Een Rat Tibial Growth Plate Injury Model om reparatie mechanismen te karakteriseren en te evalueren Growth Plate Regeneration Strategies

Medicine

GE Global Research must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

De groeiplaat is een kraakbeenachtig gebied in de lange botten van kinderen waarbij longitudinale groei optreedt. Wanneer gewond, kan botweefsel vormen en de groei verminderen. We beschrijven een ratmodel van groeiplaatschade die leidt tot benige reparatieweefsel, waardoor de studie van herstelmechanismen en regeneratiestrategieën voor groeiplaatjes mogelijk is.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Erickson, C. B., Shaw, N., Hadley-Miller, N., Riederer, M. S., Krebs, M. D., Payne, K. A. A Rat Tibial Growth Plate Injury Model to Characterize Repair Mechanisms and Evaluate Growth Plate Regeneration Strategies. J. Vis. Exp. (125), e55571, doi:10.3791/55571 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Een derde van alle pediatrische fracturen betreffen de groeiplaat en kan leiden tot een verminderde botgroei. De groeiplaat (of physis) is kraakbeenweefsel gevonden aan het einde van alle lange botten bij kinderen die verantwoordelijk zijn voor longitudinale botgroei. Eenmaal beschadigd, kan kraakbeenweefsel in de groeiplaat een vroegtijdige verenging ondergaan en leiden tot ongewenst botherstelweefsel, dat een "bony bar" vormt. In sommige gevallen kan deze benige bar resulteren in vervorming van botgroei, zoals hoekdeformaties, of het kan de botengroei van de lengte volledig stoppen. Er is momenteel geen klinische behandeling die een gewonde groeiplaat volledig kan repareren. Het gebruik van een diermodel van groeiplaatschade om de mechanismen van de bony barvorming beter te begrijpen en om manieren te identificeren om hem te remmen, is een geweldige kans om betere behandelingen te ontwikkelen voor de groei van de plaatbeschadigingen. Dit protocol beschrijft hoe u de proximale tibiale groeiplaat met een boorgat defect kunt verstoren. Deze smaLl diermodel produceert betrouwbaar een benige bar en kan resulteren in groei misvormingen die vergelijkbaar zijn met die die bij kinderen worden gezien. Dit model maakt het mogelijk om de moleculaire mechanismen van bony bar formatie te onderzoeken en dient als middel om potentiële behandelingsopties te testen voor groeiplaatverwondingen.

Introduction

Plantenverwondingen zijn 30% van alle pediatrische fracturen en kunnen leiden tot een verminderde botgroei 1 . Naast fracturen kunnen groeiplaatletsel veroorzaakt worden door andere etiologieën, waaronder osteomyelitis 2 , primaire bottumoren 3 , straling en chemotherapie 4 en iatrogene schade 5 . De groeiplaat (of physis) is een kraakbeenregio aan het einde van de lange botten van de kinderen die verantwoordelijk is voor longitudinale botgroei. Het vergt botverlenging door endochondrale ossificatie; Chondrocyten ondergaan proliferatie en hypertrofie en worden vervolgens door inkomende osteoblasten herbouwd om trabekulair bot 6 te vormen. De groeiplaat is ook een zwak gebied van het ontwikkelende skelet, waardoor het vatbaar is voor letsel. Het grote probleem met groeiplaatbreuken of verwondingen is dat het beschadigde kraakbeenweefsel in de groeiplaat kan bE vervangen door ongewenste botten reparatie weefsel, ook bekend als een "bony bar." Afhankelijk van de grootte en de plaats binnen de groeiplaat kan de bony bar leiden tot hoekdeformaties of volledige groeiregst, een verwoestende sequela voor jonge kinderen die nog niet volledig zijn bereikt 7 .

Er is momenteel geen behandeling die een gewonde groeiplaat volledig kan repareren. Zodra de benige staaf vormt, moet de arts besluiten of hij 8 chirurgisch moet verwijderen. Patiënten met een resterende skeletgroei van tenminste 2 jaar of 2 cm en met een benige staaf die minder dan 50% van het groeiplaatgebied bedragen, zijn meestal kandidaten voor de bony barresectie 8 . Chirurgische verwijdering van de benige staaf wordt vaak gevolgd door een interologie van een autologe vetgraft om te voorkomen dat het beenderweefsel wordt hervormd en de omringende onbedekte groeiplaat te laten groeien om de groei te herstellen. Deze technieken zijn echter problEmatic en vaak falen, wat leidde tot een bony bar herhaling en voortgezet negatief effect op groei 9 . Er is een kritieke noodzaak om effectieve behandelingen te ontwikkelen die niet alleen voorkomen dat de bony barvorming wordt gevormd, maar ook de kraakbeen van het groeiplaatje regenereert, waardoor normale botverlenging wordt hersteld.

De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de vorming van de bonybaren moeten nog niet volledig worden uitgelicht. Een beter inzicht in deze biologische mechanismen kan leiden tot effectievere therapeutische interventies voor kinderen die lijden aan groeiplaatletsel. Aangezien het bestuderen van deze mechanismen bij mensen moeilijk is, zijn dierenmodellen gebruikt, met name het ratmodel van groeiplaatschade 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . De methode die hierin wordt gepresenteerdPapier beschrijft hoe een boorgatafwijking in de rattenbloed groeiplaat leidt tot voorspelbaar en reproduceerbaar reparatieweefsel dat al 7 dagen na verwonding begint te worden en een volgroeide benenbalk vormt met remodeling op 28 dagen na verwonding 10 . Dit verschaft een klein dier in vivo model waarin de biologische mechanismen van de bony barvorming worden bestudeerd, evenals nieuwe therapieën die de bottenbalk kunnen voorkomen en / of het groeiplaat kraakbeen kunnen regenereren. Bijvoorbeeld, dit model kan gebruikt worden om chondrogeen biomaterialen te testen die groeiplaatkraakbeen kunnen regenereren en een waardevolle behandeling bieden voor kinderen die lijden aan groeiplaatletsel. De technieken die in dit document worden gepresenteerd, beschrijven de chirurgische methoden die gebruikt worden om het groeiplaatletsel te veroorzaken en de daaropvolgende bezorging van biomaterialen op de schadeplaats. We zullen ook methoden bespreken om de bony barvorming te beoordelen en weefsel te repareren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierprocedures moeten goedgekeurd worden door de lokale instantie voor dierenwelzijn en gebruik (IACUC). Het dierprotocol voor de volgende procedure werd goedgekeurd door de Universiteit van Colorado Denver IACUC.

1. Verkrijg Ratten

OPMERKING: Tenzij genetisch gemodificeerde dieren gewenst zijn, zijn 6 weken oude, skeletale onvolwassen Sprague-Dawley ratten nodig bij operatie. Andere stammen zouden mogelijk kunnen worden gebruikt; De meeste gepubliceerde studies zijn echter uitgevoerd op Sprague-Dawley ratten.

2. Voorbereiding van chirurgische benodigdheden

  1. Autoclaaf chirurgische voorraadverpakkingen die één van de volgende omvatten: # 3 scalpel handvat, naaldhouder, Adson tang en iris schaar.
  2. Autoclaaf de sleutelschroefjes. Boorchukken kunnen worden gepereld tussen dierlijke operaties wanneer ze op meerdere dieren werken.
    OPMERKING: Lokale IACUC-regels met betrekking tot het gebruik van steriele surgEr moet worden nagegaan of er meerdere gereedschappen op meerdere dieren zijn. Bijvoorbeeld, de Universiteit van Colorado Denver IACUC zorgt ervoor dat één chirurgisch gereedschap ingesteld wordt op maximaal 5 dieren vóór de stopzetting ervan. Bovendien moeten chirurgische gereedschappen hitte gesteriliseerd worden met behulp van een kraalsterilisator tussen dieren. Extra steriele chirurgische verpakkingen moeten worden gebruikt voor extra dieren.
  3. Autoclaaf 5 cm Steinmann pennen, één voor elk dier.
    OPMERKING: Om de kans op infectie te verminderen, mogen de Steinmann pennen niet worden gebruikt voor meerdere dieren.
  4. Autoclaaf 1,8 mm tandborstels, één voor elk dier.
    OPMERKING: Om de kans op infectie te verminderen, mogen de tandborstjes niet voor meerdere dieren worden gebruikt.
  5. Autoclaaf een wondclipsapplicator, indien van toepassing. Als alternatief kunnen begraven hechtingen gebruikt worden om de kutane laag te sluiten. Zie stap 7.3.
  6. Steriliseer indien mogelijk een roterende boor met bestraling of gassterilisatie.
  7. Verzamel de volgende extra benodigdheden: elektrisch scheerapparaat, steRile 3-0 polyglycolzuur suturen, steriel gaas, povidon-jodium, steriele zoutoplossing, steriele injectiespuiten van 10 ml, steriele 23-gauge naalden, isoprolcoholalcoholen, isofluraan, calipers, post-chirurgische analgetica ( bijv. NSAIDs en buprenorfine), Steriele chirurgische gordijnen, steriele chirurgische handschoenen, steriele # 15 scalpelbladen, steriele wondklemmen, anesthesiemachine, kraalsterilisator, verwarmingsblok en absorberende ondergrond.

3. Verdoving en bereiding van dieren

  1. Verdoof het dier door het te introduceren aan een 1- tot 2-L inductie kamer die 1 L / min zuurstofstroom ontvangt met 5% isofluraan uit een verdampingssysteem met een passief ontploffingssysteem.
    OPMERKING: Blootstelling aan 5% isofluraan moet 6 weken oude ratten binnen 5 minuten anesthetiseren.
  2. Verplaats het dier naar de operatieplaats en behoud het dier onder verdoving met 2 - 3% isofluraan met een neuskegel voor de rest van de procedure. Plaats het dier op een opwarmkussen en absorbeer dezeEnt onderpad.
    OPMERKING: Het dier hoeft niet aan de chirurgische tafel te worden bevestigd. Het leggen van de been zoals aangegeven in de onderstaande stappen is een voldoende stabilisatiemethode.
    OPMERKING: Alle volgende procedures moeten met het dier onder verdoving worden uitgevoerd. 2 - 3% isofluraan moet voldoende zijn om anesthesie bij ratten op deze leeftijd te behouden. Dit kan bevestigd worden door het testen van de tweedragse terugtrekkingsreflex.
  3. Administreer intraoperatieve pijnstillers overeenkomstig het door de instelling goedgekeurde beleid ( bijv. Buprenorfine bij 0,05 mg / kg en carprofen bij 5 mg / kg).

4. Bereiding van de Tibia voor Chirurgie

  1. Scheer het hele achterpoot (en) van de mediale malleolus naar het bekken met een elektrische scheerapparaat.
  2. Meet en teken de tibialengte van het voorste tibiale plateau naar de onderste kant van de mediale malleolus met behulp van calipers. Als alternatief, meet de hele tibialengte met behulp van röntgen of microCT 11 Sup> , 12 , 14 . Optioneel, meet de afmetingen van de groeiplaat voor de operatie met behulp van röntgen of microCT.
  3. Maak de chirurgische plaats schoon door het hele been (en), buik en genitaliën te wrijven met alcoholwabben en dan met povidon-jodiumverzadigde gaas.
    OPMERKING: Om het risico op infectie te minimaliseren, moet alle volgende procedures, tot het dier verwijderd is van verdoving (stap 7.4), onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd. Alle chirurgische materialen moeten toegankelijk zijn met behulp van steriele techniek. Het gebruik van een chirurgische assistent wordt sterk aanbevolen om de steriliteit tijdens de operatie te behouden.
  4. Draag steriele chirurgische handschoenen, plaats een geventileerde steriele chirurgische drape over het dier, waardoor de been (en) blootgesteld worden door de centrale fenestratie.

5. Chirurgische procedure om toegang te krijgen tot de groeiplateau

_upload / 55571 / 55571fig1.jpg "/>
Figuur 1: Overzicht van de chirurgische procedure.
A)
Plaats van meerdere anatomische markers die gebruikt worden om een ​​succesvolle groeiplaatletsel te creëren. De kniecapsule ligt direct achter de kniebeschermer (wit), waardoor de tibia van de femur wordt gescheiden. De tibiale groeiplaat (donkerrood) kan onder de kniekap gezien worden en de tibia omzeilen. De proximale groeiplaat is een meestal vlak vlak, behalve voor het voorste kwartier dat een diagonaalvlak vormt. Het kruispunt van deze twee vlakken vormt de groeiplaathoek, die wordt gebruikt voor de juiste boorhoeken. De semitendinosus invoeging is waar de quadriceps spier in de posterior tibia inserts. B) Insnijden door het anterior-mediale aspect van het tibiale zachte weefsel om toegang te krijgen tot het corticale bot. C) Plaatsing van het corticale venster met uitlijning met de distale semitendinosus invoeging als referentiepunt. D) EvaluerenDe diepte van het letsel door de afschuining op de tandheelkundige bur met het corticale raam af te stemmen.

  1. Maak een ~ 1 cm snede door de huid langs het mediaal-voorste aspect van de proximale tibia met een # 3 scalpel handvat en een # 15 blad, beginnend bij het distale einde van de mediale femorale condyle ( Figuur 1A ).
    1. Trek de huid strak tegen het onderliggende bot en houd het been stevig vast terwijl u de incisie maakt.
      OPMERKING: dit houdt de huid incisie op de gewenste plaats en zal helpen bij het creëren van een schone incisie. Druk niet te stevig op de scalpel om te voorkomen dat de kniecapsule wordt gestoken, wat resulteert in bloedig bloeden en de overige stappen moeilijk maakt.
  2. Let op belangrijke anatomische markers, waaronder: 1) de groeiplaat, 2) de groeiplaathoek, 3) de kniecapsule en 4) de semitendinosusinvoeging ( Figuur 1A ).
  3. Met behulp van de scalpel, maak een ~ 0,5 cm incisie door thE fascia en zachte weefsels op het mediaal-voorste aspect van de proximale tibia, van de groeiplaat naar de bodem van de huidinsnijding ( Figuur 1B ).
  4. Ontleed of schrap de fascia en zachte weefsels van de tibia voorzichtig af met behulp van de scalpel ( Figuur 1B ).
    OPMERKING: Het is belangrijk om zo veel mogelijk zacht weefsel uit de tibia te verwijderen of af te schrappen, om de boorstappen niet te beïnvloeden.
  5. Boor een corticaal raam door het tibiale corticale bot bij de diafyse met een Steinmann-pin bevestigd aan een roterend gereedschap bij 10.000 RPM (lage snelheid van het roterende gereedschap gespecificeerd in het materiaalafdeling). Maak het corticale venster zodanig dat het afwijken van de distale semitendinosus-invoeging ( Figuur 1C ).
    1. Houd de boor loodrecht op de tibiale diafyse en langzaam boor, wees voorzichtig om niet door de andere kant van de diafyse te boren; Het corticale venster dient slechts 2 mm diep te zijn en wordt gemaakt wanneer neeWeerstand wordt gevoeld.
    2. Houd bovenaan het been stevig vast met de andere kant.
      OPMERKING: Voor deze stap kan een tandkool worden gebruikt. Als er echter een tandbur is gebruikt, moet het been zeer stevig vastgehouden worden om een ​​schoon corticaal raam te maken en ervoor te zorgen dat de bur het been op de gewenste plaats grijpt en snijdt. Voor deze stap wordt een Steinmann-pin aanbevolen, gezien zijn superieure snijvermogen.
  6. Druppel het corticale raam met gaas, aangezien er licht bloeding verwacht wordt.

6. De schade aan de groeiplaat veroorzaken

  1. Maak een boorgatbeschadiging door middel van de centrale groeiplaat met behulp van een 1,8 mm tandbuis die aan een draaiend gereedschap is bevestigd.
    OPMERKING: De juiste diepte, hoek en richting zijn van cruciaal belang bij het verstoren van de centrale groeiplaat ( Figuur 1C en D ). Instructies voor het bereiken van de juiste diepte, hoek en richting worden hieronder gegeven.
    1. Om de juiste diepte te meten met de tandheelkundige bur, begiN door het einde van de tandheelkundige bur met de proximale tibia af te stemmen, waar de semitendinosus de kniecapsule overschrijdt ( Figuur 1C ).
    2. Volg aan het einde van de tandbur op de kniecapsule de burkschacht langs de semitendinosus en let op waar de bur uitkomt met het corticale raam. Dit is de juiste diepte van de bur om de groeiplaat volledig te verstoren zonder het articulair oppervlak te verstoren ( Figuur 1C ).
      OPMERKING: De tandkool wordt gebruikt om de juiste diepte te meten. De bur kan gemarkeerd worden met een permanente marker op de plaats waar het uitkomt met het corticale venster om de diepte te verwijzen tijdens het boren. Echter, als de anatomische markers en het bovenstaande protocol nauwkeurig worden verwezenlijkt, zal de eerste afschuining op de hier genoemde tandborstels (FG6) op passende wijze uitlijnen met het corticale venster (zie figuur 1C ).
    3. Om de juiste boorhoek te bereiken, houd het draaigereedschap bij een hoek van minder tHan 30 ° ten opzichte van de tibiale diafyse.
      OPMERKING: Dit is een visuele benadering.
    4. Om de juiste boorrichting te bereiken, richt u op de hoek van de groeiplaat ( Figuur 1C ). Teken een visuele lijn langs de tandheelkundige bur op de groeiplaathoek om te helpen bij het creëren van een centraal defect.
    5. Zet het roterende gereedschap op 10.000 RPM (lage snelheid van het roterende gereedschap dat is gespecificeerd in het materiaalafdeling) voordat u het corticale venster binnentreedt.
    6. Met het roterende gereedschap in een passende hoek en richting, voer het corticale venster in en druk het roterende gereedschap tot de bur-markering in lijn staat met het corticale venster. Zodra de juiste diepte is bereikt, verwijder u het roterende gereedschap.
      OPMERKING: Doe de verstoring van de groeiplaat in één, snelle beweging, gebruik minimale tijd met de bur in de groeiplaat om een ​​schoon letsel te veroorzaken. Dit is belangrijk voor data analyse.
  2. Dab de corticale raam met gaas voor ~ 30 s, zoals bloeding wordt verwacht.
  3. Zorg voor de juiste diepte van het letsel door de burl opnieuw te meten (stap 6.1.2).
    1. Plaats de bur in het boorspoor (met het draaiende gereedschap uit) en stel de gemarkeerde bur in met het corticale venster ( Figuur 1D ).
  4. Als de diepte ontoereikend is, draai dan het draaigereedschap aan en druk op de gewenste diepte.
    OPMERKING: Hoewel een tweede ronde boor niet ideaal is, is het volledig ontwrichten van de groeiplaat voorop bij de ontwikkeling van de benenbalk.
  5. Spoel de boorbaan met ~ 3 ml steriele zoutoplossing met een 10 ml spuit en een 23-gauge naald.
  6. Droog de wond met gaas.

7. Na-letselprocedures

  1. Indien u een biomateriaal-gebaseerde groeiplaatbehandeling beoordeelt, injecteer het biomateriaal door de boorbaan naar de schadeplaats met behulp van een naald (18 tot 26 gauge, afhankelijk van de biomaterialviscositeit).
    OPMERKING: Het volume van het groeiplaat letsel is ~ 3 & #181; L, en het volume van de boorbaan is ~ 20 μL. Het maximale volume materiaal dat kan worden geïnjecteerd in het groeiplaat letsel en boorbaan is tussen 20 en 25 μL.
  2. Sluit de wond door het fascia te suturen met 3-0 polyglycolzuur suturen. Breng botwas over het corticale venster om het onderliggende bot te isoleren (optioneel).
  3. Sluit de huid incisie met begraven hechtingen of wondklemmen.
    OPMERKING: Wondklemmen worden aanbevolen, aangezien het dier op de schadeplaats zal krabben en de wond kan openen.
  4. Verwijder het dier uit isofluraananesthesie, plaats het op een opwarmen deken en controleer het totdat het wakker is.
  5. Om het risico op infectie te verminderen, plaats het dier in een nieuwe kooi met droge, geautoclaveerde bedden.
  6. Laat het dier na de operatie gewicht verliezen.
  7. Monitor het dier elke 12 uur gedurende 72 uur na de operatie om te controleren op tekenen van infectie, om ervoor te zorgen dat de wondklemmen op zijn plaats blijven en postoperatieveE analgetica in overeenstemming met institutioneel goedgekeurd beleid ( bijv. Buprenorfine bij 0,05 mg / kg elke 12 uur gedurende 36 uur en carprofen bij 5 mg / kg elke 24 uur gedurende 72 uur).
  8. Verwijder de wondklemmen 10 - 14 dagen na de operatie onder verdoving.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Succesvolle groeiplaatschade door deze methode te gebruiken, omvat de verstoring van het middelpunt van de tibiale groeiplaat zonder het gewrichtskraakbeenoppervlak te verstoren. Bony herstelweefsel is gerapporteerd om ongeveer 7 dagen na het letsel te beginnen en wordt volledig ontwikkeld door 28 dagen na verwonding 13 , zoals aangetoond door micro computed tomography (micro CT) ( Figuur 2 ). Hoewel deze tijdspunten hier gekozen werden om het begin en de rijping van botvorming te tonen op basis van eerder gepubliceerde data, kunnen andere tijdpunten gebruikt worden om de verschillende stadia van het herstelproces te onderzoeken, van dag 1 tot 6 maanden na operatie 17 . Tabel 1 geeft een overzicht van de vorming van de botvolume binnen de schoorlijk gewonde ratten groeiplaten 28 dagen na de operatie van drie onafhankelijke lopies door (1) de botvolume fractie binnen de gehele groeiplaat te verschaffen en (2) de boNe volume fractie binnen de reparatie weefsel gebied alleen 15 . De gegevens worden gemeld als het gemiddelde percentage ± de standaardafwijking en geven aan dat vergelijkbare resultaten werden verkregen tussen de onafhankelijke runs. Variantie tussen de verschillende runs werd geanalyseerd door een eenweganalyse van variantie (ANOVA) en laat geen statistisch significant verschil zien tussen de lopies, wat de reproduceerbaarheid van het model voorstelt. Alcian blauwe hematoxyline (ABH) met oranje G / Eosin counterstain 18 werd gebruikt om histologisch een verscheidenheid aan reparatieweefsels te tonen in verschillende stadia van benige barvorming ( Figuur 2 ). Met behulp van deze histologische vlek kunnen verschillende soorten reparatieweefsel, waaronder mesenchymale, kraakbeenachtige, benige trabeculae en beenmerg, geïdentificeerd en gekwantificeerd worden 16 .

Verschillende problemen kunnen voortvloeien uit onjuist gevolg van de bovenstaande procedures. Een insufficie Nt boordiepte zal de groeiplaat niet verstoren, wat resulteert in kleine of geen bony barvorming. Ontwrichting van het gewrichtskraakbeenoppervlak zorgt voor een groter letsel dat articulair kraakbeen in de groeiplaatletsel plaats kan brengen, waardoor het genezingsproces wordt gecompliceerd ( Figuur 3A ). Het verstoren van de groeiplaat in een ongepaste hoek of richting leidt tot een niet-centraal letsel ( Figuur 3B ). In dit geval zal de bony barvorming nog steeds optreden, hoewel het lateraal of mediaal naar de gewenste locatie zal zijn. In het algemeen kan herstelweefsel gevormd na groeiplaatletsel op verschillende manieren worden geanalyseerd, waaronder microCT, kwantitatieve PCR, histologische kleuring en immunohistochemie. Naast histologische en moleculaire metingen, geven de lengte van de ledematen en de groeiplaat een belangrijke maatstaf voor de volledige botgroei. Geaffekteerde ledematen zijn gerapporteerd om groeivermindering te ervaren in vergelijking met ongecontroleerde controle-ledematen> 13. Limb lengte kan worden gemeten op verschillende tijdstippen gedurende de loop van de studie met behulp van microCT beelden om de afwijkingen van ledematen te onderzoeken 14 . Voorbeelden van vroeger gebruikte tijdspunten omvatten 28 dagen en 56 dagen na het letsel. Groeiplaatmetingen, inclusief totale hoogte, zonale hoogten en tethervorming, kunnen ook belangrijke informatie verschaffen over het weefselherstelproces 13 , 14 , 15 . Ideaal gezien moet men de ledematen en gewrichten van de ledematen nemen voordat de operatie een basiswaarde heeft. Om de biologische mechanismen verder te verhelderen of om de werkzaamheid van een behandeling te testen, dienen passende controlegroepen te worden ontworpen en omvatten niet-geaffekteerde ledematen en ledematen die operatie ondergaan, maar onbehandeld zijn.

Biomaterialen kunnen ook getest worden in dit groeiplaatschade model. Als voorbeeld, een chiTosan microgel 19 werd geïnjecteerd in de groeiplaat letselplaats, zoals beschreven in stap 7.1, en wordt duidelijk gezien bij de schadeplaats in figuur 4 . Volgende analyse kan de bepaling van de effecten van het biomateriaal op reparatieweefselsamenstelling, ledemaatlengte en groeiplaatmetingen omvatten, zoals eerder besproken.

Figuur 2
Figuur 2. Succesvolle groeiplatenonderbreking en Bony Bar Formation.
Bony barvorming wordt gezien op 7 dagen na verwonding met microCT en bevestigd door Alcian blue hematoxylin (ABH) kleuring. De benige bar is volgroeid tegen dag 28 na het letsel, zoals gezien bij microCT- en ABH-kleuring. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.


Figuur 3. Potentiële resultaten van onjuiste boring.
A)
Te veel boring door de tibia kan het gewrichtsoppervlak verstoren, waardoor het genezingsproces wordt gecompliceerd en kan leiden tot onvolledige resultaten. B) Incorrecte hoek van de boor kan leiden tot een niet-centrale groeiplaat letsel. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Behandeling van een groeiplaatskade met een biomateriaal.
ABH-kleuring toont de chitosan-microgel in de gewonde groeiplaat.

Metriek Run 1 Run 2 Run 3 P-value
Botvolume fractie binnen de gehele groeiplaat 9,76 +/- 3,81% 10,52 +/- 4,06% 11,93 +/- 2,04% 0,5493
Botvolume fractie binnen het herstelweefselgebied 41,5 +/- 8,33% 46,08 +/- 10,12% 46,77 +/- 8,14% 0,5128

Tabel 1. Bone Volume Fraction Data.
Gegevens waren van micro CT beelden op 28 dagen na verwonding op onbehandelde ratten uit drie onafhankelijke ritten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een groeiplaat schade dier model voegt sterk toe bij ons inzicht in de biologische mechanismen van dit letsel, waardoor het mogelijk is om effectiever therapeutische interventies te geven voor kinderen die lijden aan groeiplaatletsel. Om succesvol een benige staaf te maken en zijn in vivo vorming te bestuderen door gebruik te maken van het model dat in dit werk wordt gepresenteerd, is het van kritieke belang om de groeiplaat te ontwrichten door voldoende voldoende diepte te boren zonder de gewrichtskraakbeen te verstoren. Variatie in chirurgische implementatie tussen dieren en, in mindere mate, variatie in anatomische markers kan leiden tot problematische resultaten. Wij raden aan om de hierboven beschreven procedures uit te oefenen op cadaverische dieren om een ​​succesvolle groeiplaatletsel te waarborgen alvorens de procedure voor levende dierenstudies uit te voeren. Terwijl cadaverische dieren geen weefselplooibaarheid hebben en niet zullen bloeden, zullen de groeiplaatbeseringsprocedure en anatomische eigenschappen op deze dieren vergelijkbaar zijn met die van levende dieren. FurtHermoor, kan de cadaverische tibiale groeiplaat gemakkelijk worden gedeeld, aangezien de epifyse scheidt van de metafyse door toepassing van lichtkracht en de plaats van het boorgat kan worden waargenomen. Deze snelle analyse maakt het mogelijk om techniekwijzigingen aan te brengen om de juiste boordiepte en angulatie op cadaverische dieren te leren, zonder de behoefte aan beeldvorming.

Opgemerkt dient te worden dat er andere dierenmodellen van groeiplaatschade bestaan. Een soortgelijk transfyseal defect is in de muis uitgevoerd en leidde tot een bony bar formatie 20 . Ondanks zijn kleinere grootte kan het ook gebruikt worden om de mechanismen die betrokken zijn bij de bony barvorming te bestuderen. Coleman et al . Gerapporteerd over een ander geldig rat model van groeiplaat letsel, waar een centraal transfyseal defect werd gecreëerd in de distale femur door boren door de gewrichtskraakbeen 21 . Deze aanpak leidde ook tot de vorming van een benige bar en de lengte van de ledematen, zoals in deModel hier gepresenteerd. Andere dierenmodellen van verwonding en behandeling van groeiplaatjes omvatten konijnen 22 , varkens 23 en schapen 24 . Terwijl grotere dierenbeschermingsmodellen meer klinische verwondingen kunnen vertegenwoordigen, is het ratmodel bruikbaar voor onderzoek naar de biologische mechanismen van fyseale verwondingen. Bijvoorbeeld, het hier gepresenteerde ratmodel is uitgebreid gebruikt voor het onderzoeken van moleculaire mechanismen van fyseale verwondingen en het benenvormingsproces 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Bovendien kan het ratmodel worden gebruikt om verschillende fyseale behandelingen te testen alvorens te verhuizen naar grotere dierenmodellen. Een uitdaging van dit rat model van groeiplaat letsel is echter dat de boring in het bot gedaan wordt, maKoning het onmogelijk om te observeren waar het boorgat zich in de groeiplaat bevindt. Zo kan succesvolle verstoring van de groeiplaat op levende dieren alleen worden bevestigd met behulp van beeldvormingstechnieken op het moment van de operatie of door de benenvorming tussen 7 en 28 dagen na de operatie te beoordelen. Met de praktijk kan een hoge mate van succes worden verkregen bij het verkrijgen van botvormige barvorming, maar vroege studies kunnen resulteren in een aantal dieren die de vorming van een benige staaf ontbreken, als gevolg van een ongecontroleerde groeiplaat of onvoldoende verstoring van de groei bord.

Een ander beperking van dit model is dat boorgatschade geen normale geweerbeschadigingen bij kinderen vertegenwoordigt, die gewoonlijk door breuk 25 optreden. Fracturen in het groeiplaat kunnen worden ingedeeld met behulp van het Salter-Harris classificatiesysteem 26 . Fracturen van type III en type IV groeien meestal bij tot de fyseale verwondingen die leidenNaar benige barvorming. Het hierbij meest voorkomende groeiplaat-verwondingstype heeft betrekking op een type VI-groeiplaatletsel, een zeldzame klasse letsel waarbij de fysi is verwijderd door een trauma of een puntwond. Aangezien de pathofysiologische mechanismen die ten grondslag liggen aan de bony barvorming, na het voorkomen van groeiplaatbesmettingen onduidelijk blijven, blijft het ratmodel belangrijk om dit proces te ontdekken om nieuwe behandelingsopties te ontwikkelen voor kinderen die lijden aan alle soorten groeiplaatverwondingen. De hier beschreven methode creëert een benige staaf en kan gebruikt worden om meerdere aspecten van het herstelplaatprobleemreparatieproces in vivo 17 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 te bestuderen. Ook is aangetoond dat dit ratmodel resulteert in verminderde tibiale groei na groeiplaatJury 13 , waardoor het een nog interessanter diermodel is om nieuwe behandelingsopties te testen die leiden tot regeneratie van de platen en de mogelijke herstel van de verlenging van de bot.

Ten slotte wordt in deze krant de methoden beschreven om een ​​groeiplaatverwondingsmodel te creëren waarmee bony barvorming en potentiële behandelingen voor groeiplaatverwondingen in vivo kunnen worden onderzocht . Dit ratmodel zorgt voor relatief goedkope en snelle studies, aangezien een benige staaf volgroeid is 28 dagen na groeiplaatbeschadiging. Naast het ontwikkelen van ons inzicht in de moleculaire mechanismen van bony barvorming in vivo , kan dit model worden gebruikt om biomaterialen te testen die botvormige barvorming remmen en de regeneratie van de groeiplaat kraakbeen aanmoedigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

De auteurs erkennen financieringssteun van het National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases van de National Institutes of Health (NIH) onder onderscheidingsnummer R03AR068087, het Academisch Verrijking Fonds van de Universiteit van Colorado School of Medicine en het Gates Center for Regenerative Medicine . Dit werk werd ook ondersteund door NIH / NCATS Colorado CTSA Grant Nummer UL1 TR001082. De inhoud is de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs officiële NIH-standpunten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scalpel handle McKesson MCK42332500
Needle holder Stoelting RS-7824
Adson tissue forceps Sklar 50-3048
Iris Scissors Sklar 47-1246
Rotary Tool Dremel 7700 Variable speed rotary tool 
Keyless Rotary Tool Chuck Dremel 4486
Dental Burs Dental Burs USA FG6 Round carbide bur, ≤2mm
Steinmann pins Simpex Medical T-078
Hair clippers Wahl  5537N
3-0 PGA surutes Oasis MV-J398-V
Sterile gauze 2 x 2" Covidien 441211
Povidone Iodine McKesson 922-00801
Sterile saline Vetone 510224
10 mL luer lock syringe Becton Dickinson 309604
23 gauge needle Becton Dickinson 305145
Isopropyl alcohol pads Dynarex 1113
Isoflurane IsoFlo 30125-2
Caliper Mitutoyo 500-196-30
Carprofen Rimadyl 27180
Buprenorphine Par Pharmaceuticals Inc NDC 42023-179
Fenestrated Surgical Drape McKesson 25-517
Surgical Gloves Uline S-20204
#15 Scalpel Blade Aven 44044
9 mm wound clips Fine Science Tools 12032-09
Reflex clip applier World Precision Instruments 500345
Absorbant underpads McKesson MON 43723110
Tec 3 Iso Vaporizer  VetEquip 911103 
Germinator 500 Braintree Scientific GER 5287-120V
Warm water recirculator Kent Scientific TP-700
Absorbent Underpads Medline Industries MSC281230

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mann, D. C., Rajmaira, S. Distribution of physeal and nonphyseal fractures in 2,650 long-bone fractures in children aged 0-16 years. J Pediatr Orthop. 10, (6), 713-716 (1990).
  2. Browne, L. P., et al. Community-acquired staphylococcal musculoskeletal infection in infants and young children: necessity of contrast-enhanced MRI for the diagnosis of growth cartilage involvement. AJR Am J Roentgenol. 198, (1), 194-199 (2012).
  3. Weitao, Y., Qiqing, C., Songtao, G., Jiaqiang, W. Epiphysis preserving operations for the treatment of lower limb malignant bone tumors. Eur J Surg Oncol. 38, (12), 1165-1170 (2012).
  4. Butler, M. S., Robertson, W. W., Rate, W., D'Angio, G. J., Drummond, D. S. Skeletal sequelae of radiation therapy for malignant childhood tumors. Clin Orthop Relat Res. (251), 235-240 (1990).
  5. Shapiro, F. Longitudinal growth of the femur and tibia after diaphyseal lengthening. J Bone Joint Surg Am. 69, (5), 684-690 (1987).
  6. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423, (6937), 332-336 (2003).
  7. Dodwell, E. R., Kelley, S. P. Physeal fractures: basic science, assessment and acute management. Orthopaedics and Trauma. 25, (5), 377-391 (2011).
  8. Khoshhal, K. I., Kiefer, G. N. Physeal bridge resection. J Am Acad Orthop Surg. 13, (1), 47-58 (2005).
  9. Hasler, C. C., Foster, B. K. Secondary tethers after physeal bar resection: a common source of failure. Clin Orthop Relat Res. (405), 242-249 (2002).
  10. Xian, C. J., Zhou, F. H., McCarty, R. C., Foster, B. K. Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site. J Orthop Res. 22, (2), 417-426 (2004).
  11. Chen, J., et al. Formation of tethers linking the epiphysis and metaphysis is regulated by vitamin d receptor-mediated signaling. Calcif Tissue Int. 85, (2), 134-145 (2009).
  12. Coleman, R. M., Schwartz, Z., Boyan, B. D., Guldberg, R. E. The therapeutic effect of bone marrow-derived stem cell implantation after epiphyseal plate injury is abrogated by chondrogenic predifferentiation. Tissue Eng Part A. 19, (3-4), 475-483 (2013).
  13. Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. The potential role of VEGF-induced vascularisation in the bony repair of injured growth plate cartilage. J Endocrinol. 221, (1), 63-75 (2014).
  14. Coleman, R. M., et al. Characterization of a small animal growth plate injury model using microcomputed tomography. Bone. 46, (6), 1555-1563 (2010).
  15. Macsai, C. E., Hopwood, B., Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. Structural and molecular analyses of bone bridge formation within the growth plate injury site and cartilage degeneration at the adjacent uninjured area. Bone. 49, (4), 904-912 (2011).
  16. Su, Y. W., et al. Neurotrophin-3 Induces BMP-2 and VEGF Activities and Promotes the Bony Repair of Injured Growth Plate Cartilage and Bone in Rats. J Bone Miner Res. (2016).
  17. Zhou, F. H., Foster, B. K., Sander, G., Xian, C. J. Expression of proinflammatory cytokines and growth factors at the injured growth plate cartilage in young rats. Bone. 35, (6), 1307-1315 (2004).
  18. Sayers, D., Volpin, G., Bentley, G. The demonstration of bone and cartilage remodelling using alcian blue and hematoxylin. Biotechnic & Histochemistry. 63, (1), 59-63 (1988).
  19. Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
  20. Lee, M. A., Nissen, T. P., Otsuka, N. Y. Utilization of a murine model to investigate the molecular process of transphyseal bone formation. J Pediatr Orthop. 20, (6), 802-806 (2000).
  21. Coleman, R. M., et al. Characterization of a small animal growth plate injury model using microcomputed tomography. Bone. 46, (6), 1555-1563 (2010).
  22. Lee, S. U., Lee, J. Y., Joo, S. Y., Lee, Y. S., Jeong, C. Transplantation of a Scaffold-Free Cartilage Tissue Analogue for the Treatment of Physeal Cartilage Injury of the Proximal Tibia in Rabbits. Yonsei Med J. 57, (2), 441-448 (2016).
  23. Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 156, (2), 128-134 (2012).
  24. Hansen, A. L., et al. Growth-plate chondrocyte cultures for reimplantation into growth-plate defects in sheep. Characterization of cultures. Clin Orthop Relat Res. (256), 286-298 (1990).
  25. Cepela, D. J., Tartaglione, J. P., Dooley, T. P., Patel, P. N. Classifications In Brief: Salter-Harris Classification of Pediatric Physeal Fractures. Clin Orthop Relat Res. (2016).
  26. Salter, R. B., Harris, W. R. Injuries Involving the Epiphyseal Plate. The Journal of Bone & Joint Surgery. 83, (11), 1753 (2001).
  27. Chung, R., Foster, B. K., Zannettino, A. C., Xian, C. J. Potential roles of growth factor PDGF-BB in the bony repair of injured growth plate. Bone. 44, (5), 878-885 (2009).
  28. Fischerauer, E., Heidari, N., Neumayer, B., Deutsch, A., Weinberg, A. M. The spatial and temporal expression of VEGF and its receptors 1 and 2 in post-traumatic bone bridge formation of the growth plate. J Mol Histol. 42, (6), 513-522 (2011).
  29. Chung, R., Cool, J. C., Scherer, M. A., Foster, B. K., Xian, C. J. Roles of neutrophil-mediated inflammatory response in the bony repair of injured growth plate cartilage in young rats. J Leukoc Biol. 80, (6), 1272-1280 (2006).
  30. Chung, R., et al. Roles of Wnt/beta-catenin signalling pathway in the bony repair of injured growth plate cartilage in young rats. Bone. 52, (2), 651-658 (2013).
  31. Zhou, F. H., Foster, B. K., Zhou, X. F., Cowin, A. J., Xian, C. J. TNF-alpha mediates p38 MAP kinase activation and negatively regulates bone formation at the injured growth plate in rats. J Bone Miner Res. 21, (7), 1075-1088 (2006).
  32. Arasapam, G., Scherer, M., Cool, J. C., Foster, B. K., Xian, C. J. Roles of COX-2 and iNOS in the bony repair of the injured growth plate cartilage. J Cell Biochem. 99, (2), 450-461 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics