Экстракция и очистка полифенолов от лиофилизированного порошка ягод для лечения сосудистых гладких мышечных клеток

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

В этой работе подробно описан пошаговый способ получения экстрактов, богатых полифенолом, из лиофилизированного порошка ягод. Кроме того, он дает подробное описание того, как использовать эти богатые полифенолом экстракты в культуре клеток в присутствии пептидного гормона ангиотензина II (Ang II) с использованием сосудистых гладких мышечных клеток (VSMCs).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Feresin, R. G., Pourafshar, S., Huang, J., Zhao, Y., Arjmandi, B. H., Salazar, G. Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (125), e55605, doi:10.3791/55605 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Эпидемиологические исследования показывают, что увеличение потребления флавоноидов коррелирует со снижением смертности от сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) в США (США) и Европе. Ягоды широко потребляются в США и имеют высокий полифенольный состав. Было показано, что полифенолы взаимодействуют со многими молекулярными мишенями и оказывают множество положительных биологических функций, включая антиоксидантные, противовоспалительные и кардиозащитные эффекты. Полифенолы, выделенные из ежевики (BL), малины (RB) и черной малины (BRB), снижают окислительный стресс и клеточное старение в ответ на ангиотензин II (Ang II). В этой работе приводится подробное описание протокола, используемого для получения полифенольных экстрактов из лиофилизированных ягод. Выделение полифенолов из лиофилизированного порошка ягод осуществляли с использованием 80% -ного водного этанола и метода экстракции ультразвуком. Неочищенный экстракт далее очищали и фракционировали с использованием хлороформа и этилацетата,соответственно. Эффекты как сырых, так и очищенных экстрактов были протестированы на сосудистых гладких мышечных клетках (VSMC) в культуре.

Introduction

Полифенолы представляют собой соединения, содержащие по крайней мере одно фенольное кольцо в своей структуре и обильно присутствуют в растительном царстве 1 . Люди потребляют растения в течение тысячелетий в медицинских целях, не зная о существовании таких соединений 2 . Многие фрукты и овощи имеют некоторые общие полифенольные соединения, хотя и с различными количествами, включая флавоноиды, стильбены и фенольные кислоты. 3 . Хотя полифенолы часто ассоциируются с красочными фруктами и овощами, это не совсем верно. Например, зеаксантин и ксантин присутствуют в овощах, которые не очень яркие, такие как лук и чеснок, которые принадлежат к семейству луков и связаны с многочисленными преимуществами для здоровья 4 . Помимо того, что они связаны с несколькими преимуществами для здоровья 5 , полифенолы также служат растениям, защищая их от насекомых,D ультрафиолетовое излучение 2 . Полифенолы обычно встречаются в рационе человека и считаются мощными антиоксидантами, поскольку они могут собирать реактивные виды кислорода (ROS) 6 , 7 , 8 . Они также имеют противовоспалительные 9 , антимикробные 10 , антигипертензивные 11 и антиканцерогенные 12 , 13 свойства.

Эпидемиологические исследования демонстрируют обратную связь между потреблением флавоноидов и сердечно-сосудистыми заболеваниями (ССЗ) 16 , 17 и смертностью 14 , 15 . Ягоды широко потребляются в США и содержат большое количество полифенолов, включая флавоноиды. Например, потребление сока ежевики (BL) (300 Мл / д) в течение восьми недель значительно уменьшалось систолическое артериальное давление у пациентов с дислипидемией 18 . Jeong et al. 19 сообщили, что у мужчин и женщин с гипертензией, потребляющих 2,5 г экстракта черной малины (BRB) в день, было более низкое 24-часовое и ночное кровяное давление по сравнению с теми, кто потреблял плацебо. Малина (RB) уменьшала артериальное давление, увеличивая экспрессию супероксиддисмутазы (SOD) у спонтанно гипертензивных крыс 20 . Недавно было показано, что BL, RB и BRB снижают уровни РОС и старения, вызванные ангиотензином II (Ang II) в сосудистых гладких мышечных клетках (VSMC) 21 . Кроме того, антоцианиновая фракция из экстракта BL уменьшала экспрессию индуцируемой синтазы оксида азота (iNOS) и ингибировала активность ядерного фактора kappa B (NF-κB) и внеклеточной сигнально-регулируемой киназы (ERK) в липополисахариде (LPS) -стимулированной Ячейки J774Ass = "xref"> 22. Экстракты BRB уменьшали экспрессию NF-κB и циклооксигеназы 2 (COX-2) in vitro 23 , улучшали профиль липидов и предотвращали образование атеросклероза у мышей, которым кормили диету с высоким содержанием жиров 24 . Антоцианины, которые считаются наиболее распространенными флавоноидами в ягодах, модулируют воспалительную реакцию в LPS-стимулированных макрофагах RAW 264.7 путем уменьшения производства альфа-фактора (NFRO-α) фактора роста опухоли 25 и уменьшают пролиферацию и миграцию VSMCs 26 .

Поскольку растет интерес к пониманию роли полифенолов в здоровье и болезни человека, важно оптимизировать метод извлечения. Для этой цели широко используется экстракция растворителем, так как она экономична и легко воспроизводима. В этом исследовании использовали экстракцию растворителем с этанолом наряду с экстрактом ультразвукаN, который был адаптирован из Ким и Ли 27 . Очистку и фракционирование сырых экстрактов (CE) с использованием хлороформа и этилацетата проводили для получения фракции очищенного экстракта (PE), которая была адаптирована из Queires et al. 28 . Кроме того, сравнивали эффективность неочищенных и очищенных полифенольных экстрактов из BL при восстановлении базального фосфорилирования ERK1 / 2 и были представлены типичные примеры ингибирующего действия очищенного экстракта полифенола BL на Ang-индуцированные передачи сигналов в VSMC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Получение реагентов

  1. Подготовьте 80% этанола (100 мл) путем смешивания 80 мл абсолютного этанола (молекулярная биология) и 20 мл стерильной воды с клеточной культурой.
  2. Для приготовления экстракта полифенола (10 мг / мл) весят 10 мг СЕ или ПЭ. Добавьте 1 мл простой модифицированной среды Dulbecco Eagle Medium (DMEM) под кожух клеточной культуры. Vortex решение. Аликвоту в 200 мкл порциями и хранить при -20 ° C.
  3. Подготовьте буфер для лизиса.
    1. Добавляют 5 мл основного раствора 1 М HEPES (pH 7,4, 50 мМ конечного), 1 мл 5 М раствора NaCl (50 мМ конечного), 1 мл 0,5 М исходного раствора EDTA (5 мМ конечного), 2 мл 0,5 M NaF (конечный раствор 10 мМ), 286 мкл 700 мМ исходного раствора Na 3 VO 4 (2 мМ конечного), 5 мл 200 мМ Na 4 P 2 O 7 исходного раствора (10 мМ конечного) и 5 ​​мл 20% исходного раствора Triton-X-100, приготовленного в воде (1% конечного продукта). Добавьте воду, чтобы достичь объема 100 мл. Хранить при температуре 4 ° C.
  4. Подготовьте буфер образца Laemmli (4 раза).
    1. Добавляют 31,25 мл 2 М Tris исходного раствора (pH 6,8), 100 мл глицерина, 50 мл 20% раствора додецилсульфата натрия (SDS), приготовленного в воде, и 50 мл β-меркаптоэтанола. Добавить воду до 250 мл. Хранить при температуре 4 ° C.
  5. Для приготовления буфера Tris-Buffered Saline (TBS) весят 3 г Трис (25 мМ финала), 0,18 г KCl (2,5 мМ конечного) и 8,76 г NaCl (150 мМ финала). Отрегулируйте рН до 7,4 и добавьте воду до 1 л. Хранить при комнатной температуре.
  6. Для получения TBS-T добавляют 997,5 мл TBS и 2,5 мл 20% раствора Triton-X-100, приготовленного в воде. Хранить при комнатной температуре.

2. Подготовка экстрактов Blackerry

  1. Получение неочищенного экстракта из лиофилизированного порошка ягод.
    1. Взвесьте 10 г лиофилизированного порошка ежевики (или 5 г свежего порошка). Если используются замороженные фрукты, разрежьте их iNto очень мелкие кусочки перед началом экстракции.
    2. Смешайте фруктовый порошок с 100 мл 80% -ного водного этанола в 1 л круглодонную колбу Эрленмейера.
    3. Сонатируйте смесь в течение 20 минут при 42 кГц, 135 Вт, используя ультразвуковую ванну при 25 ° C, без какого-либо промежутка времени между ними. Выполняйте обработку ультразвуком с непрерывной продувкой азота в приглушенном свете. Для замороженных фруктов увеличьте время инкубации до 4 часов.
    4. Фильтруйте смесь через фильтровальную бумагу №2 с помощью охлажденной воронки Бюхнера с вакуумным отсосом.
      ПРИМЕЧАНИЕ. В конце этого этапа на фильтровальной бумаге появляются остатки образца; Это называется фильтровальной лепешкой.
    5. Промойте фильтровальную лепешку 50 мл 100% этанола. Сохраните фильтрат и добавьте осадок на фильтре в круглодонную колбу емкостью 1 л, содержащую 100 мл 80% -ного водного этанола.
    6. Повторите процесс экстракции остатка (шаги 2.1.2 - 2.1.4).
    7. Объедините два фильтрата в круглодонную колбу с дополнительными 50 мл80% -ного водного этанола.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Конечный объем должен составлять приблизительно 300 мл.
    8. Для испарения растворителя используйте роторный испаритель при 62 ° C и 50 об / мин. Продолжайте этот процесс до тех пор, пока этанол не испарится.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Этот процесс занимает приблизительно 45 минут.
    9. Перенесите образец в коническую трубку объемом 50 мл. Выпаривают этанол, впрыскивая газообразный азот в верхней части трубки в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Этот шаг необходим для обеспечения полного испарения этанола. Объем образца на этой стадии составляет приблизительно 20 мл.
    10. Заморозьте образец при -80 ° C в течение не менее 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Этот шаг необходим, чтобы обеспечить более эффективный процесс сублимационной сушки.
    11. Замораживают образец при -50 ° C в течение приблизительно 8 часов. Храните образцы при температуре -20 ° C.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Сушилка для замораживания создает мощный вакуум при температуре -50 ° C внутри камеры для сушки образцов, но сохраняет большую часть соединений, таких как полифNoLS.
  2. Получение очищенных полифенольных экстрактов из сырых экстрактов.
    1. Взвесьте лиофилизированные экстрагированные образцы.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Объем экстракта на этом этапе составляет приблизительно 10 мл.
    2. Добавить два объема (~ 20 мл) хлороформа в неочищенный экстракт и встряхнуть раствор в течение 5 минут в мешалке.
    3. Вылейте смесь в разделительную воронку. Пусть сырой экстракт декантируют в течение 1 часа при комнатной температуре с получением очищенной фракции.
      ПРИМЕЧАНИЕ. На этом этапе образуется двухфазная смесь.
    4. Удалите нижний слой (фазу хлороформа) из разделительной воронки и соберите водный слой в чистый стакан.
    5. Добавьте два объема этилацетата к водной фракции и используйте магнитную мешалку для перемешивания смеси в течение 5 мин при комнатной температуре.
    6. Отфильтруйте смесь через фильтровальную бумагу №2 с помощью охлажденной воронки Бюхнера с вакуумным отсосом.
    7. Соберите отфильтрованный образец и перенесите его в круглодонную колбу для насС роторным испарителем.
    8. Установите роторный испаритель на 62 ° C и 50 об / мин и испарите этилацетат в течение примерно 30 минут.
    9. Замораживают образец при -50 ° C в течение приблизительно 8 часов. Перенесите образец в коническую трубку объемом 50 мл и храните его при -20 ° C.

3. Лечение VSMC с экстрактами ягод

  1. Культура VSMC.
    1. Выделите VSMC из грудных аортов крыс Sprague-Dawley, выполнив ферментативное расщепление, как описано ранее 29 . Культура VSMC, как описано 29 .
    2. Подготовьте полную среду для культивирования VSMC с использованием DMEM, содержащей глюкозу 1 г / л, и добавьте 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ед. / Мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина. Хранить всю среду при температуре 4 ° C.
  2. Инкубация VSMC с экстрактами полифенолов.
    1. Чтобы разбить VSMC, отбросьте культуруИ промыть клетки дважды фосфатным буферным раствором (PBS). Добавить 4 мл PBS и 2 мл трипсина EDTA 0,25%. Инкубируйте клетки в течение 5 мин при 37 ° С в инкубаторе CO 2 .
      1. Соберите клетки, смешайте их с 2 мл полной среды в 15 мл центрифужной пробирке и центрифугируйте при 1100 × g в течение 5 минут. Удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок с 1 мл PBS. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
      2. Семя 50 000 VSMC на лунку в 6-луночных планшетах для культивирования и выращивать их в полной среде, содержащей 10% FBS, до тех пор, пока они не достигнут 90% слияния (около 3 г). Поддерживайте VSMC при температуре 37 ° C в увлажненном 5% -ном инкубаторе CO 2 .
    2. Подготовьте среду для лечения с использованием среды DMEM, содержащей 1 г / л глюкозы, 100 ед. / Мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина и 0,5% FBS. Храните обрабатывающую среду при температуре 4 ° C.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Полифенольные экстракты и Ang II добавляют непосредственно в клетки, используя это meРадиевом.
    3. Подготовьте исходный раствор 10 мг / мл сырого экстракта (CE) или очищенного экстракта (PE) из полифенолов путем растворения 10 мг экстракта в 1 мл простой среды DMEM. Храните запас в 200 мкл аликвоты при -20 ° C.
    4. Инкубируйте VSMC с 2 мл обрабатывающей среды, содержащей 0,5% FBS, и добавьте экстракт CE или PE для достижения концентрации 50-500 мкг / мл. Изменяйте среду каждые 24 часа, добавляя свежие экстракты полифенолов. Обработайте клетки в течение 3 дней.
    5. Для лечения Ang II или других гормонов и факторов роста голодайте клетки в течение по меньшей мере 24 часов путем инкубации клеток с лечебной средой, содержащей 0,5% FBS, перед добавлением Ang II (100 нМ).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Инкубация с CE и без CE в 0,5% среде для обработки FBS перед добавлением Ang II рекомендуется.
      1. Через 24 часа голодания добавьте 100 нМ Ang II. Замените среду для обработки свежим CE, PE или Ang II каждые 24 часа на 3 дня.
  3. Подготовка образцов клеток.
    1. Промыть обработанные клетки дважды в холодном PBS и лизировать их 200 мкл буфера для лизиса на льду.
    2. Собирайте клеточные лизаты с помощью скребков клеток и переносите лизаты в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки. Инкубируйте полные клеточные лизаты в течение 20 мин на льду и вихрете каждые 5 мин.
    3. Сонатируйте экстракты клеток тремя вспышками при 125 Вт в течение 10 с каждый с паузой в 2 с между ними. Храните образцы на льду во время обработки ультразвуком.
    4. Измерьте концентрацию белка, используя реагент для анализа белка при 595 нм.
    5. Храните образцы при -20 ° C для анализа с помощью Вестерн-блоттинга.
  4. Вестерн-блот.
    1. Смешайте равные количества белка (около 50 мкг) из контрольных необработанных и обработанных полифенолом или обработанных Ang II образцов буфером для лизиса, чтобы получить максимальный общий объем 50 мкл. Добавьте 16 мкл 4x буфера для образцов Laemmli. Нагреть образцы в течение 5 мин при 75 ° С.
    2. Отделите образецВ 10% гелях SDS-PAGE и переносить их на мембраны PDVF при 10 В в течение 75 мин в полусухой системе переноса для Вестерн-блот-анализа с конкретными антителами.
    3. Заблокируйте мембрану 2% молоком в TBS 0,05% буфера Triton-X100 (TBS-T) в течение 20 мин.
    4. Удалите молоко, промывая мембрану по меньшей мере три раза TBS (по 5 минут каждый) и инкубируйте с первичными антителами в течение 1 часа при RT или O / N при 4 ° C.
    5. Промывайте мембрану три раза, по 10 минут каждый, с TBS-T и инкубируйте с HRP-связанным вторичным антителом в течение 45 мин.
    6. Промывайте мембрану три раза, по 10 минут каждый, с TBS-T и развивайте с помощью улучшенной хемилюминесценции (ECL).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ранее было продемонстрировано, что экстракты полифенолов, выделенные из BL, RB и BRB, уменьшают старение VSMC в ответ на Ang II 21 . Было показано, что эти очищенные полифенольные экстракты модулируют передачу сигналов Ang II путем снижения фосфорилирования Akt, p38 митоген-активированной белковой киназы (MAPK) и ERK1 / 2. BL предотвращает старение, уменьшая экспрессию NADPH-оксидазы (Nox) 1, фермента, который продуцирует супероксидные анионы и сильно активируется Ang II. Напротив, RB и BRB предотвращают старение с помощью Nox1-независимого механизма, поскольку они увеличивают экспрессию антиоксидантных ферментов SOD1, SOD2 и глутатионпероксидазы 1 (GPx-1). BL не увеличивает экспрессию SOD2, в то время как ни один из экстрактов не ослабляет подавление каталазы Ang II 21 . BL был сфокусирован, чтобы определить, может ли отсутствие эффекта BL на SOD2 и экспрессию каталазыОбъясняются потерей полифенольных соединений в процессе очистки или недостаточной концентрацией определенного полифенольного соединения в экстракте. VSMC инкубировали с 50-500 мкг / мл СЕ ( фиг. 1А ) или РЕ ( фиг. 1В ) в среде, содержащей 0,5% FBS в течение трех дней. Ни CE, ни PE не повышали уровни SOD2 или каталазы ни в одной из тестируемых концентраций. В качестве положительного контроля было измерено фосфорилирование ERK1 / 2, и было установлено, что CE снижает фосфорилирование этой киназы при концентрациях выше 300 мкг / мл. Напротив, ПЭ был эффективен при примерно 100 мкг / мл ( фиг. 1В ). Низкие уровни фосфорилирования наблюдались при концентрациях 200-500 мкг / мл. Эти данные подтверждают предыдущее наблюдение, показывающее, что 200 мкг / мл BL PE является достаточным для снижения сигнализации 21 Ang II. Эти результаты показывают, что более высокие концентрации полифенола cOmpounds в PE, по сравнению с CE, может объяснить более высокую эффективность этого экстракта при уменьшении фосфорилирования ERK1 / 2. Чтобы проверить эту идею, сравнивали полифенольные композиции обоих экстрактов. Идентификацию и количественную оценку полифенольных соединений в СЕ проводили с помощью ВЭЖХ, как описано выше 21 ( таблица 1 ). 3- O- каффеоилхиноновая кислота и кверцетин присутствовали на более высоких уровнях в ПЭ по сравнению с СЕ, в то время как феруловая кислота и рутин были обнаружены только в СЕ. Затем VSMC обрабатывали 200 мкг / мл BL PE в течение 24 часов перед добавлением 100 нМ Ang II ( фиг.1C ). Как сообщалось ранее 21 , экстракт полифенола BL уменьшал индуцированное Ang II ERK1 / 2 фосфорилирование, но не оказывал никакого влияния на экспрессию каталазы и SOD2.

Рисунок 1
B ) или 200 мкг / мл PE ( C ) в 0,5 % Среды FBS DMEM в течение 3 дней. C ) Через 24 часа инкубации с BL PE добавляли Ang II (100 нМ) и клетки инкубировали в течение 3 дней. Среда, со свежими экстрактами и Ang II, менялась каждый день. Затем клетки промывали и лизировали, а общие клеточные экстракты отделяли в 10% -ных гелях PAGE-SDS. Вестерн-блоттинги тестировали с помощью кроличьих антител против фосфорилированного ERK1 / 2 (Thr 202 / Tyr 204), ERK1 / 2, каталазы и SOD2 и мышиного антитела против β-актина. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Анализы (ppm) PE CE
Фенольные кислоты
Галлия кислота 243,5 321,9
П-кумариновая кислота 32,9 46,5
Феруловая кислота - 236,5
Хлорогенные кислоты
3-O-каффеоилхинова кислота 235,3 170,5
4-O-каффеоилхинова кислота 13 76,9
5-O-каффеоилхинова кислота 14,1 49,9
ФЛАВОНОИДЫ
Флавонолы
кверцетин 95 +24,5
флаванонами
Рутин - 37,8

Таблица 1: Анализ полифенольного состава ежевики в сырых и полифенол-очищенных экстрактах. Фенольные кислоты и флавоноиды в сыром экстракте (CE) и очищенном экстракте (PE) анализировали с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Концентрация аналитов выражается в виде ppm. Недавно была опубликована композиция полифенолов в BL PE и добавлена ​​в таблицу для сравнения с CE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Полифенолы, выделенные из ягод, содержат различные композиции. Протокол извлечения этанола, описанный здесь, позволил идентифицировать различные уровни фенольных кислот и флавоноидов, присутствующих в неочищенных и очищенных полифенольных экстрактах BL ( таблица 1 ). CE был обогащен галловой кислотой, феруловой кислотой, 4-O-каффеоилхиноновой кислотой и 5-O-каффеоилхиноновой кислотой. Процесс очистки существенно не изменял уровни галловой кислоты и р-кумариновой кислоты. Тем не менее, он увеличил уровни 3- O- каффеоилхиновой кислоты с 170,5 до 235,3 м.д. и кверцетина с 24,5 до 95 частей на миллион. Напротив, феруловая кислота и рутин были потеряны во время очистки СЕ.

Обработка VSMC с 50-500 мкг / мл CE и PE показала, что оба экстракта эффективны в снижении базального фосфорилирования ERK1 / 2. Однако ПЭ показал более сильную подавление активности этой киназы при более низкой концентрации: 100 &181 г / мл для ПЭ по сравнению с 400-500 мкг / мл для СЕ. Эти результаты могут отражать более высокую концентрацию 3- O- каффеоилхиновой кислоты или кверцетина, обнаруженного в ПЭ. Использование отдельных фенольных соединений в клетках в культуре необходимо для идентификации конкретного соединения (-ов), ответственного за понижение уровня фосфорилирования ERK1 / 2.

Сниженная активность сигнальных киназ, включая Akt, ERK1 / 2 и p38MAPK, вызванные очищенными полифенолами, выделенными из BL, RB и BRB 21 , а также ERK1 / 2, вызванные BL CE, показанные здесь, согласуется с Предыдущие отчеты. Например, экстракты полифенолов, выделенные из черники, уменьшали рост опухолей клеток рака молочной железы, частично за счет снижения активности Akt и ERK1 / 2 30 . Как упоминалось ранее, эти киназы также участвуют в индукции клеточного старения Ang II 21 , предполагая, что полифенолы из BL, RB и BRB shoulD уменьшают сосудистое старение и дисфункцию, связанную с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Как сообщалось ранее 21 , экспрессия каталазы и SOD2 не регулировалась ПЭ даже при концентрациях до 500 мкг / мл. Поскольку CE также неэффективен при увеличении экспрессии каталазы и SOD2, эти данные свидетельствуют о том, что фенольные соединения, потерянные во время протокола очистки, не участвуют в регуляции этих антиоксидантных ферментов. Эти данные также показывают, что протокол очистки, показанный здесь, эффективно концентрирует фенольные соединения, имеющие отношение к регулированию передачи сигналов Ang II, окислительного стресса и клеточного старения. Например, представительские результаты показывают, что PE сильно ингибирует Ang II-индуцированное фосфорилирование ERK1 / 2. Оценка фосфорилирования этой киназы является актуальной, поскольку ингибирование активности ERK1 / 2 предотвращает индуцированное Ang II клеточное старение 21 .

В тErms модификаций предыдущих протоколов, была добавлена ​​обработка ультразвуком для увеличения выхода извлечения для CE. Кроме того, для очистки полифенолов вместо использования картриджа C18, как описано Ким и Ли 27 , более традиционный метод от Queires et al . 28 был принят здесь. Для очистки участка полифенола добавляли стадию фильтрации с использованием фильтровальной бумаги для удаления примесей. С точки зрения ограничений, процедуры обработки ультразвуком и испарения должны тщательно контролироваться в соответствии с типом используемого инструмента, поскольку продолжительность и температура обработки ультразвуком и испарения являются критическими шагами в этом протоколе. Модификации, добавленные к этому методу, привели к наивысшему выходу полифенолов по сравнению с предыдущими методами 27 , 28, используемыми в нашей лаборатории (данные не показаны), скорее всего, из-за добавления стадии обработки ультразвуком. Как mentiЭтот протокол может использоваться для высушенного вымораживанием порошка из различных ягод, а также для замороженных фруктов. Этот метод был успешно использован для извлечения и очистки полифенолов из малины и черной малины 21 , а также из черники и клубники (данные не показаны). Таким образом, этот метод можно было бы также использовать для извлечения полифенолов из других видов пищевых продуктов, включая овощи.

В заключение, эта работа подробно описывает быстрый, экономически эффективный и легко воспроизводимый метод выделения полифенолов из ягод, что позволяет удерживать и концентрировать соединения, которые защищают от окислительного стресса в VSMC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась Американской кардиологической ассоциацией (14GRNT20180028) и Советом Университета штата Флорида по исследованиям и творчеству (COFRS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiotensin II Sigma-Aldrich, Inc. A9525-10MG Treatment of VSMCs
β-actin Sigma-Aldrich, Inc. A2228 Primary antibody (1:5000)
Blackberry fruit Mercer Foods Freeze-dried blackberry powder
Catalase  Calbiochem 219010 Primary antibody (1:1000)
Chloroform Biotech Grd, Inc. 97064-678 Preparation of purified polyphenol extracts
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM ) Mediatech, Inc. 10-014-CV Culture of VSMCs
Ethanol (absolute molecular biology grade) Sigma-Aldrich, Inc. E7023-500ML Preparation of polyphenol extracts 
Ethylacetate Sigma-Aldrich, Inc. 439169 Preparation of purified polyphenol extracts
ERK1/2 Cell Signaling Technology, Inc. 9102S Primary antibody (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8.0 Teknova, Inc. E0306 Lysis buffer
Freeze-Dryer Labconco VirTis Benchtop K Preparation of polyphenol extracts
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1400-500 Cell culture
HEPES Sigma-Aldrich, Inc. H3375 Lysis buffer 
NaCl EMD Millipore, Inc. 7760 Lysis buffer
NaF J.T.Baker, Inc. 3688-01  Lysis buffer
Na3VO4 Sigma-Aldrich, Inc. 450243 Lysis buffer
Na4P2O7 , decahydrate Sigma-Aldrich, Inc. S-9515 Lysis buffer
phospho ERK1/2  Cell Signaling Technology, Inc. 9101S Primary antibody (1:1000)
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich, Inc. P8340-5ml Lysis buffer
Protein assay dye reagent Bio-Rad Laboratories, Inc. 500-0006 Protein concentration Measurement
PVDF transfer membrane Thermo Scientific, Inc. 88518 Western blots
Rotatory Evaporator Buchi Labortechnik Rotavapor
R3000
Preparation of polyphenol extracts
Sterile water Mediatech, Inc. 25-055-CV Preparation of polyphenol extracts
Sonicator QSonica, LLC Q125 Preparation of cell extracts
SOD2 Enzo Life Sciences, Inc. ADI-SOD-110-F Primary antibody (1:1000)
Triton-X-100 Sigma-Aldrich, Inc. X100 Western blots
Whatman #2 filter paper GE Healthcare, Inc. 28317-241 Preparation of polyphenol extracts

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morton, L. W., Abu-Amsha Caccetta, R., Puddey, I. B., Croft, K. D. Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds: relevance to cardiovascular disease. Clin Exp Pharmacol Physiol. 27, (3), 152-159 (2000).
  2. Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90, (3), 859-904 (2010).
  3. Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Remesy, C., Jimenez, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. Am J Clin Nutr. 79, (5), 727-747 (2004).
  4. Griffiths, G., Trueman, L., Crowther, T., Thomas, B., Smith, B. Onions--a global benefit to health. Phytother Res. 16, (7), 603-615 (2002).
  5. Mazzoni, L., et al. The genetic aspects of berries: from field to health. J Sci Food Agric. 96, (2), 365-371 (2016).
  6. Wang, S. Y., Jiao, H. Scavenging capacity of berry crops on superoxide radicals, hydrogen peroxide, hydroxyl radicals, and singlet oxygen. J Agric Food Chem. 48, (11), 5677-5684 (2000).
  7. Choi, M. H., Shim, S. M., Kim, G. H. Protective effect of black raspberry seed containing anthocyanins against oxidative damage to DNA, protein, and lipid. J Food Sci Technol. 53, (2), 1214-1221 (2016).
  8. Forbes-Hernandez, T. Y., et al. The Healthy Effects of Strawberry Polyphenols: Which Strategy behind Antioxidant Capacity? Crit Rev Food Sci Nutr. 56, Suppl 1. S46-S59 (2016).
  9. Figueira, M. E., et al. Protective effects of a blueberry extract in acute inflammation and collagen-induced arthritis in the rat. Biomed Pharmacother. 83, 1191-1202 (2016).
  10. Daglia, M. Polyphenols as antimicrobial agents. Curr Opin Biotechnol. 23, (2), 174-181 (2012).
  11. Hügel, H. M., Jackson, N., May, B., Zhang, A. L., Xue, C. C. Polyphenol protection and treatment of hypertension. Phytomedicine. 23, (2), 220-231 (2016).
  12. Niedzwiecki, A., Roomi, M. W., Kalinovsky, T., Rath, M. Anticancer Efficacy of Polyphenols and Their Combinations. Nutrients. 8, (9), E552 (2016).
  13. Kresty, L. A., Mallery, S. R., Stoner, G. D. Black raspberries in cancer clinical trials: Past, present and future. J Berry Res. 6, (2), 251-261 (2016).
  14. Hertog, M. G., et al. Flavonoid intake and long-term risk of coronary heart disease and cancer in the seven countries study. Arch Intern Med. 155, (4), 381-386 (1995).
  15. Peterson, J. J., Dwyer, J. T., Jacques, P. F., McCullough, M. L. Associations between flavonoids and cardiovascular disease incidence or mortality in European and US populations. Nutr Rev. 70, (9), 491-508 (2012).
  16. Cassidy, A., et al. High anthocyanin intake is associated with a reduced risk of myocardial infarction in young and middle-aged women. Circulation. 127, (2), 188-196 (2013).
  17. Jacques, P. F., Cassidy, A., Rogers, G., Peterson, J. J., Dwyer, J. T. Dietary flavonoid intakes and CVD incidence in the Framingham Offspring Cohort. Br J Nutr. 114, (9), 1496-1503 (2015).
  18. Aghababaee, S. K., et al. Effects of blackberry (Morus nigra L.) consumption on serum concentration of lipoproteins, apo A-I, apo B, and high-sensitivity-C-reactive protein and blood pressure in dyslipidemic patients. J Res Med Sci. 20, (7), 684-691 (2015).
  19. Jeong, H. S., et al. Effects of Rubus occidentalis extract on blood pressure in patients with prehypertension: Randomized, double-blinded, placebo-controlled clinical trial. Nutrition. 32, (4), 461-467 (2016).
  20. Jia, H., et al. The antihypertensive effect of ethyl acetate extract from red raspberry fruit in hypertensive rats. Pharmacogn Mag. 7, (25), 19-24 (2011).
  21. Feresin, R. G., et al. Blackberry, raspberry and black raspberry polyphenol extracts attenuate angiotensin II-induced senescence in vascular smooth muscle cells. Food Funct. 7, (10), 4175-4187 (2016).
  22. Pergola, C., Rossi, A., Dugo, P., Cuzzocrea, S., Sautebin, L. Inhibition of nitric oxide biosynthesis by anthocyanin fraction of blackberry extract. Nitric Oxide. 15, (1), 30-39 (2006).
  23. Lu, H., Li, J., Zhang, D., Stoner, G. D., Huang, C. Molecular mechanisms involved in chemoprevention of black raspberry extracts: from transcription factors to their target genes. Nutr Cancer. 54, (1), 69-78 (2006).
  24. Kim, S., et al. Aqueous extract of unripe Rubus coreanus fruit attenuates atherosclerosis by improving blood lipid profile and inhibiting NF-κB activation via phase II gene expression. J Ethnopharmacol. 146, (2), 515-524 (2013).
  25. Wang, J., Mazza, G. Effects of anthocyanins and other phenolic compounds on the production of tumor necrosis factor alpha in LPS/IFN-gamma-activated RAW 264.7 macrophages. J Agric Food Chem. 50, (15), 4183-4189 (2002).
  26. Pascual-Teresa, S., Moreno, D. A., Garcia-Viguera, C. Flavanols and anthocyanins in cardiovascular health: a review of current evidence. Int J Mol Sci. 11, (4), 1679-1703 (2010).
  27. Kim, D. O., Lee, C. Y. Extraction and Isolation of Polyphenolics. Curr Protoc Food Analyt Chem. 1, John Wiley & Sons. New York. 2.1-2.12 (2002).
  28. Queires, L. C., et al. Polyphenols purified from the Brazilian aroeira plant (Schinus terebinthifolius, Raddi) induce apoptotic and autophagic cell death of DU145 cells. Anticancer Res. 26, (1A), 379-387 (2006).
  29. Griendling, K. K., Taubman, M. B., Akers, M., Mendlowitz, M., Alexander, R. W. Characterization of phosphatidylinositol-specific phospholipase C from cultured vascular smooth muscle cells. J Biol Chem. 266, (23), 15498-15504 (1991).
  30. Vuong, T., et al. Role of a polyphenol-enriched preparation on chemoprevention of mammary carcinoma through cancer stem cells and inflammatory pathways modulation. J Transl Med. 14, (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics