В этой работе подробно описан пошаговый способ получения экстрактов, богатых полифенолом, из лиофилизированного порошка ягод. Кроме того, он дает подробное описание того, как использовать эти богатые полифенолом экстракты в культуре клеток в присутствии пептидного гормона ангиотензина II (Ang II) с использованием сосудистых гладких мышечных клеток (VSMCs).
Эпидемиологические исследования показывают, что увеличение потребления флавоноидов коррелирует со снижением смертности от сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) в США (США) и Европе. Ягоды широко потребляются в США и имеют высокий полифенольный состав. Было показано, что полифенолы взаимодействуют со многими молекулярными мишенями и оказывают множество положительных биологических функций, включая антиоксидантные, противовоспалительные и кардиозащитные эффекты. Полифенолы, выделенные из ежевики (BL), малины (RB) и черной малины (BRB), снижают окислительный стресс и клеточное старение в ответ на ангиотензин II (Ang II). В этой работе приводится подробное описание протокола, используемого для получения полифенольных экстрактов из лиофилизированных ягод. Выделение полифенолов из лиофилизированного порошка ягод осуществляли с использованием 80% -ного водного этанола и метода экстракции ультразвуком. Неочищенный экстракт далее очищали и фракционировали с использованием хлороформа и этилацетата,соответственно. Эффекты как сырых, так и очищенных экстрактов были протестированы на сосудистых гладких мышечных клетках (VSMC) в культуре.
Полифенолы представляют собой соединения, содержащие по крайней мере одно фенольное кольцо в своей структуре и обильно присутствуют в растительном царстве 1 . Люди потребляют растения в течение тысячелетий в медицинских целях, не зная о существовании таких соединений 2 . Многие фрукты и овощи имеют некоторые общие полифенольные соединения, хотя и с различными количествами, включая флавоноиды, стильбены и фенольные кислоты. 3 . Хотя полифенолы часто ассоциируются с красочными фруктами и овощами, это не совсем верно. Например, зеаксантин и ксантин присутствуют в овощах, которые не очень яркие, такие как лук и чеснок, которые принадлежат к семейству луков и связаны с многочисленными преимуществами для здоровья 4 . Помимо того, что они связаны с несколькими преимуществами для здоровья 5 , полифенолы также служат растениям, защищая их от насекомых,D ультрафиолетовое излучение 2 . Полифенолы обычно встречаются в рационе человека и считаются мощными антиоксидантами, поскольку они могут собирать реактивные виды кислорода (ROS) 6 , 7 , 8 . Они также имеют противовоспалительные 9 , антимикробные 10 , антигипертензивные 11 и антиканцерогенные 12 , 13 свойства.
Эпидемиологические исследования демонстрируют обратную связь между потреблением флавоноидов и сердечно-сосудистыми заболеваниями (ССЗ) 16 , 17 и смертностью 14 , 15 . Ягоды широко потребляются в США и содержат большое количество полифенолов, включая флавоноиды. Например, потребление сока ежевики (BL) (300 Мл / д) в течение восьми недель значительно уменьшалось систолическое артериальное давление у пациентов с дислипидемией 18 . Jeong et al. 19 сообщили, что у мужчин и женщин с гипертензией, потребляющих 2,5 г экстракта черной малины (BRB) в день, было более низкое 24-часовое и ночное кровяное давление по сравнению с теми, кто потреблял плацебо. Малина (RB) уменьшала артериальное давление, увеличивая экспрессию супероксиддисмутазы (SOD) у спонтанно гипертензивных крыс 20 . Недавно было показано, что BL, RB и BRB снижают уровни РОС и старения, вызванные ангиотензином II (Ang II) в сосудистых гладких мышечных клетках (VSMC) 21 . Кроме того, антоцианиновая фракция из экстракта BL уменьшала экспрессию индуцируемой синтазы оксида азота (iNOS) и ингибировала активность ядерного фактора kappa B (NF-κB) и внеклеточной сигнально-регулируемой киназы (ERK) в липополисахариде (LPS) -стимулированной Ячейки J774Ass = "xref"> 22. Экстракты BRB уменьшали экспрессию NF-κB и циклооксигеназы 2 (COX-2) in vitro 23 , улучшали профиль липидов и предотвращали образование атеросклероза у мышей, которым кормили диету с высоким содержанием жиров 24 . Антоцианины, которые считаются наиболее распространенными флавоноидами в ягодах, модулируют воспалительную реакцию в LPS-стимулированных макрофагах RAW 264.7 путем уменьшения производства альфа-фактора (NFRO-α) фактора роста опухоли 25 и уменьшают пролиферацию и миграцию VSMCs 26 .
Поскольку растет интерес к пониманию роли полифенолов в здоровье и болезни человека, важно оптимизировать метод извлечения. Для этой цели широко используется экстракция растворителем, так как она экономична и легко воспроизводима. В этом исследовании использовали экстракцию растворителем с этанолом наряду с экстрактом ультразвукаN, который был адаптирован из Ким и Ли 27 . Очистку и фракционирование сырых экстрактов (CE) с использованием хлороформа и этилацетата проводили для получения фракции очищенного экстракта (PE), которая была адаптирована из Queires et al. 28 . Кроме того, сравнивали эффективность неочищенных и очищенных полифенольных экстрактов из BL при восстановлении базального фосфорилирования ERK1 / 2 и были представлены типичные примеры ингибирующего действия очищенного экстракта полифенола BL на Ang-индуцированные передачи сигналов в VSMC.
Полифенолы, выделенные из ягод, содержат различные композиции. Протокол извлечения этанола, описанный здесь, позволил идентифицировать различные уровни фенольных кислот и флавоноидов, присутствующих в неочищенных и очищенных полифенольных экстрактах BL ( таблица 1 ). CE был обо…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась Американской кардиологической ассоциацией (14GRNT20180028) и Советом Университета штата Флорида по исследованиям и творчеству (COFRS).
Angiotensin II | Sigma-Aldrich, Inc. | A9525-10MG | Treatment of VSMCs |
β-actin | Sigma-Aldrich, Inc. | A2228 | Primary antibody (1:5000) |
Blackberry fruit | Mercer Foods | Freeze-dried blackberry powder | |
Catalase | Calbiochem | 219010 | Primary antibody (1:1000) |
Chloroform | Biotech Grd, Inc. | 97064-678 | Preparation of purified polyphenol extracts |
DMEM | Mediatech, Inc. | 10-014-CV | Culture of VSMCs |
Ethanol (absolute molecular biology grade) | Sigma-Aldrich, Inc. | E7023-500ML | Preparation of polyphenol extracts |
Ethylacetate | Sigma-Aldrich, Inc. | 439169 | Preparation of purified polyphenol extracts |
ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9102S | Primary antibody (1:500) |
EDTA, 500 mM, pH 8.0 | Teknova, Inc. | E0306 | Lysis buffer |
Freeze-Dryer | Labconco | VirTis Benchtop K | Preparation of polyphenol extracts |
FBS | Seradigm | 1400-500 | Cell culture |
HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | Lysis buffer |
NaCl | EMD Millipore, Inc. | 7760 | Lysis buffer |
NaF | J.T.Baker, Inc. | 3688-01 | Lysis buffer |
Na3VO4 | Sigma-Aldrich, Inc. | 450243 | Lysis buffer |
Na4P2O7 , decahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | S-9515 | Lysis buffer |
phospho ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9101S | Primary antibody (1:1000) |
Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich, Inc. | P8340-5ml | Lysis buffer |
Protein assay dye reagent | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 500-0006 | Protein concentration Measurement |
PVDF transfer membrane | Thermo Scientific, Inc. | 88518 | Western blots |
Rotatory Evaporator | Buchi Labortechnik | Rotavapor R3000 |
Preparation of polyphenol extracts |
Sterile water | Mediatech, Inc. | 25-055-CV | Preparation of polyphenol extracts |
Sonicator | QSonica, LLC | Q125 | Preparation of cell extracts |
SOD2 | Enzo Life Sciences, Inc. | ADI-SOD-110-F | Primary antibody (1:1000) |
Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, Inc. | X100 | Western blots |
Whatman #2 filter paper | GE Healthcare, Inc. | 28317-241 | Preparation of polyphenol extracts |