Un modèle de traumatisme en plaques de croissance tibiale de rat pour caractériser les mécanismes de réparation et évaluer les stratégies de régénération des plaques de croissance

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Summary

La plaque de croissance est une région cartilagineuse dans les os longs des enfants où se développe la croissance longitudinale. Lorsqu'ils sont blessés, les tissus osseux peuvent former et nuire à la croissance. Nous décrivons un modèle de rat de blessure à la plaque de croissance qui mène à un tissu de réparation osseuse, ce qui permet d'étudier les mécanismes de réparation et les stratégies de régénération des plaques de croissance.

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Erickson, C. B., Shaw, N., Hadley-Miller, N., Riederer, M. S., Krebs, M. D., Payne, K. A. A Rat Tibial Growth Plate Injury Model to Characterize Repair Mechanisms and Evaluate Growth Plate Regeneration Strategies. J. Vis. Exp. (125), e55571, doi:10.3791/55571 (2017).

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Abstract

Un tiers de toutes les fractures pédiatriques impliquent la plaque de croissance et peut entraîner une diminution de la croissance osseuse. La plaque de croissance (ou physis) est le tissu de cartilage trouvé à la fin de tous les os longs chez les enfants qui est responsable de la croissance osseuse longitudinale. Une fois endommagé, le tissu de cartilage dans la plaque de croissance peut subir une ossification prématurée et conduire à un tissu de réparation osseuse indésirable, qui forme une «barre osseuse». Dans certains cas, cette barre osseuse peut entraîner des déformations de croissance osseuse, telles que des déformations angulaires, ou elle peut bloquer complètement la croissance osseuse longitudinale. Il n'existe actuellement aucun traitement clinique qui puisse réparer complètement une plaque de croissance blessée. L'utilisation d'un modèle animal de blessure à la plaque de croissance pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents de la formation de la barre osseuse et pour identifier les moyens de l'inhiber est une excellente occasion de développer de meilleurs traitements pour les blessures à la plaque de croissance. Ce protocole décrit comment perturber la plaque de croissance tibiale proximale du rat en utilisant un défaut de trou de forage. Ce smaLe modèle animal produit de manière fiable une barre osseuse et peut entraîner des déformations de croissance similaires à celles observées chez les enfants. Ce modèle permet d'étudier les mécanismes moléculaires de la formation de la barre osseuse et sert à tester les options de traitement possibles pour les blessures à la plaque de croissance.

Introduction

Les blessures par plaque de croissance représentent 30% de toutes les fractures pédiatriques et peuvent entraîner une diminution de la croissance osseuse 1 . En plus des fractures, les blessures à la plaque de croissance peuvent être causées par d'autres étiologies, y compris l'ostéomyélite 2 , les tumeurs osseuses primaires 3 , les radiations et la chimiothérapie 4 et les dommages iatrogènes 5 . La plaque de croissance (ou physis) est une région cartilagineuse à la fin des os longs de l'enfant qui est responsable de la croissance osseuse longitudinale. Il entraîne l'allongement osseux par l'ossification endochondrale; Les chondrocytes subissent une prolifération et une hypertrophie et sont ensuite remodelés par des ostéoblastes entrants pour former un os trabéculaire 6 . La plaque de croissance est également une zone faible du squelette en développement, ce qui le rend sujet aux blessures. La principale préoccupation des fractures ou des blessures par la plaque de croissance est que le tissu de cartilage endommagé à l'intérieur de la plaque de croissance peut être bE remplacé par des tissus de réparation osseux indésirables, également appelés «barre osseuse». En fonction de sa taille et de son emplacement au sein de la plaque de croissance, la barre osseuse peut entraîner des déformations angulaires ou une arrêt de croissance complète, une séquelle dévastatrice pour les jeunes enfants qui n'ont pas encore atteint leur pleine hauteur 7 .

Il n'y a actuellement aucun traitement qui peut entièrement réparer une plaque de croissance blessée. Une fois que la barre osseuse se forme, le clinicien doit décider s'il faut ou non l'enlever chirurgicalement 8 . Les patients avec au moins 2 ans ou 2 cm de croissance squelettique restants et avec une barre osseuse qui dépasse moins 50% de la surface de la plaque de croissance sont habituellement des candidats à la résection à la barre osseuse 8 . L'élimination chirurgicale de la barre osseuse est souvent suivie d'une interposition d'un greffe de graisse autologue pour éviter la réformation du tissu osseux et pour permettre à la plaque de croissance non blessée environnante de restaurer la croissance. Cependant, ces techniques sont problÉmatique et échoue souvent, entraînant une récurrence de la barre osseuse et un effet négatif continu sur la croissance 9 . Il est essentiel de développer des traitements efficaces qui empêchent non seulement la formation de barbes osseuses, mais aussi la régénération du cartilage de la plaque de croissance, ce qui permet de restaurer l'allongement osseux normal.

Les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la formation de la barre osseuse n'ont pas encore été pleinement élucidés. Une meilleure compréhension de ces mécanismes biologiques pourrait conduire à des interventions thérapeutiques plus efficaces pour les enfants souffrant de blessures à la plaque de croissance. Étant donné que l'étude de ces mécanismes chez l'homme est difficile, des modèles animaux ont été utilisés, en particulier le modèle de rat de la plaie de croissance 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . La méthode présentée dans cettePapier décrit comment un défaut de forage dans la plaque de croissance tibiale de rat conduit à un tissu de réparation prévisible et reproductible qui commence l'ossification dès 7 jours après la blessure et forme une barre osseuse entièrement mûre avec remodelage 28 jours après une blessure 10 . Ceci fournit un petit modèle animal in vivo dans lequel étudier les mécanismes biologiques de la formation de barres osseuses, ainsi que d'évaluer de nouvelles thérapies qui pourraient empêcher la barre osseuse et / ou régénérer le cartilage de la plaque de croissance. Par exemple, ce modèle peut être utilisé pour tester les biomatériaux chondrogéniques qui peuvent régénérer le cartilage de la plaque de croissance et offrent un traitement précieux pour les enfants souffrant de blessures à la plaque de croissance. Les techniques présentées dans cet article décrivent les méthodes chirurgicales utilisées pour produire la lésion de la plaque de croissance et la délivrance subséquente de biomatériaux au site de blessure. Nous discuterons également des méthodes pour évaluer la formation de la barre osseuse et la réparation des tissus.

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Protocol

Toutes les procédures animales doivent être approuvées par le comité local d'aide et de soins pour animaux (IACUC). Le protocole animal pour la procédure suivante a été approuvé par l'Université du Colorado Denver IACUC.

1. Obtenir des rats

REMARQUE: Sauf si des animaux génétiquement modifiés sont souhaités, des rats Sprague-Dawley immématables de 6 semaines sont indispensables au moment de la chirurgie. D'autres souches pourraient être utilisées; Cependant, la majorité des études publiées ont été réalisées sur des rats Sprague-Dawley.

2. Préparation des fournitures chirurgicales

  1. Packs d'alimentation chirurgicale autoclave qui incluent l'un des éléments suivants: poignée de scalpel n ° 3, support d'aiguille, pince Adson et ciseaux d'iris.
  2. Enclenchez automatiquement les mandrins de forage sans clé. Les mandrins de forage peuvent être stérilisés par perles entre les chirurgies animales lorsqu'ils opèrent sur de multiples animaux.
    REMARQUE: Les règles locales de l'IACUC relatives à l'utilisation de la chirurgie stérileLes outils scientifiques sur les animaux multiples doivent être respectés. Par exemple, l'Université du Colorado Denver IACUC permet d'utiliser un ensemble d'outils chirurgicaux sur jusqu'à 5 animaux avant leur arrêt. En outre, les outils chirurgicaux doivent être stérilisés par la chaleur à l'aide d'un stérilisateur à talons entre les animaux. Des paquets chirurgicaux stériles supplémentaires doivent être utilisés pour tout animal supplémentaire.
  3. Autoclavez des épingles Steinmann de 5 cm, une pour chaque animal.
    REMARQUE: Pour réduire le risque d'infection, les épingles Steinmann ne doivent pas être utilisées pour de multiples animaux.
  4. Autoclave des fraises dentaires de 1,8 mm, une pour chaque animal.
    REMARQUE: Pour réduire le risque d'infection, les fraises dentaires ne doivent pas être utilisées pour de multiples animaux.
  5. Enclenchez automatiquement un applicateur de clip de blessure, le cas échéant. Alternativement, des sutures enterrées peuvent être utilisées pour fermer la couche cutanée. Voir l'étape 7.3.
  6. Si possible, stériliser une perceuse rotative à l'aide d'une irradiation ou d'une stérilisation au gaz.
  7. Recueillir les fournitures supplémentaires suivantes: rasoir électrique, steDes sutures d'acide polyglycolique rile 3-0, de la gaze stérile, de la povidone-iode, de la solution saline stérile, des seringues stériles de 10 mL, des aiguilles stériles de calibre 23, des tampons d'alcool isopropylique, de l'isoflurane, des étriers, des analgésiques post-opératoires ( p. Ex. Des AINS et de la buprénorphine) Des armoires chirurgicales stériles, des gants chirurgicaux stériles, des lames scalpel stériles # 15, des clips stériles enroulés, une machine d'anesthésie, un stérilisateur à talons, un coussin chauffant et des sous-couches absorbantes.

3. Anesthésie et préparation des animaux

  1. Anesthésier l'animal en l'introduisant dans une chambre d'induction de 1 à 2 L recevant un flux d'oxygène de 1 L / min avec 5% d'isoflurane à partir d'un système de vaporisation avec un système de balayage passif.
    NOTE: L'exposition à 5% d'isoflurane devrait anesthésier les rats de 6 semaines dans les 5 minutes.
  2. Déplacez l'animal sur le site chirurgical et maintenez l'animal sous anesthésie avec 2 à 3% d'isoflurane en utilisant un cône de nez pour le reste de la procédure. Placez l'animal en position couchée sur un coussin chauffant et absorbezEnt underpad.
    NOTE: L'animal n'a pas besoin d'être fixé à la table chirurgicale. Le maintien de la jambe comme spécifié dans les étapes ci-dessous est une méthode de stabilisation suffisante.
    NOTE: Toutes les procédures suivantes doivent être effectuées avec l'animal sous anesthésie. 2 - 3% d'isoflurane devrait être suffisant pour maintenir l'anesthésie chez les rats à cet âge. Cela peut être confirmé en testant le réflexe de retrait bipède.
  3. Administrer des analgésiques intra-opératoires conformément à des politiques approuvées par l'institution ( p. Ex. Buprénorphine à 0,05 mg / kg et carprofène à 5 mg / kg).

4. Préparation de la Tibia pour la Chirurgie

  1. Raser l'ensemble des jambes postérieures de la maléole médiale vers le bassin avec un rasoir électrique.
  2. Mesurer et enregistrer la longueur tibiale du plateau tibial antérieur vers le côté inférieur de la malléole médiale à l'aide d'étriers. Alternativement, mesurez la longueur totale du tibia à l'aide de rayons X ou de microCT 11 Sup> , 12 , 14 . En option, mesurez les dimensions de la plaque de croissance avant la chirurgie à l'aide de rayons X ou de microcT.
  3. Nettoyez le site chirurgical en essuyant toute la jambe, l'abdomen et les organes génitaux avec des écouvillons d'alcool et ensuite avec de la gaze povidone-trempée au iode.
    REMARQUE: Pour minimiser le risque d'infection, toutes les procédures ultérieures, jusqu'à ce que l'animal soit retiré de l'anesthésie (étape 7.4), doivent être effectuées dans des conditions stériles. Tous les matériaux chirurgicaux doivent être accessibles en utilisant une technique stérile. L'utilisation d'un assistant chirurgical est fortement recommandée pour maintenir la stérilité tout au long de la chirurgie.
  4. Porter des gants chirurgicaux stériles, placer un drap chirurgical stérile stérile sur l'animal, en laissant la ou les jambes exposées à travers la fenêtrage centrale.

5. Procédure chirurgicale pour accéder à la plaque de croissance

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Figure 1: Aperçu de la procédure chirurgicale.
A)
Localisation de plusieurs marqueurs anatomiques utilisés pour créer une blessure à la plaque de croissance réussie. La capsule du genou est immédiatement postérieure à la rotule (blanche), séparant le tibia du fémur. La plaque de croissance tibiale (rouge foncé) peut être inférieure à la rotule et contourner le tibia. La plaque de croissance proximale est un plan essentiellement plat, à l'exception du quartier antérieur qui forme un plan diagonal. L'intersection de ces deux plans forme l'angle de la plaque de croissance, qui est utilisé pour une angulation de forage appropriée. L'insertion de semitendinosus est l'insertion du muscle du quadriceps dans le tibia postérieur. B) Incision à travers l'aspect antérieur-médian des tissus mous tibiaux pour accéder à l'os corticale. C) Emplacement de la fenêtre corticale à l'aide de l'alignement avec l'insertion distale des demi-tendons comme point de référence. D) ÉvaluationLa profondeur de la blessure en alignant le biseau sur la fraise dentaire avec la fenêtre corticale.

  1. Faire une incision de ~ 1 cm dans la peau le long de l'aspect antérieur médian du tibia proximal en utilisant une poignée de scalpel n ° 3 et une lame # 15, en commençant à l'extrémité distale du condyle femoral médian ( Figure 1A ).
    1. Tirez la peau contre l'os sous-jacent et maintenez la jambe fermement tout en faisant l'incision.
      REMARQUE: Cela empêchera l'incision cutanée à l'endroit désiré et aidera à créer une incision propre. Ne pas presser trop fermement avec le scalpel pour éviter de perforer la capsule du genou, ce qui entraînerait un saignement abondant et rendra les étapes restantes difficiles.
  2. Notez les marqueurs anatomiques importants, y compris: 1) la plaque de croissance, 2) l'angle de la plaque de croissance, 3) la capsule du genou, et 4) l'insertion de demi-endinosus ( figure 1A ).
  3. En utilisant le scalpel, faites une incision de ~ 0,5 cm à traversE fascia et tissus mous sur l'aspect antérieur médian du tibia proximal, de la plaque de croissance au bas de l'incision cutanée ( figure 1B ).
  4. Mélanger délicatement ou gratter le fascia et les tissus mous du tibia à l'aide du scalpel ( Figure 1B ).
    REMARQUE: Il est important d'enlever ou de racler autant de tissu mou du tibia que possible afin de ne pas gêner les étapes de forage.
  5. Percez une fenêtre corticale à travers l'os cortical tibial à la diaphyse avec une goupille Steinmann attachée à un outil rotatif à 10 000 tr / min (faible vitesse de l'outil rotatif spécifié dans la section des matériaux). Créez la fenêtre corticale de telle sorte qu'elle s'harmonise avec l'insertion distale de semitendinosus ( Figure 1C ).
    1. Tenir le foret perpendiculaire à la diaphyse tibiale et percez lentement, en faisant attention de ne pas forer l'autre côté de la diaphyse; La fenêtre corticale doit avoir seulement 2 mm de profondeur et sera faite lorsque nonLa résistance est ressentie.
    2. Comme ci-dessus, maintenez la jambe fermement d'autre part.
      REMARQUE: Une fraise dentaire peut être utilisée pour cette étape. Cependant, si une fraise dentaire est utilisée, la jambe doit être maintenue très fermement pour créer une fenêtre corticale propre et pour s'assurer que le bur prend et coupe l'os à l'endroit désiré. Une goupille Steinmann est recommandée pour cette étape, compte tenu de sa capacité de coupe bien supérieure.
  6. Dab la fenêtre corticale avec de la gaze, comme un saignement léger est attendu.

6. Création de la blessure à la plaque de croissance

  1. Créez une blessure au forage à travers la plaque de croissance centrale en utilisant une fraise dentaire de 1,8 mm attachée à un outil rotatif.
    REMARQUE: La profondeur, l'angle et la direction appropriés sont essentiels pour perturber la plaque de croissance centrale ( Figure 1C et D ). Des instructions pour obtenir la profondeur, l'angle et la direction appropriées sont données ci-dessous.
    1. Pour mesurer la profondeur appropriée en utilisant la fraise dentaire, begiN en alignant la fin de la fraude dentaire avec le tibia proximal, où le semitendinosus traverse la capsule du genou ( figure 1C ).
    2. Avec la fin de la fraise dentaire à la capsule du genou, suivez l'arbre de la fraise le long du semitendinosus et notez où la fraise s'aligne avec la fenêtre corticale. C'est la profondeur appropriée pour que la fraise perturbe complètement la plaque de croissance sans perturber la surface articulaire ( Figure 1C ).
      REMARQUE: La fraise dentaire est utilisée pour mesurer la profondeur appropriée. Le bur peut être marqué avec un marqueur permanent à l'endroit où il s'aligne avec la fenêtre corticale pour faire référence à la profondeur pendant le forage. Cependant, si les marqueurs anatomiques et le protocole ci-dessus sont étroitement référencés, le premier biseau sur les fraises dentaires spécifiées ici (FG6) s'alignera de manière appropriée avec la fenêtre corticale (voir la figure 1C ).
    3. Pour atteindre l'angle de forage approprié, maintenez l'outil rotatif à un angle inférieur à tHan 30 ° par rapport à la diaphyse tibiale.
      REMARQUE: il s'agit d'une approximation visuelle.
    4. Pour atteindre la direction de forage appropriée, vissez l'angle de la plaque de croissance ( Figure 1C ). Dessinez une ligne visuelle le long de la fraise dentaire à l'angle de la plaque de croissance pour aider à créer un défaut central.
    5. Activez l'outil rotatif à 10 000 tr / min (faible vitesse de l'outil rotatif spécifié dans la section des matériaux) avant d'entrer dans la fenêtre corticale.
    6. Avec l'outil rotatif à angle et direction appropriés, entrez la fenêtre corticale et appuyez sur l'outil rotatif jusqu'à ce que le marqueur de fraise soit aligné avec la fenêtre corticale. Une fois que la profondeur appropriée est atteinte, enlevez l'outil rotatif.
      REMARQUE: Effectuez la rupture de la plaque de croissance dans un mouvement rapide, en utilisant un temps minimal avec la fraise dans la plaque de croissance afin de créer une blessure propre. Ceci est important pour l'analyse des données.
  2. Dab la fenêtre corticale avec de la gaze pour ~ 30 s, comme un saignement est attendu.
  3. Assurez-vous la profondeur appropriée de la blessure en mesurant de nouveau la longueur du bur (étape 6.1.2).
    1. Insérez le bur dans la foret (avec l'outil rotatif désactivé) et alignez la fraise marquée avec la fenêtre corticale ( Figure 1D ).
  4. Si la profondeur est insuffisante, mettez l'outil rotatif et appuyez sur la profondeur souhaitée.
    REMARQUE: Bien qu'un second cycle de forage ne soit pas idéal, le dérangement total de la plaque de croissance est primordial pour le développement de la barre osseuse.
  5. Rincer le foret avec ~ 3 mL de solution saline stérile en utilisant une seringue de 10 mL et une aiguille de calibre 23.
  6. Sécher la plaie avec de la gaze.

7. Procédures postérieures aux blessures

  1. Si vous évaluez un traitement de plaque de croissance à base de biomatériau, injectez le biomatériau à travers le foret dans le site de blessure en utilisant une aiguille de taille appropriée (calibre 18 à 26 selon la viscosité du biomatériau).
    NOTE: Le volume de la blessure à la plaque de croissance est ~ 3 & #181; L, et le volume de la foret est de ~ 20 μL. Le volume maximal du matériau pouvant être injecté dans la blessure et la foret de la plaque de croissance est compris entre 20 et 25 μL.
  2. Fermez la plaie en suturant le fascia avec des sutures d'acide polyglycolique 3-0. Appliquer de la cire osseuse sur la fenêtre corticale pour isoler l'os sous-jacent (facultatif).
  3. Fermer l'incision cutanée avec des sutures enterrées ou des clips enroulés.
    REMARQUE: Les clips de plaie sont recommandés, car l'animal gratte sur le site de blessure et peut ouvrir la plaie.
  4. Retirez l'animal de l'anesthésie isoflurane, placez-le sur une couverture chauffante et surveillez-le jusqu'à ce qu'il soit éveillé.
  5. Pour réduire le risque d'infection, placez l'animal dans une nouvelle cage contenant un lit sec et autoclavé.
  6. Permettre à l'animal de supporter le poids après l'opération.
  7. Surveiller l'animal toutes les 12 h pendant 72 heures après une intervention chirurgicale pour vérifier les signes d'infection, pour s'assurer que les clips de la plaie restent en place et pour administrer la postopératoireEt les analgésiques conformément aux politiques approuvées par l'institution ( p. Ex. Buprénorphine à 0,05 mg / kg toutes les 12 h pendant 36 h et carprofène à 5 mg / kg toutes les 24 h pendant 72 h).
  8. Retirez les plaquettes de la plaie 10 à 14 jours après la chirurgie sous anesthésie.

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Representative Results

Une lésion réussie de la plaque de croissance utilisant cette méthode implique la rupture du centre de la plaque de croissance tibiale sans perturber la surface du cartilage articulaire. On a signalé que les tissus de réparation osseux commencèrent environ 7 jours après la blessure et deviennent pleinement développés par 28 jours après la blessure 13 , tel que visualisé par micro tomographie (microcc) ( figure 2 ). Bien que ces points de temps aient été choisis ici pour afficher le début et la maturation de la formation osseuse sur la base de données publiées précédemment, d'autres points de temps peuvent être utilisés pour étudier les différentes étapes du processus de réparation, du 1er au 6 mois après la chirurgie 17 . Le tableau 1 donne un aperçu de la formation du volume osseux dans les plaques de croissance des rats chirurgicales 28 jours après la chirurgie à partir de trois cycles indépendants en fournissant (1) la fraction volumique osseuse dans l'ensemble de la plaque de croissance et (2) la boNe volume fraction dans la zone de tissu de réparation que 15 . Les données sont indiquées comme pourcentage moyen ± l'écart-type et indiquent que des résultats similaires ont été obtenus entre les essais indépendants. La variance entre les différentes séries a été analysée par une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) et ne présente aucune différence statistiquement significative entre les séries, ce qui suggère la reproductibilité du modèle. L'hématoxyline bleue Alcian (ABH) avec Orange G / Eosin counterstain 18 a été utilisée pour montrer histologiquement une variété de tissus de réparation à différents stades de formation de barre osseuse ( Figure 2 ). En utilisant cette tache histologique, différents types de tissus de réparation, y compris les métrages mésenchymateux, cartilagineux, osseux et la moelle osseuse, peuvent être identifiés et quantifiés 16 .

Plusieurs problèmes peuvent résulter d'une mauvaise application des procédures ci-dessus. Une insuffisance La profondeur de forage nt ne perturbera pas la plaque de croissance, ce qui entraînera peu ou pas de formation de barre osseuse. La perturbation de la surface du cartilage articulaire crée une blessure plus importante qui peut introduire le cartilage articulaire dans le site de lésion de la plaque de croissance, ce qui complique le processus de guérison ( figure 3A ). Le fait de perturber la plaque de croissance à un angle ou une direction inappropriés entraîne une blessure non centrale ( figure 3B ). Dans ce cas, la formation de la barbe osseuse se produira encore, bien qu'elle soit latérale ou médiane à l'emplacement désiré. Dans l'ensemble, les tissus de réparation formés après une blessure à la plaque de croissance peuvent être analysés de diverses façons, y compris le microCT, la PCR quantitative, la coloration histologique et l'immunohistochimie. En plus des mesures histologiques et moléculaires, la longueur des membres et les mesures de la plaque de croissance fournissent une mesure importante de la croissance osseuse entière. Les membres affectés ont connu une réduction de la croissance par rapport aux membres de contrôle non lésés> 13. La longueur des membres peut être mesurée à différents moments au cours de l'étude en utilisant des images microCT pour enquêter sur les écarts de longueur des membres 14 . Des exemples de points de temps précédemment utilisés incluent 28 jours et 56 jours après la blessure. Les mesures de la plaque de croissance, y compris la hauteur totale, les hauteurs de la zone et la formation de l'attache, peuvent également fournir des informations importantes sur le processus de réparation des tissus 13 , 14 , 15 . Idéalement, on devrait prendre des longueurs de membres et des mesures de plaque de croissance avant l'intervention chirurgicale pour avoir une valeur de référence. Pour élucider davantage les mécanismes biologiques ou pour tester l'efficacité d'un traitement, des groupes témoins appropriés devraient être conçus et inclure des membres et des membres non affectés qui ont subi une intervention chirurgicale mais qui n'ont pas été traités.

Les biomatériaux peuvent également être testés dans ce modèle de blessure par plaque de croissance. À titre d'exemple, un chiLe microgel 19 a été injecté dans le site de lésion de la plaque de croissance, comme décrit à l'étape 7.1, et il est clairement vu sur le site de blessure à la figure 4 . Une analyse ultérieure peut impliquer la détermination des effets du biomatériau sur la composition du tissu de réparation, la longueur des membres et les mesures de la plaque de croissance, comme discuté précédemment.

Figure 2
Figure 2. La rupture réussie de la plaque de croissance et la formation Bony Bar.
La formation de la barre osseuse est observée à 7 jours post-blessure avec microCT et confirmée par coloration Alzheimer à l'hématoxyline (HAH). La barre osseuse est complètement mûre au jour 28 après les blessures, comme on le voit avec la coloration au microCT et à l'ABH. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.


Figure 3. Résultats potentiels du forage incorrect.
A) Le
forage trop loin à travers le tibia peut perturber la surface articulaire, ce qui complique le processus de guérison et peut conduire à des résultats non concluants. B) Une angulation incorrecte de la perceuse peut entraîner une blessure à la plaque de croissance non centrale. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4. Traitement d'une lésion de la plaque de croissance avec un biomarqueau.
La coloration ABH montre le microgel de chitosane dans la plaque de croissance blessée.

Métrique Course 1 Course 2 Course 3 Valeur P
Fraction volumique osseuse dans toute la plaque de croissance 9,76 +/- 3,81% 10,52 +/- 4,06% 11,93 +/- 2,04% 0,5493
Fraction volumique osseuse dans la zone de tissu de réparation 41,5 +/- 8,33% 46,08 +/- 10,12% 46,77 +/- 8,14% 0,5128

Tableau 1. Données de fractionnement des volumes osseux.
Les données proviennent de micro-images CT à 28 jours après les blessures sur des rats non traités à partir de trois essais indépendants.

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Discussion

Un modèle animal de blessure par plaque de croissance ajoute beaucoup à notre compréhension des mécanismes biologiques de cette blessure, ce qui pourrait conduire à des interventions thérapeutiques plus efficaces pour les enfants souffrant de blessures à la plaque de croissance. Pour créer avec succès une barre osseuse et pour étudier sa formation in vivo en utilisant le modèle présenté dans ce travail, il est essentiel de perturber la plaque de croissance en perçant à une profondeur suffisante, sans perturber le cartilage articulaire. La variation de la mise en œuvre chirurgicale chez les animaux et, dans une moindre mesure, la variation des marqueurs anatomiques peut entraîner des résultats problématiques. Nous recommandons de pratiquer les procédures décrites ci-dessus sur les animaux cadavériques pour assurer une blessure réussie en plaque de croissance avant d'effectuer la procédure pour des études sur des animaux vivants. Alors que les animaux cadavériques manquent de souplesse tissulaire et ne saignent pas, la procédure de blessure à la plaque de croissance et les caractéristiques anatomiques de ces animaux seront similaires à celles des animaux vivants. FurtDe plus, la plaque de croissance tibiale cadavérique peut être disséquée facilement, car l'épiphyse se sépare de la métaphyse par l'application d'une force légère et l'emplacement du foret peut être observé. Cette analyse rapide permet de modifier la technique pour connaître la profondeur et l'angulation appropriées des cadavres, sans avoir besoin d'imagerie.

Il convient de noter que d'autres modèles animaux de blessure à la plaque de croissance existent. Un défaut transphyseal similaire a été effectué chez la souris et conduit à une formation de barre osseuse 20 . Malgré sa taille plus petite, elle peut également être utilisée pour étudier les mécanismes impliqués dans la formation de la barre osseuse. Coleman et al . Rapporté sur un autre modèle valide de rat de la plaie de la plaque de croissance, où un défaut transphysaire central a été créé dans le fémur distal par le forage à travers le cartilage articulaire 21 . Cette approche a également conduit à la formation d'une osseuse et des inégalités de longueur des membres, comme dans laModèle présenté ici. D'autres modèles animaux de blessure et de traitement de la plaque de croissance ont inclus les lapins 22 , les cochons 23 et les moutons 24 . Alors que les modèles plus gros de blessures animales peuvent représenter plus étroitement les blessures cliniques, le modèle de rat est utile pour la recherche sur les mécanismes biologiques des lésions physeales. Par exemple, le modèle de rat présenté ici a été largement utilisé pour étudier les mécanismes moléculaires de lésions physeaux et le processus de formation de barre osseuse 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . En outre, le modèle de rat peut être utilisé pour tester divers traitements physeaux avant de passer à des modèles animaux plus gros. Cependant, un défi de ce modèle de rat de blessure à la plaque de croissance est que le forage se fait à l'intérieur de l'os, maKing, il est impossible d'observer où le foret est situé dans la plaque de croissance. Ainsi, une rupture réussie de la plaque de croissance sur les animaux vivants ne peut être confirmée qu'en utilisant des techniques d'imagerie au moment de la chirurgie ou en évaluant la formation de la barbe osseuse entre 7 à 28 jours après la chirurgie. Avec la pratique, un degré élevé de réussite dans l'obtention de la formation de la barre osseuse peut être réalisé, mais des études antérieures peuvent entraîner un certain nombre d'animaux qui n'ont pas la formation d'une barre osseuse due soit à une plaque de croissance non lésée, soit à une perturbation insuffisante de la croissance assiette.

Une autre limitation de ce modèle est que les blessures par trous de forage ne représentent pas des blessures normales de la plaque de croissance chez les enfants, ce qui se produit généralement en raison de la fracture 25 . Les fractures dans la plaque de croissance peuvent être classées à l'aide du système de classification Salter-Harris 26 . Les fractures de la plaque de croissance de type III et de type IV contribuent le plus souvent aux blessures physeales qui mènentÀ la formation de barres osseuses. Le type de blessure par plaque de croissance présenté ici se rapporte plus étroitement à une blessure à la plaque de croissance de type VI, une classe rare de blessure dans laquelle la physis est enlevée par un traumatisme ou une blessure par ponction. Toutefois, étant donné que les mécanismes pathophysiologiques sous-jacents à la formation de la barre osseuse après une lésion de la plaque de croissance restent insaisissables, le modèle de rat reste important pour découvrir ce processus afin de développer de nouvelles options de traitement pour les enfants souffrant de tous les types de blessures à la plaque de croissance. La méthode décrite ici crée de manière fiable une barre osseuse et peut être utilisée pour étudier plusieurs aspects du processus de réparation des blessures de la plaque de croissance in vivo 17 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 . Il a également été montré que ce modèle de rat entraîne une croissance tibiale réduite après la plaque de croissance enJury 13 , ce qui en fait un modèle animal encore plus intéressant pour tester de nouvelles options de traitement qui mènent à une régénération de la plaque de croissance et à la restauration potentielle de l'allongement osseux.

En conclusion, cet article détaille les méthodes pour créer un modèle de blessure par plaque de croissance avec lequel étudier la formation de barres osseuses et les traitements potentiels pour les blessures à la plaque de croissance in vivo. Ce modèle de rat permet des études relativement peu coûteuses et rapides, étant donné qu'une barre osseuse est complètement mature 28 jours après une blessure à la plaque de croissance. En plus de développer notre compréhension des mécanismes moléculaires de la formation de barres osseuses in vivo , ce modèle peut être utilisé pour tester les biomatériaux qui inhibent la formation de barres osseuses et favorisent la régénération du cartilage de la plaque de croissance.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgements

Les auteurs reconnaissent le soutien financier de l'Institut national de l'arthrite et des maladies musculo-squelettiques et cutanées des Instituts nationaux de santé (NIH) sous le numéro R03AR068087, le Fonds d'enrichissement académique de l'École de médecine de l'Université du Colorado et le Centre Gates pour la médecine régénératrice . Ce travail a également été soutenu par NIH / NCATS Colorado CTSA Numéro de subvention UL1 TR001082. Le contenu est la responsabilité exclusive de l'auteur et ne représente pas nécessairement les points de vue NIH officiels.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scalpel handle McKesson MCK42332500
Needle holder Stoelting RS-7824
Adson tissue forceps Sklar 50-3048
Iris Scissors Sklar 47-1246
Rotary Tool Dremel 7700 Variable speed rotary tool 
Keyless Rotary Tool Chuck Dremel 4486
Dental Burs Dental Burs USA FG6 Round carbide bur, ≤2mm
Steinmann pins Simpex Medical T-078
Hair clippers Wahl  5537N
3-0 PGA surutes Oasis MV-J398-V
Sterile gauze 2 x 2" Covidien 441211
Povidone Iodine McKesson 922-00801
Sterile saline Vetone 510224
10 mL luer lock syringe Becton Dickinson 309604
23 gauge needle Becton Dickinson 305145
Isopropyl alcohol pads Dynarex 1113
Isoflurane IsoFlo 30125-2
Caliper Mitutoyo 500-196-30
Carprofen Rimadyl 27180
Buprenorphine Par Pharmaceuticals Inc NDC 42023-179
Fenestrated Surgical Drape McKesson 25-517
Surgical Gloves Uline S-20204
#15 Scalpel Blade Aven 44044
9 mm wound clips Fine Science Tools 12032-09
Reflex clip applier World Precision Instruments 500345
Absorbant underpads McKesson MON 43723110
Tec 3 Iso Vaporizer  VetEquip 911103 
Germinator 500 Braintree Scientific GER 5287-120V
Warm water recirculator Kent Scientific TP-700
Absorbent Underpads Medline Industries MSC281230

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References

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