوقت الحالي". لمشاهدة جميع المسارات، قم بإلغاء تحديد هذا الخيار.
      4. مواصلة النقر حتى ينظر إلى مسار الخلية الأولى. ثم احفظ المسار بالنقر على "حفظ".
    6. تتبع الخلية الثانية.
      1. في القائمة، انقر على "إضافة" لبدء مسار جديد. كرر الخطوات 2.3.5.1 - 2.3.5.4 لتتبع الخلية الجديدة. انقر على "حفظ" لحفظ المسار الثاني.
      2. متابعة هذه الخطوات لجميع الخلايا تتبعها لاحظت. بعد تتبع الخلايا، انقر على "قياس" و "موافق" في علامة التبويب القائمة للحصول على النتائج.
        ملاحظة: يتم فتح نافذة النتائج تلقائيا، والتي يمكن حفظها وفتحها في جدول بيانات لمزيد من التحليل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم تصور كريات الدم الحمراء مع 1.5٪ إيسغ في الدورة الدموية في شبكية العين من الفئران C57BL / 6J (نوع البرية). كل من 1٪ و 5٪ هيماتوكريت من 1.5٪ إيسغ المسمى كرات الدم الحمراء كانت مميزة في الدورة الدموية في شبكية العين. ومع ذلك، كانت تصور الخلايا الفردية المسمى أكثر وضوحا مع 1٪ الهيماتوكريت من 1.5٪ إيسغ المسمى كرات الدم الحمراء ( الشكل 1 ). في 5٪ الهيماتوكريت، ويرجع ذلك إلى عدد كبير من الخلايا المسمى في الأوعية الشبكية، لم يكن من الممكن للاحتفال الخلية الفردية. لوحظ بعض إريثروستاسيس في المنطقة الحليمية في ظل كل من الظروف، لكنه كان أكثر بروزا في هيماتوكريت 5٪ من الكريات الحمراء المسمى ( الشكل 2 ).

تم وصف الكريات البيض بنجاح مع 1٪ فلوريسئين الصوديوم بعد البروتوكول أعلاه وتصور الخلايا الخضراء المسمى باستخدام المجهر الفلورسنت ( كلاس = "زفيغ"> الشكل 3). كما لوحظت كتل صغيرة من الخلايا (4 - 5 خلايا معا) في عينات وصفت. عندما تم حقن الخلايا في الدورة الدموية الماوس، وصفت الكريات البيض المسمى في الدورة الدموية في شبكية العين ( الشكل 4 ). بعد وضع العلامات، تم حقن كل من كرات الدم الحمراء والكريات البيض على الفور في الفئران وتصور في 30 و 60 دقيقة فترات زمنية. وقد لوحظت الخلايا فلورزنتلي المسمى مباشرة بعد الحقن، ولكن شدة مضان انخفضت تدريجيا في 30 و 60 دقيقة فترات زمنية. استخدمنا أيضا بروتوكول تلطيخ الكريات البيض (1٪ فلوريسئين الصوديوم) على كرات الدم الحمراء وملاحظ عدم وضع العلامات من كرات الدم الحمراء. باستخدام البرنامج المساعد متراك J على برنامج J المجال العام الصورة، وتتبع الخلايا في الدورة الدموية في شبكية العين ( الشكل 5 ).

95 / 55495fig1.jpg "/>
الشكل 1 : 1٪ الهيماتوكريت من 1.5٪ إيسغ المسمى كريات الدم الحمراء في تداول الشبكية. وصفت إيسغ الكريات الحمراء الفردية التي تعرض إشارات مشرقة في الأوعية الشبكية. لوحظت بعض إريثروستاسيس في المنطقة حويضة. مقياس = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2 : 5٪ الهيماتوكريت من 1.5٪ إيسغ المسمى كريات الدم الحمراء في دوران الشبكية. وصف العديد من إيسغ كريات الدم الحمراء عرض إشارات مشرقة في الأوعية الشبكية. لوحظت كمية كبيرة من إريثروستاسيس في المنطقة حويضة. مقياس = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل 3 : المجهري مضان صورة 1٪ الصوديوم فلوريسئين الكريات البيض المسمى. الصوديوم فلوريسئين المسمى الكريات البيض تظهر إشارات الفلورسنت الخضراء مع كتل صغيرة (20X التكبير؛ مقياس = 50 ميكرون). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4
الشكل 4 : 1٪ الصوديوم فلوريسئين الكريات البيض المسمى في دوران الشبكية. الصوديوم فلوريسئين المسمى الكريات البيض (السهم) تظهر إشارة مشرقة في الأوعية الشبكية. مقياس = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5
الشكل 5 : تتبع الخلايا الفردية المسمى في دوران الشبكية باستخدام برنامج تحليل الصور. تم قياس المسارات المختلفة (الدوائر الملونة والخطوط كما هو موضح في الصورة) لحساب السرعة المتوسطة للخلايا المسمى في الدورة الدموية في شبكية العين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

دراسة ديناميكا الدم في دوران الشبكية والمشيمية أمر حيوي لفهم الفيزيولوجيا المرضية للعديد من أمراض العين. ويمكن دراسة ديناميات تدفق الدم في الدورة الدموية في شبكية العين من قبل التصوير الفوتوغرافي التماسك البصري فورييه المجال (فد-أوكت)، فلوغرافي الليزر الرقطة (لسفغ) وقياس التأكسج الشبكية. على الرغم من أن هذه الأساليب تستخدم نهج مختلفة لدراسة تدفق الدم الكلي في الدورة الدموية في شبكية العين 40 ، 41 ، 42 ، 43 ، 44 ، 45 ، فإنها تشترك في الحد من عدم القدرة على دراسة ديناميات تدفق أنواع الخلايا الفردية. ويمكن دراسة العناصر الغذائية والأكسجين إلى شبكية العين والأنسجة المشيمية، وكذلك هجرة الخلايا المناعية في أمراض التهاب العين ودورها في المرضية المرضية من خلال التحقيق في ديناميات تدفق إيهيثروسيتس والكريات البيض في شبكية العين والدورة المشيمية، على التوالي. سوف تقنيات وضع العلامات إلى جانب أساليب التصوير تساعد على تتبع الخلايا المسمى في الدورة الدموية ودراسة ديناميات تدفق الخلايا المسمى. تم تطبيق عدة أصباغ الفلورسنت بنجاح لتسمية الكريات البيض والكريات الحمراء للتحقيق في ديناميكية تدفقها في الدورة الدموية 3 ، 17 ، 18 ، 19 .

هنا، ونحن تقرير تطبيق إدارة الغذاء والدواء وافقت الأصباغ الفلورية غير سامة، والأندوسيانين الأخضر والصوديوم فلوريسئين، لوضع العلامات والتصور من الكريات الحمراء والكريات البيض في الدورة الدموية في شبكية العين، على التوالي. على الرغم من أن فلوريسئين الصوديوم هو الصبغة الأكثر شيوعا لتتبع الكريات البيض 31 ، 32 ، 33 34 ، ميزة في وقت واحد وضع العلامات الكريات الحمراء والكريات البيض مع إيسغ والصوديوم فلوريسئين، على التوالي هو التصور الفعال للخلايا المسمى في وقت واحد في العين الحيوان عن طريق تغيير المرشحات في سلو. سلو هو طريقة غير الغازية للتصوير الشبكية التي تستخدم على نطاق واسع في دراسة التغيرات المرضية في مختلف أمراض الشبكية في البشر والحيوانات. ويمكن أن يساعد أيضا في مقارنة التغيرات في شبكية العين في الاستجابة لعلاج معين 46 .

لتحقيق صور ذات جودة في سلو، يحتاج التلاميذ إلى أن يكون متوسعا تماما، ويجب استخدام العدسة اللاصقة مع هلام العيون للحفاظ على القرنية الرطبة ومنع تشكيل الساد. موقف العينين والمسار البصري للكاميرا يجب أن تكون على التوالي لتحقيق جودة قاع وصور أنجيوغرام. يجب أن يكون الحيوان مخدر عميق لتقليل الحركة أثناء التصوير. على الرغم من أن 1٪ و 5٪ الهيماتوكريت من 1.5٪ إيسغأظهرت كريات الدم الحمراء وصفت الخلايا فلورزنتلي المسمى في الدورة الدموية في شبكية العين، وكان 1٪ الهيماتوكريت أكثر ملاءمة لرصد الخلايا الفردية. لا يمكن تصور الخلايا فلورزنتلي المسمى إذا كان عدد من الكريات البيضاء حقن منخفضة جدا. لذلك، لتحقيق نتائج أفضل في رصد الخلايا المسمى في الدورة الدموية في شبكية العين، فمن المستحسن لجمع الكريات البيض من على الأقل 4 الفئران، والتسمية مع 1٪ فلوريسئين الصوديوم، وحقن في فأرة واحدة. على الرغم من أن هناك بعض الأصباغ البديلة ل فلوريسئين الصوديوم (كالسين، فيتس، ديو، ادارة الاغذية والعقاقير و كفدا مع امتصاص / انبعاث ماكسيما مماثلة ل أو بالقرب من فلوريسئين الصوديوم)، يجب أن يتم تقييم معدل الاحتفاظ صبغ وسمية للأنسجة العين 9 ، 12 ، 13 ، 14 ، 17 .

الحد من تقنية المبلغ عنها هويتلاشى من إشارة الفلورسنت في الدورة الدموية بعد 60 دقيقة. لذلك، يجب تحليل ديناميات تدفق الخلايا المسمى في غضون 60 دقيقة. هنا، لتسمية الكريات البيض، تم سحب الدم من فأر واحد، تم عزل الخلايا، وصفت، حقن في فأر آخر، وتصور من قبل سلو. ومع ذلك، في سلو، لوحظ فقط 0-1 خلية لكل إطار في الأوعية الدموية في شبكية العين. هذا يمكن أن يكون راجعا إلى عدد الخلايا الكريات البيض غير كافية ولذا فإننا نوصي لجمع الدم من على الأقل 3 - 4 الفئران لتصور عدد الخلايا أعلى في الإطار. تم استخدام سرعة الكاميرا 8.8 لقطة / ثانية في الدراسة، ولكن يمكن زيادة هذا لتحقيق المزيد من الصور المتسلسلة وأشرطة الفيديو من الخلايا المسمى.

ذكرت دراسات سابقة التغيرات في سرعة تدفق الدم في الدورة الدموية في شبكية العين من مرضى السكري مع مراحل مختلفة من در. كليرمون وآخرون. عن انخفاض بنسبة 33٪ في تدفق الدم في شبكية العين في المرضى الذين يعانون من المرحلة المبكرة من در 47 ، و نغوين وآخرونالله. عن زيادة في تدفق الدم في شبكية العين في مرضى السكري مع التكاثري در 48 . كما تم الإبلاغ عن انخفاض سرعة تدفق الدم أن تترافق مع الزرق التقدمي 49 . في الدراسات المذكورة أعلاه، حقق الباحثون في كامل سرعات تدفق الدم في الدورة الدموية في شبكية العين. دراسة سرعات تدفق كل نوع من الخلايا يمكن أن توفر معلومات حول التفاعلات الخلوية في أمراض مختلفة وفي مراحل مختلفة من المرض، ويمكن أن تساعد في التشخيص. هنا نحن تقرير طريقة لتسمية الكريات الحمراء والكريات البيض مع إيسغ و فلوريسئين الصوديوم، على التوالي والتصور في الدورة الدموية في شبكية العين. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نموذج المرض للدراسات في الجسم الحي .

البحوث المستقبلية يمكن الاستفادة من تقنيات وضع العلامات لدينا باستخدام سلو لدراسة التباين في ديناميات تدفق الكريات الحمراء وصفت والكريات البيض تحت العلاج الدوائي مختلفة كونديتيونس في مراحل مختلفة من المرض. وعلاوة على ذلك، يمكن أن أساليبنا تساعد على فهم دور الكريات الحمر والكريات البيض في المظاهر المرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف. لا المالية أو تضارب المصالح.

Acknowledgements

وقد تم تمويل المشروع البحثي بموجب منحة المحقق الجديد من المجلس الوطني للبحوث الطبية (نمرك)، سنغافورة. ويود الفريق أن يعترف بالتدريب البحثي المقدم إلى الدكتور أغروال في معهد طب العيون (إيو)، كلية لندن الجامعية (أوكل) في إطار المجلس الوطني للبحوث الطبية (نمرك) زمالة التدريب في الخارج من نوفمبر 2012 حتى أكتوبر 2014 تحت إشراف البروفيسور. ديفيد شيما. اكتسب الدكتور أغروال مفهوم ومهارات لوضع العلامات على الخلايا والتصوير الحي في مختبر الدكتور شيما. وبالتالي فإن الفريق يود أن يعترف الإشراف والتوجيه خلال الزمالة التدريب من البروفسور ديفيد شيما، Pro.f كينيث ميسنر، الدكتور بيتر لونده والدكتور دايجو إيواتا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) Sigma Aldrich 12633-50MG
Fluorescein 100 mg/mL Novartis U1705A/H-1330292
10x Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade 1st BASE BUF-2040-10X1L
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A7906-100G
Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) - EDTA concentration - 1.8 mg/mL of blood BD, USA REF 365974
Histopaque 1077 solution Sigma Aldrich 10771
Centrifuge 5810 R Eppendorf 05-413-401
Microcentrifuge tubes 2 mL Axygen MCT-200-C-S
Vortex mixer Insta BioAnalytik pte. ltd FINE VORTEX
Shaker incubator Lab Tech
Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100 mg/mL) Ceva KETALAB03
ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20 mg/Ml) Troy Laboratories PTY. Limited LI0605
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0355-15
2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0342-05
Terumo syringe with needle 1 cc/mL Tuberculin Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines SS-01T2613
Vidisic Gel 10 G Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany
Alcohol swabs Assure medical disposables 7M-004-L-01
Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Fluorescent microscope ZEISS Model: axio imager z1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent vesicle system. A new technique for measuring blood flow in the retina. Ophthalmology. 101, (10), 1716-1726 (1994).
  2. Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration. J Fluoresc. 23, (5), 975-987 (2013).
  3. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77, (6), 499-508 (1999).
  4. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30, (2), 140-145 (1999).
  5. Nowak, J. Z. Age-related macular degeneration (AMD): pathogenesis and therapy. Pharmacol Rep. 58, (3), 353-363 (2006).
  6. Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366, (13), 1227-1239 (2012).
  7. Rannie, G. H., Thakur, M. L., Ford, W. L. An experimental comparison of radioactive labels with potential application to lymphocyte migration studies in patients. Clin Exp Immunol. 29, 509-514 (1977).
  8. Ford, W. L. The preparation and labeling of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 3, Blackwell Scientific Pubs. Oxford. (1978).
  9. Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies: Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Meth. 133, 87-97 (1990).
  10. Brenan, M., Parish, C. R. Intracellular fluorescent labeling of cells for analysis of lymphocyte migration. J Immunol Meth. 74, 31-38 (1984).
  11. Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
  12. DeClerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leukocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. J Immunol Meth. 172, 115-124 (1994).
  13. Chiba, K., et al. FTY720, a novel immunosuppressant, induced sequestration of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing in rats. I. FTY720 selectively decreases the number of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing. J Immunol. 160, 5037-5044 (1998).
  14. Butcher, E. C., Weissman, I. L. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. I. Technical aspects. J Immunol Meth. 37, 97-108 (1980).
  15. Butcher, E. C., Scollay, R. G., Weissman, I. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. II. Potential application to studies of lymphocyte migration and maturation. J Immunol Meth. 37, 109-121 (1980).
  16. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Meth. 171, 131-137 (1994).
  17. Unthank, J. L., Lash, J. M., Nixon, J. C., Sidner, R. A., Bohlen, H. G. Evaluation of carbocyanine-labeled erythrocytes for microvascular measurements. Microvasc Res. 45, 193-210 (1993).
  18. Slezak, S. E., Horan, P. K. Fluorescent in vivo tracking of hematopoietic cells. Part I. Technical considerations. Blood. 74, 2172-2177 (1989).
  19. Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: The migration of PKH-labeled lymphocytes. Cell Immunol. 134, 157-170 (1991).
  20. Johnsson, C., Festin, R., Tufveson, G. T., Tötterman, T. H. Ex vivo PKH26-labeling of lymphocytes for studies of cell migration in vivo. Scand. J Immunol. 45, 511-514 (1997).
  21. Khalaf, A. N., Wolff-Vorbeck, G., Bross, K., Kerp, L., Petersen, K. G. In vivo labeling of the spleen with a red-fluorescent cell dye. J Immunol Meth. 165, 121-125 (1993).
  22. Albertine, K. H., Gee, M. H. In vivo labeling of neutrophils using a fluorescent cell linker. J Leukoc Biol. 59, 631-638 (1996).
  23. Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
  24. Manivannan, A., et al. Digital fundus imaging using a scanning laser ophthalmoscope. Physiol Meas. 14, 43-56 (1993).
  25. Okanouchi, T., Shiraga, F., Takasu, I., Tsuchida, Y., Ohtsuki, H. Evaluation of the dynamics of choroidal circulation in experimental acute hypertension using indocyanine green-stained leukocytes. Jpn J Ophthalmol. 47, (6), 572-577 (2003).
  26. Zdolsek, J. M., Olsson, G. M., Brunk, U. T. Photooxidative damage to lysosomes of cultured macrophages by acridine orange. Photochem Photobiol. 51, 67-76 (1990).
  27. Molnar, J., et al. Antiplasmid and carcinogenic molecular orbitals of benz[c]acridine and related compounds. Anticancer Res. 13, 263-266 (1993).
  28. Fillacier, K., Peyman, G. A., Luo, Q., Khoobehi, B. Study of lymphocyte dynamics in the ocular circulation: technique of labeling cells. Curr Eye Res. 14, (7), 579-584 (1995).
  29. Horan, P. K., et al. Fluorescent cell labeling for in vivo and in vitro cell tracking. Methods Cell Biol. 33, 469-490 (1990).
  30. Hossain, P., et al. In vivo cell tracking by scanning laser ophthalmoscopy: quantification of leukocyte kinetics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39, (10), 1879-1887 (1998).
  31. Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Visualization of retinal and choroidal blood flow with fluorescein leukocyte angiography in rabbits. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235, (1), 27-31 (1997).
  32. Kim, J., Yang, Y., Shin, B., Cho, C. Visualization and flow of platelets and leukocytes in vivo in rat retinal and choroidal vessels. Ophthalmic Res. 29, (6), 374-380 (1997).
  33. Le Gargasson, J. F., et al. Scanning laser ophthalmoscope imaging of fluorescein-labeled blood cells. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235, 56-58 (1997).
  34. Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Fluorescent dots in fluorescein angiography and fluorescein leukocyte angiography using a scanning laser ophthalmoscope in humans. Ophthalmology. 104, (10), 1670-1676 (1997).
  35. Yannuzzi, L. A. Indocyanine green angiography: a perspective on use in the clinical setting. Am J Ophthalmol. 151, (5), 745-751 (2011).
  36. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30, (2), 140-145 (1999).
  37. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. J Neurosci. 34, (34), 11504-11513 (2014).
  38. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2, (2), (2015).
  39. Matsuda, N., et al. Visualization of leukocyte dynamics in the choroid with indocyanine green. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37, (11), 2228-2233 (1996).
  40. Wang, Y., Lu, A., Gil-Flamer, J., Tan, O., Izatt, J. A., Huang, D. Measurement of total blood flow in the normal human retina using Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Br J Ophthalmol. 93, (5), 634-637 (2009).
  41. Wang, Y., Fawzim, A., Tan, O., Gil-Flamer, J., Huang, D. Retinal blood flow detection in diabetic patients by Doppler Fourier domain optical coherence tomography. Opt Express. 17, (5), 4061-4073 (2009).
  42. Srinivas, S., Tan, O., Wu, S., Nittala, M. G., Huang, D., Varma, R., Sadda, S. R. Measurement of retinal blood flow in normal Chinese-American subjects by Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, (3), 1569-1574 (2015).
  43. Sugiyama, T., Araie, M., Riva, C. E., Schmetterer, L., Orgul, S. Use of laser speckle flowgraphy in ocular blood flow research. Acta Ophthalmol. 88, (7), 723-729 (2010).
  44. Nakano, Y., Shimazaki, T., Kobayashi, N., Miyoshi, Y., Ono, A., Kobayashi, M., Shiragami, C., Hirooka, K., Tsujikawa, A. Retinal Oximetry in a Healthy Japanese Population. PLoS One. 11, (7), 0159650 (2016).
  45. Turksever, C., Orgul, S., Todorova, M. G. Reproducibility of retinal oximetry measurements in healthy and diseased retinas. Acta Ophthalmol. 93, (6), 439-445 (2015).
  46. Sharp, P. F., Manivannan, A., Xu, H., Forrester, J. V. The scanning laser ophthalmoscope-a review of its role in bioscience and medicine. Phys Med Biol. 49, (7), 1085-1096 (2004).
  47. Clermont, A. C., Aiello, L. P., Mori, F., Aiello, L. M., Bursell, S. E. Vascular endothelial growth factor and severity of nonproliferative diabetic retinopathy mediate retinal hemodynamics in vivo: a potential role for vascular endothelial growth factor in the progression of nonproliferative diabetic retinopathy. Am J Ophthalmol. 124, (4), 433-446 (1997).
  48. Nguyen, H. T., et al. Retinal blood flow is increased in type 1 diabetes mellitus patients with advanced stages of retinopathy. BMC Endocr Disord. 16, (1), 25 (2016).
  49. Schumann, J., Orgül, S., Gugleta, K., Dubler, B., Flammer, J. Interocular difference in progression of glaucoma correlates with interocular differences in retrobulbar circulation. Am J Ophthalmol. 129, (6), 728-733 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics