Анализ активности протеинкиназы с радиоактивно меченым АТФ

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Протеинкиназы представляют собой высокоразвитые сигнальные ферменты и каркасы, которые являются критическими для меж- и внутриклеточной передачи сигнала. Мы представляем протокол для измерения активности киназы с использованием радиоактивно меченого аденозинтрифосфата ([γ- 32 P] ATP), надежного метода, помогающего выявлять регуляцию клеточной сигнализации.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Karra, A. S., Stippec, S., Cobb, M. H. Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP. J. Vis. Exp. (123), e55504, doi:10.3791/55504 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Протеинкиназы способны регулировать крупномасштабные клеточные изменения в ответ на сложные массивы раздражителей, и много усилий было направлено на выявление аллостерических деталей их регуляции. Киназы содержат сигнальные сети, дефекты которых часто являются признаками множественных форм рака и связанных с ними заболеваний, что делает платформу для анализа подходящей для манипулирования восходящими регуляторными факторами и валидации реакционных требований, критически важных для поиска улучшенных терапевтических средств. Здесь мы опишем базовый анализ киназы, который может быть легко адаптирован для удовлетворения конкретных экспериментальных вопросов, включая, но не ограничиваясь ими, тестирование эффектов биохимических и фармакологических агентов, генетических манипуляций, таких как мутация и делеция, а также условий культивирования клеток и методов лечения для зондирования Клеточные сигнальные механизмы. В этом анализе используется радиоактивно меченный [γ-32P] АТФ, который позволяет проводить количественные сравнения и четкую визуализацию результатов, и может быть модифицированнымДля использования с иммунопреципитированной или рекомбинантной киназой, специфическими или типизированными субстратами, во всем широком диапазоне условий реакции.

Introduction

Протеинкиназы являются сложными ферментами, критичными для передачи клеточных сигналов в соответствующие реакции 1 . Учитывая их роль в поддержании гомеостаза и предупреждении или развитии болезненных состояний 2 , биохимические методы оценки активности киназы продолжают оставаться мощным инструментом для определения особенностей передачи сигналов эукариот 3 . Хотя стратегии, использующие фосфоспецифические антитела, были в высшей степени информативными с точки зрения измерения влияния различных условий лечения на статус 4 передачи сигнала в клетке, анализ киназы позволяет измерять эффекты различных условий лечения непосредственно в терминах ферментативной активности киназы интерес. Хотя существует несколько вариантов аналогичных анализов, которые не используют радиоактивные материалы 5 , мы по-прежнему полагаемся на этот метод для надежного количественного определения результатов. ТамЯвляются двумя типичными применениями этого анализа, которые являются ценными по различным причинам: анализ иммунопреципитата (IP) киназы ( рисунок 1 ) и анализ рекомбинантной протеинкиназы ( рисунок 2 ).

Анализ киназы IP чрезвычайно полезен для идентификации факторов, способных активировать специфические протеинкиназы, а также для оценки условий ингибирующего лечения. Вкратце, интересующую киназу эпитопа, представляющую интерес, трансфицируют в культивируемые эукариотические клетки, подвергают множеству обработок, иммунопреципитируют и анализируют на способность включать радиоактивно меченный фосфат в модельный субстрат ( например, основной миелиновый белок (MBP)). Анализ киназы IP также может быть выполнен без использования избыточной экспрессии либо путем иммунопреципитации эндогенного белка, либо с использованием любого количества методов редактирования генома. Поскольку лечение проводится в культуре, этот метод может обнаруживать стимуляции, передаваемые через множественные восходящие факторыИли параллельных путей путем считывания in vitro . Одним из основных преимуществ этого метода является то, что он не требует предварительного знания прямых восходящих или нисходящих факторов или сайтов фосфорилирования в нем. Более того, как только определенные субстраты для представляющей интерес киназы были идентифицированы, такой же протокол анализа киназы может быть использован с рекомбинантными компонентами для измерения удельной активности в отношении природных субстратов и идентификации специфических сайтов фосфорилирования в сочетании с масс-спектрометрическим анализом. Сайты, идентифицированные таким образом, могут быть дополнительно подтверждены киназными анализами с использованием субстратных мутантов. Наконец, этот метод можно также использовать для обнаружения и измерения аутофосфорилирования.

Протокол, представленный здесь, предполагает либо оптимизированную схему очистки белка, либо способ трансфекции для экспрессии меченой сродства киназы, представляющей интерес в культивируемых клетках. Для более подробных описаний трансфекции, лизиса, иммунопреципитации и протеиновой очисткиОколей, мы предлагаем сослаться на протоколы Cold Spring Harbor 6 . Для получения дополнительной информации относительно разработки и модификации анализов, пожалуйста, обратитесь к Фосфорилированию белков: Избранные методы в энзимологии 7 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Ресурсы для очистки киназы и общий контур иммунопреципитации

ПРИМЕЧАНИЕ. Киназы, используемые для этого анализа, могут быть получены из иммунопреципитатов культивируемых клеток или с помощью рекомбинантных средств, таких как очистка с аффинной меткой 6 . Ниже приведен общий протокол иммунопреципитации с меченым флагом, который, возможно, придется модифицировать в зависимости от интересующей киназы. Все должно быть на льду, когда это возможно.

  1. Добавить 2 мкл 1 мг / мл антитела к 200 мкл клеточных лизатов (обычно ~ 1 мг / мл общей концентрации белка) и инкубировать при 4 ° С в течение 1 часа при качании.
  2. Промывочный белок Сефарозные шарики 2-3 раза буфером для лизиса (см. Ниже) путем кратковременного прядения при 4 ° С в течение 30 с - 1 мин при 5000 мкг («касание спина»), удаления надосадочной жидкости с помощью пипетки и ресуспендирования гранул в буфере ,
    1. Готовят буфер для лизиса: 50 мМ HEPES pH 7,7, 150 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl 2, 1 мМ ЭГТА, 10% глицерина, 0,2 мМ ортованадата натри, 100 мМ фторида натри, 50 мМ & beta; -глицерофосфата, 0,1% Тритона Х 100 или 0,1% NP-40.
  3. Добавить 30 мкл 50% суспензии белковых сефарозных гранул в буфере для лизиса в лизаты; Инкубировать при 4 ° С в течение 1 часа при качании.
  4. Прикоснитесь к вращению при 4 ° C для осаждения шариков и удаления надосадочной жидкости.
  5. Промывают 3 раза с 1 мл буфера для промывки бусинок (1 М NaCl, 20 мМ Tris, рН 7,4).
  6. Промывают один раз 1x киназным буфером для реакции (10 мМ HEPES pH 8,0, 10 мМ MgCl 2 ). Удалите как можно больше буфера, не удаляя бусы.

2. Инициализация киназных реакций

ПРИМЕЧАНИЕ. Для анализов киназы IP, типичным исходным образцом является ~ 15 мкл нерастворенных гранул. Для анализов рекомбинантной протеинкиназы типичные исходные количества варьируют от 0,1 до 1,0 мкг в 1-10 для конечных объемов реакций 25-50 мкл. Отрегулируйте объемы образца рекомбинантного белкаS должны быть равны буферу, в котором они хранятся до инициализации анализа. При использовании больших количеств киназы, включают белок-носитель, такой как BSA, чтобы помочь в поддержании стабильности белка на время анализа.

  1. Подготовьте 5x киназный реакционный буфер, приведенный ниже:
    50 мМ HEPES, рН 8,0
    50 мМ MgCl 2
    50 мМ бензамидин (ингибитор протеазы)
    50 мМ DTT (восстановитель)
    250 мкМ АТФ (немеченое или «холодное»)
  2. Держите образцы киназы на льду в пробирках по 1,5 мл. Готовят следующую реакционную смесь в отдельных охлажденных пробирках по 1,5 мл:
    21 мкл H 2 O
    6 мкл 5x киназного реакционного буфера
    1 мкл радиоактивно меченного («горячего») АТФ
    2 мкл субстрата (~ 5 мг / мл)
    ПРИМЕЧАНИЕ. Для анализов рекомбинантной киназы объем можно отрегулировать для размещения очищенного белка. Рассчитайте таким образом, чтобы конечный объем реакции составлял 30 мкл. Используйте этот рецепт, чтобы подготовить мастерсмешивание. После получения меченого АТФ разбавить запас в H 2 O до удельной активности 0,01 мКи / мкл до добавления в реакционную смесь.
  3. Для инициализации анализа добавьте всю реакционную смесь к образцу киназы и инкубируйте реакцию при 30 ° С в течение 5 мин-1 ч в зависимости от активности анализируемой киназы.
    ПРИМЕЧАНИЕ. При работе с киназой, активность которой ранее не анализировалась, проведите временной цикл активности киназы с интервалами 5 минут между временными точками.

3. Завершение реакции и SDS-PAGE

  1. Остановите реакцию, добавив лед и добавив 7,5 мкл 5х буфера для образца Laemmli 6 .
  2. Нагрейте при 100 ° C в течение 30 секунд до 2 минут в тепловом блоке.
  3. Коснитесь спина и загрузите 20 мкл на лунку на 10-15% SDS-PAGE gel. Прогоните гель достаточно долго, чтобы отделить киназу и субстрат (обычно 1 час при постоянной мощности 5 Вт). Убедитесь, что гель-аппарат экранирован, чтобы ограничить воздействие 32
  4. Здесь используются самодельные гелевые аппараты, но стандартные коммерчески доступные мини-гели идеально подходят. Используйте размеры следующим образом:
    Гели: ширина 8 см, длина 5,5 см (разрешающая способность), толщина 1,5 мм.
    Комбс: 15 лунок, толщина 1,5 мм, ширина 2,9 мм, глубина 16 мм

4. Окрашивание и сушка геля

Внимание: на всех этапах обязательно снижайте личное облучение до 32 P с помощью радиоактивного экранирования и средств индивидуальной защиты. Для получения дополнительной информации о конкретных шагах, некоторые полезные ссылки включены.

  1. Удалите гель из стеклянных / глиноземных пластин и поместите в 50 мл красителя Кумасси (10% ледяная уксусная кислота, 50% метанол, 0,25% краситель R-250) в течение 1 часа на орбитальном шейкере со скоростью 50 об / мин. Для этого шага используйте контейнер, который немного больше, чем сам гель. 8
  2. Перенесите гель с пятна на фиксирующий раствор (10% ледяной уксусной кислотыГ, 20% метанола) для обесцвечивания. Наносите гель в 600-700 мл фиксирующего раствора в течение ночи на орбитальный шейкер со скоростью 50 об / мин. Поместите кусочки пены или сухие лабораторные салфетки в емкость с гелем для поглощения красителя Кумасси 8 , 9 .
  3. Удалите гель из раствора для фиксации и впитайте в 200 мл метанола в течение 1-2 минут с легким перемешиванием до тех пор, пока гель не станет молочно-белым. Это поможет предотвратить растрескивание во время стадии сушки.
  4. Смочите образец качественной фильтровальной бумаги 14 см х 14 см метанолом и положите на вакуумную сушку слябового геля. Положите гель на переднюю сторону фильтровальной бумаги вверх.
  5. Накройте гель пластиковой пленкой тщательно, чтобы избежать появления морщин и пузырьков воздуха. Выполнить сушилку в течение 1,5 ч при 80 ° С. После того, как вакуум достигнут, откройте крышку и выкачайте любые пузырьки воздуха, если это необходимо, с мягкой резиной.

5. Авторадиограмма и сцинтилляционные подсчеты

  1. Удалить driEd гель и прикрепить маркер autorad, фосфоресцентные правителя или точек на фильтровальной бумаге на стороне геля. Если используются точки, убедитесь, что они имеют асимметричный узор. Это позволит выровнять гель с пленкой после экспозиции и развития.
  2. Используйте счетчик Гейгера, чтобы проверить интенсивность сигнала. Для более слабых сигналов при -70 ° C до -80 ° C с усиливающим экраном повышается плотность пленочной ленты.
  3. В темной комнате поместите высушенный гель в кассету с пленкой и усиленный экран в следующем порядке сверху вниз: гель, пленка, усиливающий экран.
  4. Прикрепите усиливающий экран к крышке кассеты и заклейте гель на место, чтобы сделать этот шаг легче. Усиливающий экран излучает свет при облучении бета-частицами из 32 P. Эти световые излучения проникают в пленку более эффективно, чем бета-частицы.
    1. Удостоверьтесь, что длина волны, испускаемая от усиливающего экрана corresПруды с длиной волны, к которой пленка наиболее чувствительна.
    2. Используйте счетчик Гейгера, чтобы определить, на какое время оставить воздействие: если число отсчетов в минуту составляет ~ 100 или ниже, попробуйте в течение ночи при -70 ° C. Если количество отсчетов составляет ~ 10000, начните с экспозиции 1 час и оптимизируйте оттуда.
  5. По завершении экспозиции удалите пленку и разработайте в медицинском / рентгеновском пленочном процессоре. Если экспозиция была выполнена при температуре от -70 до -80 ° C, либо дайте кассете нагреться до комнатной температуры, чтобы минимизировать конденсацию на пленке, либо удалить пленку непосредственно перед образованием конденсата 10 .
  6. Положите пленку на высушенную гелевую / фильтровальную бумагу и выровняйте изображение метки / точек маркерами / точками на высушенном геле. Отметьте на пленке полосы, соответствующие стандартам белка. Пометьте стандарты белков, и какие полосы реакций предназначены для использования в будущем.
  7. Извлеките полосы из геля, которые соответствуют полосам интереса к фильму, и поместите ихВ 7 мл сцинтилляционных флаконов. Добавьте 4 мл сцинтилляционной жидкости и подсчитайте с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. Подтвердите, что счетчик установлен для контроля правильного окна энергетического спектра на 32 P.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно также вырезать полосу, соответствующую субстрату, из полосы контроля отсутствия киназы. Это будет использоваться для расчета фонового излучения, которое будет вычитаться из всех отсчетов сцинтилляции образца.

6. Анализ результатов

ПРИМЕЧАНИЕ. Авторадиограмма обеспечивает качественную визуализацию результатов. Для точного количественного определения включение 32 P можно измерить с помощью сцинтилляционного счетчика. Данные обычно выражаются в относительной активности, как показано на рисунке 1B . Пока для всех образцов поддерживаются одинаковые условия, относительных измерений удельной активности достаточно для сравнения обработок.

  1. При расчете абсолютных значений удельной активности выполняйте строгостьОптимизация всех условий реакции, включая концентрацию киназы, субстрата и холода АТФ, для обеспечения линейного диапазона активности во времени ( например, 2 x киназа = 2 x удельная активность). Для киназ с высокой удельной активностью проводят анализы с повышенной концентрацией субстрата в случае, если активность киназы ограничена количеством субстрата.
  2. Рассчитать удельную активность интересующей киназы в единицах наномолей фосфата, переносимых в минуту на мг киназы.
    1. Вычитайте пробелы из cpm в подсчитанных диапазонах.
    2. Рассчитайте распад горячего ATP: [(1/2) ^ (t / t 1/2 )] x 0.95, где t - количество дней с контрольной даты (должно быть предоставлено поставщиком), t 1/2 - Период полураспада 32 Р, что составляет 14,3 дня, а 0,95 отражает эффективность сцинтилляционного счетчика. Пример: при использовании горячего ATP, который составляет 28 дней, значение распада должно быть 0.245.
    3. Calc(Обычно это равно количеству холодного АТФ в реакции): объем анализа (мкл) х [холодный АТФ] (мкМ) = общий АТР (пмоль). Пример: 30 мкл × 50 мкМ = 1500 пмоль
    4. Вычислить cpm / pmol ATP: [мкл горячего ATP x (2,2 × 10 7 ) × коэффициент распада] / пмоль холодного АТФ.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Значение 2,2 × 10 7 преобразует 0,01 мКи / мкл АТФ в cpm.
    5. Рассчитать количество киназы в анализе в мг. Как для рекомбинантной киназы, так и для иммунопреципитированных киназ стандартные методы, такие как анализы BCA, подходят для определения исходных концентраций. Пример: wtERK2 0,0002 мкг / мкл в 50 мкл киназной реакции составляет 0,01 мкг или 1 × 10 -5 мг.
    6. Рассчитайте общее количество cpm в анализе. Соберите 30 мкл реакций и запустить 20 мкл от каждой реакции на гель. Умножьте отсчет cpm (после пустого вычитания) коэффициентом суммарного объема анализа / объема. Продолжая вышеупомянутоеНапример, умножьте все значения на 1,5 или 30/20.
    7. Рассчитайте удельную активность анализируемой киназы:
      Общее количество cpm в анализе) / (cpm / pmol ATP) / (время анализа в минутах) / (количество киназы в мг)
      ПРИМЕЧАНИЕ. Разделение вышеуказанного значения на 1000 дает удельную активность в наномолях / минуту / мг
  3. Вычислите, сколько молей фосфата включено в субстрат (если известен его молекулярный вес). Это используется для определения количества фосфозитов на конкретном белке после завершения реакции.
    Общее количество cpm в анализе) / (cpm / pmol ATP)] / (количество субстрата в пмоль)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Анализы киназы IP WNK1

Myc-меченный WNK1 трансфицировали в клетки HEK293 и иммунопреципитировали антителом против Myc11. Иммунопреципитат проявлял киназную активность по отношению к модельному субстрату МВР, а также к себе ( рисунок 1А ). Затем мутанты WNK1 испытывали на киназную активность по отношению к MBP тем же способом, на этот раз с использованием GST-меченых конструкций ( фиг.1B ). Анализ поведения мутантной киназы относительно дикого типа выявил остатки, критические для оптимальной активности WNK1.

Клетки HEK293 подвергали панели фармакологических и биохимических обработок. Используя антитело, полученное против N-концевого пептида WNK1, иммуноосажденную эндогенную киназную активность WNK1 анализировали с использованием MBP в качестве субстрата. Эпидермальный фактор роста (EGF), известный активитИли сигналов ERK1 / 2, нокодазол, препарат, который нацелен на динамику микротрубочек, анизомицин, ингибитор эукариотического трансляции и лизофосфатидную кислоту (LPA), мощный митоген, неспособны вызвать сильное увеличение фосфорилированного MBP. Напротив, NaCl продемонстрировал, что он является регулятором активности WNK1 киназы.

Анализы рекомбинантных протеинкиназ ERK2

Крыса ERK2, несущая N-концевую 6His-метку, экспрессировалась в бактериальных клетках и аффинно очищалась с помощью никелевой смолы 12 . Белок дополнительно очищали ионообменной хроматографией на колонке MonoQ, в которой несколько фракций элюирования испытывали на активность киназы ( фигура 2А ). Поскольку ERK2 требует двойного фосфорилирования MEK для достижения максимальной активности киназы, ERK2, очищенный от бактерий, в отсутствие MEK, в значительной степени неактивен. Поэтому, чтобы проверить доли рекомендацийБинантный ERK2 для активности в отношении MBP, в реакциях киназы включалась конститутивно активная форма MEK1, называемая MEK1R4F. Примечательно, что MEKR4F не обладает высокой активностью киназы на MBP ( рисунок 2 ).

Используя анализ, аналогичный показанному на фиг. 2А , активность киназы МВР использовали для измерения активности мутантов рекомбинантного ERK2, очищенных от бактериальных культур по сравнению с белком дикого типа ( фиг. 2В ). Хотя ERK2 способен фосфорилировать MBP при стимуляции MEKR4F, мутация каталитического лизина (K52R) или треонина, близкая к каноническим сайтам двойного фосфорилирования (T188D и T188E), резко отменяет активность ERK2-киназы. ERK2-T188D и ERK2-T188E проявляют активность маргинальной киназы в отношении небольшого гибкого пептида ( рис. 2C ), однако они неспособны прочно фосфорилировать известные субстраты ERK2 Nup153 и PDX1 ( фиг. 2). D).

Рисунок 1
Рисунок 1: Анализы киназы иммунопреципитации WNK1. ( A ) HEK293 трансфицировали либо pCMV5-Myc без вставки, либо с pCMV5-Myc-WNK1, меченные белки иммунопреципитировали антителом против Myc с последующим анализом киназы с использованием MBP в качестве субстрата. Слева показана авторадиография, а справа - иммуноблот иммунопреципитатов. ( B ) Различные мутантные белки GST-WNK1 использовали в киназных анализах с MBP в качестве субстрата; МВ фосфорилирование выражается как активность по отношению к дикому типу WNK1. ( C ) Эндогенный WNK1 иммунопреципитировался из клеток HEK293, обработанных различными стимулами, и анализировался на аутофосфорилирование. Эта цифра была изменена с Xu et al. , 2000 год 11 .5504fig1large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2: Анализ рекомбинантных протеинкиназ ERK2. ( A ) Очищенные фракции ERK2 из MonoQ-анионообменной колонки использовали в киназном анализе с МВР в присутствии или в отсутствие MEK1R4F, конститутивно активного стимулятора активности ERK2-киназы. ( B ) Мутанты ERK2 тестировали на активность киназы на MBP. ( C ) Мутанты петли активации ERK2-T188D и ERK2-T188E проявляют активность маргинальной киназы в отношении небольшого типизированного пептидного субстрата. ( D ) Сравнение киназных активностей ERK2 или T188D после активации MEK1R4F с известными субстратами ERK2 нуклеопорин-153 (Nup153) и гомеобокс поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки 1 (PDX1). Фосфорилированные субстраты обозначены клиньями и фосфориламиTed ERK2 и T188 с помощью звездочек. Перепечатано (и изменено) с разрешения McReynolds et al. , 2016 год 12 (Copyright American Chemical Society, 2016). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Киназы представляют собой разнообразное семейство белков, которые развили обширную функциональность в многочисленных контекстах, и киназные анализы были невероятно полезны при изучении нескольких сигнальных белков и в значительной степени способствовали нашему текущему пониманию сотовой связи. Примечательно, что тот же основной анализ использовался для характеристики двух разрозненных киназ, несмотря на значительные различия в структуре и активности. Киназа WNK1 содержит нетипичный каталитический карман, в котором критический лизин смещается в уникальное положение и, как известно, играет роль в регуляции катион-хлоридных котранспортеров через функции киназы и леса. Известно, что киназная активность WNK1 характеризуется низким числом оборотов даже на его наиболее хорошо охарактеризованных субстратах, чувствительность к окислительному стрессу белков-киназ 1 (OSR1) и пролиферативная аланин-богатая киназа SPS / STE20 (SPAK). Напротив, ERK2, наряду с близкородственной киназой ERK1, проявляет устойчивую киназную активность при активации 13 , 14 .

Наиболее важным аспектом анализа является реакционная сборка. Для точного измерения временных точек следует уделять особое внимание инициализации киназных реакций. Существует четыре основных требования для проведения киназного анализа: киназа, субстрат, АТФ и ион металла. Для этого протокола, который в основном используется для эукариотических киназ, в качестве источника магния используется MgCl 2 . Как препараты рекомбинантной протеинкиназы, так и IP-киназы обычно содержат магний, что делает MgCl 2 недостаточным в качестве реакционного стартера. Аналогичным образом, добавление немеченого («холодного») АТФ до добавления меченого («горячего») АТФ может инициировать реакцию неуместно рано. Мы рекомендуем готовить реакции с использованием концентрированного киназного реакционного буфера, который облегчает одновременное добавление MgCl

Хотя существует некоторое различие между анализами киназы IP и анализами рекомбинантной протеинкиназы, tЭкспериментальная парадигма, общая для обоих, демонстрирует, насколько универсальным может быть этот анализ. Действительно, бывают случаи, когда свойства обоих типов киназных анализов могут быть смешаны, как, например, с исследованиями сигнального пути киназы с активированным митогеном / MAPK / ERK сигналом. На этом пути ERK1 / 2 активируются двойным фосфорилированием с помощью восходящей факторной киназы MAPK / ERK 1 (MEK1). Предыдущие исследования показали, что, хотя MEK1, а также конститутивно активный мутант, названный MEK1R4F, способен активировать ERK1 / 2, он обладает очень низкой активностью по отношению к MBP. Следовательно, ERK1 / 2, очищенный от бактериальных клеток, проявляет ограниченную киназную активность по отношению к MBP, если не обрабатывать MEK1R4F, создавая надежную платформу для сравнения киназной активности дикого типа ERK1 / 2 с мутантными конструкциями, как показано на рисунке 2 . Включение иммунопреципитированных компонентов может добавить еще больше нюансов, выделяя киназный анализ как высоко адаптируемый метод для исследования многогранного nЭтих важных сигнальных молекул.

В то время как некоторые могут найти работу с радиоактивными материалами громоздкой, количественная трактовка анализа радиоактивно меченых киназ является одним из его основных преимуществ. Однако недавние достижения в области химии натуральных продуктов, геномики и масс-спектрометрии создали спрос на модифицированные киназные анализы С показаниями, более подходящими для приложений с высокой пропускной способностью. 15 . Поскольку эти анализы используют различные материалы для маркировки, компромиссы сделаны с точки зрения точности, но их можно преодолеть, используя радиоактивно меченый анализ для проверки результатов на экране. По мере того, как наше понимание передачи сигналов протеинкиназы возрастает, остается ясным, что методы, способные вычленить особенности регуляторных функций киназы, будут продолжать оказывать помощь в разработке инструментов и методов лечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы выражают благодарность всем нынешним и бывшим сотрудникам лаборатории Кобба за ценную работу и обсуждения, а Дион Уэр - за административную помощь. Эти исследования были поддержаны Национальным институтом здравоохранения Грант R37 DK34128 и грантом Фонда Уэлч I1243 для MHC

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protein A Sepharose CL-4B GE Healthcare Life Sciences 17-0963-03
Radiolabeled [γ-32P] ATP Perkin Elmer NEG035C010MC
Laemmli Buffer Bio-Rad #1610737
Radioactive shielding Research Products International BR-006
R-250 dye (Coomassie) Thermo Fisher 20278
Whatman Grade 3 qualitative filter paper Whatman 1003-917
Slab gel vacuum dryer Bio-Rad Model 583 Gel Dryer #1651745 
Autorad marker Agilent Technologies 420201
Phosphorescent ruler Sigma Aldrich R8133
Phosphorescent dots Sigma Aldrich L5149
Geiger counter Ludlum Model 3 with 44-9 detector
BioMax Cassette 8 x 10" Carestream Health 107 2263
BioMax MS Film 8" x 10" Carestream Health 829 4985
BioMax MS Intensifying Screen 8" x 10" Carestream Health 851 8706
Medical/X-ray film processor Konica Minolta SRX-101A
Scintillation vials Research Products International 125500
Scintillation fluid MP Biomedicals 188245305
Beckman LS 6500 Scintillation counter Beckman LS 6500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26, (22), 3100-3112 (2007).
  2. Wellbrock, C., Arozarena, I. The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer. Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).
  3. Yang, T., Terman, J. R. Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins. Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).
  4. Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases. Biochem J. 366, (Pt 3), 977-981 (2002).
  5. Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction. Bioorg Med Chem. 16, (16), 7788-7794 (2008).
  6. Cold Spring Harbor Protocols. Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2016).
  7. Dalby, K. N. Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology. J Am Chem Soc. 121, (51), 12215 (1999).
  8. Roland, J. Coomassie Staining and Destaining. Available from: http://www.cytographica.com/lab/protocols/gel_destain.html (2007).
  9. Autoradiography. Available from: https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography (2011).
  10. Walker, J. M. The Protein Protocols Handbook. 3 edn, Humana Press. (2009).
  11. Xu, B. WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II. J Biol Chem. 275, (22), 16795-16801 (2000).
  12. McReynolds, A. C. Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding. Biochemistry. 55, (12), 1909-1917 (2016).
  13. Carlson, S. M. Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3. Sci Signal. 4, (196), rs11 (2011).
  14. Courcelles, M. Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions. Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).
  15. Myers, S. M. High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors. ACS Comb Sci. 18, (8), 444-455 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics