रेडियो-लेबल वाली जीटीपी बाइंडिंग के माध्यम से जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर सिग्नलिंग को मापना

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Biochemistry

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Summary

ग्वानोसिन ट्राइफॉस्फेट (जीटीपी) बाध्यकारी जी-प्रोटीन-युग्मित रीसेप्टर (जीपीसीआर) सक्रियण में प्रारंभिक घटनाओं में से एक है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित है कि फ़ार्माकोलॉजिकल तरीके से रेडियो-लेबल वाले जीटीपी एनालॉग, [ 35 एस] गैनोसिन -5'-ओ- (3-थियो) ट्राइफोस्फेट ([ 35 एस] जीटीपीसीएस) के बंधन की निगरानी के द्वारा विशिष्ट जीपीसीआर-लैगंड इंटरैक्शन को चिह्नित किया जाता है। रुचि के लिगेंड की प्रतिक्रिया

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Vasavda, C., Zaccor, N. W., Scherer, P. C., Sumner, C. J., Snyder, S. H. Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding. J. Vis. Exp. (124), e55561, doi:10.3791/55561 (2017).

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Abstract

जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स ( जीपीसीआर ) ट्रांस्मेमेब्रन रिसेप्टर्स के एक बड़े परिवार हैं जो सामान्य सेलुलर फिजियोलॉजी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और एनलसेसिआ, ब्लड प्रेशर विनियमन और मानसिक रोग के उपचार सहित कई संकेतों के लिए एक प्रमुख औषधीय लक्ष्य का गठन करते हैं। लिगंड बंधन पर, जीपीसीआर ने ग्नोसाइन ट्राइफॉस्फेट (जीटीपी) के निगमन को उत्तेजित करके इंट्रासेल्यूलर जी-प्रोटीन्स के सक्रियण को उत्प्रेरित किया। सक्रिय जी प्रोटीन तब संकेतक मार्ग को उत्तेजित करता है जो सेलुलर प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करते हैं। जीपीआरआर सिग्नलिंग को जीटीपी के एक रेडियोलैबैड और गैर-हाइड्रोलाइजनीय फॉर्म को शामिल करके, [ 35 एस] गैनोसिन -5'-ओ- (3-थियो) त्रिफॉस्फेट ([ 35 एस] जीटीपीसीएस) को जी-प्रोटीन में मिलाकर मापा जा सकता है। अन्य तरीकों के विपरीत जो अधिक डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग प्रक्रियाओं का आकलन करते हैं, [ 35 एस] जीपीसीएस बाध्यकारी उपाय जीपीसीआर सिग्नलिंग में एक समीपस्थ घटना को मापते हैं और महत्वपूर्ण रूप से, एगोनिस को भेद कर सकते हैंटीएस, विरोधी, और व्युत्क्रम एगोनिस्ट वर्तमान प्रोटोकॉल जीपीसीआर सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए एक संवेदनशील और विशिष्ट पद्धति की रूपरेखा तैयार करता है, जो कि एक आरपीटीपीआरपीसीआर, μ-opioid रिसेप्टर (एमओआर 1) के क्रूड झिल्ली की तैयारी का उपयोग कर रहा है। हालांकि कोशिकाओं और ऊतकों को भिन्न करने के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण मौजूद हैं, कई लागत-निषेधात्मक, थकाऊ, और / या गैर-मानक प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता होती है। वर्तमान पद्धति एक साधारण प्रक्रिया प्रदान करती है जो कार्यात्मक क्रूड झिल्ली को समृद्ध करती है। एमओआर 1 को अलग करने के बाद, इसके एगोनिस्ट के विभिन्न औषधीय गुणों [डी-एला, एन-मेफे, ग्लाय-ओल] -एकेफेलिन (डैम्गो) और विरोधी, नलोक्सोन, निर्धारित किए गए थे।

Introduction

जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) एनाल्जेसिया, ऑल्फ़ाइज और वर्तन 1 सहित शारीरिक प्रक्रियाओं की उल्लेखनीय सरणी के लिए जिम्मेदार कोशिका-सतह रिसेप्टर्स के एक बड़े परिवार हैं। जीपीसीआर विशिष्ट बाहरी संकेतों को संवेदन करते हुए कार्य करते हैं और बाद में इंटरासेल्युलर सिगनल को उत्तेजित करते हैं। इसलिए वे एक सेल के बाहरी और आंतरिक वातावरण के बीच एक महत्वपूर्ण जंक्शन को चिह्नित करते हैं। जीपीसीआर जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, इसलिए वे दोनों बुनियादी शोध और दवा की खोज 2 , 3 के लिए प्रमुख लक्ष्य बन गए हैं।

असंतोषपूर्ण ligands बाध्य अन्य रिसेप्टर परिवारों के विपरीत, GPCR बहुत अलग प्रकार के अणुओं बाध्य कर सकते हैं। जबकि एक जीपीसीआर पेप्टाइड्स के साथ बातचीत कर सकता है, एक अन्य फोटॉन, छोटे अणुओं, या आयन 1 , 4 को समझ सकता है। जबकि उनके ligands विविध हैं, GPCR अपने समग्र वास्तुकार में एकीकृत कर रहे हैंUre और फ़ंक्शन व्यक्तिगत जीपीसीआर बाहरी एल्यूमीनियम टर्मिनलों और इंट्रासेल्युलर कार्बोक्ज़िल टर्मिनल 5 , 6 के साथ सात α-पेचिक ट्रान्समीटरब्रेन प्रोटीन से बना है। जीसीपीसीआर को इंट्रासेल्युल्युलर जी-प्रोटीन से जोड़ा जाता है- हेरोटेरमरिक प्रोटीन कॉम्प्लेक्स, जो कि α, β और γ सबुनेट्स से बने होते हैं-जो विविध सिग्नलिंग पाथवे 7 की मध्यस्थता करते हैं। जी α सबुनेट एक ग्वानिन न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग प्रोटीन है, जो कि जब गुआनोसिन डीफोसफेट (जीडीपी) से जुड़ा हुआ है और सक्रिय होता है, तब वह गनोसिन ट्राइफॉस्फेट (जीटीपी) 8 , 9 के लिए बाध्य होता है। जब जीपीसीआर उनके लिंगों को बाँधते हैं, तो वे एक गठनात्मक परिवर्तन से गुजरते हैं जो जी βγ से अलग होने के लिए जी α को अनुमति देता है, जिससे जी-डीटी 7 के लिए जीडीपी का आदान-प्रदान करने की अनुमति देता है। रिसेप्टर ही अपने कार्बोक्जिल टर्मिनल पर विभिन्न सरीन / थ्रेऑन द्वारा फॉस्फोरिलेटेड है10 , 11 के अंतराल में और रिसेप्टर सिग्नल को एएनएन्यूएट करने के लिए आंतरिक , 12 , 13 , 14 । इस बीच, सक्रिय जी α मोनोमर और जी βγ डिमर विशिष्ट संकेत मार्गों को सक्रिय करने के लिए आगे बढ़ते हैं 7 । प्रत्येक जी प्रोटीन सबयूनेट के कई आइसफॉर्म हैं, और प्रत्येक आइसफोर्म विशेष रूप से डाउनस्ट्रीम पथ और द्वितीयक दूत सिस्टम को लक्षित करता है। प्रमुख जी α इफॉर्मस में जी एस , जी क्यू , जी आई / ओ और जी 12-13 शामिल हैं । आमतौर पर, व्यक्तिगत जीपीसीआर एक विशिष्ट जी α आइफोरम के साथ संबद्ध होते हैं, जिससे एक विशिष्ट सेलुलर प्रतिक्रिया 1 के लिए बाहरी उत्तेजना जोड़ता है।

जीपीसीआर-लैगंड इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए रिसेप्टर की जीव विज्ञान को समझना महत्वपूर्ण है। जीडीपी / जीटीपी विनिमय जल्द से जल्द पूर्व संध्या में से एक हैएनटीएस जो लिगंड बाइंडिंग का अनुसरण करता है, जीटीपी बाध्यकारी निगरानी जीपीसीआर सक्रियण या अवरोध को माप सकता है। जीपीसीआर सिग्नलिंग में अधिक डाउनस्ट्रीम की घटनाओं का आकलन अक्सर मात्रात्मक या स्टोइकीओमेट्रिक के रूप में नहीं होता है, जो आंशिक लोगों से पूर्ण एगोनिस्टों को अलग नहीं कर सकते हैं, और महंगी अभिकर्मकों की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, जीटीपी प्रोटीन के लिए जीटीपी बढ़ाकर जीपीसीआर सक्रियण के बाद एक लगभग सार्वभौमिक घटना है, जिसका अर्थ है कि जीपीसी बंधन को मापने के लिए अधिकांश जीपीसीआर की गतिविधि की निगरानी के लिए एक व्यापक रूप से लागू परख है। GTP बाइंडिंग को मापना एक सरल और तेजी से दृष्टिकोण है जो जीपीसीआर संकेतों को ब्याज के रिसेप्टर या देशी ऊतक में अत्यधिक से छूने वाले कोशिकाओं में निगरानी करता है। जीपीसीआर सिग्नलिंग पर एगोनिस्ट और एंटीजनिस्ट की गतिविधि का मात्रात्मक निर्धारण करने के लिए, वर्तमान प्रोटोकॉल एक आरम्भिक जीपीसीआर, μ-opioid रिसेप्टर (एमओआर 1) के प्रयोग से कार्यात्मक जीटीपी बाध्यकारी परख का विवरण देता है।

यह प्रोटोकॉल पहले बताता है कि कैसे मरो 1 से अधिक कोशिकाओं से कच्चे झिल्ली को अलग करने के लिए। ध्यान दें थायह प्रोटोकॉल ओवरेक्सेशन सिस्टम तक ही सीमित नहीं है और झिल्ली के कई स्रोतों पर लागू किया जा सकता है, जिसमें मूल ऊतक या तैयारी कई रिसेप्टर्स और जी प्रोटीन 15 व्यक्त करते हैं। प्रोटोकॉल तो विवरण देता है कि [डी-एला, एन-मेफे, गली-ओल] -एकेफेलिन (डैम्गो) या नलोॉक्सोन, एक एमओआर 1 एगोनिस्ट और विरोधी, की अलग-अलग सांद्रता के जवाब में इन झिल्ली को रेडियोधर्मी GTP एनालॉग के बंधन को मापने का तरीका बताया गया है, क्रमशः। जीटीपी एनालॉग, [ 35 एस] गैनोसिन -5'-ओ- (3-थियो) ट्राइफॉस्फेट ([ 35 एस] जीटीपीसीएस) गैर-हाइड्रोलाइजबल है। यह प्रॉपर्टी महत्वपूर्ण है क्योंकि जी α सब्यूनिट्स आंतरिक जीटीपेज गतिविधि 7 प्रदर्शित करती है और हाइड्रोलाइज़ेबल जीटीपी रेडियोोकैमिकल पर लेबल वाले गामा फॉस्फेट को समाप्त कर देगा। झिल्ली तब गिलास फाइबर फिल्टर पर फंसे जाते हैं और धोया जाता है, जिसके बाद रेडियोलैबैलेटेड जीटीपी तरल जगमगाहट की गिनती द्वारा निर्धारित किया जाता है। कई औषधीय मानकों को कैरेक्टर में लिया जा सकता हैएगोनिस्टों के लिए आधे-अधिकतम प्रतिक्रिया (ईसी 50 ) और हिल गुणांक (एन एच ) और आधे से अधिक अवरोधक एकाग्रता (आईसी 50 ) और विरोधी के लिए संतुलन विस्थापन निरंतर (के बी ) सहित रिसेप्टर-लैगंड इंटरैक्शन 16 , 17 , 18

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Protocol

संवर्धित कोशिकाओं में पुनः संयोजक एचए-मोर 1 की अभिव्यक्ति

नोट: एक बाँझ लामिना का प्रवाह हुड में सभी सेल संस्कृति प्रोटोकॉल का पालन करें।

  1. 70% इथेनॉल के साथ सेल संस्कृति लामिना का प्रवाह हुड जीवाणु और सेल संस्कृति भर में बाँझ तकनीक को बनाए रखें।
  2. डेलबेको के संशोधित ईगल मध्यम (डीएमईएम) को मानव भ्रूणिक गुर्दा कोशिकाओं को 293 (एचईके 2 9 3) सेल संस्कृति माध्यम से तैयार करें: डीएमईएम, पीएच 7.4, 2 मिमी एल-ग्लूटामाइन, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) )।
  3. प्लेट 2.5 एक्स 10 6 एचईके 2 9 3 कोशिकाओं को 10 सेमी टिशू कल्चर प्लेट पर पूर्ण डीएमईएम में 10 मिलीलीटर और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में 70-80% तक पहुंचने तक (ओ / एन) तक पहुंचने पर।
    नोट: पूर्ण जीटीपी बाइंडिंग प्रयोग के लिए पर्याप्त प्रोटीन इकट्ठा करने के लिए, कोशिकाओं के कम से कम 3 x 10 सेमी प्लेट प्लेट।
  4. चुनाव के अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग करके और 'निर्माता'; दिशा निर्देश 36-48 घंटे के लिए सेते हैं
    नोट: मानव एमओआर-1 सीडीएनए (एनसीबीआई संदर्भ अनुक्रम: एनएम_000 9 14.4) गावरल पास्टरकर से एक उदार उपहार था और इसे पीसीएमवी-एचए में क्लोन किया गया था।

2. सेल फैलाव और झिल्ली संग्रह

  1. निम्न lysis बफ़र्स तैयार करें:
    1. बफर 1: 10 मिमी 4- (2-हाइड्रोक्सिथाइल) -1-पिपरीसिथेनसल्फोनिक एसिड (एचईपीईएस), पीएच 7.4; 1 मिमी एथिलीन ग्लाइकॉल-बीआईएस (बी-एमिनोथिल ईथर) -एन, एन, एन ', एन-टेट्राएसेटिक एसिड (ईजीटीए); 10% सूक्रोज; प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल; और 1 एमएम डेथियोथरेइटोल (डीटीटी) झिल्ली अलगाव के दिन डीटीटी ताजा जोड़ें।
    2. बफर 2: 10 मिमी एचईपीईएस, पीएच 7.4; 1 मिमी ईजीटीए; 1 मिमी एमजीएल 2 ; और 1 मिमी डीटीटी झिल्ली अलगाव के दिन डीटीटी ताजा जोड़ें।
  2. इनक्यूबेटर (चरण 1.4) से ट्रांसफ़ेक्ट की गई कोशिकाओं को निकालें, माध्यम का महाप्राणण करें, और 5 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को कुल्ला। पीबीएस की तरक्की और अतिरिक्त तरल सेथाली।
  3. कोशिकाओं में 600 μL बफर 1 जोड़ें। सेल खुरचनी का प्रयोग, प्लेट की सतह से कोशिकाओं को हटा दें और सेल निलंबन को 1.6 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में विंदित करें।
  4. तरल नाइट्रोजन में माइक्रोप्रतिग्यूज ट्यूब को तुरन्त स्नैप-फ्रीज करें। नमूनों को जमी जाने के बाद, lysates को बर्फ पर पिघलना या उन्हें लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  5. कोशिकाओं के सभी प्लेटों के साथ चरण 2.3 और 2.4 दोहराएं।
  6. एक बार lysates thawed है, कोशिकाओं को तोड़ने के लिए एक एकल पल्स सूक्ष्म ट्यूब homogenizer का उपयोग करें। 10 एस के लिए 3-5 बार होमोजीज़रेटर पल्स, 30 सेकंड के दालों के बीच में बर्फ पर ट्यूब वापस लाएं।
    1. पूरे सेल अंश के रूप में 20 μL लीजिए
  7. शेष नमूने को 1000 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें सतह पर तैरनेवाला लीजिए और बर्फ पर एक नई 1.6 एमएल माइक्रोसॉसिटर्यूज ट्यूब में जगह ले लीजिए।
  8. बफर 1 के 100 μL में गोली resuspend और एक मूसल के साथ rehomogenize। पल्स द होमो5 एस के लिए 3 से 5 बार उत्प्रेरक, दाल के बीच 30 एस के लिए बर्फ पर ट्यूब को वापस रखकर।
    1. 1000 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए दूसरी बार नमूना बढ़ाएं चरण 2.7 से सतह पर तैरने वाले के साथ सतह पर तैरनेवाला को मिलाएं।
      नोट: शेष गोली में परमाणु और झिल्ली प्रोटीन होते हैं
  9. 20 मिनट के लिए 11,000 xg और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए संयुक्त supernatants अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला (साइटोसोलिक अंश) को एक नया 1.6 एमएल माइक्रोसेंट्रफ़्यूज ट्यूब में अलग करें।
  10. 200 μL बफर में गोली को दोबारा खोलें। इसे 3-5 बार ट्रिटेट करके गोली को होमोजीएज करें। नमूना 20 मिनट 21,100 xg और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला Aspirate 50 μL बफर 2 में क्रूड झिल्ली अंश युक्त गोली को फिर से फिर से खोलें।
  11. तत्काल तरल नाइट्रोजन में GTPγS बाइंडिंग प्रयोग (खंड 3) या स्नैप-फ़्रीज पर जाएं और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. [ 35 एस] GTPγS बाइंडिंग नोट: [ 35 एस] GTPγS को संभालने और [ 35 एस] GTPγS बाइंडिंग प्रयोगों को नियंत्रित करते समय मानक रेडोकैमिकल सुरक्षा प्रोटोकॉल का उपयोग करें। हर समय सुरक्षात्मक दस्ताने और प्रयोगशाला कोट पहनें लीक या दरार के लिए पैकेजिंग सामग्री की जांच करें संस्थागत प्रोटोकॉल के अनुसार बेकार और अतिरिक्त अभिकर्मकों का निपटान

  1. 50 मिमी एचईपीईएस, पीएच 7.4 का मिश्रण करके अपूर्ण बाध्यकारी बफर (आईबीबी) तैयार करें; 5 मिमी एमजीक्ल 2; 100 मिमी NaCl; और आसुत पानी में 1 एमएम एथिलीनएमेनेटेटेट्रैसिटिक एसिड (ईडीटीए)
  2. 10 एमएम त्रिश-एचसीएल, पीएच 7.6, और 10 मिमी डीटीटी में 50 एनएम तक स्टॉक [ 35 एस] जीटीपीसीएस को पतला करें। 500 μL aliquots बनाओ और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें प्रयोग की शुरूआत करने से पहले केवल एक ताजा थका हुआ विभाज्य का उपयोग करें। बर्फ पर aliquots पिघलना
  3. 10 मिमी के स्टॉक एकाग्रता के लिए शुद्ध पानी के 177.62 μL में 1 मिलीग्राम जीटीपीपीएस पाउडर को भंग करके गैर-डीआरडीओ लेबल वाले जीटीपीपीएस तैयार करें। 10-μL aliquots बनाओ और उन्हें स्टोर करें-20 डिग्री सेल्सियस
  4. 1 एमएम डीटीटी, 0.1% (वाइट / वॉल्यूम) गोजातीय सीरम एल्बूमिन (बीएसए), 10 माइक्रोग्राम जीडीपी और 0.1 एनएम [ 35 एस] जीटीपीपीएस की अंतिम एकाग्रता को शामिल करने के लिए आईबीबी को पूरक करके पूर्ण बंधन बफर (सीबीबी) तैयार करें।
    नोट: सीबीबी में अब रेडियोलैलेब्ड जीटीपी शामिल है। रेडियोधर्मी समाधानों के साथ काम करते समय उचित सुरक्षा सावधानी बरतें।
  5. बर्फ पर कदम 2.11 से झिल्ली अंश पिघलना।
  6. 595 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख के माध्यम से झिल्ली अंश के प्रोटीन एकाग्रता को बढ़ाएं।
    1. 0, 250, 500, 750, 1,500, 2,500 और 5,000 माइक्रोग्राम / एमएल के अंतिम सांद्रता पर, बफर 2 के साथ बीएसए प्रोटीन मानकों की एक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला तैयार करें।
    2. क्यूवेट में ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक के 1 एमएल के प्रत्येक मानक या झिल्ली के 2 μL जोड़ें। भंवर द्वारा अच्छी तरह मिक्स करें।
    3. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर को 595 एनएम की तरंग दैर्ध्य में समायोजित करें और क्यूवेट का उपयोग 0 माइक्रोग्राम / एमएल प्रोटीन के साथ रिक्त करें।
    4. 5 मिनट और आर प्रतीक्षा करें595 एनएम तरंग दैर्ध्य में प्रत्येक मानकों और नमूने के प्रत्येक नमूने
    5. एकाग्रता की बनाम मानकों के अवशोषण का प्लॉट करें। बियर-लैंबर्ट कानून (ए = εcl, जहां ε = विलोपन गुणांक, एल = क्यूवेट की लंबाई, और सी = एकाग्रता) का प्रयोग करना, झिल्ली नमूनों की एकाग्रता की गणना करना।
  7. आईबीबी में 100 माइक्रोग्राम प्रोटीन / एमएल की एकाग्रता में झिल्ली के अंश को पतला करें।
    नोट: HEK293 कोशिकाओं का एक 10 सेमी डिश आम तौर पर 1 और 3 मिलीग्राम प्रोटीन / एमएल के बीच पैदा होता है
  8. व्यक्तिगत 1.6 एमएल माइक्रोसेंटप्रूफ्यूज ट्यूबों में निम्नलिखित प्रायोगिक स्थितियों को तैयार करें: एक लिगेंड डिलीशुशन श्रृंखला, बेसल जीटीपी बाइंडिंग को मापने के लिए एक मूल गतिविधि की स्थिति और गैर-विशिष्ट जीटीपी बाइंडिंग को मापने के लिए एक गैर-विशिष्ट बाध्यकारी स्थिति।
    1. लिगंड कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला के लिए, सीबीबी के 100 μL की अंतिम मात्रा में ब्याज के लिगैंड की एक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला तैयार करें। लीगैंड सीरीज को 2x में वांछित अंतिम ध्यान केंद्रित करेंऑन। पर्याप्त मात्रा में प्रतिक्रियाओं को कवर करने के लिए लिगेंड सांद्रता को स्थान दें
      1. एमएआर 1 के माध्यम से जीटीपी बंधन पर दमोवो के प्रभाव परखखने के लिए, 2 एमएम, 200 माइक्रोग्राम, 20 माइक्रोग्राम, 2 माइक्रोग्राम, 200 एनएम, 20 एनएम, 2 एनएम, 200 पीएम, 20 पीएम, और सीबीबी में 2 पीएम (अंतिम मात्रा: 100 μL)
        नोट: उदाहरण के लिए, यदि ब्याज के लिगैंड में 10 माइक्रोन के अपेक्षित ईसी 50 मूल्य हैं, तो 200 एनएम, 2 माइक्रोग्राम, 20 माइक्रोग्राम, 200 माइक्रोन और 2 एमएम के लिगंड dilutions तैयार करें। इन पांच स्थितियों में सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला को कवर किया गया है और परख के लिए वांछित एकाग्रता 2x है।
    2. बेसल बंधन के लिए, केवल 100 μL सीबीबी के साथ एक ट्यूब तैयार करें
    3. गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के लिए, 1 एमएल के 2 एमएम गैररेडियो-लेबल वाले जीटीपीपीएस के पूरक के साथ 99 μL सीबीबी के साथ एक ट्यूब तैयार करें।
  9. प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति में पतला झिल्ली समाधान (चरण 3.7) के 100 μL जोड़ें।
  10. विभिन्न प्रयोगों के साथ झिल्ली को सेते हैंथर्मोमिक्सर में या कक्षीय प्रकार के बरतन पर 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 1.6 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में आंत्र स्थितियां।

4. झिल्ली निस्पंदन

  1. 50 एमएम त्रिशो-एचसीएल, पीएच 7.4 को जोड़कर वॉश बफर तैयार करें; 5 मिमी एमजीएल 2 ; और आसुत पानी में 50 मिमी NaCl
  2. 10 मिनट के लिए पानी में ग्लास फाइबर फिल्टर को प्रीसोक करें
    नोट: फ़िल्टर में 1 सुक्ष्ममापी, 2.1 सेमी का एक व्यास, और 675 माइक्रोन की मोटाई है।
  3. थर्मोमिक्सर या कक्षीय प्रकार के बरतन से नमूनों को निकालें (चरण 3.10)। संक्षेप में ट्यूब के नीचे प्रत्येक नमूना एकत्र करने के लिए 5 एस के नमूनों को पल्स-स्पिन करें।
  4. वैक्यूम निस्पंदन उपकरण के ढक्कन को निकालें। उपकरण के वैक्यूम बंदरगाहों पर presoaked फिल्टर रखो। एक वैक्यूम मुहर बनाने के लिए उपकरण ढक्कन फिर से सुरक्षित करें। वैक्यूम चालू करें
  5. ट्यूब पर / / या pipet से सोखना से सोखना से त्रुटि को कम करने के लिए फिल्टर पर 200 μL प्रयोगात्मक हालत के 195 μL पिपेटटिंग।
  6. 1 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे धो बफर के साथ फिल्टर को तीन बार धो लें।

5. तरल छिद्रण गिनती

  1. एक गिनती रैक में शीशियों की 5 मिलीलीटर गिनती कीजिए। प्रत्येक शीशी के लिए 5 एमएल सीनैंटिलेशन तरल जोड़ें।
  2. वैक्यूम बंद करें (चरण 4.4)। वैक्यूम निस्पंदन उपकरण के ढक्कन को निकालें। चिमटी का उपयोग करके, निस्पंदन उपकरण के वैक्यूम बंदरगाहों से फिल्टर उठाएं और प्रत्येक फ़िल्टर को व्यक्तिगत 5 एमएल स्क्रैंटलेशन शीशी में छोड़ दें।
  3. अधिकतम संकेत निर्धारित करने के लिए सीबीबी के 195 μL के साथ एक शीशी तैयार करें।
  4. प्रत्येक शीशी को सुरक्षित रूप से कैप करें 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर शीशियों सेते हैं
  5. जगमगाहट काउंटर चालू करें स्प्रिंटिलेशन काउंटर को मानक जुड़े स्किन्तिशन प्रोग्राम का उपयोग करके 5 मिनट प्रति नमूना के लिए 35 एस आइसोटोप उत्सर्जन को मापने के लिए कार्यक्रम।
  6. एक गिनती लेने के लिए "प्रारंभ" दबाएं
  7. जब गिनती की जाती है, तो गिनी हुई शीशी का निपटारा करेंखतरनाक अपशिष्ट के रूप में

6. डेटा विश्लेषण

  1. आंकड़ों और विश्लेषण सॉफ्टवेयर में डेटा दर्ज करें
    1. विशिष्ट बाध्यकारी निर्धारित करने के लिए प्रत्येक अन्य माप से गैर-विशिष्ट बाध्यकारी घटाएं।
      नोट: गैर-विशिष्ट बाध्यकारी की डिग्री गैर-रेडियोलैबैटेड जीटीपीएसएस (चरण 3.8.3) से युक्त नमूना द्वारा निर्धारित की जाती है।
    2. आँकड़े और विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें और एक XY डेटासेट प्रविष्टि चुनें।
    3. आंकड़ों और विश्लेषण सॉफ्टवेयर में डेटा सारणी में [ 35 एस] GTPγS- बाध्य प्रयोगों से विशिष्ट बाध्यकारी डेटा दर्ज करें। "एक्स" कॉलम में दाढ़ी सांद्रता के रूप में एगोनिस्ट सांद्रता दर्ज करें। "Y" मानों के रूप में संबद्ध 35 एस गणना दर्ज करें
  2. डेटा को ट्रांसफ़ॉर्म करें
    1. "विश्लेषण करें" पर क्लिक करके अपने संबंधित लघुगणक में एक्स मानों को परिवर्तित करें। बिल्ट-आई से "ट्रांसफ़ॉर्म" चुनेंएन विश्लेषण करती है
    2. "ट्रांसफ़ॉर्म" डायलॉग बॉक्स के भीतर, "का उपयोग करके एक्स मान को ट्रांसफ़ॉर्म करें" चुनें और "एक्स = लॉग (एक्स)" फ़ंक्शन का चयन करें। परिणाम के एक नए ग्राफ़ को चुनें।
    3. ओके पर क्लिक करें।"
  3. वाई-मानों को सामान्य बनाएं
    1. प्रदर्शित परिणाम के साथ, "विश्लेषण करें" पर क्लिक करें। अंतर्निहित विश्लेषण से "सामान्यीकृत" चुनें
    2. "सामान्यीकृत" संवाद बॉक्स में, "प्रत्येक डेटा सेट में सबसे छोटा मान" के रूप में 0% को परिभाषित करने के लिए रेडियो बटन चुनें और 100% "प्रत्येक डेटा सेट में सबसे बड़ा मान" के रूप में चुनें। परिणामों को प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत करने के लिए बॉक्स का चयन करें परिणामों का नया ग्राफ़ बनाने के लिए बॉक्स का चयन करें।
    3. ओके पर क्लिक करें।"
  4. एक गैर-रेखीय प्रतिगमन प्लॉट किए गए डेटा में घटता है। एक गैर-रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण करें
    1. प्रदर्शित सामान्यीकृत परिणाम के साथ, "विश्लेषण करें" पर क्लिक करें। अंतर्निहित विश्लेषण से, "गैर-रेखीय प्रतिगमन (वक्र फिट)" का चयन करें।
    2. यदि किसी एंजोनिस्ट की जांच कर रहा है, तो संवाद बॉक्स से "लॉग (एगोनिस्ट) बनाम सामान्यीकृत प्रतिसाद - चर ढलान" का चयन करें।
    3. यदि एक विरोधी की जांच कर रहा है, तो "डायलॉग बॉक्स से लॉग इन करें (विरोधी) बनाम सामान्यीकृत प्रतिक्रिया - चर ढलान" चुनें
    4. ओके पर क्लिक करें।"
  5. यह सुनिश्चित करने के लिए ग्राफ और परिणाम की समीक्षा करें कि फिट और डेटा उचित अनुबंध में हैं। सुनिश्चित करें कि प्रतिगमन प्लॉट किए गए डेटा के सामान्य पैटर्न से मेल खाता है और शेष अवशेष इतनी बड़ी नहीं हैं कि वे खुराक-प्रतिक्रिया वक्र फ्लैट प्रस्तुत करते हैं।
    नोट: सॉफ्टवेयर गैर-रेखीय प्रतिगमन के परिणामों को संक्षेप में प्रस्तुत करेगा और उस सांद्रता का विवरण देगा जो आधे-अधिकतम प्रतिक्रिया (ईसी 50 ), हिल गुणांक (एन एच ), और आधे-अधिकतम अवरोधक एकाग्रता (आईसी 50 ) को दर्शाता है।
  6. एगोनिस्ट / प्रतिपक्षी पैरामीटर क्षमता प्राप्त करें
    1. एगोनिस्ट एसयूवी को प्राप्त करें16 , 17 , 18 के निम्न प्रयोगों में से किसी से यिलब्रिअम विस्थापन स्थिरांक (के बी )
      1. प्रतिपक्ष की एक निश्चित एकाग्रता के साथ प्रतिस्पर्धा में एक एगोनिस्ट की खुराक-प्रतिक्रिया में बदलाव का आकलन करें यहां, ईसी 50 '= ईसी 50 (1 + [शत्रुवादी] / प्रतिपक्षी केबी), जहां चुनाव आयोग 50 ' सही-स्थानांतरित ईसी 50 है
      2. एगोनिस्ट की एक निश्चित एकाग्रता के साथ प्रतिस्पर्धा में प्रतिपक्ष के विभिन्न सांद्रता के साथ बाध्यकारी [ 35 एस] GTPγS का आकलन करें। यहां, के बी = आईसी 50 / (2 + ([एगोनिस्ट] / एजोनिस्ट एसी 50 ) एन ) 1 / एन -1, जहां एन एगोनिस्ट का हिल गुणांक है।
  7. डेटा की परिवर्तनशीलता पर निर्भर करते हुए प्रत्येक लैगंद के लिए लगभग 3-5 बार प्रयोग (3। 8-5.6 कदम) दोहराएं और आँकड़े और विश्लेषण का उपयोग करके परिणामों को औसत करें।रहे।

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Representative Results

कोशिका विभाजन का उपयोग साइटोसोलिक और परमाणु प्रोटीन से झिल्ली से जुड़े प्रोटीन को अलग और समृद्ध करने के लिए किया जा सकता है। चित्रा 1 चित्रा 1 एक पश्चिमी धब्बा है जिसमें तीन प्राथमिक अंशों की सामग्री का प्रदर्शन किया गया है जो सबसेलुलर फ्रेक्चरेशन प्रक्रिया के दौरान एकत्र किया जा सकता है। विशेष रूप से, चित्रा 1 से पता चलता है कि विभेदण हिस्टोन एच 2 बी और ग्लिसराइडहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (जीएपीडीएच), परमाणु प्रोटीन और साइटोसोलिक प्रोटीन से झिल्ली प्रोटीन ( यानी ना + / के + एटीपेज, प्रोटीन डाइसल्फ़ाइड आइसोमरेज़ (पीडीआई) और एचए-मॉर 1) को अलग से अलग करता है, क्रमशः। इसके अतिरिक्त, चित्रा 1 में विभाजन के परिणामस्वरूप उनके संबंधित subcellular अंशों में प्रोटीन (लेन लेन 4 की तुलना में लेन 1) के संवर्धन को दर्शाता है। एक प्रतिनिधि पोंसेउ दाग प्रत्येक अंश में समान प्रोटीन लोडिंग दर्शाता है यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस फ्रैक्टिओशन प्रोटोकॉल अलग सेलुलर झिल्ली के बीच अंतर नहीं है पीडीआई आम तौर पर एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) के लिए स्थानीयकृत है, जबकि ना + / के + एटपेज मुख्य रूप से प्लाज्मा झिल्ली पर है। हालांकि, दोनों प्रोटीन अंतिम क्रूड झिल्ली अंश ( चित्रा 1 , लेन 4) में मौजूद हैं। इसके अतिरिक्त, जबकि यह प्रोटोकॉल साइटोसॉलिक और अंतिम झिल्ली अंश ( चित्रा 1 , लेन 2-4) से परमाणु प्रोटीन को मजबूती से अलग करता है, परमाणु प्रोटीन के लिए समृद्ध अंश में संभवतः ईआर से कुछ झिल्ली प्रोटीन ( चित्रा 1 , लेन 2) शामिल हैं।

जीपीसीआर-बाइंडिंग प्रयोगों ( तालिका 1 ) के माध्यम से एक जीपीसीआर-लैगंड इंटरैक्शन को चिह्नित करने के लिए कई औषधीय पैरामीटर प्राप्त किए जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, आंशिक प्रतिक्रिया (ईसी 50 ) और एक एंजोनिस्ट के हिल गुणांक (एन एच ) में जीटीपी बंधन की निगरानी द्वारा प्राप्त किया जा सकता हैएगोनिस्ट की अलग-अलग खुराक के जवाब चित्रा 3 ए DAMGO उपचार के बाद खुराक-उत्तरदायी जीटीपी MOR1 को बाध्यकारी दर्शाता है। जब डेटा चार-पैरामीटर नॉन-लाइनिंग प्रतिगमन के लिए फिट होता है, तो फिट 185 ± 23 एनएम के एक ईसी 50 और 0.46 ± 0.06 के एक हिल गुणांक के साथ एक रिसेप्टर-लैगंड इंटरैक्शन का वर्णन करता है। DAMGO उपचार के बाद उथले जीटीपी बाध्यकारी वक्र मनाया जाता है जो दमगो और मोर 1 के बीच नकारात्मक सहकारीता का सुझाव देता है। यह विधि एक विरोधी के फ़ार्माकोलॉजी की पहचान और वर्णन भी कर सकती है। जैसा कि चित्रा 3 ए और बी दिखाता है, नलोक्सोन एक एमओआर 1 विरोधी है। नीलॉक्सोन की एगोनिस्ट पावर (के बी ), 97 ± 20 एनएम, का निर्धारण किया गया था, जिसमें नामोकोन की एकाग्रता के साथ-साथ दामगो ( चित्रा 3 ए ) की एक निश्चित एकाग्रता के साथ अलग-अलग होता है। नलोक्सोन ने 0.88 ± 0.06 की एक हिल गुणांक का प्रदर्शन किया, जिसमें नलोक्सोन और मोर 1 के बीच स्वतंत्र बंधन का सुझाव दिया गया। अगर एसीएक लिगंड का आभास अज्ञात है, यह परख एक एगोनिस्ट, प्रतिपक्षी, और व्युत्क्रम एगोनिस्ट के बीच भेद कर सकता है। यदि लिगंड एक पीड़ित व्यक्ति है, तो डीएमपी बाइंडिंग में वृद्धि होगी, जैसा कि चित्रा 3 ए में , डेमोगो आवेदन के बाद। अगर लिगंड एक व्युत्क्रम एगोनिस्ट है, तो मूल बाध्यकारी के मुताबिक जीटीपी की बाध्यता कम हो जाएगी। यदि लिगंड एक प्रतिद्वंदी है, तो अकेले अकेले लिगेंड के साथ इलाज पर कोई असर नहीं होगा। यदि एगोनिस्ट के साथ अनुरुप रूप से लागू किया जाता है, तो एक प्रतिद्वंदी एगोनिस्ट की क्षमता को जीटीपी बाइंडिंग को प्रोत्साहित करने में बाधा डालता है। चित्रा 3 ए एगोनिस्ट डेमोगो के खिलाफ नालॉक्सन की प्रतिपक्ष गतिविधि को दर्शाता है।

आकृति 1
चित्रा 1: सेलुलर फ़्रेक्शनिशन झिल्ली से जुड़े, परमाणु और साइटोसॉलिक प्रोटीन को अलग करता है। ( शीर्ष ) लेन 1 का प्रतिनिधित्व करता हैपूरे सेल में मौजूद प्रोटीन लेन 2 में पहले सेंट्रीफ्यूगेशन स्टेप्स के दौरान पृथक परमाणु और झिल्ली-संबंधित प्रोटीन शामिल हैं। लेन 3 साइटोसॉलिक अंश 11,000 x जी पर 20 मिनट के केन्द्रोत्सर्जन के बाद अलग है। लेन 4 में एक क्रूड झिल्ली अंश शामिल है जो [ 35 एस] जीटीपीपीएस-बाइंडिंग प्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं। ( नीचे ) पश्चिमी झिल्ली के पोंसेउ दाग प्रत्येक सेलुलर अंश के लिए प्रोटीन लोडिंग दर्शाता है निम्नलिखित एंटीबॉडी का उपयोग इम्यूनोब्लॉटिंग के लिए किया गया था: माउस एटी-ना + / के + -एटपाज़ (1: 1,000), माउस एंटी-जीएपीडीएच (1: 5,000), माउस एंटी-एच 2 बी (1: 2,500), खरगोश विरोधी-पीडीआई (1 : 1,000), और एंटी-एचए (1: 2,000) चूहा। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्र 2: फ्लो चार्ट फ्रेक्सेक्शन और [ 35 एस] जीटीपीसीएस बाध्यकारी प्रक्रिया को रेखांकित करना। सबसे पहले, कोशिकाओं को रुचि के जीपीसीआर व्यक्त करने के लिए ट्रांसफ़ेक्ट करें। 48 घंटे के बाद, फसल और कोशिकाओं को रिसेप्टर (लाल) और जुड़े जी-प्रोटीन (हरा = जी α , बैंगनी = जी β , और नारंगी = जी γ ) को अलग करने के लिए अलग करना। जीटीपी बाध्य प्रयोगों को करने के लिए, [ 35 एस] जीटीपीपीएस जोड़ें और हड्डियों के लिगेंड से झिल्ली को सेते। जी-प्रोटीन गतिविधि को मापने के लिए, झिल्ली को किसी भी अनबाउंड रेडियोोकैमिकल को धोने के लिए फ़िल्टर करें और फिर तरल जगमगाहट की गिनती द्वारा बाध्य [ 35 S] GTPγS का मात्रा निर्धारित करें। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: अग्निवाद एकΜ-opioid रिसेप्टर्स पर एन डी एंटाजैमिजिशन [ 35 एस] GTPγS बाइंडिंग। ( ) [ 35 एस] जीटीपीसीएस डोमोज अकेले (नीला) या नलोॉक्सोन में 2.5 माइक्रोन डैमोजो (हरा) के साथ खुराक-प्रतिक्रिया वक्र। [ 35 एस] प्रत्येक प्रयोग में अधिकतम उत्तेजना के लिए जीटीपीएफ़एस बंधन सामान्यीकृत था और एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया था। दिखाए गए अंक तीन प्रतियों का मतलब हैं और दमोजो-उत्तेजित [ 35 एस] GTPγS का मतलब ± एसईएम ( बी ) विरोधी नलनॉक्सन द्वारा बाध्यकारी [ 35 एस] जीटीपीसीएस नलनॉक्सन (100 सुक्ष्ममापी) के साथ प्रतियोगिता में अकेले अकेले (100 सुक्ष्ममापी), अकेमो अकेले (10 माइक्रोग्राम) या दामगो (10 सुक्ष्ममापी) को जोड़ने के बाद बाध्यकारी मात्रा निर्धारित की गई थी। परिणाम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य एसईएम के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। कृपया उसे क्लिक करेंइस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए फिर से

ligand ईसी 50 या आईसी 50 (एनएम) एन एच के बी (एनएम)
DAMGO 185 ± 23 0.46 ± 0.06
naloxone 420 ± 87 0.88 ± 0.06 97 ± 20

तालिका 1: डीएमजीओ और नालोक्सोन गतिविधि के औषधीय पैरामीटर μ-opioid रिसेप्टर्स पर। दमगो के लिए आधे-अधिकतम प्रतिक्रिया (ईसी 50 ) और हिल गुणांक (एन एच ), [ 35 एस] डीएमजीओ की अलग-अलग खुराक के जवाब में बाध्यकारी [ 35 एस] से प्राप्त हुए थे। आधा-अधिकतम निरोधात्मक एकाग्रता(आईसी 50 ) और समतोल विस्थापन निरंतर (के बी ) नलॉक्सोन के लिए नलॉक्सोन और 2.5 माइक्रोन डैमो के बीच प्रतिस्पर्धा के प्रभाव से निर्धारित किया गया [ 35 एस] जीटीपीपी बाध्यकारी। परिणाम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य एसईएम के रूप में व्यक्त किए जाते हैं।

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Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल दो अलग-अलग लेकिन पूरक तरीकों का वर्णन करता है: अलग-अलग कोशिकाओं और ऊतकों को व्यापक लेकिन अलग डिब्बों में विभाजित करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण और [ 35 एस] GTPγS बाइंडिंग को मापकर जीपीसीआर सिग्नल की जांच करने के साधन।

कुशल सेलुलर फ़्रेक्केशन में विस्तृत प्रकार की अनुप्रयोग हैं, जिसमें प्रोटीन की निष्कर्षण और संवर्धन, रिसेप्टर फार्माकोलॉजी के अध्ययन के लिए प्रोटीन के सबसेलुलर स्थानीयकरण के आकलन के लिए शामिल है। हालांकि भिन्न कोशिकाओं और ऊतकों को अलग करने के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सस्ता, तेज़ और सरल है। अधिक स्थापित तरीकों के विपरीत, हालांकि, यह विधि अन्य झिल्लीदार डिब्बों से प्लाजमा झिल्ली-संबंधित प्रोटीन को साफ करने में असमर्थ है, जैसे एंडोसोम या ईआर। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि उपरोक्त प्रोटोकॉल जीसीपीसीआर युक्त सेल झिल्ली उत्पन्न करने के लिए एक क्षणिक विषमता प्रणाली का उपयोग करता हैब्याज, इस प्रोटोकॉल स्थिर overexpression प्रणालियों के साथ संगत है, साथ ही पशु या मानव ऊतक के साथ 19

अंश की उपज और शुद्धता को अधिकतम करने के लिए नमूना तैयार करना महत्वपूर्ण है यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है कि पूर्ण होमोजिनायझेशन को सुनिश्चित करना और केन्द्रापसारक कदमों के बीच संक्रमण के समय को कम करना। कोशिका झिल्ली को पूरी तरह से बाधित करने के लिए एक गोली homogenizer / pestle का प्रयोग करने से अंतिम सेल अंश में क्रूड झिल्ली उपज बढ़ जाती है। यदि झिल्ली उपज बहुत कम है, तो दो सरल समाधान प्रारंभिक कोशिका संस्कृति को बढ़ाएंगे और / या सेल गोली को कुछ और बार होमोजीएज करना होगा। यदि अलग-अलग अंश उच्चतम अशुद्धि दिखाते हैं, तो केन्द्रोत्सर्जन और पृथक्करण के बीच संक्रमण के समय को कम करें। नमूनों को सेंट्रीफ्यूगेशन के बाद बैठने की अनुमति न दें, क्योंकि प्रोटीन नमूना में फैल सकता है और अंश शुद्धता कम कर सकता है।

निस्पंदन-आधारित [ 35 एस] GTPγएस बाध्यकारी एक त्वरित और मात्रात्मक विधि है जो संबंधित रिसेप्टर का उपयोग करके जी-प्रोटीन के सक्रियण को मापने के लिए है। जीटीपी बाइंडिंग को मापने, डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं की निगरानी करते समय आमतौर पर संभवतः जीपीसीआर गतिविधि के अधिक मात्रात्मक माप की अनुमति देता है। हालांकि, यहां उल्लिखित विधि के लिए दो महत्वपूर्ण सीमाएं हैं। सबसे महत्वपूर्ण बात, निस्पंदन आधारित [ 35 एस] जीटीपीसीएस मात्रा सभी जी α isoforms 20 , 21 के साथ समान रूप से संभव नहीं है। सामान्य तौर पर, यह विधि जी I / O -coupled GPCR जैसे MOR1 22 तक सीमित है I जी एस - और जी क्यू -कॉप्ड रिसेप्टर्स कम संवेदनशील होते हैं। यह संभवतः जी एस / जी क्यू के कम प्रचुरता और उनके अपेक्षाकृत धीमी न्यूक्लियोटाइड विनिमय दर के संयोजन के कारण होता है, जिससे वास्तविक [ 35 एस] जीटीपीएफ़्स पृष्ठभूमि को बाध्य करने के लिए मुश्किल हो जाता है। यह सीमा एल्स को संबोधित किया गया है जी-प्रोटीन एंटीबॉडी कैप्चर तकनीकों का उपयोग करते हुए 20 कुछ समूहों ने पाया है कि प्रतिक्रिया से सकल घरेलू उत्पाद को दूर करने से जी के लिए संकेत-टू-शोर अनुपात में सुधार होता है- या जी क्यू -कॉप्ड रिसेप्टर्स 23 । दूसरी सीमा लाइपोफिलिक एगोनिस्ट या सर्फटेक्टर्स के लिए झिल्ली संवेदनशीलता है। [ 35 एस] जीटीपीसीएस अभिकरणों को कार्यात्मक रिसेप्टर-जी-प्रोटीन परिसरों की आवश्यकता होती है, और प्रतिक्रिया प्रणाली में लिपॉफिलिक अणुओं के अलावा झिल्ली या इन परिसरों की संरचना को बाधित कर सकते हैं। यदि यह एक संभावित चिंता है, तो यह जांच करने के लिए फायदेमंद हो सकता है कि ब्याज के अभिकर्मक पहले से ही अच्छी तरह से विशेषता प्रणाली में बाध्यकारी [ 35 एस] जीटीपीपीएस बाधित करते हैं, जैसे दमोजो-मध्यस्थता वाले एमओआर 1 उत्तेजना अनुकूलित करने पर विचार करने वाली अन्य शर्तों में बाध्यकारी बफर पीएच, एमजी 2 + और नाओकल की सांद्रता, प्रोटीन एकाग्रता और ऊष्मायन समय 23 ,Ef "> 24

यह प्रोटोकॉल एक अच्छी तरह से वर्णित जीपीसीआर, एमओआर 1, और अच्छी तरह से चिह्नित दवाओं, दमगो (एगोनिस्ट) और नालॉक्सोन (विरोधी) पर ध्यान केंद्रित करता है, जो कि एमओआर 1 पर कार्य करता है। हालांकि, इस तकनीक के फायदों में से एक यह है कि यह अज्ञात अंगों को एगोनिस्ट, विरोधी, या उलझन में दर्द के रूप में चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस आधार पर कि कैसे लैगंड जीटीपी बाइंडिंग को नियंत्रित करता है। प्रयोगों को डिजाइन करते समय, ब्याज के लिगैंड की सांद्रता का उपयोग करना और परिणामों की रेंज के प्रति सचेत करना महत्वपूर्ण है: एगोनिस्ट्स जीटीपी में बेसलाइन पर बाध्य होने का कारण बनेंगे, उलटा पीड़ाकारियों की तुलना में GTP बाइंडिंग में कमी का कारण होगा बेसलाइन, और मूलभूत जीटीपी बाइंडिंग के अलगाव में जोड़े जाने पर प्रतिद्वंद्वियों को कोई प्रभाव नहीं पड़ेगा।

संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल में subcellular fractionation प्रदर्शन करने, क्रूड झिल्ली की तैयारी एकत्र करने और [ 35 एस] जी मापने के द्वारा GPCR सक्रियण की जांच करने के लिए एक तकनीक का वर्णन किया गया है।टीपीआईजीएस बाध्यकारी रिसेप्टर्स के सबसे महत्वपूर्ण परिवारों में से एक के फार्माकोलॉजी का अध्ययन करने के लिए इन तकनीकों को आसानी से विभिन्न सेल संस्कृति और ऊतक मॉडलों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक गण घोषित करते हैं कि कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान डीए-000266 और मेडिकल वैज्ञानिक प्रशिक्षण कार्यक्रम टी 32 अनुदान (सीवी, एनडब्ल्यूजेड, और पीसीएस) द्वारा समर्थित था। लेखकों को लाइब्रेरी ऑफ साइंस और मेडिकल चित्रण के लिए सोमर्स 18: 24 (सोमर्सॉल्ट 1824 डॉट कॉम) भी स्वीकार करना चाहेंगे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine Thermo Fisher Scientific 10313021 Warm in a 37°C water bath before use
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081 Warm in a 37°C water bath before use
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Warm in a 37°C water bath before use
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070 Warm in a 37°C water bath before use
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 16000044 Warm in a 37°C water bath before use
Cell culture 10 cm plate Sigma-Aldrich CLS430167
Lipofectamine 3000 reagent Thermo Fisher Scientific L3000-008
1.6 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) Thermo Fisher Scientific BP152-1
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E9884
Sucrose Sigma-Aldrich S5016
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 2900
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich DO632
Sodium chloride (NaCl) Thermo Fisher Scientific BP358-1
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M1028-1
Pellet pestles motor Sigma-Aldrich Z359971
Pestles Bel Art F19923-0001
Bovine serum albumin (BSA) Affymetrix 10857
[35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS)  Perkin Elmer NEG030H
nonradiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS)  Sigma-Aldrich 89378
guanosine diphosphate (GDP) Sigma-Aldrich 51060
Bradford reagent Bio-Rad 5000006
UV/VIS spectrophotometer Beckman Coulter DU640
spectrophotometer cuvettes USA Scientific 9090-0460
orbital shaker Thermo Fisher Scientific 2314
thermomixer Eppendorf 535027903
glass fiber filters  GE Healthcare Life Sciences 1821-021
vacuum filtration apparatus Millipore Corporation XX2702550
desktop microcentrifuge Eppendorf 65717
Scintillation counter Beckman Coulter LS6500
scintillation fluid  Ecoscint A LS-273
scintillation counter vials Beckman Coulter 592690
scintillation vial lids Beckman Coulter 592928
Prism 6 GraphPad Software PRISM 6
ATP1A1 antibody Developmental Studies Hybridoma a6F 1:1000 in 3% BSA
GAPDH antibody EMD Millipore CB1001 1:5000 in 3% BSA
H2B antibody Cell Signaling 2934S 1:2500 in 3% BSA
PDI antibody Cell Signaling 3501S 1:1000 in 3% BSA
HA antibody Roche 11867423001 1:2000 in 3% BSA

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References

  1. Kobilka, B. K. G protein coupled receptor structure and activation. Biochim. Biophys. Acta. 1768, (4), 794-807 (2007).
  2. Neubig, R. R., Siderovski, D. P. Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets. Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).
  3. Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nat. Rev. Drug Discov. 5, (12), 993-996 (2006).
  4. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, (1), 175-187 (1991).
  5. Kobilka, B. K., et al. Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2-adrenergic receptor. Science. 238, (4827), New York, NY. 650-656 (1987).
  6. Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289, (5480), New York, NY. 739-745 (2000).
  7. Neer, E. J. Heterotrimeric c proteins: organizers of transmembrane signals. Cell. 80, (2), 249-257 (1995).
  8. Londos, C., Salomon, Y. 5'-Guanylylimidodiphosphate, a Potent Activator of Adenylate Cyclase Systems in Eukaryotic Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71, (8), 3087-3090 (1974).
  9. Ross, E. M., Gilman, A. G. Resolution of Some Components of Adenylate-Cyclase Necessary for Catalytic Activity. J. Biol. Chem. 252, (20), 6966-6969 (1977).
  10. Stadel, J. M., Nambi, P., Shorr, R., Sawyer, D. F., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. Catecholamine-Induced Desensitization of Turkey Erythrocyte Adenylate-Cyclase Is Associated with Phosphorylation of the Beta-Adrenergic-Receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, (11), 3173-3177 (1983).
  11. Wilden, U., Kuhn, H. Light-Dependent Phosphorylation of Rhodopsin - Number of Phosphorylation Sites. Biochemistry. 21, (12), 3014-3022 (1982).
  12. Lohse, M., Benovic, J., Codina, J., Caron, M., Lefkowitz, R. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248, (4962), New York, NY. 1547-1550 (1990).
  13. Leftowitz, R. J., Shenoy, S. K. Transduction of receptor signals by beta-arrestins. Science. 308, (5721), New York, NY. 512-517 (2005).
  14. Lefkowitz, R. J. Historical review: a brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors. Trends Pharmacol. Sci. 25, (8), 413-422 (2004).
  15. Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological assessment of m1 muscarinic acetylcholine receptor-gq/11 protein coupling in membranes prepared from postmortem human brain tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325, (3), 869-874 (2008).
  16. Yung-Chi, C., Prusoff, W. H. Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 22, (23), 3099-3108 (1973).
  17. Lazareno, S., Birdsall, N. Estimation of competitive antagonist affinity from functional inhibition curves using the Gaddum, Schild and Cheng-Prusoíf equations. Br. J. Pharmacol. 109, (4), 1110-1119 (1993).
  18. Maréchal, E. Chapter 5, Measuring Bioactivity: KI, IC50 and EC50. Chemogenomics and Chemical Genetics. Springer. 55-65 (2011).
  19. Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological Assessment of M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor-Gq/11 Protein Coupling in Membranes Prepared from Postmortem Human Brain Tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325, (3), 869-874 (2008).
  20. Milligan, G. Principles: extending the utility of [35S]GTP gamma S binding assays. Trends. Pharmacol. Sci. 24, (2), 87-90 (2003).
  21. Harrison, C., Traynor, J. R. The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology. Life Sci. 74, (4), 489-508 (2003).
  22. Traynor, J. R., Nahorski, S. R. Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5'-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47, (4), 848-854 (1995).
  23. GTPγS Binding Assays. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. (2004).
  24. Strange, P. G. Use of the GTPγS ([35S]GTPγS and Eu-GTPγS) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors. Br. J. Pharmacol. 161, (6), 1238-1249 (2010).

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