En Rat Tibial Growth Plate Skade Modell å karakterisere reparasjonsmekanismer og evaluere Growth Plate Regeneration Strategies

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vækstplaten er en bruskbein i barnets lange ben hvor langsgående vekst oppstår. Når det er skadet, kan bony vev danne og svekke veksten. Vi beskriver en rotte modell av vekstplater skade som fører til bony reparasjon vev, slik at studien av reparasjonsmekanismer og vekst plate regenerering strategier.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Erickson, C. B., Shaw, N., Hadley-Miller, N., Riederer, M. S., Krebs, M. D., Payne, K. A. A Rat Tibial Growth Plate Injury Model to Characterize Repair Mechanisms and Evaluate Growth Plate Regeneration Strategies. J. Vis. Exp. (125), e55571, doi:10.3791/55571 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En tredjedel av alle pediatriske frakturer involverer vekstplaten og kan føre til svekket beinvekst. Voksplaten (eller physis) er bruskvæv funnet på slutten av alle lange bein hos barn som er ansvarlig for langsgående beinvekst. Når det er skadet, kan bruskvev i vekstplaten gjennomgå for tidlig senkning og føre til uønsket bony reparasjonsvev, noe som danner en "bony bar". I noen tilfeller kan denne bony baren resultere i bevegelsesdeformiteter, for eksempel vinkeldeformiteter, eller det kan helt stoppe langsgående benvekst. Det er for øyeblikket ingen klinisk behandling som fullt ut kan reparere en skadet vekstplate. Ved å bruke en dyremodell av vekstplaterskade forstår man bedre mekanismene som ligger til grunn for bonybardannelse, og å identifisere måter å hemme på, er det en flott mulighet til å utvikle bedre behandlinger for vekstskadeplager. Denne protokollen beskriver hvordan du forstyrrer den rotte proksimale tibial vekstplaten ved hjelp av en borehulldefekt. Denne smaLl dyremodell produserer pålitelig en bony bar og kan resultere i vekstdeformiteter som ligner på de som er sett hos barn. Denne modellen tillater undersøkelse av de molekylære mekanismene for bonybardannelse og fungerer som et middel for å teste potensielle behandlingsalternativer for skader på vekstplater.

Introduction

Vektplaten skader står for 30% av alle pediatriske frakturer og kan føre til svekket beinvekst 1 . I tillegg til brudd, kan vekstplaten skader skyldes andre etiologier, inkludert osteomyelitt 2 , primære beintumorer 3 , stråling og kjemoterapi 4 og iatrogene skader 5 . Voksplaten (eller physis) er en bruskregion på slutten av barnets lange ben som er ansvarlig for langsgående beinvekst. Det kjører beinforlengelse gjennom endokondral ossifikasjon; Kondrocytter gjennomgår proliferasjon og hypertrofi og omformes deretter ved innkommende osteoblaster for å danne trabekulær bein 6 . Vækstplaten er også et svakt område av det utviklende skjelettet, noe som gjør det utsatt for skade. Den største bekymringen med frakturer eller skader på vekstplaten er at det skadede bruskvevet i vekstplaten kan bE erstattet med uønsket bony reparasjonsvev, også kjent som en "bony bar". Avhengig av sin størrelse og plassering innenfor vekstplaten, kan den bony stangen føre til vinkeldeformiteter eller fullstendig vekststans, en ødeleggende sequela for små barn som ennå ikke har nådd sin høyde 7 .

Det er for tiden ingen behandling som fullt ut kan reparere en skadet vekstplate. Når bonybarnet dannes, må klinikeren avgjøre om det skal fjernes 8 kirurgisk eller ikke. Pasienter med minst 2 år eller 2 cm gjenværende skjelettvekst og med en benaktig bar som strekker seg mindre enn 50% av vekstplatformen, er vanligvis kandidater for bony bar resection 8 . Kirurgisk fjerning av benstangen blir ofte fulgt av interposisjon av et autologt fetttransplantat for å forhindre reformering av det benete vevet og å tillate den omkringliggende ujente vekstplaten å gjenopprette vekst. Imidlertid er disse teknikkene problEmatisk og ofte mislykkes, som fører til gjentatt bonybjelke og fortsatt negativ effekt på vekst 9 . Det er et kritisk behov for å utvikle effektive behandlinger som ikke bare forhindrer bony bardannelse, men også regenerere vekstplaten brusk, og dermed gjenopprette normal beinforlengelse.

De molekylære mekanismene som ligger til grunn for bonybardannelse, har ennå ikke blitt fullt utklart. En større forståelse av disse biologiske mekanismer kan føre til mer effektive terapeutiske tiltak for barn som lider av skader på vekstplaten. Siden det er vanskelig å studere disse mekanismene hos mennesker, har dyrmodeller blitt brukt, spesielt rottemodellen for vekstplaterskade 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Metoden presentert i dettePapir beskriver hvordan en borehullsdefekt i rotte tibial vekstplaten fører til forutsigbart og reproduserbart reparasjonsvæv som begynner ossifisering så tidlig som 7 dager etter skade og danner en fullmåne bony bar med remodeling 28 dager etter skade 10 . Dette gir et lite dyr in vivo- modell for å studere de biologiske mekanismene for bonybardannelse, samt å evaluere nye terapier som kan hindre den benete baren og / eller regenerere vekstplastebrusk. For eksempel kan denne modellen brukes til å teste kondrogenbiomaterialer som kan regenerere vekstplastebrusk og tilby verdifull behandling for barn som lider av skader på vekstplaten. Teknikkene som presenteres i dette dokumentet, vil beskrive de kirurgiske metodene som brukes til å produsere vekstplaterskaden og den etterfølgende levering av biomaterialer til skadestedet. Vi vil også diskutere metoder for å vurdere bony bar formasjon og reparasjon av vev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreprosedyrer må godkjennes av den lokale institusjonelle dyrepleie- og brukskomiteen (IACUC). Dyreprotokollen for følgende prosedyre ble godkjent av University of Colorado Denver IACUC.

1. Oppnå rotter

MERK: Med mindre genetisk modifiserte dyr er ønsket, behøves 6 uker gamle, skeletalt umodne Sprague-Dawley-rotter ved operasjonstidspunktet. Andre stammer kan potensielt brukes; Imidlertid har flertallet av publiserte studier blitt utført på Sprague-Dawley-rotter.

2. Forberedelse av kirurgiske forsyninger

  1. Autoklaver kirurgiske forsyningspakker som inkluderer ett av følgende: # 3 skalpellhåndtak, nåleholder, Adson tang og iris saks.
  2. Autoklaver de nøkleborehullene. Drill chucks kan være perle sterilisert mellom dyr operasjoner når de opererer på flere dyr.
    MERK: Lokale IACUC-regler som gjelder bruk av steril surgIcal verktøy på flere dyr må overholdes. For eksempel tillater University of Colorado Denver IACUC at ett kirurgisk verktøy settes til å brukes på opptil 5 dyr før opphøringen. Videre må kirurgiske verktøy varmestiliseres ved bruk av en perlesterilisator mellom dyr. Ytterligere sterile kirurgiske pakninger må brukes til eventuelle ekstra dyr.
  3. Autoklaver 5 cm Steinmann pins, ett for hvert dyr.
    MERK: For å redusere risikoen for infeksjon, må Steinmann-pinnene ikke brukes til flere dyr.
  4. Autoklave 1,8 mm dental burs, en for hvert dyr.
    MERK: For å redusere infeksjonsrisikoen må tannbørsen ikke brukes til flere dyr.
  5. Autoklaver en sårklipsapplikator, hvis det er aktuelt. Alternativt kan gravede suturer brukes til å lukke det kutane laget. Se trinn 7.3.
  6. Hvis det er mulig, steriliser en roterende borer ved hjelp av bestråling eller gasssterilisering.
  7. Samle følgende ekstra forsyninger: elektrisk barbermaskin, steRile 3-0 polyglykolsyre suturer, steril gaze, povidon-jod, steril saltløsning, sterile 10 ml sprøyter, sterile 23-gauge nåler, isopropylalkohol swabs, isofluran, calipers, post-kirurgiske analgetika ( f.eks. NSAIDs og buprenorfin), Sterile kirurgiske gardiner, sterile kirurgiske hansker, sterile # 15 skalpellblad, sterile sårklemmer, anestesimaskin, perlesterilisator, varmepute og absorberende underlag.

3. Anestesi og fremstilling av dyr

  1. Bedøv dyret ved å introdusere det til et 1- til 2-L induksjonskammer som mottar 1 l / min oksygenstrøm med 5% isofluran fra et fordampningssystem med et passivt avsugningssystem.
    MERK: Eksponering for 5% isofluran bør bedøve 6 uker gamle rotter innen 5 minutter.
  2. Flytt dyret til kirurgisk område og hold dyret under anestesi med 2 - 3% isofluran ved hjelp av en nese kjegle for resten av prosedyren. Plasser dyret på en oppvarming og absorbereEnt underpad.
    MERK: Dyret trenger ikke festes til kirurgisk bord. Å holde benet som angitt i trinnene nedenfor, er en tilstrekkelig stabiliseringsmetode.
    MERK: Alle etterfølgende prosedyrer skal gjøres med dyret under anestesi. 2 - 3% isofluran bør være tilstrekkelig til å opprettholde anestesi hos rotter i denne alderen. Dette kan bekreftes ved å teste bipedal tilbaketrekningsrefleks.
  3. Administrer intraoperative analgetika i samsvar med institusjonelt godkjente retningslinjer ( f.eks. Buprenorfin ved 0,05 mg / kg og karprofen ved 5 mg / kg).

4. Forberedelse av Tibia for kirurgi

  1. Barber hele bakbenet (e) fra medial malleolus til bekkenet med en elektrisk barbermaskin.
  2. Mål og registrer tibiallengden fra det fremre tibialplatået til den nedre delen av medialmalleolus ved hjelp av kaliprer. Alternativt måler du hele tibiallengden ved hjelp av røntgen eller microCT 11 Sup> , 12 , 14 . Mål måleplattedimensjoner før kirurgi ved hjelp av røntgen eller microCT.
  3. Rengjør kirurgisk område ved å tørke hele benet, bukene og kjønnsorganene med alkoholvasker og deretter med povidon-jod-gjennomvåt gasbind.
    MERK: For å minimere risikoen for infeksjon, må alle påfølgende prosedyrer, til dyret er fjernet fra anestesi (trinn 7.4), gjøres under sterile forhold. Alle kirurgiske materialer må nås ved hjelp av steril teknikk. Bruken av en kirurgisk assistent anbefales sterkt for å opprettholde sterilitet gjennom hele operasjonen.
  4. Bruk sterile kirurgiske hansker, plasser en fenestrert steril kirurgisk drap over dyret, og la benet være utsatt gjennom den sentrale fenestrasjonen.

5. Kirurgisk prosedyre for å få tilgang til vekstplaten

_upload / 55571 / 55571fig1.jpg "/>
Figur 1: Oversikt over kirurgisk prosedyre.
A)
Plassering av flere anatomiske markører som brukes til å skape en vellykket vekstplateskade. Knækapselet er umiddelbart bakre på knekken (hvit), og separerer tibia fra lårbenet. Tibial vekstplaten (mørk rød) kan ses dårligere enn knekken og kringgår tibia. Den proksimale vekstplaten er et stort sett flatt plan, bortsett fra det fremre kvartalet som danner et diagonalt plan. Krysset mellom disse to planene danner vekstplaten vinkelen, som brukes til passende borevinkling. Semitendinosus-innføringen er hvor quadriceps-muskelen setter inn i bakre tibia. B) Innsnitt gjennom det fremre og mediale aspektet av tibiale myke vev for å få tilgang til den kortikale bein. C) Lokalisering av det kortikale vinduet ved hjelp av justering med den distale semitendinosus-innføringen som referansepunkt. D) EvalueringDypet av skaden ved å justere skråningen på tannhulen med det kortikale vinduet.

  1. Legg inn en ~ 1 cm snitt gjennom huden langs medial-fremre aspekt av proksimal tibia ved hjelp av et # 3 skalpellhåndtak og et # 15 blad, som starter ved den distale enden av medial femoral kondylen ( Figur 1A ).
    1. Trekk huden tett mot det underliggende beinet og hold benet fast mens du gjør snittet.
      MERK: Dette vil holde huden snitt på ønsket sted og vil bidra til å skape et rent snitt. Ikke trykk for fast med skalpellet for å unngå å punktere knekapselet, noe som vil resultere i kraftig blødning og vil gjøre de resterende trinnene vanskelige.
  2. Legg merke til viktige anatomiske markører, inkludert: 1) vekstplaten, 2) vekstplaten vinkel, 3) knekapselet, og 4) semitendinosusinnsatsen ( figur 1A ).
  3. Ved hjelp av skalpell må du lage en 0,5 cm snitt gjennom denE-fascia og bløtvev på medial-fremre aspekt av proksimal tibia, fra vekstplaten til bunnen av hudinnsnittet ( figur 1B ).
  4. Oppsigter eller skrape forsiktig fascia og bløtvev fra tibia ved hjelp av skalpellet ( figur 1B ).
    MERK: Det er viktig å fjerne eller skrape så mye mykt vev fra tibia som mulig for ikke å forstyrre boretrinnene.
  5. Bor et kortikalt vindu gjennom den tibiale kortikale bein ved diafysen med en Steinmann-pinne festet til et roterende verktøy ved 10.000 omdreininger (lav hastighet på det roterende verktøyet som er spesifisert i materialeseksjonen). Lag det kortikale vinduet slik at det justeres med den distale semitendinosus-innføringen ( figur 1C ).
    1. Hold boret vinkelrett på tibial diaphysis og bor langsomt, vær forsiktig så du ikke borer gjennom den andre siden av diaphysisen; Det kortikale vinduet må bare være ~ 2 mm i dybden og vil bli gjort når neiMotstand føltes.
    2. Som ovenfor, hold benet fast med den andre hånden.
      MERK: En tannkorn kan brukes til dette trinnet. Men hvis en tannhule brukes, må benet holdes veldig fast for å lage et rent kortikalt vindu og for å sikre at buret griper og kutter benet på ønsket sted. En Steinmann-pinne anbefales for dette trinnet, gitt sin langt overlegne skjæreevne.
  6. Dekk det kortikale vinduet med gasbind, da det forventes lett blødning.

6. Skape vekstskaderskade

  1. Lag boreskjoldsskader gjennom den sentrale vekstplaten ved hjelp av en 1,8 mm tannkule festet til et roterende verktøy.
    MERK: Den riktige dybden, vinkelen og retningen er avgjørende for å forstyrre den sentrale vekstplaten ( Figur 1C og D ). Instruksjoner for å oppnå riktig dybde, vinkel og retning er gitt nedenfor.
    1. For å måle riktig dybde ved hjelp av tannhulen, begynnN ved å tilpasse enden av tannhulen med den proksimale tibia, hvor semitendinosus krysser knekapselen ( figur 1C ).
    2. Med enden av tannkornet på knekapselen, følg burstaksen langs semitendinosusen og legg merke til hvor buret ligger i linje med det kortikale vinduet. Dette er den riktige dybden for buret for fullt å forstyrre vekstplaten uten å forstyrre leddflaten ( figur 1C ).
      MERK: Tannkatten brukes til å måle riktig dybde. Buren kan merkes med en permanent markør på stedet der den justerer seg med det kortikale vinduet for å referere til dybden under boring. Imidlertid, hvis de anatomiske markørene og ovennevnte protokoll er nært referert, vil den første skråningen på tannbørsen spesifisert her (FG6) justeres på riktig måte med det kortikale vinduet (som vist i figur 1C ).
    3. For å oppnå riktig borevinkel, hold rotasjonsverktøyet i en vinkel på mindre tHan 30 ° med hensyn til tibial diaphysis.
      MERK: Dette er en visuell tilnærming.
    4. For å oppnå riktig boreretning, sikte på vekstplaten vinkelen ( figur 1C ). Tegn en visuell linje langs tannhulen til vekstplaten vinkelen for å hjelpe til med å skape en sentral defekt.
    5. Slå på rotasjonsverktøyet til 10.000 RPM (lav hastighet på rotasjonsverktøyet som er angitt i materialet) før du går inn i det kortikale vinduet.
    6. Med rotasjonsverktøyet i en passende vinkel og retning, skriv inn det kortikale vinduet og skyv rotasjonsverktøyet til burmarkøren stemmer overens med det kortikale vinduet. Når riktig dybde er oppnådd, fjern rotasjonsverktøyet.
      MERK: Utfør vekstplaten avbrudd i en, rask bevegelse, ved å bruke minimal tid med buret i vekstplaten for å skape en ren skade. Dette er viktig for dataanalyse.
  2. Dab det kortikale vinduet med gasbind for ~ 30 s, ettersom blødning er forventet.
  3. Sikre riktig dybde av skaden ved å måle burlengden igjen (trinn 6.1.2).
    1. Sett buret inn i boresporet (med roterende verktøyet av) og juster merket bur med det kortikale vinduet ( Figur 1D ).
  4. Hvis dybden er utilstrekkelig, skru på rotasjonsverktøyet og trykk på ønsket dybde.
    MERK: Selv om en annen runde med boring ikke er ideell, er det helt avgjørende for vekstplaten at utviklingen av bonybjelken er fullstendig.
  5. Skyll boresporet med ~ 3 ml steril saltløsning ved hjelp av en 10 ml sprøyte og en 23-gauge nål.
  6. Tørk såret med gasbind.

7. Etterskadeprosedyrer

  1. Hvis du vurderer en biomaterialebasert vekstplatebehandling, injiser biomaterialet gjennom boresporet inn i skadestedet ved å bruke en nål med passende størrelse (18 til 26 gauge, avhengig av biomaterialets viskositet).
    MERK: Volumet av vekstplaten skade er ~ 3 & #181; L, og volumet av boresporet er ~ 20 μl. Maksimalt volum av materiale som kan injiseres i vekstplaten skade og borespor er mellom 20 og 25 μL.
  2. Lukk såret ved å sutere fascia med 3-0 polyglykolsyre suturer. Påfør benvoks over det kortikale vinduet for å isolere det underliggende benet (valgfritt).
  3. Lukk hudinnsnittet med gravede suturer eller sårklemmer.
    MERK: Sårklemmer anbefales, da dyret vil klø på skadestedet og kan åpne såret.
  4. Fjern dyret fra isofluranbedøvelse, legg det på et oppvarmet teppe, og kontroller det til det er vått.
  5. For å redusere risikoen for infeksjon, plasser dyret i et nytt bur som inneholder tørre, autoklaverte senger.
  6. Tillat dyret å bære vekt postoperativt.
  7. Overvåk dyret hver 12. time i 72 timer etter operasjonen for å sjekke for tegn på infeksjon, for å sikre at sårklemmene forblir på plass og å administrere postoperativE analgetika i samsvar med institusjonelt godkjente retningslinjer ( f.eks. Buprenorfin ved 0,05 mg / kg hver 12. time i 36 timer og carprofen ved 5 mg / kg hver 24. time i 72 timer).
  8. Fjern sårklemmen 10 - 14 dager etter kirurgi under anestesi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vellykket vekstplate skade ved hjelp av denne metoden innebærer forstyrrelsen av midten av tibial vekstplaten uten å forstyrre leddbrusk overflaten. Bony reparasjonsvæv har blitt rapportert å begynne på ca. 7 dager etter skade og blir fullt utviklet av 28 dager etter skade 13 , som visualisert ved mikroberegnet tomografi (mikro CT) ( figur 2 ). Selv om disse tidspunkter ble valgt her for å vise begynnelsen og modningen av beinformasjon basert på tidligere publiserte data, kan andre tidspunkter brukes til å undersøke de ulike trinnene i reparasjonsprosessen, fra dag 1 til 6 måneder etter kirurgi 17 . Tabell 1 gir en oversikt over beinvolumdannelse innen kirurgisk skadede rotteplattformer 28 dager etter kirurgi fra tre uavhengige forsøk ved å gi (1) benvolumfraksjonen i hele vekstplaten og (2) boenNe volumfraksjon i reparasjonsvevområdet bare 15 . Dataene er rapportert som gjennomsnittlig prosent ± standardavviket og indikerer at lignende resultater ble oppnådd mellom de uavhengige løpene. Variansen mellom de forskjellige løpene ble analysert ved en enveisanalyse av varians (ANOVA) og viser ingen statistisk signifikant forskjell mellom løpene, noe som tyder på reproduksjonsevne av modellen. Alcian Blue Hematoxylin (ABH) med Orange G / Eosin counterstain 18 ble brukt til histologisk å vise en rekke reparasjonsvev i forskjellige stadier av bony bar formasjon ( figur 2 ). Ved hjelp av denne histologiske flekken kan forskjellige typer reparasjonsvev, inkludert mesenkym, brusk, knoklet trabeculae og benmarg, identifiseres og kvantifiseres 16 .

Flere problemer kan oppstå ved feil følge de ovennevnte prosedyrene. En insufficie Nt boredybde vil ikke forstyrre vekstplaten, noe som vil resultere i liten eller ingen bony barformasjon. Forstyrrelse av leddbruskoverflaten skaper en større skade som kan introdusere leddbrusk inn i vekstplatenes skadested, og kompliserer helingsprosessen ( figur 3A ). Forstyrrelse av vekstplaten i uhensigtsmessig vinkel eller retning resulterer i en ikke-sentral skade ( figur 3B ). I dette tilfellet vil det fortsatt oppstå benaktig formasjon, selv om den vil være lateral eller medial til ønsket sted. Samlet sett kan reparasjonsvæv dannet etter vekstplateskade analyseres på en rekke måter, inkludert mikroCT, kvantitativ PCR, histologisk farging og immunhistokjemi. I tillegg til histologiske og molekylære målinger, gir lem lengde og vekst tallerken målinger et viktig mål for hele bein vekst. Berørte lemmer har blitt rapportert å oppleve vekstreduksjon sammenlignet med ukontrollerte kontroller> 13. Limlengden kan måles på forskjellige tidspunkter i løpet av studien ved hjelp av microCT-bilder for å undersøke forskjeller i lemmelengde 14 . Eksempler på tidspunkter som tidligere ble brukt inkluderer 28 dager og 56 dager etter skade. Vektplaten målinger, inkludert total høyde, zonalder og tetherdannelse, kan også gi viktig informasjon om vevsreparasjonsprosessen 13 , 14 , 15 . Ideelt sett bør man ta lem lengder og vekst tallerken målinger før kirurgi å ha en baseline verdi. For å belyse biologiske mekanismer eller å teste effekten av en behandling, bør egnede kontrollgrupper utformes og inkludere upåvirkede lemmer og lemmer som gjennomgått operasjon, men blir ubehandlet.

Biomaterialer kan også testes i denne vekstplatereskademodellen. Som et eksempel, en chiTosan mikrogel 19 ble injisert i vekstplater-skadestedet, som beskrevet i trinn 7.1, og det er tydelig sett på skadestedet i figur 4 . Etterfølgende analyse kan innebære å bestemme effekten av biomaterialet på reparasjonsvevssammensetning, lengde av lengde og vekstplate-målinger, som diskutert tidligere.

Figur 2
Figur 2. Vellykket vekstplateforstyrrelse og bony barformasjon.
Bony bar formasjon ses på 7 dager etter skade med microCT og bekreftet gjennom Alcian blå hematoxylin (ABH) farging. Den bony baren er fullt moden etter dag 28 etter skade, som sett med microCT og ABH-farging. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.


Figur 3. Potensielle utfall av feil boring.
A)
Boring for langt gjennom tibia kan forstyrre leddflaten, noe som kompliserer helingsprosessen og kan føre til ufattelige resultater. B) Feil vinkel på boret kan føre til skade på ikke-sentral vekstplate. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4. Behandling av vekstskadeskader med biomateriale.
ABH-farging viser chitosanmikrogelen i den skadede vekstplaten.

Metric Kjør 1 Kjør 2 Kjør 3 P-verdien
Bone volumfraksjon i hele vekstplaten 9,76 +/- 3,81% 10,52 +/- 4,06% 11,93 +/- 2,04% 0,5493
Beinvolumfraksjon i reparasjonsvævsområdet 41,5 +/- 8,33% 46,08 +/- 10,12% 46,77 +/- 8,14% 0,5128

Tabell 1. Bone Volume Fraction Data.
Data var fra mikro-CT-bilder ved 28 dager etter skade på ubehandlede rotter fra tre uavhengige løp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En dyrkningsmodell med dyrkningsskader bidrar sterkt til vår forståelse av de biologiske mekanismene til denne skaden, noe som potensielt fører til mer effektive terapeutiske tiltak for barn som lider av skader på vekstplaten. For å lykkes med å lage en bony bar og å studere sin formasjon in vivo ved hjelp av modellen presentert i dette arbeidet, er det kritisk å forstyrre vekstplaten ved å bore til en tilstrekkelig dybde uten å forstyrre leddbrusk. Variasjon i kirurgisk gjennomføring mellom dyr og, i mindre grad, variasjon i anatomiske markører kan føre til problematiske resultater. Vi anbefaler at du praktiserer prosedyrene beskrevet ovenfor på kadaveriske dyr for å sikre vellykket vekstplaterskade før du utfører prosedyren for levende dyreforsøk. Mens kadaveriske dyr mangler vevpålitelighet og ikke vil bløde, vil vekstplaterskadeprosedyren og anatomiske egenskaper på disse dyrene være lik de levende dyr. furtHermore, kan den cadaveric tibial vekstplaten enkelt bli dissekert, da epifysen skiller seg fra metafysen ved hjelp av lyskraft, og boringen av borehullet kan observeres. Denne raske analysen tillater teknikkendringer for å lære riktig boredybde og vinkling på kadaveriske dyr uten behov for bildebehandling.

Det skal bemerkes at andre dyremodeller av vekstplaterskader eksisterer. En lignende transfysealdefekt har blitt utført i musen og ført til bonybardannelse 20 . Til tross for sin mindre størrelse, kan den også brukes til å studere mekanismene som er involvert i bonybardannelse. Coleman et al . Rapportert på en annen gyldig rottemodell av vekstplaterskade, hvor en sentral transfysefeil ble opprettet i den distale lårbenen ved boring gjennom leddbrusk 21 . Denne tilnærmingen førte også til dannelsen av en bony bar og lem lengde ulikheter, som iModell presentert her. Andre dyremodeller av vekstplaterskader og behandling har inkludert kaniner 22 , griser 23 og sauer 24 . Mens større dyreskademodeller kan representere kliniske skader nærmere, er rottemodellen nyttig for forskning på de biologiske mekanismer for fyseskader. For eksempel er rottemodellen som presenteres her, blitt brukt i stor utstrekning for å undersøke molekylære mekanismer for fyseskader og den benformede formasjonsprosessen 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Videre kan rottemodellen brukes til å teste ulike fysebehandlinger før de flyttes til større dyremodeller. Imidlertid er en utfordring med denne rottemodellen av vekstplaterskade at boringen gjøres inne i beinet, maKongen er umulig å observere hvor borebrønnen ligger innenfor vekstplaten. Dermed kan vellykket forstyrrelse av vekstplaten på levende dyr kun bekreftes ved bruk av bildebehandlingsteknikker ved operasjonstidspunktet eller ved å bedømme knogletablering mellom 7 til 28 dager etter operasjonen. Med praksis kan man oppnå en høy grad av suksess når det gjelder å oppnå bonybardannelse, men tidlig studier kan resultere i et antall dyr som mangler dannelse av en bony bar, enten på grunn av en ujordet vekstplate eller utilstrekkelig forstyrrelse av veksten tallerken.

En annen begrensning av denne modellen er at borehullskader ikke representerer normal vekstplate skader hos barn, som vanligvis oppstår på grunn av brudd 25 . Frakturer i vekstplaten kan klassifiseres ved hjelp av Salter-Harris klassifikasjonssystemet 26 . Type III og type IV vekstplater frakturer bidrar mest til fyseskader som førerTil bony bar formasjon. Vækstplaten skade typen som presenteres her tett knyttet til en type VI vekst plate skade, en sjelden klasse av skade der physis er fjernet av et traume eller punktering sår. Siden de patofysiologiske mekanismene som ligger til grunn for bonybjelkdannelse etter at vekstplaten er skadelig, forblir rotsmodellen imidlertid viktig for å avdekke denne prosessen for å utvikle nye behandlingsmuligheter for barn som lider av alle typer skader i vekstplaten. Metoden beskrevet her oppretter på en pålitelig måte en benaktig bar og kan brukes til å studere flere aspekter av reparasjonsprosessen for vekstplaterskade in vivo 17 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 . Det har også vist seg at denne rotte modellen resulterer i redusert tibial vekst etter vekstplaten innJury 13 , noe som gjør det til en enda mer interessant dyremodell for å teste nye behandlingsalternativer som fører til regenerering av vekstplater og potensiell gjenoppretting av benforlengelse.

I konklusjonen beskriver dette papiret metodene for å skape en vekstplatereskjemodell som kan undersøke bonybardannelse og potensielle behandlinger for vekstplaterskader in vivo. Denne rottemodellen gjør det mulig for relativt billige og raske studier, da en bony bar er fullt moden 28 dager etter vekstplaten skade. I tillegg til å utvikle vår forståelse av de molekylære mekanismene for bonybarndannelse in vivo , kan denne modellen brukes til å teste biomaterialer som hemmer bonybardannelse og oppmuntre til regenerering av platensbrusk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgements

Forfatterne bekrefter finansieringsstøtte fra National Institute of Arthritis og Musculoskeletal and Skin Diseases ved National Institutes of Health (NIH) under prisnummer R03AR068087, Akademisk berikningsfond ved University of Colorado School of Medicine og Gates Center for Regenerative Medicine . Dette arbeidet ble også støttet av NIH / NCATS Colorado CTSA Grant nummer UL1 TR001082. Innholdet er forfatterens eget ansvar og representerer ikke nødvendigvis offisielle NIH-synspunkter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scalpel handle McKesson MCK42332500
Needle holder Stoelting RS-7824
Adson tissue forceps Sklar 50-3048
Iris Scissors Sklar 47-1246
Rotary Tool Dremel 7700 Variable speed rotary tool 
Keyless Rotary Tool Chuck Dremel 4486
Dental Burs Dental Burs USA FG6 Round carbide bur, ≤2mm
Steinmann pins Simpex Medical T-078
Hair clippers Wahl  5537N
3-0 PGA surutes Oasis MV-J398-V
Sterile gauze 2 x 2" Covidien 441211
Povidone Iodine McKesson 922-00801
Sterile saline Vetone 510224
10 mL luer lock syringe Becton Dickinson 309604
23 gauge needle Becton Dickinson 305145
Isopropyl alcohol pads Dynarex 1113
Isoflurane IsoFlo 30125-2
Caliper Mitutoyo 500-196-30
Carprofen Rimadyl 27180
Buprenorphine Par Pharmaceuticals Inc NDC 42023-179
Fenestrated Surgical Drape McKesson 25-517
Surgical Gloves Uline S-20204
#15 Scalpel Blade Aven 44044
9 mm wound clips Fine Science Tools 12032-09
Reflex clip applier World Precision Instruments 500345
Absorbant underpads McKesson MON 43723110
Tec 3 Iso Vaporizer  VetEquip 911103 
Germinator 500 Braintree Scientific GER 5287-120V
Warm water recirculator Kent Scientific TP-700
Absorbent Underpads Medline Industries MSC281230

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mann, D. C., Rajmaira, S. Distribution of physeal and nonphyseal fractures in 2,650 long-bone fractures in children aged 0-16 years. J Pediatr Orthop. 10, (6), 713-716 (1990).
  2. Browne, L. P., et al. Community-acquired staphylococcal musculoskeletal infection in infants and young children: necessity of contrast-enhanced MRI for the diagnosis of growth cartilage involvement. AJR Am J Roentgenol. 198, (1), 194-199 (2012).
  3. Weitao, Y., Qiqing, C., Songtao, G., Jiaqiang, W. Epiphysis preserving operations for the treatment of lower limb malignant bone tumors. Eur J Surg Oncol. 38, (12), 1165-1170 (2012).
  4. Butler, M. S., Robertson, W. W., Rate, W., D'Angio, G. J., Drummond, D. S. Skeletal sequelae of radiation therapy for malignant childhood tumors. Clin Orthop Relat Res. (251), 235-240 (1990).
  5. Shapiro, F. Longitudinal growth of the femur and tibia after diaphyseal lengthening. J Bone Joint Surg Am. 69, (5), 684-690 (1987).
  6. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423, (6937), 332-336 (2003).
  7. Dodwell, E. R., Kelley, S. P. Physeal fractures: basic science, assessment and acute management. Orthopaedics and Trauma. 25, (5), 377-391 (2011).
  8. Khoshhal, K. I., Kiefer, G. N. Physeal bridge resection. J Am Acad Orthop Surg. 13, (1), 47-58 (2005).
  9. Hasler, C. C., Foster, B. K. Secondary tethers after physeal bar resection: a common source of failure. Clin Orthop Relat Res. (405), 242-249 (2002).
  10. Xian, C. J., Zhou, F. H., McCarty, R. C., Foster, B. K. Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site. J Orthop Res. 22, (2), 417-426 (2004).
  11. Chen, J., et al. Formation of tethers linking the epiphysis and metaphysis is regulated by vitamin d receptor-mediated signaling. Calcif Tissue Int. 85, (2), 134-145 (2009).
  12. Coleman, R. M., Schwartz, Z., Boyan, B. D., Guldberg, R. E. The therapeutic effect of bone marrow-derived stem cell implantation after epiphyseal plate injury is abrogated by chondrogenic predifferentiation. Tissue Eng Part A. 19, (3-4), 475-483 (2013).
  13. Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. The potential role of VEGF-induced vascularisation in the bony repair of injured growth plate cartilage. J Endocrinol. 221, (1), 63-75 (2014).
  14. Coleman, R. M., et al. Characterization of a small animal growth plate injury model using microcomputed tomography. Bone. 46, (6), 1555-1563 (2010).
  15. Macsai, C. E., Hopwood, B., Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. Structural and molecular analyses of bone bridge formation within the growth plate injury site and cartilage degeneration at the adjacent uninjured area. Bone. 49, (4), 904-912 (2011).
  16. Su, Y. W., et al. Neurotrophin-3 Induces BMP-2 and VEGF Activities and Promotes the Bony Repair of Injured Growth Plate Cartilage and Bone in Rats. J Bone Miner Res. (2016).
  17. Zhou, F. H., Foster, B. K., Sander, G., Xian, C. J. Expression of proinflammatory cytokines and growth factors at the injured growth plate cartilage in young rats. Bone. 35, (6), 1307-1315 (2004).
  18. Sayers, D., Volpin, G., Bentley, G. The demonstration of bone and cartilage remodelling using alcian blue and hematoxylin. Biotechnic & Histochemistry. 63, (1), 59-63 (1988).
  19. Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
  20. Lee, M. A., Nissen, T. P., Otsuka, N. Y. Utilization of a murine model to investigate the molecular process of transphyseal bone formation. J Pediatr Orthop. 20, (6), 802-806 (2000).
  21. Coleman, R. M., et al. Characterization of a small animal growth plate injury model using microcomputed tomography. Bone. 46, (6), 1555-1563 (2010).
  22. Lee, S. U., Lee, J. Y., Joo, S. Y., Lee, Y. S., Jeong, C. Transplantation of a Scaffold-Free Cartilage Tissue Analogue for the Treatment of Physeal Cartilage Injury of the Proximal Tibia in Rabbits. Yonsei Med J. 57, (2), 441-448 (2016).
  23. Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 156, (2), 128-134 (2012).
  24. Hansen, A. L., et al. Growth-plate chondrocyte cultures for reimplantation into growth-plate defects in sheep. Characterization of cultures. Clin Orthop Relat Res. (256), 286-298 (1990).
  25. Cepela, D. J., Tartaglione, J. P., Dooley, T. P., Patel, P. N. Classifications In Brief: Salter-Harris Classification of Pediatric Physeal Fractures. Clin Orthop Relat Res. (2016).
  26. Salter, R. B., Harris, W. R. Injuries Involving the Epiphyseal Plate. The Journal of Bone & Joint Surgery. 83, (11), 1753 (2001).
  27. Chung, R., Foster, B. K., Zannettino, A. C., Xian, C. J. Potential roles of growth factor PDGF-BB in the bony repair of injured growth plate. Bone. 44, (5), 878-885 (2009).
  28. Fischerauer, E., Heidari, N., Neumayer, B., Deutsch, A., Weinberg, A. M. The spatial and temporal expression of VEGF and its receptors 1 and 2 in post-traumatic bone bridge formation of the growth plate. J Mol Histol. 42, (6), 513-522 (2011).
  29. Chung, R., Cool, J. C., Scherer, M. A., Foster, B. K., Xian, C. J. Roles of neutrophil-mediated inflammatory response in the bony repair of injured growth plate cartilage in young rats. J Leukoc Biol. 80, (6), 1272-1280 (2006).
  30. Chung, R., et al. Roles of Wnt/beta-catenin signalling pathway in the bony repair of injured growth plate cartilage in young rats. Bone. 52, (2), 651-658 (2013).
  31. Zhou, F. H., Foster, B. K., Zhou, X. F., Cowin, A. J., Xian, C. J. TNF-alpha mediates p38 MAP kinase activation and negatively regulates bone formation at the injured growth plate in rats. J Bone Miner Res. 21, (7), 1075-1088 (2006).
  32. Arasapam, G., Scherer, M., Cool, J. C., Foster, B. K., Xian, C. J. Roles of COX-2 and iNOS in the bony repair of the injured growth plate cartilage. J Cell Biochem. 99, (2), 450-461 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics