A الجرذ النمو الشظية لوحة الإصابات نموذج لتوصيف آليات الإصلاح وتقييم استراتيجيات تجديد لوحة النمو

Medicine

GE Global Research must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

لوحة النمو هي منطقة غضروفية في العظام الطويلة للأطفال حيث يحدث النمو الطولي. عندما يصيب، يمكن أن تشكل الأنسجة العظمية وتضعف النمو. نحن تصف نموذج الفئران من إصابة لوحة النمو الذي يؤدي إلى الأنسجة إصلاح عظمي، مما يسمح لدراسة آليات إصلاح واستراتيجيات النمو لوحة تجديد.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Erickson, C. B., Shaw, N., Hadley-Miller, N., Riederer, M. S., Krebs, M. D., Payne, K. A. A Rat Tibial Growth Plate Injury Model to Characterize Repair Mechanisms and Evaluate Growth Plate Regeneration Strategies. J. Vis. Exp. (125), e55571, doi:10.3791/55571 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ثلث جميع كسور الأطفال تنطوي على لوحة النمو ويمكن أن يؤدي إلى ضعف نمو العظام. لوحة النمو (أو فيسيس) هو أنسجة الغضاريف الموجودة في نهاية كل العظام الطويلة في الأطفال التي هي المسؤولة عن نمو العظام الطولية. مرة واحدة التالفة، والأنسجة الغضروف داخل لوحة النمو يمكن أن يخضع التحجر السابق لأوانه وتؤدي إلى الأنسجة غير المرغوب فيها إصلاح عظمي، الذي يشكل "شريط عظمي". في بعض الحالات، وهذا شريط عظمي يمكن أن يؤدي إلى تشوهات نمو العظام، مثل التشوهات الزاوي، أو أنه يمكن أن يوقف تماما نمو العظام الطولية. لا يوجد حاليا أي علاج السريرية التي يمكن إصلاح تماما لوحة النمو المصاب. باستخدام نموذج حيواني من إصابة لوحة النمو لفهم أفضل للآليات الكامنة وراء تشكيل شريط عظمي وتحديد سبل لمنعها هو فرصة عظيمة لتطوير علاجات أفضل للإصابات لوحة النمو. يصف هذا البروتوكول كيفية تعطيل الفئران القريبة لوحة النمو الظنبوب باستخدام عيب حفر حفرة. هذا سمال الحيوان نموذج موثوق تنتج قضيب عظمي ويمكن أن يؤدي إلى تشوهات النمو مماثلة لتلك التي ينظر إليها في الأطفال. هذا النموذج يسمح للتحقيق في الآليات الجزيئية لتشكيل شريط عظمي ويخدم كوسيلة لاختبار خيارات العلاج المحتملة للإصابات لوحة النمو.

Introduction

إصابات لوحة النمو تمثل 30٪ من جميع كسور الأطفال ويمكن أن يؤدي إلى ضعف نمو العظام 1 . بالإضافة إلى الكسور، قد تكون ناجمة عن إصابات لوحة النمو من مسببات أخرى، بما في ذلك التهاب العظم والنقي 2 ، أورام العظام الأولية 3 ، والإشعاع والعلاج الكيميائي 4 ، والضرر علاجي المنشأ 5 . لوحة النمو (أو فيسيس) هي منطقة الغضروف في نهاية العظام الطويلة للأطفال التي هي المسؤولة عن نمو العظام الطولية. فإنه يدفع استطالة العظام من خلال التحجر الغضروفي. تشوندروسيتس الخضوع انتشار وتضخم ثم يتم تشكيلها من قبل أوستيوبلاستس واردة لتشكيل العظام التربيقية 6 . لوحة النمو هي أيضا منطقة ضعيفة من هيكل عظمي النامية، مما يجعلها عرضة للإصابة. القلق الرئيسي مع كسور لوحة النمو أو الإصابات هو أن الأنسجة الغضروف التالفة داخل لوحة النمو يمكن به استبدال الأنسجة غير المرغوب فيها إصلاح عظمي، المعروف أيضا باسم "شريط عظمي". اعتمادا على حجمها وموقعها داخل لوحة النمو، يمكن أن يؤدي شريط عظمي إلى تشوهات الزاوي أو وقف النمو الكامل، وهو عقبة مدمرة للأطفال الصغار التي لم تصل بعد ارتفاعها الكامل 7 .

لا يوجد حاليا أي علاج يمكن أن إصلاح تماما لوحة النمو المصاب. مرة واحدة أشكال شريط عظمي، يجب على الطبيب يقرر ما إذا كان أو لم يكن جراحيا إزالته 8 . المرضى الذين يعانون من 2 سنوات على الأقل أو 2 سم من النمو الهيكل العظمي المتبقية ومع شريط عظمي الذي يمتد أقل من 50٪ من منطقة لوحة النمو وعادة ما تكون مرشحة لعظم بار استئصال 8 . إزالة الجراحي من شريط عظمي في كثير من الأحيان تليها تدخل من الكسب غير المشروع الدهون الذاتية لمنع إصلاح الأنسجة العظمية والسماح لوحة النمو غير المصحوب المحيطة لاستعادة النمو. ومع ذلك، هذه التقنيات هي بروبلإماتيك وغالبا ما تفشل، مما يؤدي إلى تكرار عظمي بار واستمرار التأثير السلبي على النمو 9 . هناك حاجة ماسة لتطوير العلاجات الفعالة التي لا تمنع فقط تشكيل شريط عظمي، ولكن أيضا تجديد لوحة الغضروف النمو، وبالتالي استعادة استطالة العظام الطبيعية.

الآليات الجزيئية الكامنة وراء تشكيل شريط عظمي لم يتم توضيحها بالكامل. إن الفهم الأكبر لهذه الآليات البيولوجية يمكن أن يؤدي إلى تدخلات علاجية أكثر فعالية للأطفال الذين يعانون من إصابات لوحة النمو. منذ دراسة هذه الآليات في البشر من الصعب، وقد استخدمت نماذج حيوانية، وخاصة نموذج الفئران من إصابة لوحة النمو 10 ، 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 . الطريقة المعروضة في هذايصف ورقة كيف عيب حفرة في لوحة نمو الفخذ الظنبوب يؤدي إلى الأنسجة إصلاح يمكن التنبؤ بها وقابلة للتكرار التي تبدأ التحجر في وقت مبكر بعد 7 أيام بعد الإصابة ويشكل شريط عظمي ناضجة تماما مع إعادة عرض في 28 يوما بعد الاصابة 10 . وهذا يوفر حيوان صغير في نموذج الجسم الحي الذي لدراسة الآليات البيولوجية لتشكيل شريط عظمي، وكذلك لتقييم العلاجات الجديدة التي يمكن أن تمنع شريط عظمي و / أو تجديد غضروف لوحة النمو. على سبيل المثال، يمكن استخدام هذا النموذج لاختبار المواد الحيوية تشوندروجيك التي يمكن تجديد لوحة الغضروف النمو وتقديم علاج قيمة للأطفال الذين يعانون من إصابات لوحة النمو. سوف التقنيات المعروضة في هذه الورقة تصف الطرق الجراحية المستخدمة لإنتاج إصابة لوحة النمو والتسليم اللاحق من المواد الحيوية إلى موقع الإصابة. وسوف نناقش أيضا أساليب لتقييم تشكيل شريط عظمي وإصلاح الأنسجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يجب أن تتم الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل المؤسسة المحلية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (إاكوك). تمت الموافقة على بروتوكول الحيوان للإجراءات التالية من قبل جامعة كولورادو دنفر إاكوك.

1. الحصول على الفئران

ملاحظة: ما لم تكن هناك حاجة الحيوانات المعدلة وراثيا، 6 أسابيع من العمر، غير ناضجة عظاميا هناك حاجة الفئران سبراغ-داولي في وقت الجراحة. ويمكن استخدام سلالات أخرى؛ ومع ذلك، فإن غالبية الدراسات المنشورة أجريت على الفئران سبراغ-داولي.

2. إعداد اللوازم الجراحية

  1. الأوتوكلاف حزم الجراحية العرض التي تشمل واحدة من كل من التالي: # 3 مشرط مقبض، حامل إبرة، ملقط أدسون، ومقص القزحية.
  2. الأوتوكلاف خراطيش الحفر بدون مفتاح. قد تكون خراطيش الحفر حبة تعقيم بين العمليات الجراحية الحيوانية عند التشغيل على الحيوانات متعددة.
    ملاحظة: قواعد إاكوك المحلية المتعلقة باستخدام سورج العقيمةيجب الالتزام بأدوات إيكال على الحيوانات المتعددة. على سبيل المثال، جامعة كولورادو دنفر إاكوك يسمح لمجموعة أداة جراحية واحدة لاستخدامها على ما يصل إلى 5 حيوانات قبل التوقف عنها. وعلاوة على ذلك، يجب أن تكون الأدوات الجراحية تعقيم الحرارة باستخدام معقم حبة بين الحيوانات. يجب استخدام حزم جراحية معقمة إضافية لأي حيوانات إضافية.
  3. الأوتوكلاف 5 سم دبابيس ستاينمان، واحد لكل حيوان.
    ملاحظة: للحد من خطر العدوى، يجب أن لا تستخدم دبابيس شتاينمان للحيوانات متعددة.
  4. الأوتوكلاف 1.8 ملم الجنين الأسنان، واحدة لكل حيوان.
    ملاحظة: للحد من خطر العدوى، لا يجوز استخدام الجراب الأسنان لحيوانات متعددة.
  5. الأوتوكلاف قضيب قضيب الجرح، إن وجدت. بدلا من ذلك، يمكن استخدام الغرز المدفونة لإغلاق الطبقة الجلدية. راجع الخطوة 7.3.
  6. إذا كان ذلك ممكنا، تعقيم الحفر الدوارة باستخدام التشعيع أو تعقيم الغاز.
  7. جمع اللوازم الإضافية التالية: ماكينة حلاقة كهربائية، ستيريل 3-0 خياطة حمض بوليجليكوليك، شاش معقم، بوفيدون اليود، محلول ملحي معقم، محاقن معقمة 10 مل، معقمة الإبر 23 مقياس، مسحات الأيزوبروبيل، إيسوفلوران، الفرجار والمسكنات بعد الجراحة (على سبيل المثال، المسكنات والبوبرينورفين)، والستائر الجراحية المعقمة، والقفازات الجراحية المعقمة، شفرات العقيمة رقم 15، مشابك الجرح المعقمة، آلة التخدير، معقم حبة، وسادة الاحترار، وندربادس ماص.

3. التخدير وإعداد الحيوانات

  1. تخدير الحيوان عن طريق إدخاله إلى غرفة الاستقراء 1- 2-L تلقي 1 لتر / دقيقة تدفق الأكسجين مع 5٪ إيسوفلوران من نظام التبخر مع نظام الكسح السلبي.
    ملاحظة: التعرض ل 5٪ إيسوفلوران يجب تخدير الفئران 6 أسابيع في غضون 5 دقائق.
  2. نقل الحيوان إلى الموقع الجراحي والحفاظ على الحيوان تحت التخدير مع 2 - 3٪ إيسوفلوران باستخدام مخروط الأنف لبقية الإجراء. وضع مستلق الحيوان على وسادة الاحترار وامتصاصإن وندرباد.
    ملاحظة: الحيوان لا تحتاج إلى أن تكون ثابتة إلى الجدول الجراحي. عقد الساق كما هو محدد في الخطوات أدناه هو وسيلة كافية لتحقيق الاستقرار.
    ملاحظة: جميع الإجراءات اللاحقة يجب القيام به مع الحيوان تحت التخدير. 2 - 3٪ إيسوفلوران يجب أن تكون كافية للحفاظ على التخدير في الفئران في هذا العصر. ويمكن تأكيد هذا عن طريق اختبار رد الفعل الانسحاب من ذوات القدمين.
  3. إدارة المسكنات أثناء العملية وفقا للسياسات المعتمدة من الناحية المؤسسية (على سبيل المثال البوبرينورفين في 0.05 ملغ / كغ و كاربروفين في 5 ملغ / كلغ).

4. إعداد تيبيا للجراحة

  1. يحلق الساق الخلفية بأكملها (ق) من الكعب الإنسي إلى الحوض مع ماكينة حلاقة كهربائية.
  2. قياس وتسجيل طول الظنبوب من هضبة الظنبوب الأمامي إلى الجانب السفلي من الكعب الإنسي باستخدام الفرجار. بدلا من ذلك، وقياس طول الظنبوب كله باستخدام الأشعة السينية أو ميكروكت 11 سوب> ، 12 ، 14 . اختياريا، وقياس أبعاد لوحة النمو قبل الجراحة باستخدام الأشعة السينية أو ميكروكت.
  3. تنظيف الموقع الجراحي عن طريق مسح الساق كامل (ق) والبطن، والأعضاء التناسلية مع مسحات الكحول ثم مع الشاش بوفيدون اليود غارقة.
    ملاحظة: للحد من خطر العدوى، يجب أن تتم جميع الإجراءات اللاحقة، حتى يتم إزالة الحيوان من التخدير (الخطوة 7.4)، في ظل ظروف معقمة. يجب الوصول إلى جميع المواد الجراحية باستخدام تقنية معقمة. ينصح بشدة استخدام مساعد جراحي للحفاظ على العقم طوال الجراحة.
  4. يرتدي قفازات جراحية معقمة، ضع ثنى جراحية معقمة مثقبة فوق الحيوان، تاركا الساق (الساق) التي تتعرض من خلال التسطيح المركزي.

5. الإجراء الجراحي للوصول إلى لوحة النمو

_upload / 55571 / 55571fig1.jpg "/>
الشكل 1: نظرة عامة على الإجراء الجراحي.
أ)
موقع عدة علامات التشريحية المستخدمة لخلق ناجحة إصابة لوحة النمو. كبسولة الركبة هي على الفور الخلفي إلى الرضفة (أبيض)، وفصل الساق من عظم الفخذ. ويمكن رؤية لوحة النمو الظنبوبي (الأحمر الداكن) أدنى من الركبة والتحايل على الساق. لوحة النمو القريبة هي طائرة مسطحة في الغالب، باستثناء الربع الأمامي الذي يشكل طائرة قطري. ويشكل تقاطع هاتين الطائرتين زاوية لوحة النمو، التي تستخدم لتدوير الحفر المناسب. الإدراج سيميتندينوسوس هو حيث تدرج عضلات الفخذ في الساق الخلفي. ب) شق من خلال الجانب الأمامي-الإنسي من الأنسجة اللينة الظنبوب للوصول إلى العظام القشرية. C) موقع النافذة القشرية باستخدام محاذاة مع الإدراج سيميتندينوسوس البعيدة كنقطة مرجعية. د) التقييموعمق الإصابة عن طريق محاذاة شطبة على بر الأسنان مع النافذة القشرية.

  1. جعل شق ~ 1 سم من خلال الجلد على طول الجانب الإنسي الأمامي من الساق القريبة باستخدام مقبض مشرط # 3 و # 15 شفرة، بدءا من نهاية البعيدة من اللقمة الفخذ الإنسي ( الشكل 1A ).
    1. سحب الجلد ضيق ضد العظام الكامنة وعقد الساق بحزم أثناء إجراء شق.
      ملاحظة: هذا سوف تبقي شق الجلد في الموقع المطلوب، وسوف تساعد في إنشاء شق نظيفة. لا تضغط بقوة مع مشرط لتجنب ثقب كبسولة في الركبة، الأمر الذي يؤدي إلى نزيف وافر وسوف تجعل الخطوات المتبقية صعبة.
  2. جعل علما علامات التشريحية الهامة، بما في ذلك: 1) لوحة النمو، 2) لوحة النمو زاوية، 3) في كبسولة الركبة، و 4) الإدراج سيميتندينوسوس ( الشكل 1A ).
  3. باستخدام مشرط، وجعل ~ 0.5 سم شق خلال ثه فاسيا والأنسجة الرخوة على الجانب الإنسي الأمامي من الساق القريبة، من لوحة النمو إلى الجزء السفلي من شق الجلد ( الشكل 1B ).
  4. تشريح بلطف أو كشط بعيدا اللفافة والأنسجة الرخوة من الساق باستخدام مشرط ( الشكل 1B ).
    ملاحظة: من المهم لإزالة أو كشط الكثير من الأنسجة الرخوة من الساق ممكن حتى لا تتداخل مع خطوات الحفر.
  5. حفر نافذة القشرية من خلال العظام القشرية الظنبوب في ديافيسيس مع دبوس شتاينمان تعلق على أداة دوارة في 10،000 دورة في الدقيقة (سرعة منخفضة من أداة دوارة محددة في قسم المواد). إنشاء نافذة القشرية بحيث يتوافق مع الإدراج سيميتندينوسوس البعيدة ( الشكل 1C ).
    1. عقد الحفر عمودي على انحلال الظنبوب وحفر ببطء، والحرص على عدم الحفر من خلال الجانب الآخر من ديافيسيس. يجب أن تكون نافذة القشرية فقط ~ 2 ملم في العمق، وسوف يتم عندما لاالمقاومة يشعر.
    2. كما هو مبين أعلاه، عقد الساق بقوة مع جهة أخرى.
      ملاحظة: يمكن استخدام برش الأسنان لهذه الخطوة. ومع ذلك، إذا تم استخدام برش الأسنان، يجب أن تعقد الساق بحزم جدا لجعل نافذة القشرية نظيفة ولضمان أن يستحوذ على بر ويقطع العظام في الموقع المطلوب. ويوصى دبوس شتاينمان لهذه الخطوة، نظرا لها قدرة القطع متفوقة.
  6. داب النافذة القشرية مع الشاش، كما من المتوقع نزيف خفيف.

6. خلق إصابة لوحة النمو

  1. إنشاء إصابة حفرة الحفر من خلال لوحة النمو المركزي باستخدام 1.8 ملم الأسنان الأسنان تعلق على أداة دوارة.
    ملاحظة: العمق الصحيح، وزاوية، والاتجاه هي حاسمة في تعطيل لوحة النمو المركزي ( الشكل 1C و D ). وترد أدناه تعليمات للحصول على العمق والزاوية والاتجاه المناسبين.
    1. لقياس العمق المناسب باستخدام بور الأسنان، بيجين عن طريق محاذاة نهاية بر الأسنان مع الساق القريبة، حيث سيميتندينوسوس يعبر كبسولة في الركبة ( الشكل 1C ).
    2. مع نهاية برغي الأسنان في كبسولة الركبة، اتبع رمح رمح على طول سيميتندينوسوس وجعل علما من حيث يتوافق مع نافذة القشرية. هذا هو العمق المناسب للبر لتعطيل تماما لوحة النمو دون تعطيل سطح مفصلي ( الشكل 1C ).
      ملاحظة: يستخدم برش الأسنان لقياس العمق المناسب. قد يتم وضع علامة على علامة بر مع علامة دائمة في المكان الذي يتوافق مع نافذة القشرية للإشارة إلى عمق أثناء الحفر. ومع ذلك، إذا كانت علامات التشريحية والبروتوكول أعلاه المشار إليها عن كثب، فإن شطبة الأولى على جراب الأسنان المحدد هنا (FG6) محاذاة بشكل مناسب مع نافذة القشرية (كما هو موضح في الشكل 1C ).
    3. لتحقيق زاوية الحفر المناسبة، عقد الأداة الدوارة في زاوية أقل tهان 30 ° فيما يتعلق ديافيسيس الظنبوب.
      ملاحظة: هذا هو تقريب البصرية.
    4. لتحقيق الاتجاه الحفر المناسبة، وتهدف إلى زاوية لوحة النمو ( الشكل 1C ). رسم خط البصرية على طول برش الأسنان إلى زاوية لوحة النمو للمساعدة في خلق عيب مركزي.
    5. بدوره على أداة دوارة إلى 10،000 دورة في الدقيقة (سرعة منخفضة من أداة دوارة محددة في قسم المواد) قبل دخول النافذة القشرية.
    6. مع أداة دوارة في زاوية والاتجاه المناسب، أدخل نافذة القشرية ودفع الأداة الدوارة حتى محاذاة علامة بور مع نافذة القشرية. مرة واحدة يتم تحقيق العمق الصحيح، وإزالة أداة دوارة.
      ملاحظة: أداء تعطل لوحة النمو في واحد، والحركة السريعة، وذلك باستخدام الحد الأدنى من الوقت مع بور في لوحة النمو من أجل خلق إصابة نظيفة. وهذا مهم لتحليل البيانات.
  2. داب نافذة القشرية مع الشاش لمدة 30 ثانية ~، كما هو متوقع النزيف.
  3. ضمان العمق المناسب للإصابة عن طريق قياس مرة أخرى طول بر (الخطوة 6.1.2).
    1. إدراج بر في مسار الحفر (مع إيقاف أداة دوارة) ومحاذاة بر ملحوظ مع نافذة القشرية ( الشكل 1D ).
  4. إذا كان عمق غير كافية، وتحويل الأداة الدوارة على ودفع إلى العمق المطلوب.
    ملاحظة: على الرغم من أن جولة ثانية من الحفر ليست مثالية، تعطل تماما لوحة النمو أمر بالغ الأهمية لتطوير شريط عظمي.
  5. شطف المسار الحفر مع ~ 3 مل من محلول ملحي معقم باستخدام حقنة 10 مل و إبرة قياس 23.
  6. تجفيف الجرح مع الشاش.

7. إجراءات ما بعد الاصابة

  1. إذا كان تقييم العلاج لوحة النمو القائم على المواد الحيوية، وضخ المواد الحيوية من خلال مسار الحفر في موقع الإصابة باستخدام إبرة الحجم المناسب (18- إلى 26 قياس، اعتمادا على اللزوجة المواد البيولوجية).
    ملاحظة: حجم الاصابة لوحة النمو هو ~ 3 و #181؛ L، وحجم مسار الحفر هو ~ 20 ميكرولتر. الحد الأقصى لحجم المواد التي يمكن حقنها في إصابة لوحة النمو وحفر المسار بين 20 و 25 ميكرولتر.
  2. إغلاق الجرح عن طريق خياطة اللفافة مع خيوط حمض 3-0 بوليجليكوليك. تطبيق الشمع العظام على النافذة القشرية لعزل العظام الكامنة (اختياري).
  3. إغلاق شق الجلد مع الغرز المدفونة أو مقاطع الجرح.
    ملاحظة: ينصح مقاطع الجرح، والحيوان سوف الصفر في موقع الإصابة وربما فتح الجرح.
  4. إزالة الحيوان من التخدير إيسوفلوران، ووضعه على بطانية الاحترار، ورصد ذلك حتى يكون مستيقظا.
  5. للحد من خطر العدوى، ووضع الحيوان في قفص جديد يحتوي على الجافة، وتعقيمها الفراش.
  6. السماح للحيوان على تحمل الوزن بعد الجراحة.
  7. مراقبة الحيوان كل 12 ساعة لمدة 72 ساعة بعد الجراحة للتحقق من وجود علامات العدوى، لضمان أن تبقى مقاطع الجرح في مكانها، وإدارة بوستوبيراتيف(على سبيل المثال البوبرينورفين عند 0.05 ملغم / كغم كل 12 ساعة لمدة 36 ساعة و كاربروفين عند 5 ملغم / كغم كل 24 ساعة لمدة 72 ساعة).
  8. إزالة مقاطع الجرح 10-14 أيام بعد الجراحة تحت التخدير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نجاح إصابة لوحة النمو باستخدام هذا الأسلوب ينطوي على تعطيل مركز لوحة النمو الظنبوبي دون تعطيل سطح الغضروف المفصلي. وقد تم الإبلاغ عن الأنسجة إصلاح عظمي لتبدأ في حوالي 7 أيام بعد الإصابة ويصبح تطويرها بالكامل من قبل 28 يوما بعد الإصابة 13 ، كما تصور بواسطة التصوير المقطعي الصغير (كت الصغيرة) ( الشكل 2 ). على الرغم من أن هذه النقاط الزمنية تم اختيارها هنا لعرض بداية ونضج تشكيل العظام على أساس البيانات المنشورة سابقا، ويمكن استخدام نقاط زمنية أخرى للتحقيق في مراحل مختلفة من عملية الإصلاح، من يوم 1 إلى 6 أشهر بعد الجراحة 17 . الجدول 1 يعطي لمحة عامة عن تشكيل حجم العظام داخل لوحات نمو الفئران المصابة جراحيا 28 يوما بعد الجراحة من ثلاثة أشواط مستقلة عن طريق توفير (1) جزء حجم العظام داخل لوحة النمو بأكملها و (2) بون حجم جزء داخل منطقة إصلاح الأنسجة فقط 15 . يتم الإبلاغ عن البيانات على أنها متوسط ​​النسبة المئوية ± الانحراف المعياري وتشير إلى أنه تم الحصول على نتائج مماثلة بين أشواط مستقلة. وقد تم تحليل التباين بين مختلف المسارات بتحليل التباين في اتجاه واحد (أنوفا) ولا يظهر فرق ذو دلالة إحصائية بين الجري، مما يشير إلى استنساخ النموذج. أسيان الأزرق الهيماتوكسيلين (أبه) مع أورانج G / يوسين كونترستين 18 استخدمت لتشريحيا تظهر مجموعة متنوعة من أنسجة الإصلاح في مراحل مختلفة من تشكيل شريط عظمي ( الشكل 2 ). باستخدام هذا وصمة عار النسيجية، ويمكن تحديد أنواع مختلفة من الأنسجة إصلاح، بما في ذلك الوسيطة، غضروفي، التربيق العظمي، ونخاع العظام وكميت 16 .

قد تنشأ عدة مشاكل من اتباع الإجراءات المذكورة أعلاه بشكل غير صحيح. أنوريفي لن عمق الحفر نت لا تعطل لوحة النمو، الأمر الذي سيؤدي إلى تشكيل شريط عظمي قليل أو معدوم. تعطيل سطح الغضروف المفصلي يخلق إصابة أكبر التي يمكن أن تقدم الغضروف المفصلي في موقع إصابة لوحة النمو، تعقيد عملية الشفاء ( الشكل 3A ). تعطيل لوحة النمو في زاوية غير مناسبة أو الاتجاه يؤدي إلى إصابة غير المركزية ( الشكل 3B ). في هذه الحالة، وسوف تشكل تشكيل عظمي لا يزال يحدث، على الرغم من أنه سيكون الجانبي أو وسطي إلى الموقع المطلوب. عموما، يمكن تحليل الأنسجة التي تشكلت بعد إصابة لوحة النمو في مجموعة متنوعة من الطرق، بما في ذلك ميكروس، الكمي ير، تلطيخ النسيجي، والمناعية. بالإضافة إلى القياسات النسيجية والجزيئية، وطول الأطراف وقياسات لوحة النمو توفر مقياسا هاما لنمو العظام كله. وقد تم الإبلاغ عن الأطراف المتضررة لتجربة خفض النمو مقارنة مع أطراف السيطرة غير المصابة> 13. طول طول يمكن قياسها في تيمبوانتس مختلفة طوال مسار الدراسة باستخدام الصور ميكروكت للتحقيق في التناقضات طول أطرافه 14 . وتشمل أمثلة النقاط الزمنية المستخدمة سابقا 28 يوما و 56 يوما بعد الإصابة. قياسات لوحة النمو، بما في ذلك الارتفاع الكلي، مرتفعات المناطق، وتشكيل الحبل، ويمكن أيضا توفير معلومات هامة عن عملية إصلاح الأنسجة 13 ، 14 ، 15 . من الناحية المثالية، ينبغي للمرء أن تأخذ أطوال أطرافهم وقياسات لوحة النمو قبل الجراحة أن يكون لها قيمة خط الأساس. لمواصلة توضيح الآليات البيولوجية أو لاختبار فعالية العلاج، ينبغي أن تصمم مجموعات السيطرة المناسبة وتشمل الأطراف غير المتضررة والأطراف التي خضع لعملية جراحية ولكن تركت دون علاج.

ويمكن أيضا أن يتم اختبار المواد الحيوية في هذا النموذج إصابة لوحة النمو. وكمثال على ذلك، تشي تم حقن توسان ميكروجيل 19 في موقع إصابة لوحة النمو، كما هو موضح في الخطوة 7.1، وينظر بوضوح في موقع الإصابة في الشكل 4 . التحليل اللاحق قد ينطوي على تحديد آثار المواد الحيوية على إصلاح تكوين الأنسجة، وطول أطرافه، وقياسات لوحة النمو، كما نوقش في وقت سابق.

الشكل 2
الشكل 2. النمو الناجح لوحة تعطل وتشكيل شريط عظمي.
وينظر تشكيل عظمي بار في 7 أيام بعد الإصابة مع ميكروكت وأكدت من خلال ألسيان الأزرق الهيماتوكسيلين (أبه) تلطيخ. شريط عظمي ناضجة تماما بعد يوم 28 بعد الإصابة، كما رأينا مع ميكروكت وتلطيخ أبه. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ضمن الصفحات = "1"> الشكل 3
الشكل 3. النتائج المحتملة للحفر غير صحيحة.
أ)
الحفر بعيدا جدا من خلال الساق يمكن أن تعطل السطح المفصلي، الأمر الذي يعقد عملية الشفاء وقد يؤدي إلى نتائج غير حاسمة. ب) تجزئة غير صحيحة من الحفر يمكن أن يؤدي إلى غير المركزية إصابة لوحة النمو. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4
الشكل 4. علاج إصابة لوحة النمو مع مادة بيولوجية.
يظهر تلطيخ أبه ميكروجيل الشيتوزان في لوحة النمو المصاب.

قياس تشغيل 1 تشغيل 2 تشغيل 3 P ذات القيمة
العظام حجم جزء داخل لوحة النمو كله 9.76 +/- 3.81٪ 10.52 +/- 4.06٪ 11.93 +/- 2.04٪ 0.5493
جزء حجم العظام داخل منطقة الأنسجة إصلاح 41.5 +/- 8.33٪ 46.08 +/- 10.12٪ 46.77 +/- 8.14٪ 0.5128

جدول 1. بيانات حجم وحدة العظام.
وكانت البيانات من الصور كت الصغيرة في 28 يوما بعد الإصابة على الفئران غير المعالجة من ثلاث أشواط مستقلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نموذج نمو إصابة لوحة الحيوان يضيف إلى حد كبير إلى فهمنا للآليات البيولوجية لهذه الإصابة، مما يحتمل أن يؤدي إلى التدخلات العلاجية أكثر فعالية للأطفال الذين يعانون من إصابات لوحة النمو. لإنشاء بنجاح شريط عظمي ودراسة تشكيله في الجسم الحي باستخدام النموذج المعروض في هذا العمل، فمن الأهمية بمكان لتعطيل لوحة النمو عن طريق الحفر إلى عمق كاف، دون تعطيل الغضروف المفصلي. الاختلاف في التنفيذ الجراحي بين الحيوانات، وبدرجة أقل، الاختلاف في علامات التشريحية قد يؤدي إلى نتائج إشكالية. نوصي ممارسة الإجراءات المذكورة أعلاه على الحيوانات الجدة لضمان نجاح نجاح لوحة النمو قبل تنفيذ الإجراء لدراسات الحيوانات الحية. في حين أن الحيوانات الجاذبة تفتقر إلى نسيج الأنسجة ولن تنزف، فإن إجراءات الإصابة لوحة النمو والخصائص التشريحية على هذه الحيوانات تكون مماثلة لتلك التي من الحيوانات الحية. Furtهيرمور، يمكن أن تشريح لوحة النمو الظنبوبي القحفي بسهولة، كما يفصل إبيفيسيس من الميتافيس من خلال تطبيق القوة الخفيفة، وموقع حفرة الحفر يمكن ملاحظتها. هذا التحليل السريع يسمح لتعديلات تقنية لتعلم عمق الحفر المناسب والتركيب على الحيوانات الجاد، دون الحاجة للتصوير.

وتجدر الإشارة إلى أن نماذج حيوانية أخرى من الإصابة لوحة النمو موجودة. وقد تم تنفيذ عيب ترانزفوسيل مماثل في الماوس وأدى إلى تشكيل عظمي بار 20 . على الرغم من حجمها أصغر، ويمكن أيضا أن تستخدم لدراسة الآليات التي تنطوي على تشكيل شريط عظمي. كولمان وآخرون . عن نموذج آخر من الفئران صالحة للإصابة لوحة النمو، حيث تم إنشاء عيب مركزي ترانزفوسيل في عظم الفخذ البعيدة عن طريق الحفر من خلال الغضروف المفصلي 21 . وأدى هذا النهج أيضا إلى تشكيل بار عظمي والطرف أطراف عدم المساواة، كما هو الحال فينموذج عرض هنا. وتشمل النماذج الحيوانية الأخرى من إصابة لوحة النمو والعلاج الأرانب 22 والخنازير 23 ، والأغنام 24 . في حين أن أكبر نماذج إصابة الحيوان قد تمثل عن كثب الإصابات السريرية، نموذج الفئران مفيد للبحث عن الآليات البيولوجية للإصابات فيزال. على سبيل المثال، تم استخدام نموذج الفئران هنا على نطاق واسع لدراسة الآليات الجزيئية للإصابة فيزال وعملية تشكيل شريط عظمي 10 ، 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 . وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام نموذج الفئران لاختبار مختلف العلاجات فيزال قبل الانتقال إلى نماذج حيوانية أكبر. ومع ذلك، فإن التحدي من هذا النموذج الفئران من إصابة لوحة النمو هو أن يتم الحفر داخل العظام، أماهالملك أنه من المستحيل أن نلاحظ حيث يقع حفرة الحفر داخل لوحة النمو. وبالتالي، يمكن تعطيل نجاح نجاح لوحة النمو على الحيوانات الحية فقط باستخدام تقنيات التصوير في وقت الجراحة أو من خلال تقييم تشكيل عظمي بار بين 7 إلى 28 يوما بعد الجراحة. مع الممارسة، درجة عالية من النجاح في الحصول على تشكيل شريط عظمي يمكن أن يتحقق، ولكن الدراسات المبكرة يمكن أن يؤدي إلى عدد من الحيوانات التي تفتقر إلى تشكيل شريط عظمي، ويرجع ذلك إما إلى لوحة النمو غير مصحوب أو لعدم كفاية تعطل النمو طبق.

هناك قيد آخر لهذا النموذج هو أن إصابات حفرة الحفر لا تمثل الإصابات لوحة النمو الطبيعي في الأطفال، والتي تحدث عادة بسبب كسر 25 . يمكن تصنيف الكسور داخل لوحة النمو باستخدام نظام تصنيف سالتر-هاريس 26 . النوع الثالث والكسور لوحة النمو من النوع الرابع تساهم الأكثر شيوعا للإصابات فيزال التي تؤديإلى تشكيل عظمي بار. نوع إصابة لوحة النمو المعروضة هنا يرتبط ارتباطا وثيقا إصابة لوحة نوع النمو السادس، فئة نادرة من الاصابة التي يتم إزالة فيسيس عن طريق الصدمة أو ثقب الجرح. ومع ذلك، منذ الآليات الفيزيولوجية المرضية الكامنة وراء تشكيل شريط عظمي بعد إصابة لوحة النمو لا تزال بعيد المنال، لا يزال نموذج الفئران المهم للكشف عن هذه العملية من أجل تطوير خيارات العلاج الجديدة للأطفال الذين يعانون من جميع أنواع إصابات لوحة النمو. الطريقة الموصوفة هنا بشكل موثوق يخلق شريط عظمي ويمكن استخدامها لدراسة جوانب متعددة من عملية إصلاح إصابة لوحة النمو في الجسم الحي 17 ، 27 ، 28 ، 29 ، 30 ، 31 ، 32 . وقد تبين أيضا أن هذا النموذج الفئران يؤدي إلى انخفاض نمو الظنبوب بعد لوحة النمو فيلجنة التحكيم 13 ، مما يجعلها نموذج الحيوان أكثر إثارة للاهتمام لاختبار خيارات العلاج الجديدة التي تؤدي إلى تجديد لوحة النمو والاستعادة المحتملة لاستطالة العظام.

في الختام، هذه الورقة تفاصيل الطرق لخلق نموذج إصابة لوحة النمو التي للتحقيق تشكيل عظمي بار والعلاجات المحتملة للإصابات لوحة النمو في الجسم الحي. هذا النموذج الفئران يسمح لدراسات غير مكلفة وسريعة نسبيا، بالنظر إلى أن شريط عظمي ناضجة تماما 28 يوما بعد إصابة لوحة النمو. بالإضافة إلى تطوير فهمنا للآليات الجزيئية لتشكيل شريط عظمي في الجسم الحي ، ويمكن استخدام هذا النموذج لاختبار المواد الحيوية التي تمنع تشكيل شريط عظمي وتشجيع النمو لوحة الغضروف التجديد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

ويعترف المؤلفون بدعم التمويل من المعهد الوطني لالتهاب المفاصل والأمراض العظمية الهيكلية والجلدية في المعاهد الوطنية للصحة (نيه) بموجب الجائزة رقم R03AR068087، وصندوق الإثراء الأكاديمي من كلية الطب كولورادو جامعة، ومركز غيتس للطب التجديدي . وأيد هذا العمل أيضا من قبل المعاهد الوطنية للصحة / نكاتس كولورادو كتسا رقم المنحة UL1 TR001082. محتويات هي مسؤولية المؤلفين وحدها ولا تمثل بالضرورة وجهات نظر المعاهد الوطنية للصحة الرسمية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scalpel handle McKesson MCK42332500
Needle holder Stoelting RS-7824
Adson tissue forceps Sklar 50-3048
Iris Scissors Sklar 47-1246
Rotary Tool Dremel 7700 Variable speed rotary tool 
Keyless Rotary Tool Chuck Dremel 4486
Dental Burs Dental Burs USA FG6 Round carbide bur, ≤2mm
Steinmann pins Simpex Medical T-078
Hair clippers Wahl  5537N
3-0 PGA surutes Oasis MV-J398-V
Sterile gauze 2 x 2" Covidien 441211
Povidone Iodine McKesson 922-00801
Sterile saline Vetone 510224
10 mL luer lock syringe Becton Dickinson 309604
23 gauge needle Becton Dickinson 305145
Isopropyl alcohol pads Dynarex 1113
Isoflurane IsoFlo 30125-2
Caliper Mitutoyo 500-196-30
Carprofen Rimadyl 27180
Buprenorphine Par Pharmaceuticals Inc NDC 42023-179
Fenestrated Surgical Drape McKesson 25-517
Surgical Gloves Uline S-20204
#15 Scalpel Blade Aven 44044
9 mm wound clips Fine Science Tools 12032-09
Reflex clip applier World Precision Instruments 500345
Absorbant underpads McKesson MON 43723110
Tec 3 Iso Vaporizer  VetEquip 911103 
Germinator 500 Braintree Scientific GER 5287-120V
Warm water recirculator Kent Scientific TP-700
Absorbent Underpads Medline Industries MSC281230

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mann, D. C., Rajmaira, S. Distribution of physeal and nonphyseal fractures in 2,650 long-bone fractures in children aged 0-16 years. J Pediatr Orthop. 10, (6), 713-716 (1990).
  2. Browne, L. P., et al. Community-acquired staphylococcal musculoskeletal infection in infants and young children: necessity of contrast-enhanced MRI for the diagnosis of growth cartilage involvement. AJR Am J Roentgenol. 198, (1), 194-199 (2012).
  3. Weitao, Y., Qiqing, C., Songtao, G., Jiaqiang, W. Epiphysis preserving operations for the treatment of lower limb malignant bone tumors. Eur J Surg Oncol. 38, (12), 1165-1170 (2012).
  4. Butler, M. S., Robertson, W. W., Rate, W., D'Angio, G. J., Drummond, D. S. Skeletal sequelae of radiation therapy for malignant childhood tumors. Clin Orthop Relat Res. (251), 235-240 (1990).
  5. Shapiro, F. Longitudinal growth of the femur and tibia after diaphyseal lengthening. J Bone Joint Surg Am. 69, (5), 684-690 (1987).
  6. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423, (6937), 332-336 (2003).
  7. Dodwell, E. R., Kelley, S. P. Physeal fractures: basic science, assessment and acute management. Orthopaedics and Trauma. 25, (5), 377-391 (2011).
  8. Khoshhal, K. I., Kiefer, G. N. Physeal bridge resection. J Am Acad Orthop Surg. 13, (1), 47-58 (2005).
  9. Hasler, C. C., Foster, B. K. Secondary tethers after physeal bar resection: a common source of failure. Clin Orthop Relat Res. (405), 242-249 (2002).
  10. Xian, C. J., Zhou, F. H., McCarty, R. C., Foster, B. K. Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site. J Orthop Res. 22, (2), 417-426 (2004).
  11. Chen, J., et al. Formation of tethers linking the epiphysis and metaphysis is regulated by vitamin d receptor-mediated signaling. Calcif Tissue Int. 85, (2), 134-145 (2009).
  12. Coleman, R. M., Schwartz, Z., Boyan, B. D., Guldberg, R. E. The therapeutic effect of bone marrow-derived stem cell implantation after epiphyseal plate injury is abrogated by chondrogenic predifferentiation. Tissue Eng Part A. 19, (3-4), 475-483 (2013).
  13. Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. The potential role of VEGF-induced vascularisation in the bony repair of injured growth plate cartilage. J Endocrinol. 221, (1), 63-75 (2014).
  14. Coleman, R. M., et al. Characterization of a small animal growth plate injury model using microcomputed tomography. Bone. 46, (6), 1555-1563 (2010).
  15. Macsai, C. E., Hopwood, B., Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. Structural and molecular analyses of bone bridge formation within the growth plate injury site and cartilage degeneration at the adjacent uninjured area. Bone. 49, (4), 904-912 (2011).
  16. Su, Y. W., et al. Neurotrophin-3 Induces BMP-2 and VEGF Activities and Promotes the Bony Repair of Injured Growth Plate Cartilage and Bone in Rats. J Bone Miner Res. (2016).
  17. Zhou, F. H., Foster, B. K., Sander, G., Xian, C. J. Expression of proinflammatory cytokines and growth factors at the injured growth plate cartilage in young rats. Bone. 35, (6), 1307-1315 (2004).
  18. Sayers, D., Volpin, G., Bentley, G. The demonstration of bone and cartilage remodelling using alcian blue and hematoxylin. Biotechnic & Histochemistry. 63, (1), 59-63 (1988).
  19. Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
  20. Lee, M. A., Nissen, T. P., Otsuka, N. Y. Utilization of a murine model to investigate the molecular process of transphyseal bone formation. J Pediatr Orthop. 20, (6), 802-806 (2000).
  21. Coleman, R. M., et al. Characterization of a small animal growth plate injury model using microcomputed tomography. Bone. 46, (6), 1555-1563 (2010).
  22. Lee, S. U., Lee, J. Y., Joo, S. Y., Lee, Y. S., Jeong, C. Transplantation of a Scaffold-Free Cartilage Tissue Analogue for the Treatment of Physeal Cartilage Injury of the Proximal Tibia in Rabbits. Yonsei Med J. 57, (2), 441-448 (2016).
  23. Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 156, (2), 128-134 (2012).
  24. Hansen, A. L., et al. Growth-plate chondrocyte cultures for reimplantation into growth-plate defects in sheep. Characterization of cultures. Clin Orthop Relat Res. (256), 286-298 (1990).
  25. Cepela, D. J., Tartaglione, J. P., Dooley, T. P., Patel, P. N. Classifications In Brief: Salter-Harris Classification of Pediatric Physeal Fractures. Clin Orthop Relat Res. (2016).
  26. Salter, R. B., Harris, W. R. Injuries Involving the Epiphyseal Plate. The Journal of Bone & Joint Surgery. 83, (11), 1753 (2001).
  27. Chung, R., Foster, B. K., Zannettino, A. C., Xian, C. J. Potential roles of growth factor PDGF-BB in the bony repair of injured growth plate. Bone. 44, (5), 878-885 (2009).
  28. Fischerauer, E., Heidari, N., Neumayer, B., Deutsch, A., Weinberg, A. M. The spatial and temporal expression of VEGF and its receptors 1 and 2 in post-traumatic bone bridge formation of the growth plate. J Mol Histol. 42, (6), 513-522 (2011).
  29. Chung, R., Cool, J. C., Scherer, M. A., Foster, B. K., Xian, C. J. Roles of neutrophil-mediated inflammatory response in the bony repair of injured growth plate cartilage in young rats. J Leukoc Biol. 80, (6), 1272-1280 (2006).
  30. Chung, R., et al. Roles of Wnt/beta-catenin signalling pathway in the bony repair of injured growth plate cartilage in young rats. Bone. 52, (2), 651-658 (2013).
  31. Zhou, F. H., Foster, B. K., Zhou, X. F., Cowin, A. J., Xian, C. J. TNF-alpha mediates p38 MAP kinase activation and negatively regulates bone formation at the injured growth plate in rats. J Bone Miner Res. 21, (7), 1075-1088 (2006).
  32. Arasapam, G., Scherer, M., Cool, J. C., Foster, B. K., Xian, C. J. Roles of COX-2 and iNOS in the bony repair of the injured growth plate cartilage. J Cell Biochem. 99, (2), 450-461 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics