A Rat Tibial Growth Plate Skademodell för att karakterisera reparationsmekanismer och utvärdera tillväxtplattans regenereringsstrategier

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Tillväxtplattan är en broskig region i barnens långa ben där längsgående tillväxt uppstår. Vid skadade kan benvävnad bilda och försämra tillväxten. Vi beskriver en råttmodell av tillväxtplatta skada som leder till benaktig reparationsvävnad, vilket möjliggör studier av reparationsmekanismer och tillväxtplattans regenereringsstrategier.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Erickson, C. B., Shaw, N., Hadley-Miller, N., Riederer, M. S., Krebs, M. D., Payne, K. A. A Rat Tibial Growth Plate Injury Model to Characterize Repair Mechanisms and Evaluate Growth Plate Regeneration Strategies. J. Vis. Exp. (125), e55571, doi:10.3791/55571 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En tredjedel av alla pediatriska frakturer inbegriper tillväxtplattan och kan resultera i nedsatt benväxt. Tillväxtplattan (eller physis) är broskvävnad som finns i slutet av alla långa ben hos barn som är ansvarig för longitudinell benväxt. En gång skadad kan broskvävnad inom tillväxtplattan genomgå för tidig nedbrytning och leda till oönskad benaktig reparationsvävnad, som bildar en "benig bar". I vissa fall kan denna beniga bar resultera i deformiteter i benstillväxten, såsom vinkeldisformiteter, eller det kan helt stoppa längsgående bentillväxt. Det finns för närvarande ingen klinisk behandling som fullständigt kan reparera en skadad tillväxtplatta. Att använda en djurmodell av tillväxtplåtsskada för att bättre förstå mekanismerna bakom bonybarbildning och för att identifiera sätt att hämma det är ett utmärkt tillfälle att utveckla bättre behandlingar för tillväxtplattskador. Detta protokoll beskriver hur man förstör råttans proximala tibialväxtplatta med hjälp av en borrhålsdefekt. Denna smaLl djurmodell ger tillförlitligt en benstång och kan resultera i tillväxtdeformiteter som liknar dem som ses hos barn. Denna modell möjliggör en undersökning av de molekylära mekanismerna för benformning och fungerar som ett medel för att testa potentiella behandlingsalternativ för skador på tillväxtplåten.

Introduction

Växthuvudskador utgör 30% av alla pediatriska frakturer och kan leda till nedsatt bentillväxt 1 . Utöver sprickor kan växtskador orsakas av andra etiologier, inklusive osteomyelit 2 , primära bentumörer 3 , strålning och kemoterapi 4 och iatrogent skada 5 . Tillväxtplattan (eller physis) är en broskregion i slutet av barnens långa ben som är ansvarig för longitudinell benväxt. Det driver benförlängning genom endokondralbenifikation Kondrocyter genomgår proliferation och hypertrofi och omformas därefter genom inkommande osteoblaster för att bilda trabekulärt ben 6 . Tillväxtplattan är också ett svagt område av det utvecklande skelettet, vilket gör det benäget för skada. Den största oro med odlingsplättfrakturer eller skador är att den skadade broskvävnaden inom tillväxtplattan kan bE ersatt med oönskad benaktig reparationsvävnad, även känd som en "benig bar". Beroende på storlek och plats inom odlingsplattan kan den beniga stången leda till vinkeldeformiteter eller fullständig tillväxtstopp, en förödande följd för unga barn som ännu inte har nått sin fulla höjd 7 .

Det finns för närvarande ingen behandling som helt kan reparera en skadad tillväxtplatta. När den beniga baren bildats måste läkaren bestämma huruvida den ska avlägsnas kirurgiskt 8 eller ej. Patienter med minst 2 år eller 2 cm kvarvarande skeletttillväxt och med en benstång som sträcker sig mindre än 50% av tillväxtplattområdet är vanligen kandidater till benstångsresektion 8 . Kirurgisk avlägsnande av benbenet följs ofta av införlivande av ett autologt fetttransplantat för att förhindra reformering av benvävnaden och att tillåta den omgivande oinjorda tillväxtplattan att återställa tillväxten. Emellertid är dessa tekniker problEmatisk och misslyckas ofta, vilket leder till återkommande benstängning och fortsatt negativ effekt på tillväxten 9 . Det finns ett kritiskt behov av att utveckla effektiva behandlingar som inte bara förhindrar benformig barbildning, men också förnyar tillväxtbruskbrosk, vilket återställer normal benöjning.

De molekylära mekanismer som ligger till grund för bonybarbildningen har ännu inte klarlagts fullständigt. En större förståelse för dessa biologiska mekanismer kan leda till effektivare terapeutiska ingrepp för barn som lider av skador på tillväxtplåten. Eftersom studier av dessa mekanismer hos människor är svåra har djurmodeller använts, särskilt råttmodellen för tillväxtplattskada 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Metoden som presenteras i dettaPapper beskriver hur en borrhålskada i råtta-tibialtillväxtplattan leder till förutsägbar och reproducerbar reparationsvävnad som börjar ossifiera så tidigt som 7 dagar efter skada och bildar en helt mogen benig bar med ombyggnad 28 dagar efter skada 10 . Detta ger en in vivo- modell med ett litet djur för att studera de biologiska mekanismerna för benformig barbildning, samt att utvärdera nya terapier som kan förhindra den beniga baren och / eller regenerera tillväxtplattskroken. Till exempel kan denna modell användas för att testa kondrogena biomaterial som kan regenerera tillväxtbruskbrosk och erbjuda värdefull behandling för barn som lider av skador på tillväxtplåten. De tekniker som presenteras i denna uppsats kommer att beskriva de kirurgiska metoder som används för att producera tillväxtplattskadorna och den efterföljande tillförseln av biomaterial till skadningsstället. Vi kommer också att diskutera metoder för att bedöma bony bar formation och reparera vävnad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurprocedurer måste godkännas av den lokala institutionella djurvårds- och användningskommittén (IACUC). Djurprotokollet för följande förfarande godkändes av University of Colorado Denver IACUC.

1. få råttor

OBS! Om inte genetiskt modifierade djur är önskade behövs 6 veckors gamla, skelettmogena Sprague-Dawley-råttor vid operationen. Andra stammar kan potentiellt användas. Emellertid har majoriteten av publicerade studier utförts på Sprague-Dawley-råttor.

2. Förberedelse av kirurgiska förnödenheter

  1. Autoklaver kirurgiska förpackningar som innehåller en av följande: # 3 skalpellhandtag, nålhållare, Adson tang och iris sax.
  2. Autoklavera de nyckelfria borrblocken. Borrblock kan vara pärlsteriliserad mellan djuroperationer när de används på flera djur.
    OBS: Lokala IACUC-regler som gäller användningen av steril surgIcal verktyg på flera djur måste följas. Till exempel tillåter University of Colorado Denver IACUC att ett kirurgiskt verktyg som ska användas på upp till 5 djur före avbrottet. Vidare måste kirurgiska verktyg värmesteriliseras med användning av en pärlsterilisator mellan djur. Ytterligare sterila kirurgiska förpackningar måste användas för några ytterligare djur.
  3. Autoklaver 5 cm Steinmann stift, en för varje djur.
    OBS! För att minska risken för infektion, får Steinmann-stiften inte användas för flera djur.
  4. Autoklaver 1,8 mm tandborstar, en för varje djur.
    OBS! För att minska risken för infektion, får tandborsten inte användas för flera djur.
  5. Autoklavera en sårklämapplikator, om tillämpligt. Alternativt kan begravda suturer användas för att stänga det kutana skiktet. Se steg 7.3.
  6. Om möjligt sterilisera en roterande borr med användning av bestrålning eller gassterilisering.
  7. Samla följande extra tillbehör: elektrisk rakapparat, steRile 3-0 polyglykolsyra suturer, steril gasbindning, povidon-jod, steril saltlösning, sterila 10 ml sprutor, sterila 23-gauge nålar, isopropylalkoholservetter, isofluran, kalipirer, postkirurgiska analgetika ( t.ex. NSAID och buprenorfin), Sterila kirurgiska draperier, sterila kirurgiska handskar, sterila # 15 skalpskovlar, sterila sårklämmor, anestesimaskin, pärlsterilisator, uppvärmningsplatta och absorberande underlag.

3. Narkos och beredning av djur

  1. Bedöda djuret genom att introducera det till en 1- till 2-L induktionskammare som tar emot 1 liter / min syreflöde med 5% isofluran från ett förångningssystem med ett passivt avskiljningssystem.
    OBS! Exponering för 5% isofluran bör bedövas 6 veckor gamla råttor inom 5 minuter.
  2. Flytta djuret till operationsplatsen och håll djuret under anestesi med 2 - 3% isofluran med en näskegel för resten av proceduren. Placera djuret liggande på en värmeplatta och en absorberaEnt underpad.
    OBS: Djuret behöver inte fästas på operationsbordet. Att hålla benet enligt vad som anges i nedanstående steg är en tillräcklig stabiliseringsmetod.
    OBS: Alla efterföljande procedurer ska göras med djuret under anestesi. 2 - 3% isofluran ska vara tillräcklig för att upprätthålla anestesi hos råttor vid denna ålder. Detta kan bekräftas genom att testa den bipedala återtagningsreflexen.
  3. Administrera intraoperativa analgetika i enlighet med institutionellt godkänd policy ( t.ex. buprenorfin vid 0,05 mg / kg och carprofen vid 5 mg / kg).

4. Framställning av Tibia för kirurgi

  1. Raka hela bakbenet från medialmalleolus till bäckenet med en elektrisk rakapparat.
  2. Mät och registrera tibiallängden från den främre tibialplattan till den underliggande sidan av medialmalleolus med hjälp av kaliper. Alternativt mäta hela tibialängden med hjälp av röntgen eller microCT 11 Sup> , 12 , 14 . Eventuellt mäta tillväxtplattans dimensioner före operation med hjälp av röntgen eller microCT.
  3. Rengör den kirurgiska platsen genom att torka hela benet, buken och könsorganen med alkoholpinnen och sedan med povidon-jodtvattnat gasväv.
    OBS! För att minimera risken för infektion måste alla efterföljande procedurer, tills djuret är avlägsnat från anestesi (steg 7.4), utföras under sterila förhållanden. Alla kirurgiska material måste nås med steril teknik. Användningen av en kirurgisk assistent rekommenderas starkt för att bibehålla sterilitet under hela operationen.
  4. Bär sterila kirurgiska handskar, placera en fönstret steril kirurgisk draperi över djuret, vilket lämnar benet som utsätts genom den centrala fenestrationen.

5. Kirurgisk procedur för att komma åt tillväxtplattan

_upload / 55571 / 55571fig1.jpg "/>
Figur 1: Översikt över den kirurgiska proceduren.
A)
Placering av flera anatomiska markörer som används för att skapa en framgångsrik tillväxtplatta skada. Knäkapseln är omedelbart bakom knäskålen (vit), separerar tibia från lårbenet. Tibialtillväxtplattan (mörkröd) kan ses underlägsen knäskäret och kringgår tibia. Den proximala tillväxtplattan är ett huvudsakligen plattplan, förutom det främre kvartalet som bildar ett diagonalt plan. Korsningen av dessa två plan bildar tillväxtplattavinkeln, vilken används för lämplig borrvinkling. Semitendinosus-införandet är där quadriceps muskeln sätter in i bakre tibia. B) Inskärning genom den främre mediala aspekten av tibialmjukvävnaden för att komma åt det kortikala benet. C) Plats för det kortikala fönstret med hjälp av inriktning med distal semitendinosus-införandet som referenspunkt. D) UtvärderingSkadans djup genom att anpassa avfasningen på tandkuren med det kortikala fönstret.

  1. Gör ett ~ 1 cm snitt genom huden längs medial-främre sidan av proximal tibia med ett # 3 skalpellhandtag och ett # 15 blad som börjar vid den distala änden av medial femoral condyle ( Figur 1A ).
    1. Dra huden tätt mot det underliggande benet och håll benet ordentligt när du gör snittet.
      OBS: Detta kommer att hålla huden snittet på önskad plats och hjälper till att skapa en ren snitt. Tryck inte för hårt på skalpellan för att undvika punktering av knäkapseln, vilket skulle resultera i kraftig blödning och gör de återstående stegen svåra.
  2. Notera viktiga anatomiska markörer, inklusive: 1) tillväxtplattan, 2) tillväxtplattavinkeln, 3) knäkapseln, och 4) semitendinosusinsättningen ( Figur 1A ).
  3. Använd skalpellan, gör en ~ 0,5 cm snitt genom thE-fascia och mjuka vävnader på den medial-främre sidan av proximal tibia, från tillväxtplattan till botten av hudinsnittet ( Figur 1B ).
  4. Låt försiktigt dissekera eller skrapa bort fascia och mjuka vävnader från tibia med skalpellan ( Figur 1B ).
    OBS! Det är viktigt att ta bort eller skrapa så mycket mjukvävnad från tibia som möjligt för att inte störa borrstegen.
  5. Borra ett kortikalt fönster genom det tibiala kortikala benet vid diafysen med en Steinmann-stift fäst vid ett rotationsverktyg vid 10 000 varv / min (låg hastighet på det roterande verktyget som anges i materialavsnittet). Skapa det kortikala fönstret så att det inriktar sig mot den distala semitendinosusinsatsen ( Figur 1C ).
    1. Håll borr vinkelrätt mot tibialdiafysen och borra långsamt, var försiktig så att du inte borrar genom den andra sidan av diafysen; Det kortikala fönstret behöver bara vara 2 mm djupt och kommer att göras när nejMotstånd känns.
    2. Som ovan, håll benet ordentligt med den andra handen.
      OBS! En tandburk kan användas för detta steg. Om en tandburna används, måste benet hållas väldigt fast för att göra ett rent kortikalt fönster och se till att burken griper och skär benet på önskad plats. En Steinmann-stift rekommenderas för detta steg, med tanke på dess överlägsen skärningsförmåga.
  6. Dab det kortikala fönstret med gasväv, eftersom ljusblödning förväntas.

6. Skapa skador på tillväxtplattan

  1. Skapa en borrhålskada genom den centrala tillväxtplattan med en 1,8 mm tandburk som är fäst på ett roterande verktyg.
    OBS: Korrekt djup, vinkel och riktning är avgörande för att störa den centrala tillväxtplattan ( Figur 1C och D ). Instruktioner för att uppnå lämpligt djup, vinkel och riktning ges nedan.
    1. För att mäta lämpligt djup med tandburken, börjaN genom att anpassa tandkärlens ände med proximal tibia, där semitendinosus passerar knäkapseln ( Figur 1C ).
    2. Med slutet av dentalburgen vid knäkapseln följer du burskakan längs semitendinosusen och noterar var borgen ligger i linje med det kortikala fönstret. Detta är lämpligt djup för att buret ska fullständigt störa tillväxtplattan utan att störa ledytan ( Figur 1C ).
      OBS: Dentalburken används för att mäta lämpligt djup. Buren kan märkas med en permanent markör vid den plats där den ligger i linje med det kortikala fönstret för att referera till djupet under borrningen. Om emellertid de anatomiska markörerna och det ovanstående protokollet är nära refererade kommer den första avfasningen på tandborrningarna som anges här (FG6) att anpassas korrekt med det kortikala fönstret (se figur 1C ).
    3. För att uppnå lämplig borrvinkel, håll rotationsverktyget i en vinkel på mindre tHan 30 ° med avseende på tibialdiafysen.
      OBS: Detta är en visuell approximation.
    4. För att uppnå lämplig borrriktning, sikta på tillväxtplattans vinkel ( Figur 1C ). Rita en synlinje längs tandburken till tillväxtplattavinkeln för att hjälpa till med att skapa en central defekt.
    5. Slå på rotationsverktyget till 10 000 RPM (låg hastighet på det roterande verktyget som anges i materialet) innan du går in i det kortikala fönstret.
    6. Med rotationsverktyget i lämplig vinkel och riktning, skriv in det kortikala fönstret och tryck på rotationsverktyget tills burmarken ligger i linje med det kortikala fönstret. När det korrekta djupet är uppnått, ta bort rotationsverktyget.
      ANMÄRKNING: Utför växelplåtstörningen i en snabb rörelse med minimal tid med burgen i tillväxtplattan för att skapa en ren skada. Detta är viktigt för dataanalys.
  2. Dab det kortikala fönstret med gasbindning i ~ 30 s, eftersom blödning förväntas.
  3. Se till att skadans lämpliga djup uppnås genom att man mäter korglängden igen (steg 6.1.2).
    1. Sätt in burgen i borrspåret (med rotationsverktyget av) och rikta den markerade burgen med det kortikala fönstret ( Figur 1D ).
  4. Om djupet är otillräckligt, vrid rotationsverktyget och tryck på önskat djup.
    OBS! Även om en andra omgång borrning inte är idealisk, är det väldigt stört att tillväxtplattan är avgörande för utvecklingen av benbenet.
  5. Skölj borrspåret med ~ 3 ml steril saltlösning med en 10 ml spruta och en 23-gauge nål.
  6. Torka såret med gasbindning.

7. Skadeståndsprocedurer

  1. Om du utvärderar en biomaterialbaserad tillväxtplattbehandling, injicera biomaterialet genom borrspåret i skadningsstället med en nål av lämplig storlek (18-26 gauge, beroende på biomaterialets viskositet).
    OBS: Volymen av tillväxtplatta skada är ~ 3 & #181; L, och borrspårets volym är ~ 20 μl. Den maximala volymen av material som kan injiceras i tillväxtplatta skada och borrspår är mellan 20 och 25 μl.
  2. Stäng såret genom att suture fascia med 3-0 polyglykolsyra suturer. Applicera benvax över det kortikala fönstret för att isolera det underliggande benet (valfritt).
  3. Stäng huden snittet med begravda suturer eller sårklämmor.
    OBS! Sårklämmor rekommenderas, eftersom djuret kommer att skrapa på skadestedet och kan öppna såret.
  4. Ta bort djuret från isoflurananestesi, placera det på en värmande filt och övervaka den tills den är vaken.
  5. För att minska risken för infektion, placera djuret i en ny bur som innehåller torrt autoklaverat sängkläder.
  6. Låt djuret bära vikt efter operationen.
  7. Övervaka djuret var 12: e timme efter 72 timmar efter operation för att kontrollera infektionstekniker, se till att sårklämmorna förblir på plats och administrera postoperativE-analgetika i enlighet med institutionellt godkänd policy ( t.ex. buprenorfin vid 0,05 mg / kg var 12: e timme i 36 timmar och carprofen vid 5 mg / kg var 24: e timme under 72 timmar).
  8. Ta bort sårklämmorna 10 - 14 dagar efter operationen under anestesi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Framgångsrik tillväxtplatta skada med användning av denna metod involverar störningen av centrum av tibialtillväxtplattan utan att störa ledbroskytan. Bony reparationsvävnad har rapporterats börja om cirka 7 dagar efter skada och blir fullt utvecklad av 28 dagar efter skada 13 , som visualiseras av mikroberäknad tomografi (mikro CT) ( Figur 2 ). Även om dessa tidpunkter valdes här för att visa början och mognad av benbildning baserat på tidigare publicerade data kan andra tidpunkter användas för att undersöka de olika stadierna i reparationsprocessen, från dag 1 till 6 månader efter operationen 17 . Tabell 1 ger en översikt över benvolymbildningen inom kirurgiskt skadade råtttillväxtplattor 28 dagar efter kirurgi från tre oberoende körningar genom att (1) benvolymfraktionen ges inom hela tillväxtplattan och (2) boenNe volymfraktion i reparationsvävnadsområdet endast 15 . Uppgifterna rapporteras som medelvärdet ± standardavvikelsen och indikerar att liknande resultat uppnåddes mellan de oberoende körningarna. Variansen mellan de olika körningarna analyserades genom en envägsanalys av varians (ANOVA) och visar ingen statistiskt signifikant skillnad mellan körningarna, vilket föreslår modellens reproducerbarhet. Alcianblått hematoxylin (ABH) med Orange G / Eosin-motstain 18 användes för att histologiskt visa en mängd reparationsvävnader vid olika steg av benformig barbildning ( figur 2 ). Med hjälp av denna histologiska fläck kan olika typer av reparationsvävnad, inklusive mesenkymala, broskiga, beniga trabeculae och benmärg identifieras och kvantifieras 16 .

Flera problem kan uppstå felaktigt enligt ovanstående procedurer. En insufficie Nt borrdjupet kommer inte att störa tillväxtplattan, vilket kommer att resultera i liten eller ingen benformig formning. Avbrott i ledbroskytan ger en större skada som kan införa artikulärt brosk i skadningsstället för tillväxtplåten, vilket komplicerar läkningsprocessen ( Figur 3A ). Förvrängning av tillväxtplattan i en olämplig vinkel eller riktning leder till en icke-central skada ( Figur 3B ). I detta fall kommer det fortfarande att förekomma benformning, även om den kommer att vara lateral eller medial till önskad plats. Sammantaget kan reparationsvävnad bildad efter tillväxtplåtsskada analyseras på olika sätt, inklusive mikroCT, kvantitativ PCR, histologisk färgning och immunhistokemi. Förutom histologiska och molekylära mätningar ger längdlängden och tillväxtplattmätningarna ett viktigt mått på helbenstillväxt. Berörda lemmar har rapporterats uppleva tillväxtreduktion jämfört med oskadade kontrollämnen> 13. Limlängden kan mätas vid olika tidpunkter under hela studiens gång med hjälp av microCT-bilder för att undersöka skillnader i extremiteterna i extremiteterna 14 . Exempel på tidpunkter som tidigare användes inkluderar 28 dagar och 56 dagar efter skada. Tillväxtplattmätningar, inklusive totalhöjd, zonhöjder och tätningsbildning, kan också ge viktig information om vävnadsreparationsprocessen 13 , 14 , 15 . Helst bör man ta extremt längd och tillväxtplattmätningar före operation för att ha ett baslinjevärde. För att ytterligare belysa biologiska mekanismer eller för att testa effekten av en behandling, bör lämpliga kontrollgrupper utformas och inkludera oförändrade extremiteter och lemmar som genomgått operation men lämnas obehandlade.

Biomaterial kan också testas i denna tillväxtplattskyddsmodell. Som ett exempel, en chiTosan-mikrogel 19 injicerades i tillväxtplattskyddsstället, såsom beskrivits i steg 7.1, och det ses tydligt vid skademställningen i figur 4 . Efterföljande analys kan innebära att man bestämmer effekterna av biomaterialet på reparationsvävnadskomposition, längd längd och tillväxtplattmätningar, som diskuterats tidigare.

Figur 2
Figur 2. Framgångsrik tillväxtplattaavbrott och benformig barformation.
Bony bar formation ses 7 dagar efter skada med microCT och bekräftas genom Alcian blå hematoxylin (ABH) färgning. Den beniga baren är fullt mogen efter dag 28 efter skada, som ses med mikroCT och ABH-färgning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.


Figur 3. Potentiella resultat av felaktig borrning.
A)
Borrning för långt genom tibia kan störa artikulärytan, vilket komplicerar läkningsprocessen och kan leda till otillräckliga resultat. B) Felaktig vinkel på borren kan leda till en icke-central tillväxtplatta skada. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4
Figur 4. Behandling av ett plana skada med ett biomaterial.
ABH-färgning visar chitosanmikrogelen i den skadade tillväxtplattan.

Metrisk Kör 1 Kör 2 Kör 3 P-värde
Benvolymfraktion inom hela tillväxtplattan 9,76 +/- 3,81% 10,52 +/- 4,06% 11,93 +/- 2,04% 0,5493
Benvolymfraktion inom reparationsvävnadsområdet 41,5 +/- 8,33% 46,08 +/- 10,12% 46,77 +/- 8,14% 0,5128

Tabell 1. Bensvolymfraktdata.
Data var från mikro-CT-bilder vid 28 dagar efter skada på obehandlade råttor från tre oberoende körningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En växtplattskada djurmodell bidrar till vår förståelse för de biologiska mekanismerna för denna skada, vilket möjligen leder till effektivare terapeutiska ingrepp för barn som lider av skador på tillväxtplåten. För att framgångsrikt skapa en benstång och studera dess bildning in vivo med hjälp av den modell som presenteras i detta arbete är det kritiskt att störa tillväxtplattan genom att borra till ett tillräckligt djup utan att störa ledbrusk. Variation i kirurgiskt genomförande bland djur och, i mindre utsträckning, variation i anatomiska markörer kan leda till problematiska resultat. Vi rekommenderar att du övar de förfaranden som beskrivs ovan på kadaveriska djur för att säkerställa framgångsrik tillväxtplatta skada innan du utför proceduren för levande djurstudier. Medan kadaveriska djur saknar vävnadspåläggning och inte kommer att blöda, kommer växtskadaförfarandet och anatomiska egenskaper hos dessa djur att likna dem hos levande djur. FurtHermore kan den kadaveriska tibialtillväxtplattan enkelt dissekeras, eftersom epifysen skiljer sig från metafysen genom applicering av ljuskraft och borrhålets placering kan observeras. Denna snabba analys möjliggör tekniskt modifieringar för att lära sig rätt borrdjup och vinkling på kadaveriska djur utan att behöva avbildas.

Det bör noteras att andra djurmodeller av tillväxtplatta skada existerar. En liknande transfysal defekt har utförts i musen och lett till benformig barbildning 20 . Trots sin mindre storlek kan den också användas för att studera mekanismerna som är inblandade i benformig formning. Coleman et al . Rapporterade på en annan giltig råttmodell av tillväxtplåtsskada, där en central transfysaldefekt skapades i distal lårben genom att borra genom ledbrusk 21 . Detta tillvägagångssätt ledde också till bildandet av en benstång och ojämlikhet i lemmar, som iModell som presenteras här. Andra djurmodeller av tillväxtplatta skada och behandling har inkluderat kaniner 22 , grisar 23 och får 24 . Medan större djurskada modeller kan representera mer kliniska skador, är råttmodellen användbar för forskning om de biologiska mekanismerna för fysisk skada. Till exempel har den råttmodell som presenteras här använts i stor utsträckning för att undersöka molekylära mekanismer för fysisk skada och benformningsprocessen 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Vidare kan råttmodellen användas för att testa olika fysebehandlingar innan de flyttas till större djurmodeller. En utmaning av denna råttmodell av tillväxtplatta skada är emellertid att borrningen görs inne i benet, maKung det omöjligt att observera var borrhålet ligger inom tillväxtplattan. Således kan framgångsrik störning av tillväxtplattan på levande djur endast bekräftas med användning av bildteknik vid operationstiden eller genom att bedöma benformig bildning mellan 7 till 28 dagar efter operationen. Med praktiken kan en hög grad av framgång med att uppnå benformig barbildning uppnås, men tidiga studier kan resultera i ett antal djur som saknar bildandet av en benstång, beroende på antingen en oskadad tillväxtplatta eller otillräcklig störning av tillväxten tallrik.

En annan begränsning av denna modell är att borrhålskador inte representerar normala tillväxtplattskador hos barn, vilket vanligen uppstår på grund av fraktur 25 . Frakturer inom tillväxtplattan kan klassificeras med hjälp av Salter-Harris klassificeringssystemet 26 . Frakturer av typ III och typ IV-växtplattor bidrar oftast till de fysiska skadorna som lederTill benformig stapelbildning. Den växtplattskada typ som presenteras här är närmast relaterad till en typ VI-tillväxtplatta skada, en sällsynt klass av skada, i vilken physisen avlägsnas av ett trauma eller punkteringsår. Eftersom de patofysiologiska mekanismer som ligger bakom bonybarbildning efter att tillväxtplattskadorna fortfarande är blygsamma, är råttmodellen emellertid viktig för att avslöja denna process för att utveckla nya behandlingsalternativ för barn som lider av alla typer av växtskador. Metoden som beskrivs här skapar på ett tillförlitligt sätt en benstång och kan användas för att studera flera aspekter av reparationsprocessen för tillväxtplattskador in vivo 17 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 . Det har också visat sig att denna råttmodell resulterar i minskad tibialväxt efter tillväxtplattanJuryn 13 , vilket gör det till en ännu mer intressant djurmodell för att testa nya behandlingsalternativ som leder till regenerering av tillväxtplattan och den potentiella återställningen av benförlängning.

Sammanfattningsvis beskriver det här dokumentet metoderna för att skapa en tillväxtplatta skademodell för att undersöka benformig barbildning och potentiella behandlingar för växtskador i vivo. Denna råttmodell möjliggör relativt billiga och snabba studier, med tanke på att en benaktig bar är full mogen 28 dagar efter tillväxtplåtsskada. Förutom att utveckla vår förståelse för de molekylära mekanismerna för benformig bildning in vivo , kan denna modell användas för att testa biomaterial som hämmar benformig barbildning och uppmuntra tillväxt av plattabruskbildning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja.

Acknowledgements

Författarna bekräftar finansieringsstöd från National Institute of Arthritis och Muskuloskeletala och Hudsjukdomar hos National Institute of Health (NIH) under prisnummer R03AR068087, Akademiska anrikningsfonden vid University of Colorado School of Medicine och Gates Center for Regenerative Medicine . Detta arbete stöddes också av NIH / NCATS Colorado CTSA Grant Number UL1 TR001082. Innehållet är upphovsmannens ansvar och representerar inte nödvändigtvis officiella NIH-synpunkter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scalpel handle McKesson MCK42332500
Needle holder Stoelting RS-7824
Adson tissue forceps Sklar 50-3048
Iris Scissors Sklar 47-1246
Rotary Tool Dremel 7700 Variable speed rotary tool 
Keyless Rotary Tool Chuck Dremel 4486
Dental Burs Dental Burs USA FG6 Round carbide bur, ≤2mm
Steinmann pins Simpex Medical T-078
Hair clippers Wahl  5537N
3-0 PGA surutes Oasis MV-J398-V
Sterile gauze 2 x 2" Covidien 441211
Povidone Iodine McKesson 922-00801
Sterile saline Vetone 510224
10 mL luer lock syringe Becton Dickinson 309604
23 gauge needle Becton Dickinson 305145
Isopropyl alcohol pads Dynarex 1113
Isoflurane IsoFlo 30125-2
Caliper Mitutoyo 500-196-30
Carprofen Rimadyl 27180
Buprenorphine Par Pharmaceuticals Inc NDC 42023-179
Fenestrated Surgical Drape McKesson 25-517
Surgical Gloves Uline S-20204
#15 Scalpel Blade Aven 44044
9 mm wound clips Fine Science Tools 12032-09
Reflex clip applier World Precision Instruments 500345
Absorbant underpads McKesson MON 43723110
Tec 3 Iso Vaporizer  VetEquip 911103 
Germinator 500 Braintree Scientific GER 5287-120V
Warm water recirculator Kent Scientific TP-700
Absorbent Underpads Medline Industries MSC281230

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mann, D. C., Rajmaira, S. Distribution of physeal and nonphyseal fractures in 2,650 long-bone fractures in children aged 0-16 years. J Pediatr Orthop. 10, (6), 713-716 (1990).
  2. Browne, L. P., et al. Community-acquired staphylococcal musculoskeletal infection in infants and young children: necessity of contrast-enhanced MRI for the diagnosis of growth cartilage involvement. AJR Am J Roentgenol. 198, (1), 194-199 (2012).
  3. Weitao, Y., Qiqing, C., Songtao, G., Jiaqiang, W. Epiphysis preserving operations for the treatment of lower limb malignant bone tumors. Eur J Surg Oncol. 38, (12), 1165-1170 (2012).
  4. Butler, M. S., Robertson, W. W., Rate, W., D'Angio, G. J., Drummond, D. S. Skeletal sequelae of radiation therapy for malignant childhood tumors. Clin Orthop Relat Res. (251), 235-240 (1990).
  5. Shapiro, F. Longitudinal growth of the femur and tibia after diaphyseal lengthening. J Bone Joint Surg Am. 69, (5), 684-690 (1987).
  6. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423, (6937), 332-336 (2003).
  7. Dodwell, E. R., Kelley, S. P. Physeal fractures: basic science, assessment and acute management. Orthopaedics and Trauma. 25, (5), 377-391 (2011).
  8. Khoshhal, K. I., Kiefer, G. N. Physeal bridge resection. J Am Acad Orthop Surg. 13, (1), 47-58 (2005).
  9. Hasler, C. C., Foster, B. K. Secondary tethers after physeal bar resection: a common source of failure. Clin Orthop Relat Res. (405), 242-249 (2002).
  10. Xian, C. J., Zhou, F. H., McCarty, R. C., Foster, B. K. Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site. J Orthop Res. 22, (2), 417-426 (2004).
  11. Chen, J., et al. Formation of tethers linking the epiphysis and metaphysis is regulated by vitamin d receptor-mediated signaling. Calcif Tissue Int. 85, (2), 134-145 (2009).
  12. Coleman, R. M., Schwartz, Z., Boyan, B. D., Guldberg, R. E. The therapeutic effect of bone marrow-derived stem cell implantation after epiphyseal plate injury is abrogated by chondrogenic predifferentiation. Tissue Eng Part A. 19, (3-4), 475-483 (2013).
  13. Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. The potential role of VEGF-induced vascularisation in the bony repair of injured growth plate cartilage. J Endocrinol. 221, (1), 63-75 (2014).
  14. Coleman, R. M., et al. Characterization of a small animal growth plate injury model using microcomputed tomography. Bone. 46, (6), 1555-1563 (2010).
  15. Macsai, C. E., Hopwood, B., Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. Structural and molecular analyses of bone bridge formation within the growth plate injury site and cartilage degeneration at the adjacent uninjured area. Bone. 49, (4), 904-912 (2011).
  16. Su, Y. W., et al. Neurotrophin-3 Induces BMP-2 and VEGF Activities and Promotes the Bony Repair of Injured Growth Plate Cartilage and Bone in Rats. J Bone Miner Res. (2016).
  17. Zhou, F. H., Foster, B. K., Sander, G., Xian, C. J. Expression of proinflammatory cytokines and growth factors at the injured growth plate cartilage in young rats. Bone. 35, (6), 1307-1315 (2004).
  18. Sayers, D., Volpin, G., Bentley, G. The demonstration of bone and cartilage remodelling using alcian blue and hematoxylin. Biotechnic & Histochemistry. 63, (1), 59-63 (1988).
  19. Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
  20. Lee, M. A., Nissen, T. P., Otsuka, N. Y. Utilization of a murine model to investigate the molecular process of transphyseal bone formation. J Pediatr Orthop. 20, (6), 802-806 (2000).
  21. Coleman, R. M., et al. Characterization of a small animal growth plate injury model using microcomputed tomography. Bone. 46, (6), 1555-1563 (2010).
  22. Lee, S. U., Lee, J. Y., Joo, S. Y., Lee, Y. S., Jeong, C. Transplantation of a Scaffold-Free Cartilage Tissue Analogue for the Treatment of Physeal Cartilage Injury of the Proximal Tibia in Rabbits. Yonsei Med J. 57, (2), 441-448 (2016).
  23. Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 156, (2), 128-134 (2012).
  24. Hansen, A. L., et al. Growth-plate chondrocyte cultures for reimplantation into growth-plate defects in sheep. Characterization of cultures. Clin Orthop Relat Res. (256), 286-298 (1990).
  25. Cepela, D. J., Tartaglione, J. P., Dooley, T. P., Patel, P. N. Classifications In Brief: Salter-Harris Classification of Pediatric Physeal Fractures. Clin Orthop Relat Res. (2016).
  26. Salter, R. B., Harris, W. R. Injuries Involving the Epiphyseal Plate. The Journal of Bone & Joint Surgery. 83, (11), 1753 (2001).
  27. Chung, R., Foster, B. K., Zannettino, A. C., Xian, C. J. Potential roles of growth factor PDGF-BB in the bony repair of injured growth plate. Bone. 44, (5), 878-885 (2009).
  28. Fischerauer, E., Heidari, N., Neumayer, B., Deutsch, A., Weinberg, A. M. The spatial and temporal expression of VEGF and its receptors 1 and 2 in post-traumatic bone bridge formation of the growth plate. J Mol Histol. 42, (6), 513-522 (2011).
  29. Chung, R., Cool, J. C., Scherer, M. A., Foster, B. K., Xian, C. J. Roles of neutrophil-mediated inflammatory response in the bony repair of injured growth plate cartilage in young rats. J Leukoc Biol. 80, (6), 1272-1280 (2006).
  30. Chung, R., et al. Roles of Wnt/beta-catenin signalling pathway in the bony repair of injured growth plate cartilage in young rats. Bone. 52, (2), 651-658 (2013).
  31. Zhou, F. H., Foster, B. K., Zhou, X. F., Cowin, A. J., Xian, C. J. TNF-alpha mediates p38 MAP kinase activation and negatively regulates bone formation at the injured growth plate in rats. J Bone Miner Res. 21, (7), 1075-1088 (2006).
  32. Arasapam, G., Scherer, M., Cool, J. C., Foster, B. K., Xian, C. J. Roles of COX-2 and iNOS in the bony repair of the injured growth plate cartilage. J Cell Biochem. 99, (2), 450-461 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics