Модель титановой модели роста крысы для характеристики механизмов восстановления и оценки стратегий регенерации пласта

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Пластинчатая пластинка представляет собой хрящевой участок в детских длинных костях, где происходит продольный рост. При травме костная ткань может образовывать и ухудшать рост. Мы описываем крысиную модель травмы роста, которая приводит к костной восстановительной ткани, позволяя изучать механизмы восстановления и стратегии регенерации пластин роста.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Erickson, C. B., Shaw, N., Hadley-Miller, N., Riederer, M. S., Krebs, M. D., Payne, K. A. A Rat Tibial Growth Plate Injury Model to Characterize Repair Mechanisms and Evaluate Growth Plate Regeneration Strategies. J. Vis. Exp. (125), e55571, doi:10.3791/55571 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Третий из всех педиатрических переломов связан с пластиной роста и может привести к нарушению роста кости. Пластина роста (или physis) - это хрящевая ткань, обнаруженная в конце всех длинных костей у детей, которая отвечает за продольный рост костей. После повреждения хрящевая ткань в пластине роста может подвергаться преждевременной оссификации и привести к нежелательной костной восстановительной ткани, которая образует «костный план». В некоторых случаях этот костный план может приводить к деформациям роста кости, таким как угловые деформации, или может полностью остановить продольный рост кости. В настоящее время нет клинического лечения, которое может полностью восстановить поврежденную пластину роста. Используя животную модель травмы роста, чтобы лучше понять механизмы, лежащие в основе формирования костного барьера, и определить способы его подавления - отличная возможность разработать лучшие методы лечения травм растительных пластинок. Этот протокол описывает, как разрушить крысиную проксимальную пластинку роста большеберцовой кости, используя дефект отверстия. Это smaLl модель животного надежно производит костный планшет и может привести к деформациям роста, подобным тем, которые наблюдаются у детей. Эта модель позволяет исследовать молекулярные механизмы формирования костного барьера и служит средством для проверки возможных вариантов лечения травм растительных пластинок.

Introduction

При травмах растительных пластинок приходится 30% всех педиатрических переломов и может привести к нарушению роста кости 1 . В дополнение к переломам травмы растительных пластин могут быть вызваны другими этиологиями, включая остеомиелит 2 , первичные опухоли костей 3 , радиацию и химиотерапию 4 , и ятрогенный ущерб 5 . Пластина роста (или physis) является хрящевой областью в конце длинных костей детей, которая отвечает за продольный рост кости. Он стимулирует удлинение кости через эндохондральную оссификацию; Хондроциты подвергаются пролиферации и гипертрофии и затем реконструируются входящими остеобластами для образования трабекулярной кости 6 . Пластина роста также является слабой областью развивающегося скелета, что делает ее склонной к травме. Основная проблема, связанная с переломами или травмами в пластинках, заключается в том, что поврежденная ткань хряща в пластине роста может bE заменен нежелательной костной ремонтной тканью, также известной как «костлявый бар». В зависимости от размера и местоположения в пластине роста костный штанга может привести к угловым деформациям или полной остановке роста, разрушительной силе для маленьких детей, которые еще не достигли своей высоты 7 .

В настоящее время нет лечения, которое может полностью восстановить поврежденную пластину роста. Как только костный брусок формируется, клиницист должен решить, удалять или нет хирургическое удаление 8 . Пациенты с по меньшей мере 2 годами или 2 см остаточного скелетного роста и с костным бруском, который составляет менее 50% площади роста, обычно являются кандидатами на резекцию костного шва 8 . Хирургическое удаление костного полотна часто сопровождается вмешательством аутологичного жирового трансплантата, чтобы предотвратить реформацию костной ткани и позволить окружающей не поврежденной пластине роста восстановить рост. Однако эти методы являютсяЭмаль и часто терпят неудачу, что приводит к рецидиву костного стержня и продолжает отрицательно влиять на рост 9 . Существует критическая потребность в разработке эффективных методов лечения, которые не только предотвращают образование костного барьера, но также регенерируют хрящ пластинки роста, тем самым восстанавливая нормальное удлинение кости.

Молекулярные механизмы, лежащие в основе образования костного барьера, еще не полностью выяснены. Более глубокое понимание этих биологических механизмов может привести к более эффективному терапевтическому вмешательству для детей, страдающих травмами растительных пластинок. Поскольку изучение этих механизмов у людей затруднено, использовались модели на животных, особенно крысиная модель повреждения растительных пластин 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Метод, представленный в этомВ статье описывается, как дефект буровой скважины в планшете роста тибиальных крыс приводит к предсказуемой и воспроизводимой восстанавливающей ткани, которая начинает окостенение уже через 7 дней после травмы и образует полностью зрелый костный планшет с ремоделированием через 28 дней после травмы 10 . Это дает небольшую модель животного in vivo, в которой изучаются биологические механизмы формирования костного барьера, а также оцениваются новые методы лечения, которые могут препятствовать костному брусу и / или регенерировать хрящ. Например, эта модель может быть использована для проверки хондрогенных биоматериалов, которые могут регенерировать хрящ хрестоматий и предложить ценную терапию для детей, страдающих травмами растительных пластинок. Методы, представленные в этой статье, будут описаны хирургические методы, используемые для получения травмы растительной пластинки и последующей доставки биоматериалов в место повреждения. Мы также обсудим методы оценки костного образования и восстановления тканей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры на животных должны быть одобрены местным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC). Протокол животных для следующей процедуры был одобрен Университетом Колорадо Денвер IACUC.

1. Получите крыс

ПРИМЕЧАНИЕ. Если генетически модифицированные животные не требуются, 6-недельные, скелетно-незрелые крысы Sprague-Dawley необходимы во время операции. Можно было бы использовать другие штаммы; Однако большинство опубликованных исследований было выполнено на крысах Sprague-Dawley.

2. Подготовка хирургических принадлежностей

  1. Автоклавные хирургические упаковочные комплекты, которые включают в себя один из следующих вариантов: ручка скальпеля № 3, держатель иглы, щипцы Adson и ножницы для ирисовой диафрагмы.
  2. Автоклавируйте бесключевые сверлильные патроны. Буровые патроны могут быть стерилизованными между операциями на животных при работе на нескольких животных.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Местные правила IACUC, относящиеся к использованию стерильной хирургииНеобходимо соблюдать физические инструменты на нескольких животных. Например, Университет Колорадо Денвер IACUC позволяет использовать один набор хирургических инструментов до 5 животных до их прекращения. Кроме того, хирургические инструменты должны быть подвергнуты термической стерилизации с использованием стерилизатора борта между животными. Дополнительные дополнительные стерильные хирургические пакеты должны использоваться для любых дополнительных животных.
  3. Автоклав размером 5 см Штейнмана, по одному для каждого животного.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы уменьшить риск заражения, штифты Steinmann не должны использоваться для нескольких животных.
  4. Автоклав 1,8 мм зубных боров, по одному для каждого животного.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы уменьшить риск заражения, зубные боры нельзя использовать для нескольких животных.
  5. При необходимости автоклавируйте аппликатор для зажимов раны. Альтернативно, скрытые швы могут использоваться для закрытия кожного слоя. См. Шаг 7.3.
  6. Если возможно, стерилизовать роторную дрель с использованием облучения или газовой стерилизации.
  7. Соберите следующие дополнительные принадлежности: электробритва, steСтерильные солевые шприцы, стерильные 10-мл шприцы, стерильные иглы 23 калибра, мастики из изопропилового спирта, изофлуран, суппорты, постхирургические анальгетики ( например, НПВП и бупренорфин), стерильные марли, Стерильные хирургические драпировки, стерильные хирургические перчатки, стерильные лезвия скальпеля №15, стерильные зажимы для раны, анестезиологический аппарат, стерилизатор бортов, нагревательную подушку и абсорбирующие поддоны.

3. Анестезия и подготовка животных

  1. Анестезируйте животное, введя его в индукционную камеру от 1 до 2 л, получая поток кислорода 1 л / мин с 5% изофлураном из испарительной системы с пассивной очищающей системой.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Воздействие 5% изофлурана должно обезболивать 6-недельных крыс в течение 5 мин.
  2. Переместите животное на хирургическое место и поддержите животное под наркозом с 2 - 3% изофлураном, используя носовой конус для оставшейся части процедуры. Поместите животное на спину на нагревательную подушку и впитывайтеEnt underpad.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Животное не нужно фиксировать на хирургическом столе. Удержание ноги, как указано в нижеприведенных шагах, является достаточным методом стабилизации.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Все последующие процедуры должны проводиться с животным под наркозом. 2 - 3% изофлурана должно быть достаточным для поддержания анестезии у крыс в этом возрасте. Это может быть подтверждено путем тестирования рефлекса отмены бипедаля.
  3. Администрирование интраоперационных анальгетиков в соответствии с институционально утвержденными политиками ( например, бупренорфин при 0,05 мг / кг и карпрофен в дозе 5 мг / кг).

4. Подготовка Tibia для хирургии

  1. Обрежьте всю заднюю ногу (и) от медиальной лодыжки до таза с помощью электробритвы.
  2. Измерьте и запишите длину большеберцовой кости от переднего большеберцового плато до нижней стороны медиальной лодыжки с помощью суппорта. Альтернативно, измерьте всю длину большеберцовой кости с помощью рентгеновского снимка или microCT 11 Sup> , 12 , 14 . Необязательно, измерьте размеры пластин роста до операции с помощью рентгеновского или микроконцентратора.
  3. Очистите хирургический участок, протерев всю ногу (и), живот и гениталии спиртовыми мазками, а затем пропитанной повидоном йодом марлей.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы свести к минимуму риск заражения, все последующие процедуры, пока животное не будет удалено из анестезии (шаг 7.4), должны выполняться в стерильных условиях. Все хирургические материалы должны быть доступны с использованием стерильной техники. Использование хирургического помощника настоятельно рекомендуется поддерживать бесплодие во время операции.
  4. При ношении стерильных хирургических перчаток поместите искусственную стерильную хирургическую драпировку на животное, оставив ногу (ноги) через центральное отверстие.

5. Хирургическая процедура для доступа к пластинке роста

_upload / 55571 / 55571fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Обзор хирургической процедуры.
A)
Расположение нескольких анатомических маркеров, используемых для создания успешной травмы роста. Коленная капсула сразу же расположена к коленной чашечке (белая), отделяя большеберцовую кость от бедренной кости. Планку роста большеберцовой кости (темно-красный) можно увидеть ниже коленной чашечки и обходить большую берцовую кость. Проксимальная пластинка роста - это в основном плоская плоскость, за исключением передней четверти, которая образует диагональную плоскость. Пересечение этих двух плоскостей образует угол плиты роста, который используется для соответствующего угла сверления. Вставка semitendinosus - это место, где мышцы quadriceps вставляются в заднюю большеберцовую кость. B) разрез через передне-медиальный аспект мягких тканей большеберцовой кости для доступа к кортикальной кости. C) Расположение кортикального окна с использованием выравнивания с дистальной вставкой semitendinosus в качестве контрольной точки. D) ОценкаГлубину травмы путем выравнивания скоса на зубном боре с кортикальным окном.

  1. Сделайте разрез размером 1 см через кожу вдоль медиально-переднего аспекта проксимальной большеберцовой кости, используя ручку скальпеля № 3 и лезвие № 15, начиная с дистального конца медиального бедренного мыщелка ( рис. 1А ).
    1. Потяните кожу на лежащую ниже кость и крепко держите ногу, делая надрез.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Это позволит сохранить разрез кожи в нужном месте и поможет в создании чистого разреза. Не надавливайте слишком сильно на скальпель, чтобы избежать прокалывания капсулы коленного сустава, что приведет к обильному кровотечению и затруднит выполнение оставшихся шагов.
  2. Обратите внимание на важные анатомические маркеры, в том числе: 1) планку роста, 2) угол роста пластины, 3) коленную капсулу и 4) вставку semitendinosus ( рисунок 1A ).
  3. Используя скальпель, сделайте разрез размером 0,5 см черезE fascia и мягких тканей на медиально-переднем аспекте проксимальной большеберцовой кости, от пластины роста до нижней части разреза кожи ( рис. 1B ).
  4. Мягко рассечь или очистить фасцию и мягкие ткани от голени с помощью скальпеля ( рис. 1B ).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Важно удалить или очистить как можно больше мягких тканей от большеберцовой кости, чтобы не мешать этапам сверления.
  5. Просверлите кортикальное окно через кость костей голени на диафизе с помощью штифта Штейнмана, прикрепленного к вращающемуся инструменту при 10000 об / мин (низкая скорость вращающегося инструмента, указанного в разделе материалов). Создайте кортикальное окно таким образом, чтобы оно выравнивалось с дистальной вставкой semitendinosus ( рис. 1C ).
    1. Держите сверло перпендикулярно большеберцовому диафизу и будьте медленно, осторожно, чтобы не просверлить другую сторону диафиза; Кортикальное окно должно быть всего лишь 2 мм в глубину и будет выполнено, когда нетСопротивление ощущается.
    2. Как и выше, крепко держите ногу другой рукой.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Для этого шага можно использовать зубной патрубок. Однако, если используется зубной патрубок, нога должна быть прочно закреплена, чтобы сделать чистое кортикальное окно и обеспечить, чтобы бур захватывал и разрезал кость в нужном месте. Для этого шага рекомендуется штифт Штейнмана, учитывая его более высокую способность резания.
  6. Нанесите кортикальное окно с марлей, так как ожидается легкое кровотечение.

6. Создание травмы роста

  1. Создайте травму сверла через центральную пластину роста, используя зубной патрубок диаметром 1,8 мм, прикрепленный к вращающемуся инструменту.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Правильная глубина, угол и направление имеют решающее значение для разрушения центральной пластины роста ( рис. 1C и D ). Ниже приведены инструкции по достижению соответствующей глубины, угла и направления.
    1. Чтобы измерить соответствующую глубину, используя зубной бур, begiN путем выравнивания конца зубного бруса с проксимальной большеберцовой костью, где semitendinosus пересекает коленную капсулу ( рис. 1C ).
    2. С концом зубного бруса в коленной капсуле следуйте за валом бура вдоль полутензиноса и обратите внимание на то, где бур совпадает с кортикальным окном. Это подходящая глубина для бора, чтобы полностью разрушить пластину роста, не нарушая суставную поверхность ( рис. 1C ).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Зубной бур используется для измерения соответствующей глубины. Бури могут быть отмечены постоянным маркером в том месте, где оно совпадает с кортикальным окном, чтобы ссылаться на глубину во время бурения. Однако, если анатомические маркеры и вышеупомянутый протокол тесно связаны, первый скос на зубных борах, указанный здесь (FG6), будет соответствующим образом выровняться с кортикальным окном (как показано на рисунке 1C ).
    3. Чтобы достичь соответствующего угла сверления, удерживайте вращающийся инструмент под углом менее tHan 30 ° относительно диагноза большеберцовой кости.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Это визуальное приближение.
    4. Чтобы достичь соответствующего направления сверления, используйте угол роста пластины ( рис. 1C ). Нарисуйте визуальную линию вдоль зубного ложа до угла пластины роста, чтобы помочь в создании центрального дефекта.
    5. Включите вращающийся инструмент до 10 000 об / мин (малая скорость вращающегося инструмента, указанного в разделе материалов) перед входом в кортикальное окно.
    6. С помощью поворотного инструмента под соответствующим углом и направлением введите кортикальное окно и нажмите вращающийся инструмент, пока маркер бури не сравняется с кортикальным окном. После достижения надлежащей глубины удалите вращающийся инструмент.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Выполняйте разрушение пластины роста одним быстрым движением, используя минимальное время с помощью бура в пластине роста, чтобы создать чистую травму. Это важно для анализа данных.
  2. Нанесите кортикальное окно с марлей на ~ 30 с, так как ожидается кровотечение.
  3. Обеспечьте соответствующую глубину повреждения, снова измерив длину бура (шаг 6.1.2).
    1. Вставьте бур в буровую дорожку (с помощью поворотного инструмента) и выровняйте отмеченный бур с кортикальным окном ( рис. 1D ).
  4. Если глубина недостаточна, поверните вращающийся инструмент и нажмите на нужную глубину.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Хотя второй раунд бурения не идеален, полное разрушение плиты роста имеет первостепенное значение для развития костного стержня.
  5. Прополощите буровую дорожку с помощью 3 мл стерильного физиологического раствора с помощью 10-мл шприца и иглы с 23 калибрами.
  6. Протрите рану сеткой.

7. Процедуры после травмы

  1. Если вы оцениваете обработку листовой пластины на основе биоматериала, впрысите биоматериал через буровую дорожку в участок травмы с использованием иглы соответствующего размера (от 18 до 26 калибра, в зависимости от вязкости биоматериала).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Объем травмы роста составляет ~ 3 & #181; L, а объем буровой дорожки составляет ~ 20 мкл. Максимальный объем материала, который может быть впрыснут в травму растительной пластинки и буровой путь, составляет от 20 до 25 мкл.
  2. Закройте рану, зашив фасцию с помощью швов 3-0 полигликолевой кислоты. Нанесите костяной воск на кортикальное окно, чтобы изолировать лежащую в основе кость (необязательно).
  3. Закройте разрез кожи с помощью скрытых швов или зажимов для раны.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Рекомендуется использовать зажимы ран, так как животное будет царапаться на месте повреждения и может открыть рану.
  4. Удалите животное из изофлурановой анестезии, поместите его на нагревающее одеяло и следите за ним, пока он не проснется.
  5. Чтобы уменьшить риск заражения, поместите животное в новую клетку, содержащую сухие, автоклавированные постельные принадлежности.
  6. Позвольте животному переносить вес после операции.
  7. Наблюдайте за животным каждые 12 ч в течение 72 часов после операции, чтобы проверить наличие признаков инфекции, чтобы убедиться, что зажимы для раны остаются на месте, и управлять послеоперациейE анальгетиков в соответствии с институционально утвержденной политикой ( например, бупренорфин при 0,05 мг / кг каждые 12 ч в течение 36 ч и карпрофен при 5 мг / кг каждые 24 ч в течение 72 ч).
  8. Удалите зажимы для раны через 10 - 14 дней после операции под наркозом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Успешная травма роста пластины с использованием этого метода включает нарушение центра пластины большеберцовой кости без нарушения суставной поверхности хряща. Сообщалось, что костная ткань для восстановления костной ткани начинается примерно через 7 дней после травмы и полностью развивается через 28 дней после травмы 13 , что визуализируется с помощью микрокомпьютерной томографии (micro CT) ( рисунок 2 ). Хотя эти временные точки были выбраны здесь для отображения начала и созревания формирования кости на основе ранее опубликованных данных, другие временные точки могут быть использованы для исследования различных этапов процесса ремонта с 1 по 6 месяцев после операции 17 . В таблице 1 приведен обзор формирования объема кости в хирургически поврежденных планшетах роста крыс через 28 дней после операции из трех независимых прогонов путем обеспечения (1) объемной доли костей во всей пластине роста и (2) боNe объемной доли в области ремонтной ткани только 15 . Данные представлены в виде среднего процента ± стандартного отклонения и указывают, что аналогичные результаты были получены между независимыми прогонами. Разница между различными прогонами была проанализирована односторонним анализом дисперсии (ANOVA) и не показала статистически значимой разницы между прогонами, что указывает на воспроизводимость модели. Алкогольный синий гематоксилин (ABH) с контрастным пятном Orange G / Eosin 18 был использован для гистологического исследования различных тканей для восстановления на разных стадиях формирования костного барьера ( рисунок 2 ). Используя это гистологическое пятно, можно идентифицировать и количественно определить различные типы восстанавливающих тканей, включая мезенхимальные, хрящевые, костные трабекулы и костный мозг. 16 .

Некоторые проблемы могут возникнуть из-за неправильного выполнения вышеуказанных процедур. Недостаточность Nt глубина сверления не разрушит пластину роста, что приведет к небольшому образованию костного стержня или вообще не будет. Нарушение суставной поверхности хряща создает большую травму, которая может привести к появлению суставного хряща на участке травмы роста, осложняя процесс заживления ( рис. 3А ). Нарушение пластины роста под неподходящим углом или направлением приводит к нецентральному повреждению ( рисунок 3B ). В этом случае образование костного полотна все равно будет происходить, хотя оно будет латеральным или медиальным в желаемом месте. В целом, восстановительная ткань, образованная после травмы растительного пластика, может быть проанализирована различными способами, включая microCT, количественную ПЦР, гистологическое окрашивание и иммуногистохимию. В дополнение к гистологическим и молекулярным измерениям длина конечности и размеры пластин роста обеспечивают важную меру роста всей кости. Сообщалось, что пораженные конечности испытывают снижение роста по сравнению с неповрежденными контрольными конечностями> 13. Длина конечности может быть измерена в разные моменты времени на протяжении всего исследования с использованием изображений microCT для исследования расхождений длины конечностей 14 . Примеры использованных ранее временных интервалов включают 28 дней и 56 дней после травмы. Измерения пластины роста, включая общую высоту, высоту зоны и формирование троса, также могут предоставить важную информацию о процессе восстановления ткани 13 , 14 , 15 . В идеале, перед хирургическим вмешательством следует брать длину конечности и размеры пластины роста, чтобы иметь базовое значение. Для дальнейшего выяснения биологических механизмов или для проверки эффективности лечения следует разработать соответствующие контрольные группы и включить незатронутые конечности и конечности, которые подверглись хирургическому вмешательству, но их не лечили.

Биоматериалы также могут быть испытаны в этой модели травмы роста. В качестве примера, циTosan microgel 19 вводили в участок повреждения растительной пластинки, как описано на этапе 7.1, и это отчетливо видно на участке повреждения на фиг. 4 . Последующий анализ может включать в себя определение влияния биоматериала на композицию восстановительной ткани, длину конечности и измерения пластин роста, как обсуждалось ранее.

фигура 2
Рисунок 2. Успешное разрушение плиты роста и формирование костного бара.
Формирование костного барьера наблюдается через 7 дней после травмы с помощью микросфер и подтверждается окрашиванием алкановым гематоксилином (ABH). Бони-бар полностью созревает после 28-го дня после травмы, как видно с окрашиванием microCT и ABH. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.


Рисунок 3. Потенциальные результаты неправильного бурения.
A)
Слишком большое расстояние от голени может нарушить суставную поверхность, что усложняет процесс заживления и может привести к неубедительным результатам. B) Неправильный угол наклона сверла может привести к нецентральному повреждению пластины. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4
Рисунок 4. Лечение травмы роста с помощью биоматериала.
Окрашивание ABH показывает микрогель хитозана в поврежденной пластине роста.

метрический Запустить 1 Запуск 2 Запуск 3 Р-значение
Объемная доля костей во всей пластине роста 9,76 +/- 3,81% 10,52 +/- 4,06% 11,93 +/- 2,04% 0,5493
Объемная доля костей в области ткани для ремонта 41,5 +/- 8,33% 46,08 +/- 10,12% 46,77 +/- 8,14% 0,5128

Таблица 1. Дробные данные объема костей.
Данные были получены от микроконтрастных изображений через 28 дней после травмы у нелеченных крыс с трех независимых прогонов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Модель животного с травмой роста значительно увеличивает наше понимание биологических механизмов этой травмы, что потенциально приводит к более эффективному терапевтическому вмешательству для детей, страдающих травмами растительных пластинок. Чтобы успешно создать костный планшет и изучить его формирование in vivo с использованием модели, представленной в этой работе, крайне важно нарушить рост пластины путем бурения на достаточной глубине, не нарушая суставного хряща. Вариация хирургической реализации среди животных и, в меньшей степени, изменение анатомических маркеров может привести к проблематичным результатам. Мы рекомендуем практиковать процедуры, описанные выше, для трупных животных, чтобы обеспечить успешную травму растительного таблеток перед выполнением процедуры для изучения живых животных. В то время как у трупных животных нет чувствительности к тканям и не будет кровоточить, процедура травмы роста и анатомические особенности этих животных будет аналогична процедуре живых животных. FurtБолее того, трупная пластинка роста большеберцовой кости может быть легко расчленена, так как эпифиз отделяется от метафиза посредством применения легкой силы и можно наблюдать положение бурильной скважины. Этот быстрый анализ позволяет модифицировать технику, чтобы узнать правильную глубину сверления и угловое отношение к трупным животным без необходимости получения изображений.

Следует отметить, что существуют другие животные модели травмы роста. Аналогичный трансфизарный дефект был выполнен у мышей и приводил к образованию костного барьера 20 . Несмотря на меньшие размеры, он также может быть использован для изучения механизмов, участвующих в формировании костного барьера. Coleman et al . Сообщалось о другой действительной модели крысы травмы роста, в которой центральный дефект был обнаружен на дистальной бедро путем сверления через суставной хрящ 21 . Этот подход также привел к формированию неравенства длины кости и длины конечностей, как вМодель представлена ​​здесь. Другие животные модели травмы и лечения растительных пластинок включают кроликов 22 , свиней 23 и овец 24 . В то время как более крупные модели травм животных могут более тесно представлять клинические травмы, модель крысы полезна для исследования биологических механизмов физрачных травм. Например, модель крысы, представленная здесь, широко использовалась для исследования молекулярных механизмов фицеального повреждения и процесса формирования костного барьера 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Кроме того, модель крысы может быть использована для тестирования различных физзальных процедур перед переносом на более крупные модели животных. Тем не менее, проблема этой крысиной модели травмы роста пластины заключается в том, что сверление выполняется внутри кости, maКороль не может наблюдать, где буровое отверстие находится внутри пластины роста. Таким образом, успешное разрушение планшета для выращивания живых животных может быть подтверждено только с использованием методов визуализации во время операции или путем оценки формирования костного шва в течение 7-28 дней после операции. С практикой может быть достигнута высокая степень успеха в получении образования костного барьера, но ранние исследования могут привести к тому, что у ряда животных, у которых отсутствует образование костного бара, из-за неповрежденной пластины роста или недостаточного нарушения роста пластина.

Другим ограничением этой модели является то, что травмы бурильных отверстий не представляют собой нормальные травмы роста у детей, которые обычно возникают из-за перелома 25 . Переломы в пластине роста можно классифицировать с использованием системы классификации Salter-Harris 26 . Переломы в пластинах роста III и IV типа чаще всего способствуют травмам физеи, которые приводят кК костному образованию. Характер повреждения пластины роста, представленный здесь, наиболее тесно связан с травмой роста роста типа VI, редким классом повреждений, при котором физ удаляется травмой или проколотой раной. Однако, поскольку патофизиологические механизмы, лежащие в основе формирования костного стержня после травмы роста, остаются неуловимыми, модель крысы остается важной, чтобы раскрыть этот процесс, чтобы разработать новые варианты лечения для детей, страдающих от всех типов травм растительных пластинок. Описанный здесь метод надежно создает костный штангу и может быть использован для изучения нескольких аспектов процесса восстановления повреждения пластин роста in vivo 17 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 . Было также показано, что эта модель крысы приводит к уменьшению роста большеберцовой кости после ростаЖюри 13 , что делает его еще более интересной моделью для животных, чтобы испытать новые варианты лечения, которые приводят к регенерации пластин роста и потенциальному восстановлению удлинения кости.

В заключение, в этом документе подробно описаны методы создания модели травмы роста, с помощью которой можно исследовать образование костного стержня и потенциальное лечение травм растительных пластинок in vivo. Эта модель крысы позволяет относительно недорогие и быстрые исследования, учитывая, что костный планшет полностью созревает через 28 дней после травмы роста. В дополнение к развитию нашего понимания молекулярных механизмов формирования костного барьера in vivo , эта модель может быть использована для проверки биоматериалов, которые препятствуют образованию костных полос и стимулируют регенерацию хряща в пластинках.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

Авторы признают финансовую поддержку Национального института артрита и заболеваний опорно-двигательного аппарата и кожных заболеваний Национального института здоровья (NIH) по номеру награды R03AR068087, Академического фонда обогащения Университета Колорадо-школы медицины и Центра регенеративной медицины Гейтса , Эта работа также была поддержана NIH / NCATS Colorado CTSA Grant Number UL1 TR001082. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scalpel handle McKesson MCK42332500
Needle holder Stoelting RS-7824
Adson tissue forceps Sklar 50-3048
Iris Scissors Sklar 47-1246
Rotary Tool Dremel 7700 Variable speed rotary tool 
Keyless Rotary Tool Chuck Dremel 4486
Dental Burs Dental Burs USA FG6 Round carbide bur, ≤2mm
Steinmann pins Simpex Medical T-078
Hair clippers Wahl  5537N
3-0 PGA surutes Oasis MV-J398-V
Sterile gauze 2 x 2" Covidien 441211
Povidone Iodine McKesson 922-00801
Sterile saline Vetone 510224
10 mL luer lock syringe Becton Dickinson 309604
23 gauge needle Becton Dickinson 305145
Isopropyl alcohol pads Dynarex 1113
Isoflurane IsoFlo 30125-2
Caliper Mitutoyo 500-196-30
Carprofen Rimadyl 27180
Buprenorphine Par Pharmaceuticals Inc NDC 42023-179
Fenestrated Surgical Drape McKesson 25-517
Surgical Gloves Uline S-20204
#15 Scalpel Blade Aven 44044
9 mm wound clips Fine Science Tools 12032-09
Reflex clip applier World Precision Instruments 500345
Absorbant underpads McKesson MON 43723110
Tec 3 Iso Vaporizer  VetEquip 911103 
Germinator 500 Braintree Scientific GER 5287-120V
Warm water recirculator Kent Scientific TP-700
Absorbent Underpads Medline Industries MSC281230

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mann, D. C., Rajmaira, S. Distribution of physeal and nonphyseal fractures in 2,650 long-bone fractures in children aged 0-16 years. J Pediatr Orthop. 10, (6), 713-716 (1990).
  2. Browne, L. P., et al. Community-acquired staphylococcal musculoskeletal infection in infants and young children: necessity of contrast-enhanced MRI for the diagnosis of growth cartilage involvement. AJR Am J Roentgenol. 198, (1), 194-199 (2012).
  3. Weitao, Y., Qiqing, C., Songtao, G., Jiaqiang, W. Epiphysis preserving operations for the treatment of lower limb malignant bone tumors. Eur J Surg Oncol. 38, (12), 1165-1170 (2012).
  4. Butler, M. S., Robertson, W. W., Rate, W., D'Angio, G. J., Drummond, D. S. Skeletal sequelae of radiation therapy for malignant childhood tumors. Clin Orthop Relat Res. (251), 235-240 (1990).
  5. Shapiro, F. Longitudinal growth of the femur and tibia after diaphyseal lengthening. J Bone Joint Surg Am. 69, (5), 684-690 (1987).
  6. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423, (6937), 332-336 (2003).
  7. Dodwell, E. R., Kelley, S. P. Physeal fractures: basic science, assessment and acute management. Orthopaedics and Trauma. 25, (5), 377-391 (2011).
  8. Khoshhal, K. I., Kiefer, G. N. Physeal bridge resection. J Am Acad Orthop Surg. 13, (1), 47-58 (2005).
  9. Hasler, C. C., Foster, B. K. Secondary tethers after physeal bar resection: a common source of failure. Clin Orthop Relat Res. (405), 242-249 (2002).
  10. Xian, C. J., Zhou, F. H., McCarty, R. C., Foster, B. K. Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site. J Orthop Res. 22, (2), 417-426 (2004).
  11. Chen, J., et al. Formation of tethers linking the epiphysis and metaphysis is regulated by vitamin d receptor-mediated signaling. Calcif Tissue Int. 85, (2), 134-145 (2009).
  12. Coleman, R. M., Schwartz, Z., Boyan, B. D., Guldberg, R. E. The therapeutic effect of bone marrow-derived stem cell implantation after epiphyseal plate injury is abrogated by chondrogenic predifferentiation. Tissue Eng Part A. 19, (3-4), 475-483 (2013).
  13. Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. The potential role of VEGF-induced vascularisation in the bony repair of injured growth plate cartilage. J Endocrinol. 221, (1), 63-75 (2014).
  14. Coleman, R. M., et al. Characterization of a small animal growth plate injury model using microcomputed tomography. Bone. 46, (6), 1555-1563 (2010).
  15. Macsai, C. E., Hopwood, B., Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. Structural and molecular analyses of bone bridge formation within the growth plate injury site and cartilage degeneration at the adjacent uninjured area. Bone. 49, (4), 904-912 (2011).
  16. Su, Y. W., et al. Neurotrophin-3 Induces BMP-2 and VEGF Activities and Promotes the Bony Repair of Injured Growth Plate Cartilage and Bone in Rats. J Bone Miner Res. (2016).
  17. Zhou, F. H., Foster, B. K., Sander, G., Xian, C. J. Expression of proinflammatory cytokines and growth factors at the injured growth plate cartilage in young rats. Bone. 35, (6), 1307-1315 (2004).
  18. Sayers, D., Volpin, G., Bentley, G. The demonstration of bone and cartilage remodelling using alcian blue and hematoxylin. Biotechnic & Histochemistry. 63, (1), 59-63 (1988).
  19. Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
  20. Lee, M. A., Nissen, T. P., Otsuka, N. Y. Utilization of a murine model to investigate the molecular process of transphyseal bone formation. J Pediatr Orthop. 20, (6), 802-806 (2000).
  21. Coleman, R. M., et al. Characterization of a small animal growth plate injury model using microcomputed tomography. Bone. 46, (6), 1555-1563 (2010).
  22. Lee, S. U., Lee, J. Y., Joo, S. Y., Lee, Y. S., Jeong, C. Transplantation of a Scaffold-Free Cartilage Tissue Analogue for the Treatment of Physeal Cartilage Injury of the Proximal Tibia in Rabbits. Yonsei Med J. 57, (2), 441-448 (2016).
  23. Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 156, (2), 128-134 (2012).
  24. Hansen, A. L., et al. Growth-plate chondrocyte cultures for reimplantation into growth-plate defects in sheep. Characterization of cultures. Clin Orthop Relat Res. (256), 286-298 (1990).
  25. Cepela, D. J., Tartaglione, J. P., Dooley, T. P., Patel, P. N. Classifications In Brief: Salter-Harris Classification of Pediatric Physeal Fractures. Clin Orthop Relat Res. (2016).
  26. Salter, R. B., Harris, W. R. Injuries Involving the Epiphyseal Plate. The Journal of Bone & Joint Surgery. 83, (11), 1753 (2001).
  27. Chung, R., Foster, B. K., Zannettino, A. C., Xian, C. J. Potential roles of growth factor PDGF-BB in the bony repair of injured growth plate. Bone. 44, (5), 878-885 (2009).
  28. Fischerauer, E., Heidari, N., Neumayer, B., Deutsch, A., Weinberg, A. M. The spatial and temporal expression of VEGF and its receptors 1 and 2 in post-traumatic bone bridge formation of the growth plate. J Mol Histol. 42, (6), 513-522 (2011).
  29. Chung, R., Cool, J. C., Scherer, M. A., Foster, B. K., Xian, C. J. Roles of neutrophil-mediated inflammatory response in the bony repair of injured growth plate cartilage in young rats. J Leukoc Biol. 80, (6), 1272-1280 (2006).
  30. Chung, R., et al. Roles of Wnt/beta-catenin signalling pathway in the bony repair of injured growth plate cartilage in young rats. Bone. 52, (2), 651-658 (2013).
  31. Zhou, F. H., Foster, B. K., Zhou, X. F., Cowin, A. J., Xian, C. J. TNF-alpha mediates p38 MAP kinase activation and negatively regulates bone formation at the injured growth plate in rats. J Bone Miner Res. 21, (7), 1075-1088 (2006).
  32. Arasapam, G., Scherer, M., Cool, J. C., Foster, B. K., Xian, C. J. Roles of COX-2 and iNOS in the bony repair of the injured growth plate cartilage. J Cell Biochem. 99, (2), 450-461 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics