Флуоресцентная маркировка красителей эритроцитов и лейкоцитов для изучения динамики потока в циркуляции сетчатки мышей

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Живые клетки меченых клеток крови при циркуляции глаз могут предоставить информацию о воспалении и ишемии при диабетической ретинопатии и возрастной макулярной дегенерации. Описан протокол для маркировки клеток крови и изображения меченых клеток в кровообращении сетчатки.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Agrawal, R., Balne, P. K., Tun, S. B., Sia Wey, Y., Khandelwal, N., Barathi, V. A. Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation. J. Vis. Exp. (125), e55495, doi:10.3791/55495 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Динамика сетчатки и хориоидального кровотока может дать представление о патофизиологии и последствиях различных глазных заболеваний, таких как глаукома, диабетическая ретинопатия, возрастная дегенерация желтого пятна (AMD) и другие воспалительные состояния глаз. Это также может помочь контролировать терапевтические реакции в глазу. Надлежащая маркировка клеток крови, в сочетании с визуализацией живых клеток меченых клеток, позволяет исследовать динамику потока в сетчатке и хориоидальной циркуляции. Здесь мы описываем стандартизированные протоколы 1,5% индоцианинового зеленого (ICG) и 1% флюоресцеиновой метки для мышей эритроцитов мышей и лейкоцитов соответственно. Сканирующая лазерная офтальмоскопия (SLO) применялась для визуализации меченых клеток в ретинальном кровообращении мышей C57BL / 6J (дикого типа). Оба метода продемонстрировали различные флуоресцентно меченные клетки в циркуляции сетчатки мыши. Эти методы маркировки могут иметь более широкое применение при различных заболеваниях глазмоделей.

Introduction

Изучение динамики течения клеток крови в сетчатке и хориоидальной циркуляции необходимо для понимания патогенеза потенциально опасных для зрения глазных заболеваний и других глазных воспалительных состояний. Однако обычные методы ангиографии, которые связаны с связыванием флуоресцентных красителей с белками плазмы, не дают никакой информации о динамике эритроцитов или лейкоцитов 1 . Динамика потока сетчатки эритроцитов важна для изучения метаболически эффективной циркуляции в сетчатке и динамики потока лейкоцитов, для понимания миграции клеток, распознавания, адгезии и разрушения в различных воспалительных состояниях. Существует несколько флуоресцентных молекул, используемых при идентификации и характеристике различных типов клеток 3 . Гемодинамику клеток крови можно измерить, окрашивая их соответствующими флуоресценциямиИ применяя надлежащие методы визуализации 4 .

Наличие воспалительных реакций при внутриглазных заболеваниях, таких как возрастная дегенерация желтого пятна (AMD) и диабетическая ретинопатия (DR), включает накопление лимфоцитов в пораженной области 5 , 6 . Отслеживание иммунных клеток в тканях может помочь понять сложные события, связанные с механизмом патогенеза болезни. Радиоактивные изотопы, такие как 51 Cr и 125 I, использовались в качестве клеточных индикаторов в ранних исследованиях. Эти красители являются токсичными и влияют на жизнеспособность клеток. Хотя радиоактивные маркеры 3 H и 14 C менее токсичны для клеток, из-за их более низких энергий излучения трудно обнаружить их сигналы в системе 7 , 8 . Ряд флуорохромных красителей был введен для преодоления потенциальных проблем, связанных сС радиоактивными маркерами и миграцией трековых лимфоцитов in vitro с использованием флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии 9 , 10 . Hoechst 33342 и тиазол апельсин представляют собой связывающие ДНК флуоресцентные красители, которые используются для отслеживания лимфоцитов in vivo. Hoechst 33342 связывается с богатыми AT областями в ДНК, является мембранопроницаемой, сохраняет флуоресцентные сигналы в течение 2-4 дней и устойчив к тушению 9 , 10 . Недостатками Hoechst 33342 и тиазола оранжевого являются ингибирование пролиферации лимфоцитов 11 и короткий период полувыведения, соответственно 9 .

Кальцеин-AM, диацетат флуоресцеина (FDA), 2 ', 7'-бис- (2-карбоксиэтил) -5- (и -6) -карбоксифлуоресцеин, ацетоксиметиловый эфир (BCECF-AM), 5- (и -6) - Карбоксифлуоресцеиндиацетат (CFDA) и 5- (и -6) -карбоксифлуоресцеиндиацетат ацетоксиметиловый эфир (CFDA-AM)Являются цитоплазматические флуоресцентные красители, используемые для изучения миграции лимфоцитов. Однако FDA, CFDA и CFDA-AM имеют более низкое удерживание в клетках 9 . BCECF-AM снижает пролиферативный ответ и влияет на хемотаксис и продуцирование супероксида 9 , 12 . Кальцеин-AM - флуоресцентный краситель и полезен для краткосрочных исследований миграции лимфоцитов in vivo . Он излучает сильные флуоресцентные сигналы, не мешает большинству сотовых функций и сохраняет флуоресцентные сигналы на срок до 3 дней 12 , 13 . Флуоресцеиновый изотиоцианат (FITC) и карбоксифлуоресцеин-диацетатсукцинимидиловый эфир (CFDA-SE) представляют собой ковалентные связующие флуоресцентные красители, которые используются для изучения миграции лимфоцитов. FITC не оказывает влияния на жизнеспособность клеток и имеет более сильное сродство с В-лимфоцитами, чем Т-лимфоциты 14 , 15 in vivo в течение более 8 недель и до 8 клеточных делений 9 , 16 . C18 DiI (1,1'-диоктадецил-3,3,3 ', 3'-тетраметилиндокарбоцианиновый перхлорат), DiO (3,3'-диоктадецилоксакарбоцианиновый перхлорат), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 и PKH26 являются мембранно- Вставляя флуоресцентные липофильные карбоцианиновые красители, используемые для маркировки лейкоцитов и эритроцитов. C18 Dil и DiO проявляют более высокие сигналы при включении в клеточную мембрану и относительно нетоксичны 12 , 17 . Меченые клетки PKH2, PKH3 и PKH26 демонстрируют хорошее удерживание флуоресцентных сигналов с меньшей токсичностью 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . Однако PKH2 down регулирует экспрессию CD62L и уменьшает Жизнеспособность мфоцитов 23 .

Большинство вышеупомянутых исследований были проведены для отслеживания миграции и пролиферации лимфоцитов в лимфатических узлах и изучения меченых эритроцитов в неокрубальной циркуляции. Есть очень мало исследований, применяющих методы маркировки для изучения клеток крови в циркуляции глаз. Применение сканирующей лазерной офтальмоскопии (SLO) имеет большое преимущество при изучении меченых клеток в сетчатке и хориоидальной циркуляции in vivo андрогенологией дна. Существует несколько флуоресцентных красителей, таких как ICG, акридиновый апельсин, FITC, флюоресцеин натрия и CFDA, которые используются для изучения лейкоцитов в циркуляции сетчатки с помощью SLO 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 . Фототоксичность и канцерогенность акридинового апельсина 26 , 27 , интерференция FITC с клеточной активностью и потребность внутрисосудистого контрастного агента для разрешения сетчатки и сосудистых сосудов ограничивают их применение в экспериментах на животных in vivo 29 . Флюоресцеин натрия и МКГ нетоксичны, одобрены Управлением по контролю за продуктами и лекарствами и безопасны для тестирования на людях 32 , 35 . Большинство динамических исследований потока связаны с маркировкой лейкоцитов или эритроцитов и его визуализацией в сетчатке и сосудистых сосудах 36 , 37 , 38 , 39

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Протоколы животных, используемые в этом исследовании, были одобрены Комитетом по гигиене и использованию животных SingHealth в Сингапуре и соответствуют рекомендациям Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) для использования животных в офтальмологии и зрения Исследование.

1. Маркировка эритроцитов и лейкоцитов флуоресцентными красителями

  1. Получение реагентов
    1. Подготовьте ICG (1,5 мг / мл) путем растворения 3 мг ICG в 1800 мкл стерилизованной дистиллированной воды. Добавить 200 мкл 10-фосфатного буферного раствора (PBS).
    2. Подготовьте 40% 1x PBS, добавив 4 мл 1x PBS в 6 мл стерилизованной дистиллированной воды. Подготовьте 1% альбумина бычьей сыворотки (BSA) в PBS, добавив 100 мг BSA в 10 мл 1x PBS. Хорошо перемешайте до тех пор, пока BSA не растворится.
  2. Выделение эритроцитов и лейкоцитов с помощью центрифугирования с градиентом плотности
    1. Анестезируйте мышей (дикаяPe C57BL / 6) с использованием комбинации гидрохлорида кетамина (50 мг / кг) и гидрохлорида ксилазина (0,5 мг / кг) (согласно графику 1 в соответствии с рекомендациями ARVO). Подтвердите анестезию с помощью рефлекса снятия педали ( т. Е. Пальца).
    2. Медленно вставьте иглу 29-го калибра (прикрепленную к 1 мл шприцу) под углом, направленным к сердцу. Чтобы подтвердить, что игла находится внутри сердца, слегка снимите плунжер и проверьте, не забрана ли кровь в шприц. Exsanguinate 0,8 - 1 мл крови непосредственно из сердца.
    3. Немедленно переносите кровь в этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) (1,8 мг / мл крови), содержащую трубку для сбора крови, и осторожно перемешайте, чтобы предотвратить коагуляцию крови.
    4. Эвтаназию мышей путем введения пентобарбитала (80 мг / кг) путем внутрибрюшинной инъекции.
    5. Слейте всю кровь сверху полисухарозы и раствора диатризоата натрия (соотношение 1: 1, плотность 1,077 г / мл) в 2 мл микроцентрифужной пробирке и центриFuge (450 xg, 30 мин), чтобы обеспечить отделение лейкоцитов и эритроцитов от плазмы.
    6. Удалите и выбросьте супернатант (плазму) с помощью пипетки. Аккуратно перенесите в новые и отдельные пробирки с помощью пипетки оштукатуренное (лейкоциты) и эритроциты (слой эритроцитов).
  3. ICG (1,5%) маркировка эритроцитов
    1. Вымойте эритроциты 1x PBS для удаления любых загрязнений. Ресуспендируют эритроциты в 1x PBS (1: 1), чтобы получить 50% гематокрита. Аликвоте 0,5 мл 50% гематокрита (~ 250 мкл упакованных эритроцитов) в микроцентрифужные пробирки. Центрифугируют эритроциты (750 xg, 5 мин) и отбрасывают супернатант.
    2. Добавить 200 мкл 40% 1x PBS в гранулированные эритроциты, хорошо перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавьте 100 мкл ICG (1,5 мг / мл) к суспензии эритроцитов, осторожно перемешайте, повернув трубку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавить 300 мкл 1x PBS и инкубировать при37 ° C в шейкерном инкубаторе в течение 60 мин.
    3. Центрифугируют эритроциты носителя (750 xg, 3 мин) и ресуспендируют в 1 мл 1x PBS.
    4. Вымойте клетки ~ 3 - 5 раз с помощью 1x PBS, пока супернатант не станет прозрачным (шаг 1.3.3). После последней промывки декантируют супернатант и добавляют 1% BSA PBS (1: 1) к меченым предварительно набухшим эритроцитам для достижения 50% гематокрита (1,25 × 10 8 клеток / мл) меченных ICG эритроцитов.
  4. Флюоресцеин натрия (1%), маркировка лейкоцитов
    1. После отделения буфера от крови с помощью центрифугирования с градиентом плотности (с этапа 1.2.6) промывают клетки один раз 10 мл 1 × PBS путем центрифугирования при 450 × g в течение 10 мин для удаления любых загрязнений. Ресуспендируют гранулу в 900 мкл 1x PBS.
    2. Добавить 100 мкл 10% флюоресцеина натрия до 900 мкл суспензии лейкоцитов и инкубировать при комнатной температуре в течение 2 мин. Промывают меченые клетки три раза 10 мл 1X PBS центрифугиNg (450 xg, 10 мин). Ресуспендируют клетки в 100 мкл 1x PBS.

2. Живая визуализация флуоресцентно маркированных клеток

  1. Живое изображение ICG с мечеными эритроцитами
    1. Чтобы приготовить клетки для инъекций через хвостовую вену или ретро-орбитальный маршрут, разбавьте 50% гематокрита ICG меченых эритроцитов в 10 раз и 50 раз с 1x PBS, чтобы сделать 5% и 1% клеток гематокрита, соответственно.
    2. Поместите мышь под инфракрасным светом (интенсивность 250 Вт) в течение 5 минут, чтобы удлинить хвостовую вену. Анестезируйте мышь с помощью гидрохлорида кетамина (50 мг / кг) и гидрохлорида ксилазина (0,5 мг / кг) с помощью внутрибрюшинной инъекции (здесь, согласно графику 1, согласно рекомендациям ARVO).
    3. Разбавьте каждый зрачок глаз каплей 0,5% тропикамида и 2,5% фенилэфрина гидрохлорида.
    4. Поместите контактные линзы на один глаз для получения изображений. Используйте офтальмический гель в качестве средства для визуализации и предотвращения сухихС роговицы. Закрепите камеру конфокальной лазерной сканирующей офтальмоскопии (SLO) с линзой +25 диоптрий, чтобы компенсировать преломление глаза мыши.
    5. Поместите мышь на платформу обработки изображений SLO. Убедитесь, что роговица мыши обращена прямо к оптической головке машины SLO.
    6. Включите модуль формирования изображения. Используя соответствующее программное обеспечение модуля изображений, нажмите кнопку «Новый пациент» и добавьте данные идентификации животных, такие как номер мышиного уха, дату рождения, процент флуоресцентного красителя и маркированный тип ячейки.
      1. Расположите зрительный нерв животного в центре экрана изображения, маневрируя модулем формирования изображения. Используя соответствующее программное обеспечение модуля изображений, нажмите кнопку «Приобретать», чтобы получить изображения инфракрасного (ИК) фундуса с настройкой угла 30 ° или 15 °. Убедитесь, что центр сетчатки, зрачок и оптический путь лазера выровнены, чтобы добиться наилучшего качества изображения.
    7. Возьмите видеоролик ICU.
      1. Включите фильтр ICG (790 нм), установите камеру в режим высокой скорости с углом обзора 30 ° или 15 ° и установите интенсивность ICG на уровне 85 для всех показаний для стандартизации. На панели управления нажмите кнопку «Получить», чтобы взять видео (базовое управление) со скоростью 8,8 / 15 кадров / с в течение 1 минуты.
    8. Загрузите 100 мкл меченных ICG эритроцитов в шприц для инсулина, прикрепленный к игле 30 калибра.
      1. Для инъекции через путь хвостовой вены вставьте иглу в скос в хвостовую вену. Подтвердите внутривенный доступ, проверив обратный поток крови в шприц и введя меченые клетки в кровоток.
      2. Для инъекции по ретро-орбитальному маршруту вставьте иглу, прилегающую к глазу, в ретро-орбитальную пространствое. Подтвердите ретро-орбитальный доступ, проверив обратный поток крови в шприц и вставьте меченые клетки в кровоток.
    9. После инъекции переместите мышь и возьмите изображения инфракрасного канала (см. Шаг 2.1.6.1) и видео с использованием фильтра ICG (см. Шаг 2.1.7.1). Меченые клетки в циркуляции сетчатки могут быть визуализированы сразу после инъекции клеток.
    10. После приобретения видеокадров извлеките .tiff изображения видеопоследовательностей, выбрав формат .tiff при экспорте видео с помощью программного обеспечения модуля просмотра SLO. Сохраните файлы в нужную папку.
    11. Удалите контактные линзы, поместите их поверх другого глаза и завершите формирование изображения, как описано в шагах 2.1.4 - 2.1.7.
    12. После визуализации разместите анестезированное животное под инфракрасным светом (250 Вт), чтобы поддерживать температуру тела до тех пор, пока он не восстановится после анестезии. Когда животное полностью восстановится, верните мышь обратно в клетку-держатель.
  2. Живая клетка визуализации 1% флюоресцеина, меченных лейкоцитами
    1. Подготовьте мышь и настройте инструмент, как описано в разделе 2.1.
    2. Расположите мышь и возьмите изображения ИК-фонуса, как описано в шагах 2.1.4 - 2.1.6.
      1. Получите флюоресцеиновую ангиограмму мыши с использованием флуоресцеинового фильтра (488 нм) с высокоскоростным режимом камеры с углом обзора 30 ° или 15 ° и интенсивностью флуоресцеина при 85 для всех показаний для стандартизации. Запишите видео (базовое управление) на 8,8 / 15 кадров / с (см. Шаг 2.1.7.1).
        ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь несколько треков видеороликов (видеоролики продолжительностью 1 мин) были получены с различными временными интервалами.
    3. Инъецировать лейкоциты с мечеными лейкоцитами по 100 мкл через хвостовую вену или ретро-орбитальную инъекцию, как описано в разделе 2.1.8.
    4. Сразу же после инъекции поместите мышь и возьмите изображения инфракрасного флюда (см. Шаги 2.1.5 и 2.1.6) и флюоАнгиограмму мыши (см. Раздел 2.2.2).
    5. Соблюдайте маркированные клетки в сетчатке или сосудистых сосудах, отрегулировав фокальную точку сканирующего лазера, повернув ручку фокусировки на модуль формирования изображения.
    6. Приобретите видеофрагменты и изображения с помощью программного обеспечения модуля просмотра SLO (см. Шаг 2.1.10) и сохраните его в нужную папку.
    7. После процедуры выполните шаг 2.1.12 для ухода за животными.
  3. Анализ изображений программным обеспечением MtrackJ
    1. Откройте последовательность изображений в ImageJ, нажав «Файл». Выберите «Импорт» и выберите «Последовательность изображений», выберите нужную папку с изображением и нажмите «Открыть». На экране появится всплывающее окно под названием «Параметры последовательности». Нажмите «ОК»; Последовательность изображений откроется.
    2. Установите интервал кадра видеоизображения, щелкнув «Изображение» и выберите «Свойства» для измерения скорости. Здесь 8,8 кадровэс / с.
    3. Откройте плагин MTrackJ, выбрав «Плагины». Выберите «Отслеживание», а затем выберите «MtrackJ». Должно появиться меню.
    4. Чтобы настроить параметры отслеживания, выберите «Отслеживание» (в меню) и установите флажок «Переход к следующему индексу временных рамок после добавления точки».
    5. Отследить первую ячейку.
      1. Найдите одну ячейку и отслеживайте одну и ту же ячейку в последующих кадрах. В меню нажмите «Добавить», чтобы добавить новый трек.
      2. Наведите курсор на изображение (знак +) и щелкните соответствующую ячейку.
        ПРИМЕЧАНИЕ. MTrackJ автоматически перейдет к следующему временному кадру и добавит небольшой круг, обозначив положение первой точки траектории.
      3. Продолжайте нажимать на текущую позицию ячейки при перемещении по кадрам последовательности изображений.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Иногда круги, обозначающие предыдущие точки траектории, препятствуют возможности просмотра текущего местоположения. Если это произойдет,Перейдите к шагу 2.3.5.3.1.
        1. Измените параметр отображения для траектории, нажав «Отображение» в меню и выбрав опцию «Отображать только дорожки в текущее время». Чтобы просмотреть все траектории, отмените выбор этого параметра.
      4. Продолжайте нажимать, пока не увидит траекторию первой ячейки. Затем сохраните дорожку, нажав «Сохранить».
    6. Отслеживание второй ячейки.
      1. В меню нажмите «Добавить», чтобы начать новый трек. Повторите шаги 2.3.5.1 - 2.3.5.4 для отслеживания новой ячейки. Нажмите «Сохранить», чтобы сохранить второй трек.
      2. Продолжите эти шаги для всех отслеживаемых клеток. После отслеживания ячеек нажмите «Измерение» и «ОК» на вкладке меню, чтобы получить результаты.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Окно результатов автоматически открывается, которое можно сохранить и открыть в электронной таблице для дальнейшего анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Эритроциты, помеченные 1,5% -ной МКГ, визуализировались в ретинальной циркуляции мышей C57BL / 6J (дикого типа). Как 1%, так и 5% гематокрит 1,5% ICG меченых эритроцитов были различимы в кровообращении сетчатки. Однако отдельные меченые клетки были более четко визуализированы с 1% гематокритом с 1,5% мечеными ICG эритроцитами ( фиг. 1 ). В 5% гематокрите, из-за большого количества меченых клеток в сосудах сетчатки, нельзя было отметить отдельную клетку. Некоторый эритростаз наблюдался в перипапиллярной области в обоих условиях, но он был более заметным в 5% гематокрите меченых эритроцитов ( рис. 2 ).

Лейкоциты были успешно помечены 1% флюоресцеином натрия по вышеуказанному протоколу и были визуализированы в виде зеленых меченых клеток с использованием флуоресцентной микроскопии ( Class = "xfig"> Рисунок 3). Небольшие скопления клеток (4-5 клеток вместе) наблюдались также в меченых образцах. Когда клетки вводили в циркуляцию мыши, меченые лейкоциты визуализировались в циркуляции сетчатки ( рис. 4 ). После этикетирования и эритроциты, и лейкоциты сразу вводили мышам и визуализировали через промежутки времени 30 и 60 мин. Флуоресцентно меченые клетки наблюдались сразу после инъекции, но интенсивности флуоресценции постепенно снижались с интервалами времени 30 и 60 мин. Мы также использовали протокол окрашивания лейкоцитов (1% флюоресцеина натрия) на эритроцитах и ​​не отмечали маркировки эритроцитов. Используя плагин Mtrack J в программном обеспечении общего доступа Image J, клетки отслеживались в циркуляции сетчатки ( рис. 5 ).

95 / 55495fig1.jpg "/>
Рисунок 1 : 1% гематокрита 1,5% ICG маркированных эритроцитов в ретинальной циркуляции. МКГ обозначил индивидуальные эритроциты, отображающие яркие сигналы в сосудах сетчатки. В перипапиллярной области наблюдался эритростаз. Масштаб = 200 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2 : 5% гематокрита 1,5% ICG маркированных эритроцитов при ретинальной циркуляции. Многие ICG помечены эритроцитами, отображающими яркие сигналы в сосудах сетчатки; В перипапиллярной области наблюдалось большое количество эритростаза. Масштаб = 200 мкм, Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3
Рисунок 3 : Изображение флуоресцентной микроскопии 1% флюоресцеина натрия, маркированного лейкоцитами. Флюоресцеин натрия, маркированный лейкоцитами, показывает зеленые флуоресцентные сигналы с небольшими скоплениями (увеличение 20 раз, масштаб = 50 мкм). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4
Рисунок 4 : 1% флюоресцеина натрия, маркированные лейкоцитами при циркуляции сетчатки. Флюоресцеин натрия, помеченный лейкоцитом (стрелка), показывает яркий сигнал в сосудах сетчатки. Масштаб = 200 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5
Рисунок 5 : Отслеживание маркированных отдельных ячеек в ретинальной циркуляции с использованием программного обеспечения для анализа изображений. Различные дорожки (цветные круги и линии, представленные на изображении) измерялись для вычисления средней скорости меченых клеток в кровообращении сетчатки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Изучение гемодинамики в сетчатке и хориоидальной циркуляции жизненно важно для понимания патофизиологии многих глазных заболеваний. Динамику кровотока в кровообращении сетчатки можно исследовать с помощью фурье-оптической когерентной томографии (FD-OCT), лазерной спекл-флюографии (LSFG) и оксиметрии сетчатки. Хотя в этих методах используются разные подходы к изучению общего кровотока в циркуляции сетчатки 40 , 41 , 42 , 43 , 44 , 45 , они разделяют ограничение неспособности исследовать динамику потока отдельных типов клеток. Питательные вещества и подача кислорода в сетчатку и хориоидальные ткани, а также миграцию иммунных клеток при воспалительных заболеваниях глаз и их роль в патогенезе болезни могут быть изучены путем исследования динамики теченияЙтроцитов и лейкоцитов в ретинальном и хориоидальном кровообращении соответственно. Методы этикетирования в сочетании с методами визуализации помогут отслеживать маркированные клетки в циркуляции и изучить динамику потока меченых клеток. Несколько флуоресцентных красителей были успешно применены для маркировки лейкоцитов и эритроцитов для исследования их динамики течения в циркуляции 3 , 17 , 18 , 19 .

Здесь мы сообщаем о применении одобренных нетоксичных флуоресцентных красителей, индоцианиновых зеленых и флюоресцеинов натрия, для маркировки и визуализации эритроцитов и лейкоцитов в кровообращении сетчатки соответственно. Хотя флуоресцеин натрия является наиболее часто используемым красителем для отслеживания лейкоцитов 31 , 32 , 33 34 , преимущество одновременной маркировки эритроцитов и лейкоцитов с ICG и флюоресцеином натрия, соответственно, является эффективной визуализацией меченых клеток одновременно в глазу животного путем смены фильтров в SLO. SLO - это неинвазивный метод визуализации сетчатки, который широко используется при изучении патологических изменений при различных заболеваниях сетчатки у людей и животных. Это также может помочь в сравнении изменений сетчатки в ответ на данное лечение 46 .

Для достижения качественных изображений в SLO зрачки должны быть полностью расширены, а контактные линзы должны использоваться с офтальмологическим гелем для поддержания влажной роговицы и предотвращения образования катаракты. Положение глаз и оптический путь камеры должны быть прямыми, чтобы достичь качественных изображений дна и ангиограммы. Животное должно быть глубоко успокоено, чтобы минимизировать движение во время визуализации. Хотя и 1% и 5% гематокрит 1,5% МКГМеченые эритроциты продемонстрировали визуализацию флуоресцентно меченных клеток в кровообращении сетчатки, 1% гематокрита лучше всего подходит для мониторинга отдельных клеток. Флюоресцентно меченные клетки не могут быть визуализированы, если количество введенных лейкоцитов слишком низкое. Поэтому для достижения лучших результатов в мониторинге меченых клеток в кровообращении сетчатки рекомендуется собирать лейкоциты из по меньшей мере 4 мышей, наклеивать 1% флюоресцеина натрия и вводить в одну мышь. Хотя существуют некоторые альтернативные красители для флюоресцеина натрия (Calcein, FITC, DIO, FDA и CFDA с максимумами абсорбции / эмиссии, аналогичными или близким к флюоресцеину натрия), скорость удержания красителя и токсичность для глазных тканей должна оцениваться 9 , 12 , 13 , 14 , 17 .

Ограничением описанной техники являетсяЗатухание флуоресцентного сигнала в циркуляции через 60 мин. Поэтому динамику потока меченых клеток необходимо анализировать в течение 60 мин. Здесь, чтобы маркировать лейкоциты, кровь отбирали с одной мыши, клетки выделяли, мечили, вводили в другую мышь и визуализировали с помощью SLO. Однако в SLO в кровеносных сосудах сетчатки наблюдалось только 0 - 1 клетка на кадр. Это может быть связано с недостаточным количеством клеток лейкоцитов, поэтому мы рекомендуем собирать кровь, по крайней мере, от 3 до 4 мышей, чтобы визуализировать более высокое количество клеток на кадр. В исследовании использовалась скорость камеры 8,8 кадров / с, но это могло быть увеличено для достижения более последовательных изображений и видео помеченных ячеек.

В более ранних исследованиях сообщалось об изменениях скорости кровотока в кровообращении у пациентов с диабетом с различными стадиями DR. Clermont et al. Сообщили о 33% -ном снижении кровотока сетчатки у пациентов с ранней стадией DR 47 и Nguyen etи др. Сообщили об увеличении кровотока сетчатки у пациентов с диабетом с пролиферативным DR 48 . Сообщалось также, что снижение скорости кровотока связано с прогрессирующей глаукомой 49 . В вышеупомянутых исследованиях авторы исследовали скорости всего кровотока в кровообращении сетчатки. Изучение скоростей потока каждого типа клеток может предоставить информацию о клеточных взаимодействиях при различных заболеваниях и на разных стадиях заболевания и может помочь в прогнозе. Здесь мы сообщаем о методе маркировки эритроцитов и лейкоцитов ICG и флюоресцеином натрия, соответственно, и их визуализации в кровообращении сетчатки; Этот метод может применяться на любой модели болезни для исследований in vivo .

Будущие исследования могут использовать наши методы маркировки с использованием SLO для изучения изменения динамики течения меченых эритроцитов и лейкоцитов в разных условиях лечения наркозависимостиНа разных стадиях заболевания. Кроме того, наши методы могут помочь понять роль эритроцитов и лейкоцитов в фенотипах болезней.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать. Никакой финансовый или конфликт интересов.

Acknowledgements

Исследовательский проект финансировался по гранту New Investigator от Национального совета по медицинским исследованиям (NMRC), Сингапур. Команда хотела бы поблагодарить доктора Агравала в Институте офтальмологии (IoO), Университетского колледжа Лондона (UCL) в рамках Национального исследовательского совета по медицинским исследованиям (NMRC) за период с ноября 2012 года по октябрь 2014 года под руководством профессора Дэвид Шима. Доктор Агравал приобрел концепцию и навыки для маркировки клеток и визуализации в лаборатории доктора Шимы. Команда, таким образом, будет признавать надзор и руководство во время обучения стипендиатам от профессора Дэвида Шимы, профессора Кенита Мейснера, доктора Питера Лунда и доктора Дайю Ивата.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) Sigma Aldrich 12633-50MG
Fluorescein 100 mg/mL Novartis U1705A/H-1330292
10x Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade 1st BASE BUF-2040-10X1L
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A7906-100G
Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) - EDTA concentration - 1.8 mg/mL of blood BD, USA REF 365974
Histopaque 1077 solution Sigma Aldrich 10771
Centrifuge 5810 R Eppendorf 05-413-401
Microcentrifuge tubes 2 mL Axygen MCT-200-C-S
Vortex mixer Insta BioAnalytik pte. ltd FINE VORTEX
Shaker incubator Lab Tech
Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100 mg/mL) Ceva KETALAB03
ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20 mg/Ml) Troy Laboratories PTY. Limited LI0605
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0355-15
2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0342-05
Terumo syringe with needle 1 cc/mL Tuberculin Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines SS-01T2613
Vidisic Gel 10 G Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany
Alcohol swabs Assure medical disposables 7M-004-L-01
Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Fluorescent microscope ZEISS Model: axio imager z1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent vesicle system. A new technique for measuring blood flow in the retina. Ophthalmology. 101, (10), 1716-1726 (1994).
  2. Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration. J Fluoresc. 23, (5), 975-987 (2013).
  3. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77, (6), 499-508 (1999).
  4. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30, (2), 140-145 (1999).
  5. Nowak, J. Z. Age-related macular degeneration (AMD): pathogenesis and therapy. Pharmacol Rep. 58, (3), 353-363 (2006).
  6. Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366, (13), 1227-1239 (2012).
  7. Rannie, G. H., Thakur, M. L., Ford, W. L. An experimental comparison of radioactive labels with potential application to lymphocyte migration studies in patients. Clin Exp Immunol. 29, 509-514 (1977).
  8. Ford, W. L. The preparation and labeling of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 3, Blackwell Scientific Pubs. Oxford. (1978).
  9. Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies: Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Meth. 133, 87-97 (1990).
  10. Brenan, M., Parish, C. R. Intracellular fluorescent labeling of cells for analysis of lymphocyte migration. J Immunol Meth. 74, 31-38 (1984).
  11. Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
  12. DeClerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leukocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. J Immunol Meth. 172, 115-124 (1994).
  13. Chiba, K., et al. FTY720, a novel immunosuppressant, induced sequestration of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing in rats. I. FTY720 selectively decreases the number of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing. J Immunol. 160, 5037-5044 (1998).
  14. Butcher, E. C., Weissman, I. L. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. I. Technical aspects. J Immunol Meth. 37, 97-108 (1980).
  15. Butcher, E. C., Scollay, R. G., Weissman, I. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. II. Potential application to studies of lymphocyte migration and maturation. J Immunol Meth. 37, 109-121 (1980).
  16. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Meth. 171, 131-137 (1994).
  17. Unthank, J. L., Lash, J. M., Nixon, J. C., Sidner, R. A., Bohlen, H. G. Evaluation of carbocyanine-labeled erythrocytes for microvascular measurements. Microvasc Res. 45, 193-210 (1993).
  18. Slezak, S. E., Horan, P. K. Fluorescent in vivo tracking of hematopoietic cells. Part I. Technical considerations. Blood. 74, 2172-2177 (1989).
  19. Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: The migration of PKH-labeled lymphocytes. Cell Immunol. 134, 157-170 (1991).
  20. Johnsson, C., Festin, R., Tufveson, G. T., Tötterman, T. H. Ex vivo PKH26-labeling of lymphocytes for studies of cell migration in vivo. Scand. J Immunol. 45, 511-514 (1997).
  21. Khalaf, A. N., Wolff-Vorbeck, G., Bross, K., Kerp, L., Petersen, K. G. In vivo labeling of the spleen with a red-fluorescent cell dye. J Immunol Meth. 165, 121-125 (1993).
  22. Albertine, K. H., Gee, M. H. In vivo labeling of neutrophils using a fluorescent cell linker. J Leukoc Biol. 59, 631-638 (1996).
  23. Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
  24. Manivannan, A., et al. Digital fundus imaging using a scanning laser ophthalmoscope. Physiol Meas. 14, 43-56 (1993).
  25. Okanouchi, T., Shiraga, F., Takasu, I., Tsuchida, Y., Ohtsuki, H. Evaluation of the dynamics of choroidal circulation in experimental acute hypertension using indocyanine green-stained leukocytes. Jpn J Ophthalmol. 47, (6), 572-577 (2003).
  26. Zdolsek, J. M., Olsson, G. M., Brunk, U. T. Photooxidative damage to lysosomes of cultured macrophages by acridine orange. Photochem Photobiol. 51, 67-76 (1990).
  27. Molnar, J., et al. Antiplasmid and carcinogenic molecular orbitals of benz[c]acridine and related compounds. Anticancer Res. 13, 263-266 (1993).
  28. Fillacier, K., Peyman, G. A., Luo, Q., Khoobehi, B. Study of lymphocyte dynamics in the ocular circulation: technique of labeling cells. Curr Eye Res. 14, (7), 579-584 (1995).
  29. Horan, P. K., et al. Fluorescent cell labeling for in vivo and in vitro cell tracking. Methods Cell Biol. 33, 469-490 (1990).
  30. Hossain, P., et al. In vivo cell tracking by scanning laser ophthalmoscopy: quantification of leukocyte kinetics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39, (10), 1879-1887 (1998).
  31. Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Visualization of retinal and choroidal blood flow with fluorescein leukocyte angiography in rabbits. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235, (1), 27-31 (1997).
  32. Kim, J., Yang, Y., Shin, B., Cho, C. Visualization and flow of platelets and leukocytes in vivo in rat retinal and choroidal vessels. Ophthalmic Res. 29, (6), 374-380 (1997).
  33. Le Gargasson, J. F., et al. Scanning laser ophthalmoscope imaging of fluorescein-labeled blood cells. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235, 56-58 (1997).
  34. Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Fluorescent dots in fluorescein angiography and fluorescein leukocyte angiography using a scanning laser ophthalmoscope in humans. Ophthalmology. 104, (10), 1670-1676 (1997).
  35. Yannuzzi, L. A. Indocyanine green angiography: a perspective on use in the clinical setting. Am J Ophthalmol. 151, (5), 745-751 (2011).
  36. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30, (2), 140-145 (1999).
  37. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. J Neurosci. 34, (34), 11504-11513 (2014).
  38. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2, (2), (2015).
  39. Matsuda, N., et al. Visualization of leukocyte dynamics in the choroid with indocyanine green. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37, (11), 2228-2233 (1996).
  40. Wang, Y., Lu, A., Gil-Flamer, J., Tan, O., Izatt, J. A., Huang, D. Measurement of total blood flow in the normal human retina using Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Br J Ophthalmol. 93, (5), 634-637 (2009).
  41. Wang, Y., Fawzim, A., Tan, O., Gil-Flamer, J., Huang, D. Retinal blood flow detection in diabetic patients by Doppler Fourier domain optical coherence tomography. Opt Express. 17, (5), 4061-4073 (2009).
  42. Srinivas, S., Tan, O., Wu, S., Nittala, M. G., Huang, D., Varma, R., Sadda, S. R. Measurement of retinal blood flow in normal Chinese-American subjects by Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, (3), 1569-1574 (2015).
  43. Sugiyama, T., Araie, M., Riva, C. E., Schmetterer, L., Orgul, S. Use of laser speckle flowgraphy in ocular blood flow research. Acta Ophthalmol. 88, (7), 723-729 (2010).
  44. Nakano, Y., Shimazaki, T., Kobayashi, N., Miyoshi, Y., Ono, A., Kobayashi, M., Shiragami, C., Hirooka, K., Tsujikawa, A. Retinal Oximetry in a Healthy Japanese Population. PLoS One. 11, (7), 0159650 (2016).
  45. Turksever, C., Orgul, S., Todorova, M. G. Reproducibility of retinal oximetry measurements in healthy and diseased retinas. Acta Ophthalmol. 93, (6), 439-445 (2015).
  46. Sharp, P. F., Manivannan, A., Xu, H., Forrester, J. V. The scanning laser ophthalmoscope-a review of its role in bioscience and medicine. Phys Med Biol. 49, (7), 1085-1096 (2004).
  47. Clermont, A. C., Aiello, L. P., Mori, F., Aiello, L. M., Bursell, S. E. Vascular endothelial growth factor and severity of nonproliferative diabetic retinopathy mediate retinal hemodynamics in vivo: a potential role for vascular endothelial growth factor in the progression of nonproliferative diabetic retinopathy. Am J Ophthalmol. 124, (4), 433-446 (1997).
  48. Nguyen, H. T., et al. Retinal blood flow is increased in type 1 diabetes mellitus patients with advanced stages of retinopathy. BMC Endocr Disord. 16, (1), 25 (2016).
  49. Schumann, J., Orgül, S., Gugleta, K., Dubler, B., Flammer, J. Interocular difference in progression of glaucoma correlates with interocular differences in retrobulbar circulation. Am J Ophthalmol. 129, (6), 728-733 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics