신경 시스템 재구성, 변조 및 모델링을 위해 해부학 적으로 영감을받은 3 차원 미세 조직 공학 신경 회로망

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Neuroscience

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Summary

이 원고는 마이크로 조직 공학 신경 네트워크의 제작에 대해 자세히 설명합니다. 3 차원 크기의 마이크론 크기의 구조물은 관 모양의 하이드로 겔에 둘러싸인 집적 된 신경 세포군에 걸친 길쭉한 정렬 축색관으로 구성됩니다. 이러한 살아있는 비계는 신경 회로를 재구성하거나 조절하기위한 기능적 중계 역할을하거나 회색 - 흰색 물질 신경 조직학을 모방 한 생물 여과 테스트 베드 (bifidelic test-bed) 역할을 할 수 있습니다.

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Struzyna, L. A., Adewole, D. O., Gordián-Vélez, W. J., Grovola, M. R., Burrell, J. C., Katiyar, K. S., Petrov, D., Harris, J. P., Cullen, D. K. Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling. J. Vis. Exp. (123), e55609, doi:10.3791/55609 (2017).

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Abstract

기능적 회복은 중추 신경계 (CNS) 내의 손상 또는 질병 유발 성 퇴행 후 억제 환경 및 신경 발생에 대한 제한된 용량으로 인해 드물게 발생한다. 우리는 손상된 CNS 내에서 신경 및 축삭 경로 손실을 동시에 처리 할 수있는 전략을 개발 중입니다. 이 원고는 마이크로 조직 공학 신경 네트워크 (micro-TENNs), 뉴런으로 구성된 이식 가능한 구조물 및 센티미터 (centimeters)를 확장 할 수있는 수백 마이크론의 직경을 가진 예비 형성된 하이드로 겔 실린더의 세포 외 매트릭스 (extracellular matrix, ECM) 길이. 신경원 집합체는 3 차원 인장의 극단으로 구분되며 축삭 투영으로 확장됩니다. Micro-TENNs는 CNS 재건을위한 전략으로 두뇌 connectome 세포 구조의 측면을 모방하고 잠재적으로 네트워크 대체 수단을 제공 할 수있는 유일한 자세를 취하고 있습니다. 노이ronal aggregates는 숙주 조직과 시냅스하여 누락되거나 손상된 회로를 복원 및 / 또는 조절하는 새로운 기능적 중계를 형성 할 수있다. 이러한 구조는 또한 세포 재생 및 축삭 경로 찾기를위한 발달 기작을 이용할 수있는 친 재생성 "살아있는 스캐 폴드"로 작용하여 재생 상태를 기반으로 시너지 구조 및 가용성 단서를 제공 할 수 있습니다. Micro-TENN은 액체 하이드로 겔을 종 방향 중심의 바늘이 들어있는 원통형 틀에 주입하여 제조됩니다. 일단 하이드로 겔이 겔화되면 바늘이 제거되어 중공 형 마이크로 컬럼이 남습니다. 루멘에 ECM 솔루션을 추가하여 신경 부착 및 축색 파 성장에 적합한 환경을 제공합니다. 해리 된 뉴런은 미세 기둥의 한쪽 또는 양쪽 끝 부분에 정확한 파종을 위해 기계적으로 응집됩니다. 이 방법론은 장기적으로 돌출 된 축삭 모양의 좁은 구조물을 안정적으로 생산하여 뇌 신경 조직의 특징을 재현 할 수 있습니다. 시냅스 렘unlabelling 및 유 전적으로 코딩 된 칼슘 지시약은 마이크로 TENN이 광범위한 시냅스 분포와 본질적인 전기적 활동을 가지고 있음을 암시합니다. 결과적으로 micro-TENN은 뇌 경로의 신경 외과 재 구축을위한 유망한 전략이며 , 생체 내에서 신경 생리 현상을 연구하기위한 biofidelic 모델로도 적용될 수 있습니다.

Introduction

외상성 뇌 손상 (TBI), 척수 손상 (SCI), 뇌졸중, 알츠하이머 병 및 파킨슨 병과 같은 중추 신경계 (CNS)의 장애 및 질병의 일반적인 특징은 축삭 경로 및 신경 세포의 단절이다 손실 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . 예를 들어, 허혈성 뇌졸중이 치료되지 않으면 축삭이 분당 7 마일의 속도로 손실된다는 것이 추정됩니다. 미국에서만 약 170 만 명의 사람들이 매년 경험하는 TBI의 경우, 초기 손상이 장기간 신경 퇴행성 상태를 유발하기 때문에 축삭 변성이 외상 후 수년 후에도 계속 발생할 수 있습니다 4 . 이러한 유해한 영향을 악화시키는 중추 신경계는 심각한 카파중생을위한 도시 1 , 7 , 8 , 9 . 손상 후, 먼 표적에 대한 유도 지침의 부족, 신경 돌기 성장을 방해하는 미엘린 - 관련 억제제의 존재 및 반응성 성상 교세포 8 , 10 , 11 , 12 에 의한 신경 교뇌 흉터의 형성을 특징으로하는 억제 환경이 발병한다. glial 흉터는 chondroitin sulfate proteoglycans와 같은 분자가 축삭 돌기를 방해하는 생화학 적 및 물리적 장벽으로 작용합니다 8 , 11 . 또한 신경 줄기 세포가 성인 CNS에서 발견 되더라도 신경 발생의 일관된 증거가 후각 구, 해마에서만 발견되어 새로운 신경 세포의 생성이 제한적이다입방 영역, 뇌실 주위 및 척수의 중심 도관 13 , 14 . 이러한 장애물은 상해 또는 질병에 따른 손실 된 뉴런 및 백질 구조의 기능적 회복을 방해하여 종종 이러한 조건의 삶을 변화시키고 연장 된 결과를 초래합니다.

성인 CNS의 재생 능력이 부족 함에도 불구하고 적절한 환경 신호가 호스트 뉴런 15 , 16 , 17 , 18에 제공 되면 축삭 재생이 가능하다는 것이 입증되었습니다. 연구자들은 성장 인자 ( 예 : 신경 성장 인자, 표피 성장 인자, glial 의존 성장 인자 및 신경 영양 인자 3) 및 가소성 및 축색 재생을 자극하는 다른 유도 분자를 전달 및 조작하려고 시도했다 14 ,18 , 19 . 비록 이러한 연구가 성체 축삭 돌기가 성장 인자에 반응 할 수 있다는 것을 확인했지만, 이러한 전략은 혈액 뇌 장벽의 낮은 침투력과 재생을 촉진시키는 데 필요한 특정 공간적, 시간적 변화에 의해 제한된다 14 , 18 , 19 . 다른 접근법은 중추 신경계 뉴런에서 재생 관련 전사 인자의과 활성화에 의존해왔다. 예를 들어, Stat3 전사 인자의 과발현은 시신경에서 축삭 재생을 자극했다. 그럼에도 불구하고, 전사 인자의 생체 분자 전달 및 과발현은 손실 된 연결 집단을 대체하지 못한다. 세포 기반 전략은 주로 신경 줄기 세포 (NSC)를 중추 신경계에 이식하는 것에 중점을두고 있으며, CNS 뉴런을 대체 할 수있는 능력을 활용하고 영양 계수를 방출하며,부상 후 발생하는 신경 발생에 대한 시도를지지한다. 그럼에도 불구하고 이식 된 신경 세포가 생존하고 숙주와 통합되며 상처 부위 6 , 14 , 17 , 21에 공간적으로 제한된 채로 남아있는 방해받는 능력을 포함하여이 접근법을 방해하는 도전 과제가 여전히 남아 있습니다. 또한, 세포 전달만으로 손상되거나 손상된 축삭 경로의 세포 구조를 복원 할 수 없다. 세포 및 약물 / 화학 물질 전달 전략이 직면 한 문제를 해결할 수있는 대체 방법은 이러한 접근법을 생체 물질 14 , 22 , 23 의 사용과 결합하는 것입니다. 하이드로 겔과 같은 생체 재료는 세포 외 매트릭스 (ECM)의 생화학 적 및 물리적 특성을 에뮬레이션 할 수 있으며, 세포 전달을 돕습니다.손상 부위 내에서의 유지, 방출 조절이 가능한 성장 인자 및 기타 생체 활성 물질 전달 22 . 이러한 생체 재료 기반 전략의 매력적인 특성은 발병 지역 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 에 비계를 이식 한 후 생체 내 축삭 재생의 증거를 가져 왔습니다. 그러나, 무 세포 생체 재료 전략은 잃어버린 연결 인구를 대체하지 않는다; 신경 세포, 신경 교세포 또는 신경 전구체 세포의 전달 비히클로 사용될 때, 생체 재료는 장거리 축색 망을 재구성 할 수 없다. CNS 손상 및 질병과 관련된 축삭 경로의 퇴행 및 신경 세포 손실 모두를 다루는 접근법을 개발하는 과제는 여전히 <sup class = "xref"> 31.

우리 연구 그룹은 이전에 아가로 오스 하이드로 겔 -ECM 마이크로 칼럼의 한쪽 또는 양쪽 끝으로 제한되는 신경 세포 몸체로 구성된 "살아있는 비계 (scaffold)"형태의 이식 가능한 미세 조직 공학 신경 네트워크 (마이크로 TENN)의 개발을보고했다 이 3 차원 (3D) 수용체 1 , 10 , 31 , 32 의 내부 전체에 걸쳐 정렬 된 축색 영역이있다. 이 기법과 이전의 접근법의 가장 큰 차이점 중 하나는 micro-TENNs 의 세포 구조 가 in vitro에서 완전히 생성 되어 이후 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 ,sup class = "xref"> 39 , 40 , 41 . In vitro 제작은 세포 표현형 및 배향, 기계적 / 물리적 특성, 생화학 적 신호 및 외인성 인자에 대한 광범위한 공간 및 시간 제어 기능을 제공하여 임플란트 후 이러한 인공 지지체를 숙주와 통합하는 데 효과적입니다. Micro-TENN은 해부학 적으로 영감을받습니다. 뇌의 신경 기능을 모방하기 때문에 뇌의 다른 기능 영역을 연결하는 것과 유사한 축삭 영역을 보이기 때문입니다 ( 그림 1A ) 1 . 따라서이 전략은 병변 부위에 이식 한 후 잃어버린 백질 물질과 뉴런을 물리적으로 대체 할 수 있습니다. 이 기술은 또한 방사상의 glial 세포와 개척 축삭에 의해 형성된 "natural living scaffolds"가 세포의 길 찾기 가이드 역할을하는 발달 기작으로부터 영감을 얻습니다subventricular zone과 axonal outgrowth에서의 이동 43 . 이러한 메커니즘은 신경 세포 이동 및 축삭 - 중재 축삭 돌기 ( 그림 1C ) 43에 의한 축삭 재생을위한 살아있는 경로를 제시 할 수있는 마이크로 TENNs의 정렬 axonal 영역에서 recapitulated 있습니다. 또한이 전략은 마이크로 TENN 뉴런과 기본 회로 사이의 시냅스 통합을 활용하여 기능적 복구 ( 그림 1B ) 43 에 기여할 수있는 새로운 릴레이를 형성합니다. 시냅스 형성 용량은 또한이 접근법에 네트워크 피드백에 따라 CNS를 조절하고 숙주 조직에 반응하는 능력을 부여 할 수있다. 예를 들어, 살아있는 발판의 optogenetically 활성 뉴런은 시냅스 상호 작용을 통해 호스트 뉴런을 변조 자극 수 있습니다 ( 그림 1D ).

또한, 생체 재료 기반 관상 면상 구마이크로 TENN의 작용은 세포 부착, 성장, 신경 돌기 확장 및 신호 전달을위한 적절한 환경을 제공하는 반면, 구조물의 미니어처 차원은 잠재적으로 최소 침습성 이식을 허용하고 부분적으로 격리 된 미세 환경을 제공하여 뇌에 점진적으로 통합시킵니다. 사실, 최근의 연구 결과는 쥐의 뇌에 이식 된 이후에 신경 경로를 모방 할 수있는 마이크로 TENN의 잠재력을 보여주었습니다. stereotaxic microinjection 후, 우리는 이전에 마이크로 TENN의 연결의 생존, axonal tract 건축의 유지 및 생체 내 에서 적어도 1 개월까지의 숙주 피질로의 신경 돌기 연장을보고했다. 또한, synapsin으로 라벨링은 원시 조직과의 시냅스 통합의 조직 학적 증거를 제공했다. 전반적으로 마이크로 TENN은 손상된 부분을 재구성하고 변조하는 데 적합 할 수 있습니다CNS는 잃어버린 뉴런을 교체하고, 숙주 회로와 시냅스 적으로 통합하고, 축삭 세포 구조를 잃어버린 채로 복원하며, 경우에 따라 축삭 재생 축삭에 적절한 길 찾기 신호를 제공함으로써 가능합니다.

그림 1
그림 1 : 마이크로 조직 공학 신경 네트워크 (마이크로 TENN) 개발의 원리와 영감 ( A ) Micro-TENN은 기능적으로 구별되는 영역이 단방향 (적색, 녹색) 또는 양방향 (파란색) 방식으로 길고 정렬 된 축색 영역에 의해 연결되는 brain connectome (자주색)의 세포 구조를 모방합니다. 예를 들어, micro-TENNs는 대뇌 피 질 및 흑질 선 경로에서, 또는 entorhinal cortex에서 해마에 이르는 경로에서 분실 된 연결을 재구성 할 수있다 (Struzyna et al. , 2015). ( B ) 단방향의 다이어그램l 및 양방향 micro-TENN (각각 빨간색과 파란색)을 사용하여 병변의 양쪽 끝 사이의 기능 중계 역할을하는 호스트 회로 (자주색)와 통합됩니다. ( C ) micro-TENN이 상호 작용하는 표적을 향한 축색 돌기 (보라색)의 축삭 촉진 재생을위한 가이드 역할을하는 단 향성 마이크로 TENN (녹색)의 축삭 덩어리의 개략도. ( D ) 흥분성 또는 억제 성 뉴런과의 시냅스 통합을 이용하여 신경 조절기로서의 광학 유전 학적으로 활성 인 마이크로 TENNS의 사용에 대한 개념도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

현재의 원고는 배아 적으로 추출 된 대뇌 피질 뉴런을 사용하여 마이크로 TENN을 제조하는 데 사용 된 방법론을 상세히 설명합니다. 주목할 만하게, micro-TENNs는 다른 종류의 신경 세포로 만들어 질 수있다. 예를 들어충분한, 마이크로 TENN 개발 성공의 초기 보고서는 지느러미 뿌리 신경절 (DRG) 뉴런을 특징으로합니다 32 . 하이드로 겔 미세 기둥은 주문 제작 된 레이저 컷 원통형 채널 어레이 또는 모세 혈관 튜브에 액체 아가로 오스를 추가하여 생성 할 수 있습니다 ( 그림 2A ). 바늘은 내강을 형성하고 미세 기둥의 내경 (ID)을 결정하는 반면 모세관 ID 및 레이저 절단 장치의 기둥 직경은 구조체의 외경 (OD)을 결정합니다. OD 및 ID는 장치 / 모세관 및 침침 바늘에 각각 다른 직경을 선택하여 원하는 용도에 따라 선택할 수 있습니다. 미세 기둥의 길이 또한 다양 할 수 있습니다. 지금까지 우리는 길이가 20mm 인 마이크로 TENN의 건설을보고했으며, 더 긴 길이를 적극적으로 추구하고 있습니다. 아가로 오스 겔과 침술 후Eedles를 제거하면 일반적으로 I 형 콜라겐과 라미닌으로 구성된 ECM 용액을 구조물의 루멘에 첨가합니다 ( 그림 2C ). ECM 코어는 신경 세포 접착 및 축색 돌기를지지하기위한 지지체를 제공한다. 초기에, 일차 쥐 대뇌 피질 뉴런은 해리 된 세포 현탁액 10 , 31 , 32 를 사용하여 마이크로 칼럼에 도금되었다. 그러나,이 접근법은 모든 경우에 표적 세포 구조를 생성하지 않았는데, 이는 뉴 칼럼의 말단에 한정된 신경 세포 몸체로 정의되었고, 중심 루멘은 순수한 정렬 된 축삭 영역으로 구성되었다. 그 이후 강제적 인 신경 집계 방법 (Ungrin et al .의 프로토콜을 기반으로 함)을 사용하여 이상적인 구조 ( 그림 2B )로 마이크로 TENN을보다 안정적이고 일관되게 제작할 수있었습니다. 전류를 설명하는 것 외에도방법론에서,이 기사는 시간이 지남에 따라 axonal tracts의 형성을 증명하는 micro-TENN의 대표적인 위상 - 대조 및 공 촛점 이미지뿐만 아니라 최종 표적 세포 구조를 보여줄 것이다. 이 원고는 프로토콜의 중요한 측면과 마이크로 TENN 기술의 향후 과제 및 향후 방향으로 확장 될 것입니다.

그림 2
그림 2 : 3 단계 마이크로 TENN 제조 공정의 개략도. ( A ) 아가로 오스 하이드로 겔의 개발 : (i) 처음에는 직경이 180-350 μm 인 작은 침침이 맞춤형 레이저 컷 몰드 또는 모세관 튜브의 원통형 채널에 삽입된다. , 직경 380-700 μm). 다음 단계에서, DPBS의 액상 아가로 오스가 원통형 채널 또는 모세관에 도입된다. (ii) 아가 로스 젤 후, 바늘을 제거하고주형을 분해하여 중공 아가 로스 미세 기둥을 수득한다. (iii) 이들 구조체는 DPBS에 살균되고 저장된다. ( B ) 일차 뉴런 문화와 집계 방법 : (1) 뉴런 집합은 12 잘 배양 접시의 우물에 맞는 3D 인쇄 금형에서 캐스팅 피라미드 형 마이크로 우물 어레이에서 수행됩니다. (ii) Micro-TENN은 배아 일 -18 쥐의 태아 두뇌에서 해리 된 일차 쥐 뉴런을 포함한다. 트립신 -EDTA 및 DNase I로 조직 해리시킨 후, 1.0-2.0 x 106 세포 / mL의 밀도를 갖는 세포 용액을 제조 하였다. (iii)이 용액 12 μL를 피라미드 마이크로 웰 어레이의 각 웰로 옮긴다. 이러한 마이크로 우물을 포함하는 플레이트를 원심 분리하여 세포 응집체를 생성한다. (iv) 이들을 마이크로 칼럼에서 도금하기 전에 밤새 배양한다. ( C ) ECM 코어 제작 및 세포 파종 : (i) 세포 파종 전에, 1 mg / mL 타입 I 콜라겐 및 1 mg / mL를 함유하는 ECM 용액라미닌은 마이크로 TENN의 내부로 전달되어 중합 될 수있다. (ii) 단방향 또는 양방향 micro-TENN이 제조되는지 여부에 따라, 응집체는 마이크로 컬럼의 한쪽 또는 양쪽 극단에 각각 위치한다. (iii) 접착을 촉진하기위한 배양 기간 후, micro-TENNs를 보충 된 배아 뉴론 기저 배지로 침수시킨 페트리 접시에서 배양한다. (iv) 배양 3 ~ 5 일 후, 최종 마이크로 -TENN 구조는 마이크로 - 칼럼의 극단에서 세포 집합체를 보여야하며, 길이에 걸친 축삭 영역이 있어야한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Protocol

동물을 포함한 모든 절차는 펜실베이니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회와 마이클 J. 크레센츠 재향 군인 의료 센터 (American J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center)의 승인을 얻었으며 NIH 공중 보건 서비스 정책에 규정 된 지침에 따라 실험실의 인간애 관리 및 사용 동물 (2015).

1. 아가로 오스 하이드로 겔 (마이크로 TENN의 무 세포 성분)

  1. 아가로 오스 용액 준비
    1. biosafety 캐비닛 내에서 두 개의 10cm 페트리 접시 각각에 Dulbecco의 인산 버퍼 식염수 (DPBS) 20 ML을 전송하여 마이크로 컬럼을위한 저수지를 준비합니다. 뜨거운 비드 멸균기로 미세 포셉 및 마이크로 알펠을 소독하십시오.
    2. 아가로 오스 3g을 바이오 안전성 캐비닛 안의 멸균 비이커에 옮긴다. 3 % 중량 / 부피 (w / v)의 최종 농도를위한 100 mL의 DPBS를 첨가한다. 깨끗한 마그네틱 바를 포함하고 알류미로 비커를 덮으십시오.num 호입니다.
    3. 핫 플레이트 / 교반기로 100 ℃에서 비이커를 따뜻하게하고 120 ~ 200 rpm으로 저어서 아가로 오스를 완전히 녹이십시오 (용액이 흐려지면서 투명하게 변합니다). 나중에 겔화를 방지하기 위해 가열 및 교반을 유지하고 아가로 오스가 연소되지 않도록 가열 온도를 변경하십시오.
      참고 : 레이저 절단 장치와 모세관 튜브를 사용한 제작은 아래 1.2 및 1.3 절에서 각각 설명합니다. 하위 섹션에 설명 된 단계를 완료 한 후 1.4 절로 진행하십시오. 두 가지 마이크로 컬럼 제조 방법의 경우, 아가로 오스가 식을 때 급속히 응고 될 때 액체 아가 로스를 신속하게 첨가하십시오. 다음 단계에서 오토 클레이브로 멸균 할 때는 유리 제품에 적용된 표준 조건을 사용하십시오.
  2. 레이저 컷 장치를 사용한 미세 기둥 준비
    참고 : 레이저 절단 장치는 상용 CO2 레이저 커터를 사용하여 투명 아크릴로 절단합니다. 파브리레이저 절단을 통한 구조 및 장치의 양이온은 다양한 엔지니어링 및 연구 응용 분야에 잘 설명되어 있습니다 45 , 46 , 47 . 이 금형 ( 그림 3 )은 직경이 398 μm이고 길이가 6.35 mm 인 5 개의 원통형 채널이 배열되어 있습니다. 이들 원통형 어레이는 그 길이를 따라 하반부 (길이 : 25.4㎜, 폭 : 6.35㎜, 높이 : 6.0㎜)와 상반부 (길이 : 31.5㎜, 폭 : 6.35㎜, 높이 : 12.7㎜ ( 도 3a도 3b 에 각각 도시 됨). 두 개의 반쪽은 그림 3C (길이 : 31.5mm, 폭 : 6.35mm, 높이 : 12.7mm)에서 볼 수 있는 전방 및 후방 캡에 의해 함께 고정 될 수 있으며, 위쪽 및 아래쪽 각각에 2 개의 구멍과 일치하는 4 개의 정렬 구멍이 있습니다 조각으로 고정하면 모든 부품을 고정시킬 수 있습니다. 이 모자는 또한 inc원통형 채널과 동심 인 5 개의 구멍으로 마이크로 - 칼럼의 루멘을 형성하기 위해 침침을 삽입 할 수있다.
    1. 알루미늄 호일과 고압 증기 멸균기로 덮어서 그림 3 의 장치를 소독하십시오. 전방 및 후방 캡을 아래쪽 절반 부분에만 맞추고 아래쪽 정렬 구멍에 두 개의 4-40 나사와 너트 (나사 직경 : 3.05 mm)로 세 부분을 고정하여 그림 3D 와 같이 장치를 조립하십시오.
    2. 침술 바늘 (직경 : 180 μm, 길이 : 30 mm)을 장치의 앞쪽 또는 뒤쪽 캡에있는 바늘 구멍에 완전히 삽입하십시오 ( 그림 3D ). 마이크로 피펫을 사용하여 아래쪽 절반 조각에 충분한 액체 아가로 오스 (5 개 채널에 대해 ~ 1 mL)를 부어 각 원통형 채널 반을 완전히 채 웁니다.
    3. 즉시 장치의 상단 절반을 하단 절반에 놓고 단단히 고정 될 때까지 압력을가하십시오원통형 채널을 완성하기위한 장소 (마개와 상단 피스 사이의 마찰로 후자가 제 위치에 유지됩니다). 장치의 채널 내부의 겔화를 허용하기 위해 아가로 오스를 첨가 한 후 실온에서 5 분간 기다립니다.
    4. 장치의 뚜껑에있는 각 구멍에서 바늘을 수동으로 뽑아냅니다. 나사를 제거하고 두 뚜껑과 상단 절반을 하단 절반 조각에서 수동으로 분리합니다. 이때 절반은 하이드로 겔 마이크로 컬럼을 보유합니다.
    5. 미세한 집게를 사용하여 아래쪽 절반 조각의 채널에서 마이크로 컬럼을 부드럽게 제거하고 DPBS가 들어있는 이전에 준비된 페트리 접시에 넣으십시오 (1.1.1 단계). 마이크로 컬럼 제조의 또 다른 라운드를 위해 장치를 재사용하십시오. 1.4 절로 가십시오.
  3. 모세관을 이용한 미세 기둥 제조
    1. 바이오 캐비닛 내부에 유리 모세관 (직경 : 398.78 μm, 길이 : 32 mm)을 옮깁니다. 수동으로긴 튜브를 2.0-2.5 cm 조각으로 채우고 각 조각 ( 그림 2A )에 하나의 침침 (직경 180 μm, 길이 30 mm)을 완전히 삽입합니다.
    2. 비이커에서 액체 아가로 오스 1 ML을 빈 페트리 접시의 표면에 전송합니다. 모세관 튜브와 주입 바늘을 잡고 튜브의 한쪽 끝을 액체 아가로 오스 풀과 접촉시켜 모세관 작용으로 채 웁니다. 모세 혈관 상승을 촉진하기 위해 튜브를 자극하십시오.
      참고 : 모세관 현상이 허용하는 한 높은 액체 아가로 오스로 모세관을 채 웁니다. 이후, 이러한 마이크로 컬럼은 원하는 길이에 따라 더 작은 구조물로 절단 될 수있다. 아가 로스가 냉각되고 빠르게 젤화되어 모세관 현상이 추가로 방지되므로 1-mL 아가로 오스 풀은 일반적으로 하나의 튜브에만 사용됩니다.
    3. 액체가 더 이상 뜨지 않으면 수영장에서 모세관을 꺼내 페트리 접시 표면에 수평으로 놓습니다. 튜브 내부에 아가로 오스 젤을 넣기 위해 5 분 동안 기다리십시오. </ li>
    4. 엄지 손가락과 집게 손가락을 튜브 양쪽에 놓고 눌러서 누릅니다. 다른 손으로 엄지 손가락과 집게 손가락을 사용하는 동안 바늘을 빨리 잡아 당겨 미세 기둥 자체가 튜브에서 빠져 나오지 않도록하십시오. 모세관에 30 게이지 바늘을 삽입하여 마이크로 컬럼을 DPBS가 들어있는 접시에 천천히 밀어 넣습니다 (1.1.1 단계).
  4. 마이크로 칼럼 트리밍 및 멸균
    1. 섬세한 집게를 사용하여 DPBS에서 빈 접시로 한 마이크로 컬럼을 섬세하게 옮깁니다. 건조를 방지하기 위해 마이크로 피펫과 함께 마이크로 컬럼의 상단에 DBPS 10 μL를 추가합니다. 시각적 인 지침을 위해 stereoscope 아래에 후자의 요리를 놓으십시오.
      참고 : 프로토콜 전체에서 미세 기둥 건조 또는 탈수 함은 이러한 구조의 일반적인 수화 된 외관과 시각적으로 구별되는 구겨진 구조의 획득을 의미합니다. 탈수 마이크로 - 칼럼은 페트리 접시의 표면에 단단히 부착되고 c수화 된 구조물은 포셉으로 조작 된 후에 표면을 가로 질러 미끄러지는 경향이있는 반면, 쉽게 움직일 수있다. 완전히 건조 된 마이크로 - 칼럼의 위상 - 대조 이미지가 도 8a 에 도시되어 있다 .
    2. 원하는 길이 (여기서는 2 ~ 5 mm)로 줄이기 위해 마이크로 칼럼으로 마이크로 컬럼을 자릅니다. 잘게 집게로 손질 된 마이크로 칼럼을 1.1.1 단계에서 준비한 다른 DPBS 페트리 접시로 옮긴다.
    3. 가공 된 각 마이크로 컬럼에 대해 1.4.1 및 1.4.2 단계를 반복하십시오.
    4. 자외선 (UV) 빛 아래 DPBS 함유 페트리 접시의 마이크로 컬럼을 1 시간 동안 멸균하십시오. ECM 첨가 및 세포 도금 전에 4 ° C에서 페트리 접시를 저장하십시오.

2. 일차 뉴런 배양과 강제 세포 응집 방법

  1. 피라미드 마이크로 웰 어레이의 준비
    참고 :이 섹션에서는 원통형베이스 (직경 : 2.2cm, 높이 : 7.0mm)로 구성된 3D 인쇄 금형을 사용합니다그림 3E 와 같이 3 x 3 어레이로 구성된 9 개의 정사각형 피라미드 (상단 길이 (측면 길이 : 4.0 mm, 경사 각도 : 60 °). 상용 3D 프린터를 사용하는 첨가제 제조 공정은 잘 문서화되어 있습니다. 몰드 설계에 컴퓨터 지원 설계 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 그 결과 생성 된 디자인 파일을 3D 프린터의 도구 경로로 디지털 변환 할 수 있습니다. 각 프린터의 사양은 다르므로 3D 프린터 설정 및 작동 지침이 그에 따라 다릅니다.
    1. 10cm 페트리 접시의 뚜껑을 중심으로 4 x ​​4 배열 (측면 길이 : 4 cm, 구멍 분리 : 1 cm)에 16 개의 구멍을 뚫기 위해 3/32 "드릴 비트를 사용하십시오. 화학 흄 후드 내부에는 27 g의 폴리 디메틸 실록산 (polydimethylsiloxane) (PDMS)과 3 g의 경화제 (1:10 비율)의 무게를 측정하기 위해 페트리 접시의 바닥 조각. 마이크로 - 주걱으로 저어 약산을 균등하게 분산시킨다.
    2. PDMS / 경화제를 구멍이 뚫린 뚜껑으로 덮으십시오. 호스의 한쪽 끝을 진공관에 연결하십시오.m 입구에 넣고 다른 쪽 끝을 깔대기 (줄기 직경 10cm, 줄기 길이 3cm, 줄기 직경 1.5cm)의 줄기에 넣습니다.
    3. 1 mL 피펫 전구의 상단에 3/32 "드릴 비트로 개구부를 만들고 1,000 μL 마이크로 피펫 팁을 입구에 삽입하십시오 (뾰족한 끝을 위쪽으로 향하게하십시오). 전구와 팁을 호스에 넣고 당겨서 벌브가 호스를 깔대기의 줄기 안으로 밀봉 할 때까지 호스를 위로 올리십시오.
    4. 구멍이 뚫린 접시 뚜껑에 깔때기를 놓고 사용 가능한 견고한 지지대로 호스를 고정시킵니다. 진공 밸브를 5 분간 열어 흡착시키고 표면에 기포를 가져온다.
    5. 밸브를 닫고 깔때기를 제거한 후 페트리 접시를 퓸 후드의 표면에 대고 3 ~ 4 번 눌러 남아있는 공기 방울을 터뜨립니다.
    6. 피라미드 모양의 3D 인쇄 된 금형을 피라미드가 위로 향하도록 12- 웰 배양 판에있는 각 웰에 놓습니다. 각 우물이 나올 때까지 금형 위에 PDMS / 경화제를 붓습니다.그는 접시가 가득 찼다. 12- 웰 플레이트를 뚜껑으로 덮고 60 ° C에서 1 시간 동안 오븐으로 옮겨 건조시킵니다.
    7. 조심스럽게 마이크로 주걱으로 플레이트에서 각 PDMS 마이크로 어레이 ( 그림 3F )를 제거하십시오. PDMS 어레이를 알루미늄 호일로 덮고 고압 증기 멸균으로 멸균하십시오. biosafety 캐비닛 내부에 하나의 마이크로 웰 어레이를 12 웰 플레이트 ( 그림 2B )의 각 웰에 삽입하십시오.
  2. 쥐 태아에서 두피 신경 세포 분리
    1. 바이오 안전성 캐비닛 안의 4 ~ 6 개의 10cm 페트리 접시 (각 해부 된 조직에 하나씩)에 행크의 균형 소금 용액 (HBSS) ~ 20mL를 추가합니다. 이러한 요리를 해부 후드로 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 뜨거운 구슬 소독기로 미세 칼날, 가위 및 포셉과 같은 해부기구를 소독하십시오.
    2. 예열 전 배아 뉴런 기저 배지 + 2 % 무 혈청 보충제 + 0.4 mM L- 글루타민 ( "배양 배지"라고 함)r)와 0.25 % trypsin + 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)를 첨가하여 37 ℃에서 2 시간 동안 배양 하였다. Deoxyribonuclease (DNase) I을 실온에 방치하여 해동시킨다. HBSS에 0.15 MG / ML DNAse I 용액 1.5 ML을 준비하고 얼음에 솔루션을 유지합니다.
    3. 배아 일 18 마리의 임신 한 태아를 이산화탄소 흡입으로 안락사시키고 목이 잘 빠져 죽을 지 확인하십시오. 시체를 멸균 해부 후드로 옮기고 배 쪽을 위로 눕혀 라. 70 % 에탄올로 복부를 완전히 헹구십시오.
    4. 자궁을 열고 가위로 양막 주머니에서 태아 (일반적으로 ~ 11)를 제거하고 48 절에서 설명한대로 감기 HBSS가 들어있는 페트리 접시로 집게로 옮깁니다. 입체경 아래에 차가운 (-20 ° C) 화강암 블록을 놓습니다. 해부 절차 전반에 걸쳐 HBSS의 낮은 온도를 보존하기 위해 감기 블록의 표면에 페트리 접시를 놓습니다.
    5. HBSS 주위를 스윙하여 새끼를 씻어 다음 깨끗한 접시로 전송HBSS 함유. 입체경과 해부기구의 도움으로, 순차적으로 머리, 대뇌 반구 및 태아의 피질을 제거하고 각 해부 48 후 새로운 HBSS 채워진 접시에 집게로 각 조직을 전송하십시오.
    6. 파스퇴르 피펫으로 피질만을 흡인하고 조직을 멸균 15 mL 원심 튜브에 넣으십시오. 다른 해부 된 조직은 폐기하십시오. 순차적으로 serological 피펫과 HBSS ~ 5 ML을 추가하고 제거하여 cortices 세 번 씻어. 사용하지 않을 때는 튜브를 얼음 위에 놓으십시오.
    7. 미리 데워진 트립신 - EDTA (트립신 - EDTA 5 ML 당 4-6 cortices)가 포함 된 15 ML 튜브에 파스퇴르 피펫으로 cortices을 전송하십시오. 수동으로 튜브를 한번 흔들어 37 ° C에 놓습니다. 조직이 뭉치지 않도록 3 분마다 튜브를 뒤집습니다.
    8. 파스퇴르 피펫으로 조직을 제거하고 깨끗한 15 mL 원심 분리기로 옮겨 ~ 10 분 후 트립신 노출을 중단하십시오튜브. 피펫으로 튜브에 0.15 MG / ML DNase I 용액 (1.5 ML)을 추가합니다.
    9. 파스퇴르 피펫을 사용하여 수동으로 조직 덩어리를 분해 한 다음 용액이 균질 해 보이고 액체에 남아있는 조직 조각이 없어 질 때까지 와동 (~ 30 초)하십시오. 용액을 완전히 균질화 할 수 없다면, 파스퇴르 피펫의 끝 부분으로 당겨서 불용성 조각을 추출하십시오.
    10. 단계 2.2.9에서 얻은 균질 세포 용액을 200 xg에서 3 분간 원심 분리한다. 펠렛 세포를 방해하지 않도록주의하면서 파스퇴르 피펫으로 상층 액을 제거합니다. 혈청 피펫과 vortex와 세포를 resuspend로 문화 매체 2 ML을 추가합니다.
    11. hemocytometer를 사용하여 단계 2.2.10에서 준비한 용액의 세포 수를 세십시오. 예상 수율은 3.0-5.0 x 106 세포 / 피질 반구이다. 1.0-2.0 x 106 세포 / mL의 밀도로 배양 배지에서 세포 현탁액 1 mL 이상을 준비합니다.
  3. 신경 세포 집합체의 형성
    1. micropipette와 PDMS 배열 (단계 2.1.7에서 접시에 배치)의 각 마이크로 우물에 1.0-2.0 X 10 6 / ML 세포 현탁액 12 μL를 추가합니다.
      참고 : 세포 농도는 마이크로 컬럼 ID 및 원하는 세포 응집체 크기에 따라 조정할 수 있습니다. 농도가 높을수록 큰 응집체가 생성되기 때문입니다.
    2. micro-wells ( 그림 2B )의 바닥에 세포의 응집을 강제로 5 분 200 XG에서 접시를 원심 분리기. 조심스럽게 각 PDMS 배열의 상단에 ~ 2 ML의 배양액을 넣어 모든 응집 된 마이크로 우물을 덮고 응집 된 세포를 방해하지 않도록주의하십시오.
    3. 세포가 바이러스 성 벡터로 형질 감염되지 않을 경우, 37 ℃에서 5 % CO2로 12-24 시간 동안 배양 한 다음 3 장으로 진행하십시오. 응집체가 형질 도입 될 경우 부화를 건너 뛰고 2.4 절로 진행하십시오 .
  4. 트란칼슘 시그널링을 관찰하기위한 바이러스 벡터와의 결합
    참고 :이 단계는 유전자 암호화 된 칼슘 지시약 (GECI)을 포함하는 바이러스 벡터로 뉴런을 변환하기 위해 수행됩니다. 이 논문에서 제시된 결과는 녹색 형광 단백질 (GFP), 칼 모둘린 (CaM) 및 M13 펩타이드로 구성된 빠른 속도론을 갖는 GECI 인 GCaMP6f를 갖는 상업적으로 이용 가능한 아데노 - 관련 바이러스 (AAV) (혈청 형 1) 인간 Synapsin I 프로모터에 의해 구동된다. 바이러스 벡터 솔루션은 주식 솔루션의 농도에 따라, 변환 전에 멸균 DPBS에 희석을 요구할 수 있습니다. 세포 건강 / 형태 및 GCaMP6f 신호 강도는 일정한 벡터 농도 범위에서 시간 경과에 따라 관찰되어야합니다. 이 최적화 절차는 각 세포 배양에 적합한 적정량을 결정하기 위해 각 조사자가 수행해야합니다. 전형적인 GCaMP6f 발현 시간은 st에서 수행 된 배양 중에 일어나는 형질 도입 후 7-8 일이다ep 2.4.2.
    1. 마이크로 피펫을 사용하여 배양액에 바이러스 벡터 용액 (최종 농도 약 3.0 x 10 9 개 집합체)을 배양액에 넣고 필요한 양의 바이러스 벡터 용액을 첨가합니다. 천천히 위아래로 피펫 팅하여 벡터 용액이 배양 배지 전반에 걸쳐 균일하게 분포되도록하십시오.
    2. GCaMP6f의 바이러스 성 형질 도입을 허용하도록 37 ° C와 5 % CO 2 에서 24 시간 동안 시드 피라미드 형 마이크로 우물과 플레이트를 품어.

3. 마이크로 TENNs의 세포 구성 요소의 개발

  1. ECM 코어 제작
    1. 총 부화 후, ECM 솔루션을 준비하는 microcentrifuge 튜브에 문화 매체 (각각 1 밀리그램 / ML의 농도에 대한)에 타입 I 콜라겐과 laminin를 추가합니다. 실온에서 3.1.2-3.1.4 단계를 수행하고, 조기 겔화를 방지하기 위해 사용하지 않을 때는 얼음 위의 ECM으로 튜브를 유지하십시오.
    2. 리터머스 종이에 1-2 μL를 옮겨 ECM에 1 N 수산화 나트륨 (NaOH) 및 / 또는 1 N 염산 (HCl) 1 μL를 첨가하여 초기 pH를 확인하고, pH가 7.2-7.4가 될 때까지 반복한다. 기포 형성을 피하면서 위 / 아래로 pipetting하여 ECM 용액의 균질화를 확인하십시오.
    3. 1.4.3 단계의 접시에서 멸균 집게로 마이크로 칼럼을 35 또는 60mm 빈 페트리 접시에 옮긴다. 탈수를 방지하기 위해 한 번에 4-5 마이크로 컬럼을 작업하십시오. 마이크로 피펫에 1,000μL 팁에 부착 된 10μL 팁을 부착하십시오. 시각적 안내를 위해 입체경을 사용하여 팁을 마이크로 컬럼의 한쪽 끝에 놓고 흡인하여 잔여 DPBS 및 공기 방울을 루멘에서 추출합니다.
    4. micropipette에 4-5 μL의 ECM을 빠르게 작성하십시오. 관찰 아래에서 ste현미경을 사용하여 미세 기둥의 끝 부분에 micropipette의 팁을 놓고 루멘을 채우기에 충분한 ECM을 배출합니다. ECM을 통한 축색 돌기를 억제 할 수 있으므로 루멘의 기포가 없음을 확인하십시오. 기포가있는 경우 3.1.3 단계에서 설명한대로 ECM을 제거하고 ECM을 다시 추가하십시오.
    5. 탈수를 방지하기 위해 각 마이크로 컬럼 주위에 ~ 2 μL의 ECM을 추가하십시오. 페트리 접시에서 37 분 C와 5 % CO 2 에서 25 분 동안 하이드로 겔 / ECM 마이크로 컬럼을 부화시킨다. 부화 후 즉시 세포 파종에 진행하십시오.
      참고 : 단계 3.1.5의 잠복기는 마이크로 컬럼 내부 콜라겐과 라미닌의 중합 시간을 허용하기위한 것입니다.
  2. 미세 기둥의 신경 세포 시딩
    참고 : 변환 된 집합체의 배양 배지를 변경하려면 플레이트를 기울이고 마이크로 피펫을 사용하여 웰 벽에 쌓인 배지를 제거한 다음 천천히 ~ 1 mL를벽 (피라미드 형 마이크로 우물에서 응집체를 방해하지 않기 위해). 이 매체 변경을 다시 한 번 반복하십시오.
    1. 단계 3.1.5에서 잠복기 다음, 마이크로 컬럼을 들고 페트리 접시에 두 개의 무료 영역으로 약 10-20 μL 문화 매체를 전송합니다. micropipette을 사용하여 개별적으로 구조를 포함하는 페트리 접시에 집계를 전송하고 세포 건강을 보존하기 위해 작은 매체 풀 중 하나에 집게로 그들을 이동합니다.
    2. 입체경에서 관찰하면서 양방향 마이크로 TENN의 경우 마이크로 컬럼의 각 끝에 집계를 삽입하고 집게를 사용하여 단방향 아키텍처의 경우 한쪽 끝에 집계를 삽입하십시오. 입체경을 사용하여 마이크로 컬럼 내부에 집합체의 위치를 ​​확인하십시오. 포셉을 사용하여 탈수를 피하고 전체 건강을 보존하기 위해 시드 마이크로 컬럼을 다른 작은 배양 배지로 이동하십시오.
    3. 37 ° C 및 5 % CO 2 에서 45 분 동안 품어집계가 ECM을 따르도록합니다. 입체경을 사용하여 응집체가 마이크로 칼럼의 끝에 남아 있는지 확인하십시오. 세포 응집체를 재 도입하고 필요에 따라 배양 단계를 반복하십시오.
    4. 조심스럽게 혈청 피펫을 사용하여 마이크로 TENNs가 들어있는 페트리 접시를 배양 매체 (각각 35 또는 60mm 페트리 접시의 경우 3 또는 6mL)로 가득 채우십시오. 37 ° C와 5 % CO 2의 배양기에 장기간 배양하십시오.
    5. 배지로 2 일마다 하프 미디어 변경을 수행하십시오. 조심스럽게 피펫으로 오래된 매체의 절반을 제거하고 마이크로 TENNs을 흡입하지 않도록 시각적 안내를 위해 입체경을 사용하십시오. 신선한, 미리 데워진 매체를 피펫으로 천천히 추가하여 교체하십시오.
    6. PDMS 마이크로 우물 배열을 reutilize하려면, 문화 매체를 제거하고, 30 분 탈 이온수에 배열을 종기하고, 골재 형성 및 문화의 또 다른 라운드에 대한 오토 클레이브에서 소독.
      참고 : 원하는 시간대에서미세 TENNs의 세포 구조는 위상차 현미경을 사용하여 검증 할 수 있습니다. 여기서 5-8ms 및 10X (0.64 μm / 픽셀) 및 20X (0.32 μm / 픽셀) 대물 렌즈의 노출 시간을 사용하여 위상 대비 이미지를 캡처했습니다. 바이러스로 변환 된 마이크로 TENNs에서 칼슘 농도 변화와 관련된 형광은 50ms 노출 시간, 10X 대물 렌즈 (0.64 μm / 픽셀) 및 ~ 480의 대역 통과 필터를 갖는 고체 상태 광을 사용하여 고속 형광 현미경을 사용하여 캡처했습니다 GCaMP6f 형광 신호를 시각화하기 위해 각각 여기 및 방출에 대해 ~510nm 및 ~ 510nm.

4. In vitro 실험을위한 면역 세포 화학

참고 : 여기에 표시된 이미지의 경우 다음과 같은 기본 항체가 사용되었습니다 : 축삭과 사전의 라벨에 대한 마우스 항 Tuj - 1 / 베타 - III의 tubulin (1시 500 분)와 토끼 안티 synapsin - 1 (1시 500 분) - 시냅스 부용제. 2 차 항체는 당나귀- 마우스 568 (1 : 500)과 당나귀 - 토끼 488 (1 : 500). 포름 알데히드, 말 혈청 및 세제 용액의 부피뿐만 아니라 준비된 1 차 및 2 차 항체 용액의 필수 부피는 구조물을 완전히 덮기 위해 필요한 부피에 달려있다. 이러한 볼륨은 각 마이크로 컬럼을 둘러싸는 영역을 제한하기 위해 소수성 장벽 펜을 사용하여 최소화 할 수 있습니다.

주의 :이 절에서는 포름 알데히드와 Hoechst를 사용합니다. 포름 알데히드는 발암 성이있는 것으로 알려진 독성 화합물이며 Hoechst는 알려진 돌연변이 유발 물질입니다. 따라서 이러한 화합물은 적절한 폐기 용기에 폐기해야합니다. 실험실 외투, 안전 안경 및 장갑과 같은 적절한 개인 보호 장비를 사용하면서 항상 화학 흄 후드에서 취급하십시오.

  1. 화학 흄 후드 내부의 1x 인산염 완충 식염수 (PBS)에 4.0 % 부피 / 부피의 포름 알데히드 용액을 준비합니다.
  2. 배양 접시에서 배양 배지를 제거하십시오.micro-TENN을 마이크로 피펫으로 채 웁니다. 포름 알데히드 용액을 접시에 충분히 넣어 마이크로 TENN을 완전히 덮으십시오. 18-24 ° C에서 35 분 동안 포름 알데히드 용액에 마이크로 TENN을 담그고 마이크로 컬럼 내에서 세포를 고정시킵니다.
  3. 페트리 접시로 4.0 % 포름 알데히드 용액을 제거하고 적절한 위험 물질 처리 지침에 따라 버립니다.
  4. 고정 된 마이크로 TENNs를 완전히 커버하기 위해 충분한 PBS를 추가하고 피펫으로 PBS를 제거하여 두 번의 빠른 린스를 수행하십시오. 10 분 동안 PBS에 구조물을 담가 두어 세 번째로 긴 헹굼을 수행하십시오.
    주의 : 헹굼에 사용 된 PBS는 흔히 포름 알데히드가 포함 된 것으로 폐기하십시오.
  5. PBS로 4 % v / v 말 혈청에서 비이 온성 세제의 0.3 % v / v 용액을 준비한다. 고정 마이크로 TENNs가 들어있는 페트리 접시에서 PBS를 제거하고 구조를 커버하는 0.3 % 세제 솔루션의 충분한 볼륨을 추가합니다. 18-24 및 60 분에 60 분 동안 담그십시오.176 ℃에서 세포를 투과시킨다.
  6. 피펫으로 세제 용액을 제거하십시오. PBS를 넣고 뺀 다음 두 번 빨리 헹구십시오. 그 후에, 각 헹구기 동안 5 분 동안 PBS에 구조물을 담가서 세 번의 긴 헹굼을 수행하십시오.
  7. 4 % 말 혈청에서 1 차 항체를 희석하십시오. 고정 및 permeabilized 마이크로 TENNs을 포함하는 페트리 접시에서 PBS를 제거합니다. 완전히 커버하기 위해 마이크로 컬럼에 충분한 1 차 항체 용액을 첨가하십시오. 증발을 막기 위해 파라 필름으로 페트리 접시를 밀봉하고 4 ° C에서 밤새 (12-16 시간) 배양하십시오.
  8. 접시에서 일차 항체 용액을 제거하고 4.6 단계에서 설명한대로 헹구십시오. 어둠 속에서 4.0 % 말 혈청에서 2 차 항체 용액을 준비하십시오. 충분한 이차 항체 솔루션을 추가하여 구조물을 완전히 커버하고, 알루미늄 호일로 접시를 덮고 18-24 ° C에서 2 시간 동안 배양하십시오.
  9. 핵을 얼룩이 PBS에 Hoechst 솔루션 (1 : 10,000)을 준비합니다.
  10. 참고 : immunolabeled 마이크로 TENNs에 대한 이미지는 2,048 (~ 8 초 / 프레임), 10X 대물 렌즈 (0.64 μm / 픽셀), 487 nm 여기 및 ~ 525 nm 방출 파장의 해상도를 가진 레이저 공 촛점 현미경으로 촬영했습니다. 녹색 형광, 561 nm 여기 및 적색 형광에 대해서는 ~ 595 nm 방출 파장, z 스택에 대해 평균 ~ 60 슬라이스로 ~ 3.22 μm / 슬라이스.

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Representative Results

Micro-TENN은 위상차 현미경을 사용하여 모니터하여 세포 구조 및 축색 돌기를 평가했습니다 ( 그림 4 ). 단방향, 2mm 길이의 마이크로 -TENN 내에서, 뉴런 집합체는 마이크로 - 컬럼의 한쪽 말단으로 제한되고 내부 코어를 통해 축색 돌기가 투영되었다. Axons 은 체외에서 5 일 (DIV) ( 그림 4A ) 열의 전체 길이를 스팬. 축색 돌기가 3 DIV ( 그림 4B )에 의해 전체 마이크로 컬럼을 스팬하기 때문에 양방향 2 mm 길이의 마이크로 TENN에서 더 큰 초기 축삭 성장 속도가있었습니다. 5 DIV에 의해, 양방향 micro-TENNs는 마이크로 컬럼의 극단에서 유지 된 응집체를 연결하는 조밀 한 축삭 덩어리를 특징으로했다. 이 cytoarchitecture는 5-DIN micro-TENNs에서도 관찰되었으며 축색 돌기는 5-DIV로 마이크로 컬럼에 걸쳐있다 ( 그림 4C ). 모든 경우에 관찰 된 바와 같이, 루멘의 ECM 및 기하학적 restri아가로 오스가 제시 한 ction은 구조적으로 원시 신경 조직의 특징을 모방하는 축삭 영역을 형성하는 데 필요한 방향성을 제공했습니다.

Immunocytochemistry 기술은이 프로토콜에 적용되었으며 공 촛점 이미지는 마이크로 TENN 아키텍처의 구성 요소를 확인하기 위해 찍은. Hoechst (청색)로 염색 된 세포 핵은 내부에서만 Hoechst 염색이 거의 없었던 단방향 및 양방향 마이크로 컬럼의 극단에서 거의 골재 내에서만 국한되었습니다 ( 그림 5 ). 이 관찰은 위상 대비 이미지에서 추론 된 것을 확인해주었습니다. 연결 인구는 끝으로 제한되고 축색 만 (빨간색으로 표시)은 마이크로 TENN의 루멘을 스팬했습니다. 그러나, 축삭이 골재를 가로 지른 후에, 28mm DIV의 내부에서 핵 (파란색)의 존재에 의해 관찰 된 바와 같이, 축 방향 길이를 따라 세포 내막이 내강으로 관찰되었다.마이크로 마이크로 TENN ( 그림 6 ). 또한, synapsin I immunolabeling (녹색)은 세포체와 axonal tracts에서 발견되었다 ( 그림 6 ). Synapsin I은 신경 전달 물질 방출 조절에 관여하는 시냅스 전 말단 단백질이며 점적 분포에서 발견 될 때 시냅스 전 말단의 존재를 나타냅니다. 이전에는 전체 세포 패치 기록 49 에 의한 활성 시냅스의 형성과 관련되어있었습니다. 마이크로 TENN의 축색 돌기가 풍부한 중앙 구역에서의 시냅스 염색은 아마도 시냅스와 시냅스가 결합되어 시냅스 전 말단으로 축삭 아래로 운반된다. 그럼에도 불구하고 마이크로 TENN 집합체 내에 synapsin puncta가 존재 함으로 시냅스를 통해 전달할 수있는 능력을 가지고 있음을 시사한다. 시냅스 후 단백질과 시냅스 단백질의 동시 발현은 기능적인 시냅스의 구조적 증거를 필요로한다./ p>

Micro-TENN은 또한 GCaMP6f 칼슘 지시약을 함유 한 AAV로 형질 전환 된 뉴런 집합체로 조작되어 이들 구조의 전기 생리 학적 성질을 예비 조사 하였다. 이러한 구조는 뉴런 집계와 axonal 지역 ( 그림 7A ) 모두에서 형광으로 표시, 그들의 전체 길이에 걸쳐 칼슘 표시기를 표현. 응집체의 강도를 최대화하기위한 현미경 설정으로 인해 axonal tracts의 형광은 더 희미하게 보였다. 이러한 형질 도입 된 마이크로 TENN은 고속 형광 현미경 (외부 전기 자극이없는)으로 시간이 지남에 따라 분석되었으며, 이들의 신호 용량을 특성화하기 위해 대표적인 마이크로 TENN에서 임의의 셀 크기의 관심 영역 (ROI)을 무작위로 선택했습니다 구조. 거의 모든 ROI에서 칼슘 농도의 폭발이 관찰되었으며,시간이 지남에 따라 변동하는 형광 세기를 발생시켰다 ( 도 7B ). 특히, 다양한 ROI는 칼슘 농도 증가에 거의 일정한 주기성을 보였다 ( 그림 7B ). 이러한 칼슘 농도의 변화는 자발적이고 고유 한 활동 전위, 개별 응집체 내에서의 세포 신호 전달 및 / 또는 별개의 응집체로부터 축삭을 통한 신호 전달의 결과로 추측됩니다. 더 자세한 분석은 마이크로 TENNs 내의 뉴런과 axonal 지역의 electrophysiological 속성을 완벽하게 특성화하는 데 필요합니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 초기 결과는 마이크로 TENN이 강력한 내인성 /베이스 라인 전기 활동을 나타냄을 보여줍니다.

그림 3
그림 3 : 레이저 컷 마이크로 컬럼 제조 장치의 청사진과 세포 응집을위한 3D 인쇄 피라미드 마이크로 우물 곰팡이. ( A) - ( B ) 각각 하이드로 겔 미세 기둥을 제작하는 데 사용되는 원통형 채널 어레이의 아래쪽과 위쪽의 청사진과 이미지. ( C ) 청사진과 함께 장치를 잡는 데 사용되는 모자의 이미지. 앞과 뒤 조각 모두 같은 치수를 가지고 있습니다. ( D ) 마이크로 컬럼을 제조하는 데 필요한 조립 된 장치의 이미지. 두 개의 캡과 아래쪽 절반 만 아래쪽 두 개의 정렬 구멍 (왼쪽)에 나사로 고정되어 있습니다. 파선은 각 캡의 다섯 구멍을 통해 침침 바늘을 배치 한 모습입니다. 액상 아가로 오스를 실린더의 아래쪽 반쪽에 넣고, 그 후 상단 절반 (오른쪽)을 장치 위에 올려 액체 아가로 오스를 모양으로 만듭니다. ( E ) PDMS 마이크로 우물 어레이를 만드는 데 사용되는 3D 인쇄 된 금형의 청사진. ( F ) 3D 인쇄 된 금형의 이미지 (왼쪽)와 PDMS 마이크로 우물 어레이 (오른쪽). 모든 치수는 밀리 단위입니다. 미터 (mm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : 체외 에서 일의 함수로서 단방향 및 양방향 구조의 위상 - 조영 이미징에 의한 마이크로 TENNS의 axonal 성장 관찰 . ( A ) 단방향 2mm 길이의 마이크로 TENNs는 마이크로 컬럼의 거의 전체 길이를 5DIV만큼 연장하는 축색의 영역을 보여줍니다. ( B ) 단방향 마이크로 TENN에 비해 양방향 2mm 마이크로 TENN은 빠른 축삭 성장 속도를 나타냅니다. ( C ) 5 밀리미터 양방향 마이크로 TENNs, axonal 지역은 5 DIV에 마이크로 칼럼의 길이를 채 웁니다. 이 아키텍처는 적어도 10 DIV까지 유지됩니다. 스케일 바 = 200 μm./ftp_upload/55609/55609fig4large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : 면역 표지 된 단방향 및 양방향 micro-TENN의 공 촛점 이미지로 관찰 된 Micro-TENN 세포 구조. 세포핵 (Hoechst; 청색) 및 축색 돌기 (Tuj1; 적색)에 대해 세포를 염색 하였다. ( A ) 5mm 양방향 마이크로 TENN (28 DIV)의 위상차 이미지. 5 mm 양방향 (28 DIV) 및 단방향 (25 DIV) 마이크로 TENN의 공 촛점 재구성 ( D ) - ( F ) 및 ( I ) - ( K )는 표지 된 세포 핵 ( D ), 및 축색 ( E ), ( J ) 및 오버레이 ( F ), ( K ). 스케일 바 : 500 μm. 인서트 ( A B ) - ( C ) 및 공 초점 ( G ) - ( H ), ( L ) - ( M ) 줌 - 인 (neuronal aggregates and axonal tracts) . 이미지는 micro-TENN의 끝으로 제한된 응집체를 보여 주며, 루멘은 정렬 된 축색 영역에 의해 뻗어있다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6 : 대표적인 양방향 micro-TENN에서 시냅스 전 단백질 synapsin I의 발현. 생성물은 세포핵 (Hoechst; 청색), 축삭 (Tuj1; 적색) 및 시냅스 전 부대 (시냅스 I; 녹색)에 대해 염색되었다. ( A ) 위상 제어기28 DIV에서 2 mm 양방향 micro-TENN 이미지 ( D ) - ( G ) 세포 핵 ( D ), 축삭 ( E ), 시냅스 이전 부 튼 ( F ), 그리고 세 채널의 오버레이 ( G )를 보여주는 공 촛점 재건. 상자는 각각의 연결 집합에 대한 위상 - 대비 및 오버레이 이미지의 확대 / 축소 ( B ) - ( C ), ( H ) - ( I )를 보여줍니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
도표 7 : 양방향 마이크로 TENN에서 자발적 신호 활동은 유 전적으로 코딩 된 칼슘 지시약의 발현을 통해 관찰됩니다. ( A ) Fluorescenc전자 현미경으로 응집체와 축색 돌기 전체에서 형광으로 관찰 된 GCaMP 리포터의 발현이 확인되었다. 스케일 바 = 100 μm. ( B ) 칼슘 농도 변화와 관련된 형광 변화는 시간에 따라 여러 관심 영역 (ROI)에서 외부 자극없이 측정되었습니다. ( A )의 번호가 매겨진 색깔의 원은이 ROI를 지정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8
그림 8 : 마이크로 TENN 방법론의 일반적인 실패 모드 이미지. ( A ) 제조의 초기 단계에서 DPBS의 제거 및 / 또는 증발의 결과로 완전 탈수 / 건조 된 아가로 오스 마이크로 컬럼. 스케일 바 = 5081; m. ( B ) 하이드로 겔 미세 기둥과 침술 바늘과 모세관과의 동심 정렬이 이루어지지 않아 외벽을 감싸는 내강. 스케일 바 = 100 μm. ( C ) 1 DIV에 존재하는 두 응집체를 갖는 시드 마이크로 TENN. ( D ) 집계 중 하나는 3 DIV에서 ( C )와 동일한 마이크로 컬럼에서 떨어졌습니다. ( E ) 단방향 마이크로 TENN 4 DIV. ( F ) 집계 및 axonal 지역은 ( E )에서 마이크로 컬럼에서 떨어졌고 5 DIV에서 문화 매체에 떠있었습니다. ( C ) - ( E ) = 300 μm에 대한 스케일 바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

CNS 손상 및 질병은 전형적으로 부수적 인 신경 세포 변성의 유무에 관계없이 뇌 결합체를 구성하는 장거리 축삭 경로의 손실 또는 기능 부전을 야기한다. 이것은 신경 발생 및 재생을 촉진하는 CNS의 제한된 용량에 의해 합성됩니다. 성장 인자, 세포 및 생체 물질 전달과 같은 수복 전략을 개별적 또는 조합 적 접근으로 추구 함에도 불구하고 이러한 기술은 신경 세포의 퇴행과 축삭 연결의 손실을 동시에 설명하지 못한다 14 , 22 . 이러한 기술 격차는 통제되고 지속적인 방식으로 신경망을 수리, 변경 및 조사하는 능력을 제한합니다. 따라서 마이크로 TENN 기술은 기존의 방법과 달리 신경 교체 및 긴 축삭 연결 재건을 용이하게하는 신경 치료 전략의 필요성을 해결하기 위해 개발되었습니다. 마이크ro-TENN은 숙주 신경 회로의 표적 재구성, 교체 및 변형을 위해 특별히 설계된 뇌 결합체의 시스템 수준 빌딩 블록에 접근하는 예비 형성된 세포 구조를 갖는 이식 가능한 살아있는 발판이다. 이러한 비계는 미니어처 원통형 아가로 오스 하이드로 겔의 ECM- 함유 루멘 내에서 긴 축삭 영역에 의해 연결된 뉴런의 이산 집단으로 구성된다. 이러한 구조는 잃어버린 경로를 대체하고 네이티브 회로를 동적으로 변조하기위한 시냅스 릴레이로서 기능 할 수 있습니다. 또한, 축삭 변성이 고립 된 경우 (근원 뉴런은 손상되지 않음), 마이크로 TENN은 아마도 축색 돌기 촉진 축삭 재생 메커니즘에 기초한 축삭 재생 가이드 역할을 할 수있다. 이 원고는 제어 된 기하학, 표현형 및 기능적 특성을 가진 마이크로 TENN을 안정적으로 생성하기위한 제작 프로토콜을 제시했습니다. 위상차 현미경, 면역 세포 확대stry 및 공 촛점 현미경 검사는 프로토콜로 생산 된 마이크로 TENNs가 필요한 cytoarchitecture을 전시하고 사전 시냅스 말단 단백질 synapsin을 표현 것을 보여 주었다. 또한 마이크로 TENN은 외부 시뮬레이션이 없을 때 활동 전위로 인해 고유의 신호 전달 활성을 가지고있는 것으로 나타났습니다. 이것은 유 전적으로 암호화 된 칼슘 리포터와 관련된 형광의 거의 동시적인 변동의 존재에 의해 확인되었습니다.

Micro-TENN 발달은 (1) 중공의 하이드로 겔 튜브의 제작, (2) 튜브의 루멘에 ECM 용액을 첨가하는 것, (3) 분리 된 뉴런의 응집체를 튜브의 끝. 미세 기둥은 유리 모세관 또는 원통형 채널을 포함하는 미세 가공 된 장치로 제작할 수 있습니다. 이 장치는 조사자가 사용할 수있는 고정밀 마이크로 제작 방법으로 만들 수 있습니다. 액체아가로 오스는 장치의 채널 또는 하이드로 겔 마이크로 - 칼럼을 생성하기위한 중앙의 침침을 포함하는 모세관에 부어진다. 아가 로스 겔화 후, 경혈을 만들기 위해 침침을 제거한다. 제조 또는 성장 중에 발생하는 몇 가지 일반적인 함정이 그림 8 에 강조 표시되어 있습니다. 그림 4표시된 일부 이미지와 그림 8B 의 극단적 인 경우는 실린더의 벽에 불확실하게 가까운 관강 부분을 보여줍니다. 모세관 방법을 사용할 때 균일 한 벽 두께를 생성하려면 아가로 오스와 접촉 할 때 튜브 - 바늘 어셈블리를 똑바로 세워야하며 바늘은 튜브의 중앙에 유지되어야합니다. 튜브 - 바늘 조립체를 아가로 오스 표면에 대해 일정한 각도로 유지하면 바늘의 분산이 촉진됩니다. 그럼에도 불구하고, 이러한주의 사항은 실행하기 어렵고, 바늘은 자주 쉬는 것보다 더 자주 있습니다g 모세관 튜브의 벽. 반대로, 마이크로 가공 된 장치의 주요 자산은 원통형 채널과 동심원으로 정렬 된 바늘 구멍을 특징으로하며, 각각 바늘과 루멘이 채널과 마이크로 컬럼에 상대적으로 적절하게 집중되도록 촉진합니다. 또한이 장치는 동시에 여러 마이크로 컬럼의 제조를 용이하게함으로써 처리량을 증가시킵니다. 장치가 제공하는 이점에도 불구하고 구부러진 침침을 사용하여 중심에서 벗어난 내강을 만들 수 있습니다. 마이크로 - 제조 기술은 또한 그 효과를 제한하는 내재 한 공차를 가지고있다. 일반적으로 그림 8A 에 극단적 인 경우가있는 마이크로 칼럼 탈수는 프로토콜을 통해 제공된 권장 사항을 준수하는 것이 방해가되어서는 안된다. 외부 encasement에 사용되는 아가로 오스의 물리적 속성은 개선 된 대뇌 피질 뉴런으로 대체 뉴런 아형에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다(3-4 %) 대 낮은 (1-2 %) 아가로 오스 농도에서 urvival과 neurite의 번식이 관찰되었다.

Micro-TENN 개발은 마이크로 기둥 루멘에 ECM을 도입함으로써 계속 이어지며, 이는 신경 부착, 생존 및 성장에 적합한 환경을 제공하는 역할을합니다. 또한, ECM은 아가 로스 하이드로 겔에 의해 제공되는 기하학적 제한 및 낮은 다공성과 함께 필요한 구조를 생성하기 위해 축 방향 성장을 종 방향으로 제한합니다. ECM 솔루션의 내용은 사용 된 뉴런 유형에 맞게 최적화 할 수 있습니다. 예를 들어 콜라겐은 DRG micro-TENN에서 생존과 축삭 성장을 촉진하는 반면 콜라겐과 라미닌의 조합은 대뇌 피질 뉴런에 필요합니다 10 . 또한, micro-column 내에서의 ECM 중합은 세포가 재생되기 전에 중요합니다. ECM이 중합되지 않은 세포를 공동 전달하면 신경 돌기의 수가 감소합니다허풍과 연대 31 . micro-column이 ECM 용액으로 채워지더라도 그 내용물은 부드러운 젤로 중합되어 잠복기 동안 수축되어 세포 응집체의 삽입을 허용하는 공간을 만듭니다. 또한 ECM이 입체경 아래에서 검사하여 마이크로 컬럼 내부로 들어 갔는지 확인하는 것이 중요합니다. 완전한 ECM 부재 및 / 또는 주머니는 응집체로부터의 축색 돌기 (axonal outgrowth)의 결핍을 가져온다. Micro-TENN 제작은 발판의 극단에서 피질 뉴런 집합체의 파종으로 최고조에 달합니다. 이 뉴런은 알려진 절차를 사용하여 래트 태아에서 해부되었다. 격리에 사용 된 임신 기간의 배아 쥐 피질은 99 % 뉴런으로 구성되어 있고, 프로토콜에 사용 된 정의 된 배양 배지는 신경 교세포의 증식을 위해 대사 적으로 제한하기 때문에 고립 된 세포의 대부분은 뉴런이라고 추정 할 수 있습니다 49 . 결과적으로 확인을 위해 특정 마커를 염색해야하지만 글 리아 오염이 최소화되어야합니다. 이 원고가 대뇌 피질 뉴런을 이용한 마이크로 TENN 제작을 제시하는 반면, 다른 뇌 영역 ( 예 : 흑질, 시상 및 해마) 또는 상이한 표현형 ( 예 : 흥분성, 억제 성 및 도파민 성)의 뉴런을 원하는 응용 분야 및 주입 영역. 마이크로 TENN 제작 프로토콜의 이전 반복에는 해리 된 세포를 파종하는 것이 포함되었다 ( 10 , 31 , 32) . 해리 된 방법을 사용하여 원하는 구조가 얻어졌지만 모든 경우에 달성되지는 않았습니다. 많은 경우 해리 된 세포가 내부로 침투하여 내강 전체에 여러 개의 세포 덩어리가 형성되었으며, 광범위한 3D 네트워크에서 이들을 연결하는 과정이있었습니다반면에 집계 방법은 극한까지 세포체를 봉쇄하는 것을 보장하므로 micro-TENN 기술의 성공에 필수 불가결하다. ( 그림 5 ) 대표적인 micro-TENNs는 도 4-6 에서와 같이 완전히 삽입되지 않은 더 큰 응집체로 제조되었으며, 이는 때때로 도 8D8E에 도시 된 예와 같이 배양 물의 미세 기둥으로부터 떨어지는 응집체를 초래할 수 있다 .이를 방지하기 위해 응집체는 마이크로 컬럼 내부에 완전히 삽입 될 수있다. 이러한 상황이 이전의 전략을 적용한 후에도 나타난다면, 초기 잠복기가 연장되어 ECM에 응집체 접착을위한 충분한 시간을 제공 할 수있다. 배양 중에 마이크로 TENN의 부드러운 취급은 하이드로 겔 용기 및 세포 구조의 완전성을 유지하기 위해 권장되며 마이크로 T 동안의 문제ENN 조작은 달리 정렬 된 축색 영역에서 얻어진 곡률의 원인입니다 ( 그림 5 ). 그럼에도 불구하고,이 기사에서 제시된 프로토콜을 따르면 예상되는 신경 / 축색 구조, 시냅스 이전의 부톤 분포 및 고유 한 전기적 활동으로 마이크로 TENN을 일관되게 제작해야합니다.

마이크로 TENN이 보유하고 있다는 약속에도 불구하고이 기술의 적용을 제한 할 수있는 과제가 남아 있습니다. 현재의 마이크로 컬럼 제조 기술은 마이크로 칼럼 내강의 분산에 의해 제한되며, 이것은 세포에 대한 기계적 단서 ( 예 : 강성)의 불일치 제시, 마이크로 컬럼 벽의 파열 및 후속적인 축삭 영역의 노출을 야기 할 수있다 외과 및 이식시 문제가 있습니다. 미세 가공 된 장치의 사용으로 모세관에 비해 결과가 향상되었지만,보다 정밀한 미세 가공이러한 기술의 차원 재현성을 높이기위한 기술이 필요합니다. 이 원고의 결과는 micro-TENN 방법론이 원시 신경 조직, 특히 뚜렷한 뇌 영역을 연결하는 축삭 영역과 유사한 뉴런 및 축삭 영역으로 구성된 살아있는 발판을 안정적으로 생산할 수 있음을 보여주었습니다. 그럼에도 불구하고 micro-TENN 길이는 교체해야 할 숙주 축삭 경로의 길이에 따라 장애물입니다. 예를 들어, 조직 공학 신경 이식 (TENGs)은 극도로 긴 신경 부상을 치료하기 위해 연구 그룹에서 활용하는 별도의 살아있는 발판 전략입니다. 이러한 긴 간격을 대체하기 위해 TENGs의 축삭은 주문형 메커 바이오 리액터 1 , 23 , 50 에 지속적인 기계적 인장력을가함으로써 수십 센티미터까지 길어질 수 있습니다. 이 "스트레치 성장"기술은 또한 bette에 astrocytic 프로세스 길이를 조작하는 데 적용되었습니다r 방사형 glial 경로의 구조를 모방 51 . 반대로, 현재의 마이크로 TENN 기술은 아직 이러한 통제 범위를 제공하지 못한다. 도달 가능한 최대 길이는 현재 전통적인 성장 - 콘 - 매개 확장 기초하여 생체 내에서 축삭 영역이 성장할 수있는 기간에 의해 제한된다. 더욱이, CNS가 다양한 자극에 대한 신경 생리 학적 재 배선을위한 고유의 능력을 가지고 있고, 이식 된 세포는 자연 회로와의 시냅스 적 통합 능력을 가지고 있지만,이 기술의 또 다른 한계는 마이크로 TENN이 원주민 뇌의 가소성에 의존한다는 것이다 및 호스트 네트워크가 이식 구조물 (52 , 53 , 54 , 55 ) 과 기능적으로 통합 할 수 있는지 여부를 결정한다. 마지막으로, 마이크로 TENN과 같은 모든 임플란트 기반 접근법의 본질적인 결함은 침입성입니다. 뉴런은일반적으로 모세 혈관에 근접하여 어떤 형태의 외과 수술이라도 뇌 혈관 장벽의 파열, 뇌 실질 내로의 혈액 인자 누출 및 급성 (심지어 만성) 염증 반응을 유발할 수 있습니다 31 . 이 반응은이 기술의 유리한 측면을 부정하는 호스트 및 마이크로 TENN 뉴런을 손상시킬 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 랫드의 대뇌 피질 경로에 이식 된 마이크로 TENNs는 적어도 1 개월 동안 생존하고 숙주 대뇌 피질과의 구조적 통합의 증거를 보였다. 또한, 우리 연구 그룹의 이전 간행물은 쥐의 뇌에 마이크로 TENNs의 바늘없는 삽입을 가능하게하는 방법론을 제시했다. 그 접근법에서,이 하이드로 겔 캡슐화 전략은 약한 탈수시에 침투하기에 충분한 강성을 나타내는 카르복시 메틸 셀룰로오스의 얇은 (약 20 ㎛) 코팅을 포함하도록 증가되었다바늘이나 가이드가 필요없는 뇌 31 . 마이크로 칼럼의 작은 횡단면과 결합 된이 바늘없는 삽입 방법은 정위 주입 과정 동안 및 후에 뇌에 대한 손상을 최소화해야합니다.

생체 내 마이크로 TENN의 예비 성공에도 불구하고, 미래의 연구는 이러한 구조가 원시 조직과 시냅스 통합되는지 확인하고 기능적 회복이 CNS 손상 및 신경 퇴행성 질환 모델에서 획득되는지 여부를 조사해야 할 것이다 10,31. 예를 들어 맞춤형 마이크로 TENN은 특정 세포 표현형으로 설계하고 네트워크를 재구성하고 기능을 복원하기 위해 해당 퇴보 경로에 이식 될 수 있습니다. 이식 후 급성 염증 반응을 줄이기 위해 micro-TENN 하이드로 겔 껍질에 항 염증 및 생존 촉진제를 도핑 할 수 있습니다. 대체 제조루멘의 일관된 집중화 및 치수의 재현성을 포함하여 더욱 용이하고보다 정확한 특징으로 하이드로 겔 미세 기둥을 생성하는 기술 ( 예 : 3D 인쇄)을 개발할 수 있습니다. micro-TENNs와 함께 사용 된 동일한 생체 재료 설계는 CNS 손상 및 질병의 다른 특징적인 병리를 다루기 위해 변형 될 수있다. 예를 들어, 우리 그룹은 이전에 구조적으로 축 방향의 glial 경로를 모방하는 아가로 오스 하이드로 겔의 콜라겐 코팅 루멘을 따라 종 방향으로 정렬 된 성상 교세포와 축삭 재생 및 신경 세포 이동을 촉진하는 신경관으로 구성된 구조물을 개발했습니다. 또한, 인간 배아 줄기 세포 (HESCs), 유도 다 능성 줄기 세포 (iPSCs) 및 지방 유래 줄기 세포 (ASCs)와 같은 줄기 세포를 통합하여 환자 당 기준으로자가 마이크로 TENN을 더 많이 만들 수 있습니다 잃어버린 세포 구조와 세포 표현형과 매우 유사합니다. 이 futu재조합은 생체 내에서 퇴행성 경로를 대체 할 마이크로 -TENN의 능력을 증가시킬 것이며, 다른 특징들 중에서도 성상 세포 지원 및 축삭 수초 형성을 포함하는보다 정교한 조직 구조의 재구성을 허용 할 것이다. 유 전적으로 조작 된 뉴런은 영양 인자의 방출을 통해 micro-TENNs의 재생 작용을 증가 시키거나 light-gated ion channels의 optogenetic 자극에 의한 CNS의 조절을 가능하게하기 위해 파종 될 수있다. 이러한 발판은 간질, 우울증, 약물 중독 또는 통증 장애와 같은 조건에서 기존의 기능 장애가있는 숙주 연결을 시냅스 조절하기 위해 흥분성 또는 억제 성 뉴런으로 제조 될 수 있습니다 1 . 예를 들어, 주로 GABA 성 또는 글루탐산 작용 성 시냅스를 형성하는 미세 TENN은 시냅스 통합 및 / 또는 벌크 신경을 통해 각각 상향 또는 비 조절 경로를 억제 또는 자극하도록 구성 될 수있다송신기 방출. 중요한 것은 이러한 자 급식 변조 구조는 이론적으로 호스트 - 네트워크 피드백 1을 기반으로 반응 적입니다. 마찬가지로, 마이크로 TENN은 뇌와 무기 자극 또는 기록 장치 사이의 중간체 역할을하는 광학 유전 공학으로 설계된 마이크로 TENN과 함께 뇌 - 컴퓨터 인터페이스 (BCI)로 적용될 수 있습니다. 이 응용 프로그램은 특정 세포 타겟팅 및 기계적 안정성이 부족하고 염증 반응, glial 흉터 형성, 그리고 신경 세포의 마이 그 레이션 또는 손실을 뇌에 침투했을 때 microelectrode BCIs의 대안이 될 수 있습니다 57 , 58 .

시험관 시험대에서 마이크로 TENN은 신경 생물학 및 전기 생리학 연구를위한 강력한 플랫폼을 제공하여 신경계의 바이오 피델 모델로 사용됩니다. 또한, 3D 구조물은 신경 주입 장치로 사용될 때 치료 전략의 테스트 베드 역할을 할 수 있습니다ury 및 질병 모델 59 . 3D 구조물로서 마이크로 TENN은 평면 세포 배양에서 정확하게 표현할 수없는 모든 공간 방향에서 복잡한 세포 - 세포 및 세포 -ECM 상호 작용을 특징으로하는 생체 내 환경을 시뮬레이션 할 수 있습니다 42 , 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65 . 실제로 수많은 유형의 환경이 세포가 형태, 증식, 이동, 유전자 발현, 분화 및 네이티브 환경에서 나타나는 신호 전달을 나타내는 데 결정적으로 중요하다는 사실이 입증되었습니다. 이러한 인공 지지체의 3D 환경과 뇌 자체의 유사점은 이러한 구조물이 신체적 및 생화학 적 특성에 대해 제공하는 통제 정도에 의해 보완됩니다오티 42 . 이것은 신경 신호 생존, 성숙, 축색 연장, 시냅스 생성 및 mechanotransduction 32 , 42 , 63 에 개별적으로 또는 synergistically 이러한 단서의 효과를 연구하기 위해 기계적, haptotaxic, 그리고 chemotaxic 신호의 다른 세트와 마이크로 TENNs의 공학 수 있습니다. 또한,이 미세 조직 공학 기술의 설계 유연성은 connectome의 축삭 덩어리가 뻗어있는 대뇌 피질의 원주 형, 구획화 된 구조와 같은 뇌 조직의 다른 특징을 모방 한 살아있는 발판을 건설 할 수있게하여 뇌를 연구하기위한 시험관 플랫폼 으로서의이 시스템의 힘 65 . 연구 플랫폼으로서 마이크로 TENN은 전형적인 시험 관내 모델의 통제 된 설정, 조직 en의 디자인 매개 변수의 광범위한 가용성3D 플랫폼의 생리 학적 및 병태 생리 학적 관련성이 증가하여 신경 생물학 지식을 발전시키는 이상적인 시험대가 될 수 있습니다. 이 기술의 미래 방향은 마이크로 TENN의 다양성을 보여줍니다. 이 원고는 마이크로 TENN 프로토콜이 뇌 신경 조직의 중요한 특징을 모방 한 조직 공학 살아있는 발판을 안정적으로 생산하여 발달, 질병 및 회복 과정을 포함한 신경 생물학적 현상에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 구조물은 또한 손상된 백색질 영역을 재구성하고, 손실 된 신경 세포를 대체하고, 중추 신경계 손상 및 질병 후 조절되지 않은 경로를 조절하기 위해 원시 조직과 시냅스 적으로 통합 될 수있다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

재정 지원은 U01-NS094340 (컬린), T32-NS043126 (해리스), F31-NS090746 (카티 야), 마이클 J. 폭스 재단 (치료 파이프 라인 프로그램 # 9998 (컬린) (Cullen), 미국 과학 재단 (대학원 연구 동창 DGE-1321851 (Struzyna and Adewole)), Veterans Affairs (RR & D Merit Review # B1097-I (Cullen)), Penn Medicine 신경 과학 센터 파일럿 상 신경 외과 의사 및 신경 외과 의사 회의 (2015-2016 년 신경 외상 및 중환자 실에서의 코닥 개인 연구 (Petrov)) 및 미 육군 의학 연구 및 물질 명령 (# W81XWH-13-207004 (컬른) 및 W81XWH- 0466 (컬른)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laser cutter Universal Laser Systems PLS4.75 Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold.
Laser-cut micro-column fabrication device Custom-made -------------- Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Screws -------------- -------------- #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Nuts -------------- -------------- #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Acupuncture needle (180 µm diameter) Lhasa Medical sj.16X40 The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish Fisher 08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Invitrogen 14200075
Polystyrene disposable serological pipet Fisher 13-678-11D
Agarose Sigma A9539-50G
Capillary tube (398 µm diameter) Fisher 21170D The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Hot plate Fisher SP88857200
Magnetic bar Fisher 1451352
Micropipette Sigma Z683884-1EA
25 mm gauge needle Fisher 14-826-49
Microscalpel Roboz Surgical RS-6270
Scissors Fine Science Tools 14081-09
Forceps World Precision Instruments 501985
Hot bead sterilizer Sigma Z378550-1EA
Stereoscope Nikon SMZ800N Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication.
Rat tail type I collagen Corning 354236 Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube Fisher 02-681-256
Mouse laminin Corning 354232 Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Neurobasal medium Invitrogen 21103049 Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher SS2661
Hydrochloric acid (HCl) Fisher SA48-1
Litmus paper Fisher 09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS) Invitrogen 14170112 Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I Sigma 10104159001 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 Supplement Invitrogen 12587010 Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine  Invitrogen 35050061 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Sprague Dawley embryonic day 18 rats Charles River Strain 001
Pasteur pipette Fisher 22-042816
15 mL centrifuge tube EMESCO 1194-352099
Vortex Fisher 02-215-414
Centrifuge Fisher 05-413-115
Hemocytometer Fisher 02-671-6
Objet30 3D-Printer Stratasys  -------------- Used to fabricate the pyramidal micro-well molds.
3D-printed pyramidal well mold Custom-made -------------- Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent Fisher NC9285739 Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood.
Funnel Fisher 10-348C
1 ml pipette bulb Sigma Z509035
Micro-spatula Fisher S50821
12-well culture plate EMESCO 1194-353043
Oven Fisher 11-475-154
Incubator Fisher 13 998 076
AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 UPenn Vector Core 36373 Store at -80ºC. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator.
Formaldehyde 40% Fisher F77P-4 Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container. 
Triton X-100 Sigma T8787 Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes.
Horse serum Gibco 16050-122
Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody Sigma T8578-200UL Store at -20ºC.
Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody Synaptic Systems 106-001 Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody Invitrogen A10037 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody Invitrogen A21206 Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride Invitrogen H3570 Store at 4ºC.  Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen.  Therefore, it must be disposed of in a separate container.
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope  Nikon -------------- Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope  Nikon -------------- Used for taking the phase-contrast images.  With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).
High-speed Fluorescence Microscope Nikon -------------- Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging.
NIS Elements AR 4.50.00 Software Nikon Instruments -------------- Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope. 

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