Sinir Sistemi Yeniden Yapılanma, Modülasyon ve Modelleme için Anatomik olarak İlham Almış Üç Boyutlu Mikro-Dokulu Mühendisli Sinir Ağları

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu el yazması, mikro-doku ile tasarlanmış sinir ağlarının imalatını ayrıntılarıyla anlatmaktadır: boru biçiminde bir hidrojel içine konan agrega nöronal popülasyon (lar) yı kapsayan uzunlamasına hizalanmış aksonal yollardan oluşan üç boyutlu mikron boyutlu yapılar. Bu canlı iskele, sinirsel devreleri yeniden yapılandırmak veya modüle etmek için fonksiyonel röleler veya gri-beyaz madde nöroanatomisini taklit eden biyofiziksel test yatakları olarak işlev görebilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Struzyna, L. A., Adewole, D. O., Gordián-Vélez, W. J., Grovola, M. R., Burrell, J. C., Katiyar, K. S., Petrov, D., Harris, J. P., Cullen, D. K. Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling. J. Vis. Exp. (123), e55609, doi:10.3791/55609 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fonksiyonel düzelme nörojenez için inhibe edici ortam ve sınırlı kapasite nedeniyle merkezi sinir sistemi (MSS) içindeki yaralanma veya hastalığa bağlı dejenerasyon sonrasında nadiren oluşur. Hasar gören SSS'de nöronal ve aksonal yol kaybını aynı anda gidermek için bir strateji geliştiriyoruz. Bu el yazması, mikro-doku mühendislik yapmış sinir ağları (mikro-TENN'ler), implante edilebilen nöronlar ve santimetre uzayabilen yüzlerce mikron çapında önceden oluşturulmuş bir hidrojel silindirin hücre dışı matrisi (ECM) lümenine hizalı aksonal yollardan oluşan implantasyon yapım protokolünü sunmaktadır uzunluğunda. Nöronal agregalar üç boyutlu kaplamanın uçlarına sınırlanır ve aksonal projeksiyonlarla yayılır. Micro-TENN'ler CNS yeniden yapılandırması için bir strateji olarak benzersiz bir konumdadır ve beyin bağlantılı sitrik mimarisinin özelliklerini taklit eder ve potansiyel olarak ağ değişimi için araçlar sağlar. NeuRonal agregalar eksik veya hasar görmüş devreyi restore etmek ve / veya modüle etmek için yeni fonksiyonel röleler oluşturmak üzere konakçı doku ile sinapslanabilir. Bu yapılar ayrıca, hücre yenilemesi ve aksonal yol bulma için gelişim mekanizmalarını kullanabilen, rejenerasyon durumuna dayanan sinerjik yapısal ve çözünür ipuçları sağlayan pro-rejeneratif "canlı iskele" olarak da işlev görebilir. Mikro-TENN'ler sıvı hidrojel, uzunlamasına merkezli bir iğne içeren silindirik bir kalıba dökülüp imal edilir. Hidrojel jelleştikten sonra iğne boşaltılarak içi boş bir mikro sütun bırakılarak çıkarılır. Nöronal yapışma ve aksonal gelişim için uygun bir ortam sağlamak için lümene bir ECM çözeltisi eklenir. Ayrışmış nöronlar, mikro sütunun bir veya iki ucunda hassas tohumlama için mekanik olarak toplanır. Bu metodoloji, beyin nöroanatomisinin özelliklerini yineleyebilecek uzun projeksiyonlu aksonal yollar içeren kendi kendine yeten minyatür yapıları güvenilir bir şekilde üretir. Synaptic immEtiketsiz ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri, mikro-TENN'lerin kapsamlı sinaptik dağılımına ve elektriksel aktiviteye sahip olduğunu ortaya koymaktadır. Sonuç olarak, mikro-TENN'ler, beyin yolaklarının hedefe yönelik nöroşirürji rekonstrüksiyonu için umut verici bir stratejiyi temsil eder ve nörobiyolojik olayları in vitro olarak incelemek için biyo-fidelik modeller olarak da uygulanabilir.

Introduction

Travmatik beyin hasarı (TBI), omurilik yaralanması (SCI), inme, Alzheimer hastalığı ve Parkinson hastalığı gibi merkezi sinir sistemi hastalıklarının (MSS) ortak bir özelliği, aksonal yolların ve nöronal hücrenin kopukluğudur Kayıp 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Örneğin, iskemik bir inme tedavi edilmezse, aksonların dakikada 7 mil akson hızında kaybolduğu tahmin edilir. Her yıl yaklaşık 1.7 milyon insanın her yıl ABD'de deneyimlediği TBI vakasında, aksonal bozulmalar travmadan sonra yıllar sonra devam edebilir, çünkü ilk hasar uzun vadede nörodejeneratif bir duruma neden olur 4 . Bu zararlı etkileri ağırlaştıran MSS ciddi ölçüde sınırlı bir kapaa sahiptirRejenerasyon için şehir 1 , 7 , 8 , 9 . Yaralanmadan sonra, uzak hedeflere yöneltilen rehberlik eksikliği, nörit büyümesini engelleyen miyelin ile ilişkili inhibitörlerin varlığı ve reaktif astrositler 8 , 10 , 11 , 12 tarafından bir glial skar oluşumu ile karakterize bir inhibitör ortam gelişir. Glial skar, yenilenmeye karşı biyokimyasal ve fiziksel bir bariyer görevi görür ve kondroitin sülfat proteoglikanlar gibi akson büyümesini engelleyen moleküller bulunur 8 , 11 . Dahası, yetişkin MSS'de sinir kök hücreleri bulunsa da, yeni nöronların üretimi sınırlıdır çünkü tutarlı nevrojenez bulgusu yalnızca koku alma ampulünde, hipokampalde bulunurSubgranular bölge, periventriküler alan ve omuriliğin merkezi kanalı 13 , 14 . Bu engeller, yaralanma ya da hastalığın ardından kayıp nöronların ve beyaz cevher mimarisinin işlevsel olarak iyileştirilmesini önler ve bu durumların yaşamı değişen ve uzayan etkileriyle sonuçlanır.

Yetişkin MSS'de rejeneratif kapasitenin olmamasına rağmen, konakçı nöronlarına 15 , 16 , 17 , 18 yeterli çevresel ipuçları verildiğinde aksonal rejenerasyonun mümkün olduğu gösterilmiştir. Araştırmacılar, büyüme faktörlerini ( örn., Sinir büyüme faktörü, epidermal büyüme faktörü, glial bağımlı büyüme faktörü ve nörotrofik faktör-3) ve diğer rehberlik moleküllerini, plastisite ve akson rejenerasyonunu uyarmak için sunmaya ve bunları manipüle etmeye teşebbüs ettiler14 ,/ Sup> 18 , 19 . Bu çalışmalar yetişkin aksonların büyüme faktörlerine cevap verebildiklerini doğrulasa da, bu stratejiler, kan-beyin bariyerinin düşük permeabilitesi ve rejenerasyonu teşvik etmek için gereken spesifik uzaysal ve zamansal gradyanlar ile sınırlandırılmıştır 14,18,19. Diğer yaklaşımlar, CNS nöronlarında rejenerasyona bağlı transkripsiyon faktörlerinin hiperaktivasyonuna dayanmaktadır. Örneğin, Stat3 transkripsiyon faktörünün aşırı ekspresyonu optik sinir 20'de aksonal rejenerasyonu uyardı. Bununla birlikte, hem biyomolekülün verilmesi hem de transkripsiyon faktörlerinin aşırı ekspresyonu kayıp nöronal popülasyonların yerini alamaz. Hücre temelli stratejiler esas olarak merkezi sinir sistemi kök hücrelerine (CNS nöronları) yer değiştirme kapasitelerinden yararlanarak merkezi sinir sistemi kök hücrelerine (NSC) nakledilmeyi, trofik faktörleri serbest bırakmayı,Ve yaralanma sonrası meydana gelen nörojenez girişimlerini desteklemek 17 . Buna rağmen, transplante nöral hücrelerin hayatta kalma, konakçıya entegre olma ve fiziksel olarak yaralı bölgeye 6 , 14 , 17 , 21 ile sınırlı kalma gibi engellenmiş yetenekleri de içeren bu yaklaşımı engelleyen zorlayıcı zorluklar hala var. Buna ek olarak, hücre iletiminin tek başına hasar görmüş ya da kaybolmuş aksonal yolların sitrik mimarisini eski haline getirememesi mümkündür. Hücre ve ilaç / kimyasal dağıtım stratejilerinin karşılaştığı problemleri ele alan alternatif bir yaklaşım, bu yaklaşımları biyomalzemelerin 14 , 22 , 23 kullanımı ile birleştirmektir. Hidrojenler gibi biyomalzemeler, hücre dışına matrisin (ECM) biyokimyasal ve fiziksel özelliklerini öykünme yeteneğine sahiptir ve hücre dağıtımına yardımcı olur veD sakat bölgede tutulması ve kontrollü salınımlı büyüme faktörleri ve diğer biyoaktif moleküller sağlanması 22 . Bu biyo materyal temelli stratejilerin çekici özellikleri, iskeleleri lezyon alanına 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 nakledildikten sonra in vivo aksonal rejenerasyon kanıtıyla sonuçlanmıştır. Bununla birlikte, hücresel olmayan biyomalzeme stratejileri kayıp nöronal popülasyonların yerini tutmaz; Nöronal, glial veya nöronal öncü hücreler için iletim araçları olarak kullanıldığında, biyomalzemeler uzun mesafeli aksonal ağları yeniden yapılandıramazlar. Hem aksonal patikada bozulma, hem de MSS hasarı ve hastalığına bağlı nöronal kaybı ele alan bir yaklaşım geliştirmenin zorluğu <Sup class = "xref"> 31.

Araştırma grubumuz, bir agaroz hidrojel-ECM mikro sütununun bir veya her iki ucuyla sınırlandırılmış nöronal hücre cisimciklerinden oluşan bir "canlı iskelet" türü olan implante edilebilir mikro doku mühendislik sinir ağlarının (mikro-TENN'lerin) gelişimini daha önce rapor etmiştir , Bu üç boyutlu (3D) kaplamanın 1 , 10 , 31 , 32 iç kısmı boyunca uzanan hizalı aksonal yollarla birlikte. Bu teknik ile daha önceki yaklaşımlar arasındaki temel farklardan biri, mikro-TENN'lerin sitolojisinin in vitro olarak tamamen oluşturulduğu ve daha sonra 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 ,Sup class = "xref"> 39 , 40 , 41 . In vitro üretim, hücre iskeletinin ve oryantasyonunun, mekanik / fiziksel özelliklerin, biyokimyasal ipuçlarının ve eksojen faktörlerin kapsamlı mekansal ve zamansal kontrolünü sağlar ve implantasyon sonrası konakçıya bu iskeletlerin entegrasyonunu sağlar 41,42. Mikro-TEN'ler anatomik olarak esinlenmiştir, çünkü beyin nöroanatomisini taklit ederler, beyindeki farklı işlevsel bölgelere köprü yapanlara benzer aksonal yollar görüntüler ( Şekil 1A ) 1 . Bu nedenle, bu strateji lezyonlu bir bölgeye implantasyon sonrası kaybedilen beyaz cevher yollarını ve nöronları fiziksel olarak değiştirebilir. Bu teknik aynı zamanda radyal glial hücreler ve öncü aksonlar tarafından oluşturulan "doğal canlı iskele" nin hücre için yol bulma kılavuzları rolündeki gelişim mekanizmalarından esinlenmiştir.Subventriküler bölgeden göç ve aksonal büyüme, sırasıyla 43 . Bu mekanizmalar, akson aracılı aksonal büyümeyle ( Şekil 1C ) nöral hücre göçü ve aksonal rejenerasyon için canlı yollar sunabilen mikro-TENN'lerin hizalı aksonal yollarında tekrarlar. Dahası, bu strateji, mikro-TENN nöronları ve doğal devre arasındaki sinaptik bütünleşmeden yararlanarak işlevsel toparlanmaya katkıda bulunabilecek yeni röleler oluşturur ( Şekil 1B ) 43 . Sinaps oluşumu kapasitesi, bu yaklaşıma, MSS'yi modüle etme ve ağ geri bildirimine göre ev sahibi dokuya yanıt verme becerisi de verebilir. Örneğin canlı iskele içindeki optogenetik olarak aktif nöronlar, sinaptik etkileşimler yoluyla konakçı nöronlarını modüle etmek için uyarılabilir ( Şekil 1D ).

Buna ek olarak, biyomalzeme esaslı boru şekilli konstrüksiyonMikro-TENN'lerin kullanılması yapıların minyatür boyutları, minimal invaziv implantasyona izin verir ve kademeli olarak beyne entegrasyon için kısmen kenetlenmiş bir mikro ortam sağlarken hücre yapışması, büyüme, nevrit ekspansiyonu ve sinyalizasyon için uygun bir ortam sunar. Nitekim, son yayınlar sıçan beynine yerleştirildikten sonra mikro-TEN'lerin sinir yollarını taklit etme potansiyeli olduğunu göstermiştir. Stereotaksik mikroenjeksiyon sonrasında daha önce, mikro-TENN nöronal sağkalımı, aksonal bölge mimarisi bakımından ve konakçı kortekse in vivo 10 , 31 en az 1 ay boyunca nörit uzatmanın kanıtlarını bildirdik. Dahası, synapsin ile etiketleme, doğal doku 10,31 ile sinaptik entegrasyonun histolojik kanıtı sağladı. Genel olarak, mikro-TENN'ler, hasarın yeniden yapılandırılması ve modülasyonu için benzersiz şekilde uygun olabilirKaybedilmiş nöronları değiştirerek, ana devre ile sinaptik olarak bütünleşerek, kaybedilen aksonal sitolojiyi geri yükleyerek ve bazı durumlarda uygun yol bulma ipuçlarını içeren yenilenen aksonları sağlayarak MSS.

Şekil 1
Şekil 1: Mikro-doku ile tasarlanmış sinir ağı (mikro-TEN) gelişimi arkasındaki ilkeler ve ilham. ( A ) Mikro-TENN'ler işlevsel olarak farklı bölgelerin tek yönlü (kırmızı, yeşil) veya iki yönlü (mavi) şekilde uzun, hizalanmış aksonal yollarla bağlandığı beynin bağlanmasını (mor) simüle eder. Örnek olarak, mikro-TENN'ler, kortikotalamik ve nigrostriatal yollarda veya entorinal korteksten hipokampusa (struzyna ve diğerleri, 2015'den adapte edilmiş) perforant yolda kaybedilen bağlantıları yeniden oluşturabilir 1 . ( B ) Tek yönlü bir diyagramL ve her lezyonun her iki ucu arasında fonksiyonel bir röle olarak görev yapmak üzere ana devre (mor) ile sinaptik olarak entegre olan çift yönlü mikro-TENN (sırasıyla kırmızı ve mavi). ( C ) Mikro-TENN'in etkileşimde bulunduğu bir hedefe doğru ana aksonların (mor) akson kolaylaştırılmış rejenerasyonu için bir kılavuz olarak hizmet eden, tek yönlü bir mikro-TENN'in (yeşil) aksonal yollarının şeması. ( D ) Neşredici veya inhibe edici nöronlar (alt) ile sinaptik entegrasyon yararlanarak, nöromodülatörler olarak optogenetik olarak aktif mikro-TENNS kullanımı kavramsal diyagram. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Mevcut el yazması, embriyonik olarak türetilen serebral kortikal nöronları kullanarak mikro-TEN'lerin imalinde kullanılan metodolojiyi ayrıntılarıyla anlatmaktadır. Özellikle, mikro-TEN'ler diğer nöral hücreler türleriyle birlikte üretilebilir. Eski içinBaşarılı, mikro-TENN gelişiminin ilk raporlarında sırt kök gangliyon (DRG) nöronları 32 bulunmaktadır. Hidrojel mikro sütunları, sıvı ile şekillendirilmiş, lazerle kesilmiş bir silindirik kanal dizisine veya kılcal tüplere, her ikisi de hizalı akupunktur iğnelerini içeren sıvı agaroz eklenerek üretilebilir ( Şekil 2A ). İğne lümeni oluşturur ve mikro-kolonun iç çapını (ID) belirler; buna karşın kılcal tüp ID'si ve lazer kesme cihazındaki silindirlerin çapı yapıların dış çapını (OD) belirler. OD ve ID, sırasıyla, cihaz / kılcal tüpler ve akupunktur iğneleri için farklı çaplar seçerek istenen uygulamaya göre seçilebilir. Mikro kolonların uzunluğu da değiştirilebilir; Bugüne kadar, uzunluğu 20 mm'ye kadar olan mikro-TEN'lerin yapımını bildirdik ve aktif olarak daha uzun uzunluklarda ilerliyoruz. Agaroz jellerinden ve akupunkturdan sonra nEedles kaldırılır, genellikle tip I kollajen ve laminin içeren bir ECM çözeltisi yapıların lümenine eklenir ( Şekil 2C ). ECM çekirdeği, nöronal hücre yapışmasını ve aksonal gelişimini desteklemek için bir iskelet sağlar. Başlangıçta, primer sıçan kortikal nöronları, ayrılmış hücre süspansiyonları 10 , 31 , 32 kullanılarak mikro-kolonlara kaplandı. Bununla birlikte, bu yaklaşım, merkezi lümen saf hizalanmış aksonal yollardan oluşan, mikro kolonların uçlarıyla sınırlı nöronal hücre cisimcikleri olarak tanımlanan her durumda hedef cyto mimari yapı oluşturmadı. O günden bu yana, (Ungrin ve arkadaşlarının uyarladığı protokollere dayalı olarak) zorlanmış bir nöronal toplama yönteminin kullanılması, ideal yapı ( Şekil 2B ) 44 ile daha güvenilir ve tutarlı bir mikro-TENN imalatı sağlamıştır. Mevcut durumu tanımlamanın yanı sıraMetodoloji ile bu makalede zamanla aksonal yolların oluşumunu gösteren mikro-TENN'lerin temsili faz kontrastı ve konfokal görüntülerinin yanı sıra sonuçlandırılmış hedef hücre mimarisi de gösterilecektir. Bu el yazması, protokolün kayda değer yönleri ve kalan teknolojilerin ve gelecekteki mikro-TENN teknolojisinin yöneliminde de genişleyecektir.

şekil 2
Şekil 2: Üç aşamalı mikro-TENN imalat sürecinin şematik diyagramı. ( A ) Agaroz hidrojelinin gelişimi: (i) Başlangıçta, küçük bir akupunktur iğnesi ( örn. , 180-350 μm çapında), ısmarlama lazerle kesilmiş kalıp veya kılcal borunun silindirik kanallarına yerleştirilir ( örn. , 380-700 μm çapında). Bir sonraki adımda, DPBS içindeki sıvı agaroz silindirik kanallara veya kılcal tüplere sokulur. (Ii) Agaroz jellerinden sonra, iğne çıkarılır veKalıp boşaltılmış agaroz mikro sütunları elde etmek için söküldü. (Iii) Bu yapılar daha sonra sterilize edilir ve DPBS'de saklanır. ( B ) Primer nöron kültürü ve agrega yöntemi: (i) Nöronal agregasyon, 12-çukurlu bir kültür plakasının oyuklarına uyan 3D baskılı kalıplardan dökülen piramidal mikro-kuyu dizilerinde gerçekleştirilir. (Ii) Mikro-TENN'ler, embriyonik-gün-18 sıçanların fetal beyinlerinden ayrılan birincil sıçan nöronlarını içerir. Tripsin-EDTA ve DNaz I ile doku ayrışmasının ardından, 1.0-2.0 x 106 hücre / mL yoğunluğa sahip bir hücre çözeltisi hazırlanır. (Iii) Bu çözeltiden 12 uL, piramidal mikro-kuyu dizisindeki her kuyuya aktarılır. Bu mikro kuyuları içeren plaka, hücre agregaları üretmek üzere santrifüje tabi tutulur. (Iv) Bunlar daha sonra mikro-kolonlara kaplamadan önce gece boyunca inkübe edilir. ( C ) ECM çekirdek imalatı ve hücre tohumlaması: (i) Hücre tohumlamadan önce, 1 mg / mL tip I kollajen ve 1 mg / mLLaminin, mikro-TENNlerin içine aktarılır ve polimerize olmasına izin verilir. (Ii) Tek yönlü veya çift yönlü mikro-TEN'lerin imal edilip edilmediklerine bağlı olarak, bir agrega sırasıyla mikro-kolonun bir veya her iki ucuna yerleştirilir. (Iii) Yapışma kabiliyetini arttırmak için inkübasyon süresinin ardından, mikro-TENN'ler eklenmiş embriyonik nöronal bazal ortam ile sızdırılmış Petri kaplarında kültürlenir. (Iv) Kültürde 3-5 gün sonra nihai mikro-TENN yapısı, akson kanallarının uzunluğunu uzatarak mikro kolonun uçlarında hücre agregalarını göstermelidir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler, Pennsylvania Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komiteleri ve Michael J. Crescenz Gaziler İşleri Tıp Merkezi tarafından onaylandı ve NIH Kamu Sağlığı Hizmet Politikası'nda yer alan ilkelere uyuldu ve İnsani Bakım ve Laboratuar Kullanımı Hayvanlar (2015).

1. Agaroz Hidrojelinin Geliştirilmesi (mikro-TEN'lerin Uç Faz Komponenti)

  1. Agaroz çözeltisi hazırlama
    1. Biyogüvenlik kabininde, iki 10 cm'lik Petri tabağının her birine 20 mL Dulbecco fosfat tamponlu salin (DPBS) aktararak mikro sütun için rezervuar hazırlayın. Sıcak bir boncuk sterilizatörü ile ince forsepsleri ve mikroskopları steril edin.
    2. 3 g agaroz tartın ve biyogüvenlik kabini içindeki steril bir behere aktarın. % 3 ağırlık / hacim (w / v) nihai konsantrasyonu için 100 mL DPBS ekleyin. Temiz bir manyetik çubuk yerleştirin ve alüviyeyle kap sağlayınNum folyo.
    3. Sıcak plakalı / karıştırıcıda, beheri 100 ° C'de ısıtın ve agarozu tamamen çözmek için 120-200 rpm'de karıştırın (solüsyon bulutludan berrak hale gelecektir). Jelleşmeyi önlemek için ısıtıp karıştırın ve agarozun yakılmasını önlemek için ısıtma sıcaklığını gerektiği gibi değiştirin.
      NOT: Hem lazer kesme cihazı hem de kılcal borular ile yapılan üretim aşağıda sırasıyla alt bölüm 1.2 ve 1.3'de sunulmuştur. Her iki alt bölümde açıklanan adımları tamamladıktan sonra 1.4 alt bölümüne geçin. Hem mikro kolon üretim yöntemleri için, agaroz soğuyunca hızla katılaştığından, sıvı agarozu çabucak ekleyin. Aşağıdaki adımlardan herhangi birinde bir otoklav ile sterilize edildiğinde, cam eşyalara uygulanan standart koşulları kullanın.
  2. Lazerle kesilmiş bir cihaz kullanarak mikro-kolon hazırlığı
    NOT: Lazerle kesilen cihaz, ticari bir CO 2 lazer kesici kullanarak şeffaf akrilikten kesilir. FabriYapıların ve cihazların lazerle kesme katyonu bir dizi mühendislik ve araştırma uygulaması için iyi belgelenmiştir 45 , 46 , 47 . Bu kalıp ( Şekil 3 ), her biri 398 μm çapında ve 6,35 mm uzunluğa sahip beş silindirik kanal dizisinden oluşur. Bu silindirik diziler, iki parça halinde oluşur: bir alt yarı (uzunluk: 25.4 mm, genişlik: 6.35 mm, yükseklik: 6.0 mm) ve bir üst yarım (uzunluk: 31.5 mm, genişlik: 6.35 mm, yükseklik: 12.7 mm ), Sırasıyla Şekil 3A ve 3B'de gösterildiği gibi. İki yarım, Şekil 3C'de (uzunluk: 31.5 mm, genişlik: 6.35 mm, yükseklik: 12.7 mm) gözlenen ön ve arka kapaklarla birbirine kenetlenebilir, bu üst ve altta iki delik ile çakışan dört hizalama deliği içerir Parçalarıyla birleştirildiğinde ve vidalanmış haldeyken tüm parçaların birbirine sabitlenmesine yardımcı olur. Bu kapaklar da incMikro kolonların lümenini oluşturmak için akupunktur iğnelerinin sokulabileceği silindirik kanallara konsantrik beş delik.
    1. Şekil 3'te gösterilen cihazı alüminyum folyo ile kaplayarak ve otoklavla sterilize edin. Cihazı Şekil 3D'de gösterildiği gibi ön ve arka kapakları sadece alt yarım parçayla hizalayarak ve üç parçayı iki adet # 4-40 vida ve somun (diş çapı: 3.05 mm) ile alt hizalama deliklerine sabitleyerek monte edin.
    2. Cihazın anterior veya arka kapağı üzerindeki iğne deliklerine tam olarak bir akupunktur iğnesi (çap: 180 μm, uzunluk: 30 mm) ekleyin ( Şekil 3D ). Bir mikropipet ile, silindirik kanal yarılarının her birini tamamen doldurmak için alt yarım parçaya yeterli sıvı agaroz (beş kanal için ~ 1 mL) dökün.
    3. Cihazın üst yarısını derhal alt yarımın üzerine yerleştirin ve sıkıca yerine oturana kadar basıncı uygulayınSilindirik kanalları tamamlamak için yerleştirin (kapaklar ile üst parça arasındaki sürtünme, ikinci parçayı tutacaktır). Cihazın kanalları içindeki jelasyonuna izin vermek için agaroz ilavesinden sonra oda sıcaklığında ~ 5 dakika bekleyin.
    4. İğneyi cihazın kapaklarının her birinden elle çekin. Vidaları çıkarın ve iki kapağı ve alt yarım parçadan hidrojen mikro sütunları tutacak olan üst yarıyı manuel olarak ayırın.
    5. Mikro kolonları alt yarım parçadaki kanallardan nazikçe çıkarmak için ince forseps kullanın ve daha önceden hazırlanmış DPBS içeren Petri kabına yerleştirin (adım 1.1.1). Cihazı başka bir mikro sütun imalatı yuvarlak rutini tekrar kullanın. 1.4 alt bölümüne geçin.
  3. Kılcal tüpler kullanarak mikro sütun üretimi
    1. Cam kılcal boruları (çap: 398,78 μm, uzunluk: 32 mm) biyogüvenlik kabininin içine aktarın. El ile kırmakUzun boruları 2.0-2.5 cm'lik fragmanlara yerleştirin ve her bir parçaya bir akupunktur iğnesi (çap: 180 μm, uzunluk: 30 mm) tam olarak yerleştirin ( Şekil 2A ).
    2. Beherden boş bir Petri kabının yüzeyine 1 mL sıvı agaroz aktarın. Kılcal tüpü ve girilen iğneyi tutarak, kılcal eylemle doldurmak için borunun bir ucunu sıvı agaroz havuzu ile temas halinde bırakın. Kılcal yükselişi desteklemek için tüpü çalkalayın.
      NOT: Kılcal damarları, kılcal etki izin verdiği kadar yüksek sıvı agarozla doldurun; Daha sonra, bu mikro sütunlar istenen uzunluğa bağlı olarak daha küçük yapılar halinde kesilebilir. 1 mL'lik agaroz havuzu, sadece bir tüp için kullanılır, zira agaroz soğur ve hızla jeller, böylece daha fazla kılcal damar etkisi önlenir.
    3. Sıvı yükselmeye son verdiğinde, kılcal boruyu havuzdan çıkarın ve bir Petri kabının yüzeyine yatay olarak yerleştirin. Tüplerin içinde agaroz jelinin bırakması için 5 dakika bekleyin. </ Li>
    4. Başparmak ve işaret parmağını tübün her iki yanına yerleştirin ve bastırın. Mikro sütunun kendisinin tüpün dışına kaymasını önlemek için başparmağını ve işaret parmağını kullanırken iğneyi hızlı bir şekilde çekmek için diğer eli kullanın. Mikro kolonu yavaşça DPBS içeren bir çanağa (adım 1.1.1) itmek için kılcal boruya 30 gauge iğne yerleştirin.
  4. Mikro sütun düzeltme ve sterilizasyon
    1. İnce forseps kullanarak bir mikro sütunu DPBS'den ince bir forseps kullanarak boş bir tabağa aktarın. Kurumayı önlemek için bir mikropipet ile mikro kolonun tepesine 10 uL DBPS ekleyin. Görsel rehberlik için ikinci bir çanağı bir stereoskopun altına yerleştirin.
      NOT: Protokol boyunca mikro sütun kurutulması veya dehidrasyonu, bu yapıların tipik, hidrasyon görünümünden görsel olarak ayırt edilebilen buruşuk bir yapının edinilmesine değinmektedir. Kurutulmuş mikro sütunlar Petri kaplarının yüzeyine sıkıca bağlanır ve cAncak, hidratlı yapılar, forseps ile manipüle edildikten sonra yüzey boyunca kayma eğilimi gösterirler. Tamamen kurutulmuş bir mikro sütunun bir faz kontrastlı görüntüsü Şekil 8A'da gösterilmiştir.
    2. İstenilen uzunluğa (burada, 2-5 mm) kısaltmak için mikro-kolonu bir mikroskopik pleytle kesin. Kesilmiş mikro sütunu, adım 1.1.1'de hazırlanan diğer DPBS Petri kabına ince forsepsle nakletin.
    3. Üretilen her bir mikro sütun için 1.4.1 ve 1.4.2 adımlarını tekrarlayın.
    4. DPBS içeren petri kaplarındaki mikro sütunları ultraviyole (UV) ışık altında 1 saat süreyle sterilize edin. Petri kaplarını ECM ilavesi ve hücre kaplamasından önce 4 ° C'de saklayın.

2. Birincil Nöron Kültürü ve Zorla Hücre Toplama Yöntemi

  1. Piramidal mikro-kuyu dizisinin hazırlanması
    NOT: Bu bölüm, silindirik bir taban (çap 2.2 cm, yükseklik 7.0 mm) veŞekil 3E'de gösterildiği gibi, üstte dokuz kare piramit (yan uzunluk: 4.0 mm, eğik açı: 60 °), 3 x 3 dizi halinde düzenlenmiştir. Ticari olarak bulunan 3B yazıcıları kullanan katkı maddesi üretim süreci iyi belgelenmiştir. Kalıbı tasarlamak için bilgisayar destekli tasarım yazılımı kullanılabilir. Elde edilen tasarım dosyası daha sonra dijital olarak bir 3B yazıcı için bir takım yolu haline dönüştürülebilir. Her yazıcının farklı özellikleri vardır ve bir 3B yazıcının kurulması ve çalıştırılması ile ilgili talimatlar buna göre değişir.
    1. 10 cm'lik bir Petri kabının kapağında ortalanmış 4 x 4'lük bir dizide (yan uzunluk: 4 cm, delik ayırma: 1 cm) 16 delik delmek için 3/32 "matkap ucu kullanın. 27 g polidimetilsiloksan (PDMS) ve 3 g sertleştirici ajan (1:10 oranında) tartmak için Petri kabının alt parçasını, ajanı eşit şekilde dağıtmak için bir mikro spatula ile karıştırın.
    2. Delinmiş kapaklı PDMS / kür ajanı örtün. Bir hortumun bir ucunu vakuma bağlayın(Ağız çapı: 10 cm, gövde uzunluğu: 3 cm, gövde çapı: 1,5 cm) yerleştirin.
    3. 1 mL pipet ampulün üst kısmında 3/32 "matkap ucu ile bir delik açın ve deliğe (sivri uc yukarı doğru gelecek şekilde) bir 1000 mcL mikropipet ucu yerleştirin ve ampulü ve ucu hortumun içine yerleştirin ve çekin Hortumu, huniyi huni sapına sızdırmaz hale getirene kadar yukarıya doğru itin.
    4. Huniyi delinmiş çanak kapağına yerleştirin ve hortumun sağlam ve sağlam bir destek ile sabitlenmesini sağlayın. Vakum valfini emmek için 5 dakika açın ve hava kabarcıklarını yüzeye getirin.
    5. Kalan hava kabarcıklarını patlatmak için valfi kapatın, huniyi çıkarın ve Petri kabını duman kapağının yüzeyine 3 kez vurarak vurun.
    6. Piramitleri yukarı bakacak şekilde, 12 kuyucuklu bir kültür plakasındaki kuyuların her birine piramidal-iyi 3D baskılı bir kalıp yerleştirin. Kalıpların her bir tarafına kadar PDMS / sertleştirici ajan dökünO plaka doldu. 12 oyuklu plakayı kapağı ile kapatın ve 60 ° C'de 1 saat süreyle fırında kurutun.
    7. Her bir PDMS mikro-kuyu dizisini ( Şekil 3F ) plakadan bir mikro-spatula ile dikkatlice çıkarın. Alüminyum folyo ile PDMS dizilerini örtün ve otoklavla sterilize edin. Biyogüvenlik kabininde, 12 delikli bir plakanın her kuyucuğuna bir mikro kuyucuk dizisi yerleştirin ( Şekil 2B ).
  2. Sıçan fetüslerinden kortikal nöron izolasyonu
    1. Bir biyogüvenlik kabini içinde dört ila altı adet 10 cm'lik Petri kaplarının her biri (her disseke doku için birer tane) ~ 20 mL Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ekleyin. Bu yemekleri bir diseksiyon kapağına aktarın ve buz üzerinde bırakın. Mikroalpeller, makas ve forseps gibi diseksiyon aletlerini sıcak bir boncuk sterilizatörüyle sterilize edin.
    2. Pre-warm embriyonik nöron bazal orta +% 2 serum-ücretsiz destek + 0.4 mM L-glutamin ("kültür ortamı" olarak anılacaktır)R) ve% 0.25 tripsin + 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile 37 ° C'de inkübe edildi. Deoksiribonükleaz (DNase) I'i oda sıcaklığına yerleştirerek çözün. HBSS içinde 0.15 mg / mL DNAse I solüsyonunun 1.5 mL'si hazırlayın ve çözeltiyi buz üzerinde muhafaza edin.
    3. Kararsız hamile bir embriyonik-gün-18 sıçanı karbondioksit inhalasyonuyla euthanize edin ve kesilme ile ölüme teyit edin. Karkası steril bir diseksiyon kaputuna aktarın ve ventral yüz yukarı gelecek şekilde yerleştirin. Karnımı% 70 etanol ile iyice durulayın.
    4. Uterus açın ve fetüsleri (genellikle ~ 11) makasla amniyotik keselerden alın ve açıklanan şekilde soğuk HBSS içeren bir Petri kabına forseps ile aktarın. Stereoskopun altına soğutulmuş bir (-20 ° C) granit blok yerleştirin. Diseksiyon işlemi boyunca HBSS'nin düşük sıcaklığını korumak için Petri kabını bu soğuk bloğun yüzeyine yerleştirin.
    5. Çevredeki HBSS'yi yutarak yavruları durulayın ve bir sonraki temiz çanağa aktarın.Içeren HBSS. Stereoskop ve diseksiyon aletlerinin yardımı ile, fetüslerin başlarını, serebral hemisferlerini ve kortekslerini sırayla çıkarın ve her diseksiyon sonrasında yeni bir HBSS-dolu tabağa forseps ile her dokuyu aktarın 48 .
    6. Sadece pastil pipet ile korteksleri aspire edin ve dokuyu steril bir 15 mL santrifüj tüpüne yerleştirin. Diğer disseke dokuları atın. Serolojik bir pipet ile ~ 5 mL HBSS'yi sırayla ekleyip çıkararak kortekste üç kez durulayın. Tüpü kullanmadığınız zamanlarda buz üzerinde bırakın.
    7. Korteksleri bir Pasteur pipetiyle, önceden ısıtılmış tripsin-EDTA (5 mL tripsin-EDTA için 4-6 korteks) içeren 15 mL tüp içine aktarın. Boruyu elle çalkalayın ve 37 ° C'ye yerleştirin. Doku kapanmasını önlemek için tüp 3 dakikada bir ters çevirin.
    8. Dokuyu bir Pasteur pipetiyle çıkarıp temiz bir 15 mL santrifüje aktararak yaklaşık 10 dakika sonra tripsin maruziyetini durduruntüp. 0.15 mg / mL DNase I çözeltisini (1.5 mL) bir pipet yardımıyla tüpün içine ekleyin.
    9. Çözünürlük homojen görünene ve sıvı içinde kalan doku parçaları olmadan doku kümelerini elle parçalamak için bir Pasteur pipet kullanın ve daha sonra girdap (~ 30 s) vorteksleyin. Çözeltiyi tamamen homojenize etmek mümkün değilse, çözünmeyen parçaları bir Pasteur pipetinin ucuna çekerek çıkarın.
    10. Adım 2.2.9'da elde edilen homojen hücre çözeltisini 200 xg'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin. Peletlenmiş hücreleri rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı bir Pasteur pipetiyle çıkarın. Serolojik bir pipetle 2 mL kültür ortamı ekleyin ve hücreleri tekrar süspanse etmek için girdap ekleyin.
    11. Hemocytometer kullanarak adım 2.2.10'da hazırlanan çözeltideki hücre sayısını sayın; Beklenen verim 3.0-5.0 x 106 hücre / kortikal yarı küre şeklindedir. 1.0-2.0 x 10 6 hücre / mL yoğunluğunda, kültür ortamında 1 mL veya daha fazla hücre süspansiyonu hazırlayın.
  3. Nöronal hücre agregatlarının oluşumu
    1. Bir mikropipet ile, PDMS dizisinin her mikro-kuyusuna (adım 2.1.7'deki plakaya yerleştirilen), 12 uL 1.0-2.0 x 10 6 / mL hücre süspansiyonu ekleyin.
      NOT: Yüksek konsantrasyonlar daha büyük agrega üretebileceğinden, hücre konsantrasyonu, mikro-kolon ID'ye ve arzu edilen hücre agrega boyutuna bağlı olarak ayarlanabilir.
    2. Mikro kuyuların ( Şekil 2B ) altındaki hücrelerin birikmesini zorlamak için plakayı 200 xg'de 5 dakika santrifüjleyin. Agregalı hücreleri rahatsız etmemeye özen göstererek tüm tohumlanmış mikro-kuyucuları kaplayacak şekilde her PDMS dizisinin üstüne ~ 2 mL kültür ortamı ekleyin.
    3. Eğer hücreler bir viral vektör ile transforme edilmezlerse, plakayı 12-24 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 C02'de inkübe edin ve daha sonra 3. bölüme geçin. Agregalar transdüser hale getirilirse inkübasyonu atlayın ve Bölüm 2.4'e geçin .
  4. TranKalsiyum sinyalini gözlemlemek için bir viral vektörle sindirim
    Not: Bu adımlar, genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum göstergesi (GECI) içeren viral bir vektörle nöronları dönüştürmek için yapılır. Bu makalede gösterilen sonuçlar, yeşil flüoresan proteini (GFP), kalmodulin (CaM) ve M13 peptidinden oluşan hızlı kinetik olan bir GECI olan GCaMP6f ile piyasada bulunan bir adeno-ilişkili virüs (AAV) (serotip 1) Insan Synapsin I destekleyicisi tarafından yönlendirilir. Viral vektör çözeltisi, stok çözeltisinin konsantrasyonuna bağlı olarak, dönüştürmeden önce steril DPBS'de seyreltme gerektirebilir. Bir dizi vektör konsantrasyonu için zamanla hücre sağlığı / morfolojisi ve GCaMP6f sinyal gücü gözlemlenmelidir. Bu optimizasyon prosedürü, kendi hücre kültürleri için uygun titreyi belirlemek için her araştırıcı tarafından gerçekleştirilmelidir. Tipik GCaMP6f ekspresyon zamanı, st içinde yapılan inkübasyon sırasında ortaya çıkan transdüksiyonun ardından 7-8 günlüktirEp 2.4.2.
    1. Bir mikropipet ile agregaları kaplayan kültür ortamına viral vektör çözümünün hacmini (agrega başına ~ 3.0 x 10 9 genomik kopyanın nihai bir konsantrasyonu için) ekleyin. Vektör çözeltisinin kültür ortamı boyunca homojen bir şekilde dağıtıldığından emin olmak için yavaş yavaş pipetle aşağı yukarı pipetleyin.
    2. Plakayı tohumlanmış piramidal mikro-kuyucuklar ile 37 ° C'de ve% 5 C02'de 24 saat boyunca GCaMP6f'nin viral transdüksiyonuna izin vermek için kuluçkalayın.

3. Mikro-TEN'lerin Hücresel Bileşeninin Geliştirilmesi

  1. ECM temel imalat
    1. Agrega inkübasyondan sonra, ECM solüsyonunu hazırlamak için mikrosantrifüj tüpünde kültür ortamına (her biri 1 mg / mL konsantrasyonda) tip I kollajen ve laminin ekleyin. 3.1.2-3.1.4 adımlarını oda sıcaklığında uygulayın, ancak erken jelasyon önlemek için kullanılmadığında tüp ECM ile buzda muhafaza edilmelidir.
    2. ECM çözeltisinin pH'sını, ilk pH'ı doğrulamak için ECM'ye 1 μL 1 N sodyum hidroksit (NaOH) ve / veya 1 N hidroklorik asit (HC1) ilave ederek 1-2 μL litmus kağıda aktararak gerektiği gibi ayarlayın, Ve pH değeri 7.2-7.4 olana kadar tekrarlayın. Hava kabarcığı oluşumunu önlerken, ECM solüsyonunun homojenize edilmesini sağlayın ve pipetleme yapın.
    3. Mikro kolonları sterilize edilmiş forsepsle adımlar 1.4.3'deki bulaşıklardan boş 35- veya 60-mm Petri kaplarına aktarın. Dehidrasyonu önlemek için her seferinde 4-5 mikro sütun üzerinde çalışın. 1000-μL'lik bir uca bağlı bir 10 μL'lik ucu bir mikropipe ekleyin. Stereoskopu görsel kılavuz olarak kullanmak için ucu, mikro sütunların bir ucuna yerleştirin ve lümenden artık DPBS ve hava kabarcığı çıkarmak için emme yapın.
    4. Bir mikropipette 4-5 μL ECM'yi hızla çizin. Bir gözlem altında gözlemlemeMikroskopun ucunu mikro kolonların uçlarından birine yerleştirin ve lümeni dolduracak kadar ECM'yi boşaltın. ECM yoluyla aksonal gelişimini inhibe edebileceğinden, lümende hava kabarcığı olmamasını onaylayın. Hava kabarcıkları varsa, adım 3.1.3'te açıklandığı gibi ECM'yi çıkarın ve ECM'yi tekrar ekleyin.
    5. Dehidrasyonu önlemek için, her mikro sütunda yaklaşık 2 μL ECM ekleyin. 37 ° C'de ve% 5 C02'de Petri kabındaki hidrojel / ECM mikro sütunlarını 25 dakika inkübe edin. İnkübasyondan hemen sonra hücre ekimine devam edin.
      NOT: Adım 3.1.5'deki kuluçka süresi, mikro kolonların içindeki kollajen ve laminin polimerizasyonu için zaman tanıyacak şekilde tasarlanmıştır.
  2. Mikro sütunlarda nöronal hücre tohumlaması
    NOT: Dönüştürülmüş agregaların kültür ortamını değiştirmek için plakayı eğin, kuyunun duvarı üzerinde toplanan ortamı çıkarmak için bir mikropipet kullanın ve sonra yavaş yavaş ~ 1 mL ekleyin.(Piramidal mikro kuyularda agrega rahatsızlığından kaçınmak için). Bu orta değişikliği ikinci kez tekrarlayın.
    1. Adım 3.1.5'te inkübasyon süresinin ardından yaklaşık 10-20 μL kültür ortamı, mikro sütunları tutan Petri kaplarındaki iki boş alana aktarın. Agregaları, yapıları içeren Petri kabına tek tek aktarmak ve hücre sağlığını korumak için kültür ortamının küçük havuzlarından birine forsepsle taşımak için bir mikropipet kullanın.
    2. Bir stereoskop altında gözlem yaparken, çift yönlü mikro-TEN'ler için mikro sütunların her iki ucuna bir arada veya bir ucunda forseps kullanarak tek yönlü bir mimari için (arzu edildiği gibi) bir agrega yerleştirin. Mikroskoplardaki agregatların stereoskop kullanılarak yerleştirilmesini onaylayın. Dehidrasyonu önlemek ve toplam sağlığı korumak için, tohumlanmış mikro sütunları kültür ortamının diğer küçük havuzuna taşımak için forseps kullanın.
    3. 37 ° C'de ve% 5 C02'de 45 dakika inkübe edin.Toplulukları ECM'ye uyacak şekilde genişletin. Agregaların stereoskop kullanılarak mikro sütunların ucunda kaldıklarını doğrulayın; Hücre agregalarını tekrar sunun ve gerektiğinde kuluçka adımını tekrarlayın.
    4. Serolojik bir pipet kullanarak kültür ortamı (sırasıyla 35 veya 60 mm'lik bir Petri kabı için 3 veya 6 mL) ile mikro-TEN'leri içeren Petri kaplarını dikkatlice selleyin. Uzun vadeli kültür için 37 ° C'de ve% 5 CO 2'de inkübatöre yerleştirin.
    5. Kültür ortamı ile her 2 günde bir yarım medya değişiklikleri yapın. Eski medyanın yarısını bir pipetle dikkatli bir şekilde çıkarın ve mikro-TEN'lerin emilmesinden kaçınmak için stereoskopu görsel kılavuz olarak kullanın. Pipetle yavaşça taze, önceden ısıtılmış ortam ilave ederek değiştirin.
    6. PDMS mikro-kuyulu dizileri yeniden kullanmak için, kültür ortamı çıkarın, 30 dakika boyunca deiyonize su dizileri kaynatın ve agregat oluşumu ve kültür başka bir tur için bir otoklav sterilize edin.
      NOT: İstenilen zaman noktalarındaMikro-TEN'lerin sitolojisi, faz-kontrast mikroskobu kullanılarak doğrulanabilir. Burada, faz-kontrast görüntüleri yakalamak için 5-8 ms ve 10X (0.64 um / piksel) ve 20X (0.32 um / piksel) hedeflerden bir maruz kalma süresi kullanıldı. Viral olarak iletilen mikro-TENN'lerdeki kalsiyum konsantrasyonu değişiklikleri ile ilişkili floresans, 50 ms'lik maruz kalma süresi, 10X'lik bir objektif (0.64 μm / piksel) ve ~ 480 bant geçiren filtrelerle katı hal ışığı ile yüksek hızlı bir floresan mikroskop kullanılarak yakalandı Nm ve ~ 510 nm, uyarma ve emisyon için, sırasıyla, GCaMP6f floresan sinyalini görselleştirmek için kullanıldı.

4. İn Vitro Çalışmalarda İmmünositokimya

Not: Burada gösterilen görüntüler için aşağıdaki birincil antikorlar kullanılmıştır: aksonların etiketlenmesi için pre-fare anti-Tuj-1 / beta-III tübulin (1: 500) ve tavşan anti-synapsin-1 (1: 500) -Sinaptik boutons, sırasıyla. İkincil antikorlar eşek anti-mouse 568 (1: 500) ve eşek anti-tavşan 488 (1: 500). Hazırlanan primer ve sekonder antikor solüsyonlarının gerekli hacimleri, ayrıca formaldehit hacmi, at serumu ve deterjan solüsyonları, yapıları tamamen kaplaması için gereken hacme bağlıdır. Bu hacimler, her bir mikro sütunun çevresini sınırlamak için bir hidrofobik bariyer kalemi kullanarak minimize edilebilir.

DİKKAT: Bu bölüm formaldehit ve Hoechst kullanmaktadır. Formaldehit, kanserojen olduğu bilinen toksik bir bileşiktir ve Hoechst bilinen bir mutajendir. Bu nedenle, bu bileşikler uygun bir atık kabına atılmalıdır. Laboratuar önlüğü, güvenlik gözlükleri ve eldivenler gibi uygun kişisel koruma ekipmanlarını kullanırken bunları daima bir kimyasal duman bacasında tutun.

  1. Kimyasal duman davlumbazının içine 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 4.0 hacim / hacim (v / v) formaldehit solüsyonu hazırlayın.
  2. Petri kaplarının içerdiği kültür ortamını çıkarınMikro-TEN'leri bir mikropipet ile incelemek. Mikro-TENN'leri tamamen örtmek için, yemeklere yeterli miktarda formaldehit solüsyonu ekleyin. Mikro-sütunlar içindeki hücreleri sabitlemek için 18-24 ° C'de 35 dakika süreyle formaldehit solüsyonundaki mikro-TENN'leri bekletin.
  3. Bir pipetle Petri kaplarından% 4.0 formaldehit solüsyonu alın ve uygun tehlikeli madde atma kurallarına uymadan atın.
  4. Sabit mikro-TENN'leri tamamen kaplayacak ve ardından bir pipetle PBS'yi çıkarmak için yeterli PBS ekleyerek iki hızlı durulama gerçekleştirin. 10 dakika boyunca PBS yapıları ıslatarak üçüncü bir uzun durulama yapın.
    DİKKAT: Durulamak için kullanılan PBS'yi muhtemelen formaldehit izleri içeren olarak atın.
  5. PBS içinde% 4 v / v at serumu içinde iyonik olmayan bir deterjanın% 0.3 v / v çözeltisi hazırlayın. Sabit mikro-TENN'leri içeren Petri kaplarından PBS'yi çıkarın ve yapıları örtmek için yeterli miktarda% 0.3 deterjan çözeltisi ilave edin. 18-24'te 60 dk bekleyin ve #176 C hücreleri permeabilize etmek.
  6. Deterjan solüsyonunu bir pipetle çıkarın. PBS'yi ekleyip sonradan çıkartarak iki hızlı durulama yapın. Ardından, yapıları her durulama işlemi sırasında 5 dakika boyunca PBS'ye batırarak üç kez daha durulama gerçekleştirin.
  7. Birincil antikorları% 4 at serumu içinde seyreltin. PBS'yi, sabit ve permeabilize edilmiş mikro-TEN'leri içeren Petri kaplarından çıkarın. Mikro kolonlara, bunları tamamen örtecek kadar birincil antikor çözeltisi ekleyin. Buharlaşmayı önlemek için parafilm ile Petri yemeklerini kapatın ve gece boyunca (12-16 saat) 4 ° C'de inkübe edin.
  8. Birinci antikor çözeltisini tabaklardan çıkarın ve adım 4.6'da açıklandığı gibi durulayın. Karanlıkta,% 4.0 at serumu içinde ikincil antikor çözeltisi hazırlayın. Yapıları tamamen kaplayacak kadar yalın ikincil antikor çözeltisi ekleyin, bulguları alüminyum folyo ile örtün ve 18-24 ° C'de 2 saat inkübe edin.
  9. Çekirdeği leke yapmak için Hoechst çözeltisini (1: 10,000) PBS'de hazırlayın.
  10. NOT: İmmün işaretli mikro-TENN'ler için görüntüler 2048 (~ 8 s / çerçeve) çözünürlük, 10X hedef (0.64 μm / piksel), 487 nm uyarılma ve ~ 525 nm emisyon dalga boyları ile lazer konfokal mikroskop ile çekilmiştir Kırmızı fluoresans için 561 nm uyarım ve ~ 595 nm emisyon dalga boyları ve z-yığınları için ~ 60 dilimlik ~ 3.22 um / dilim.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mikro-TENN'ler, sitografi ve aksonal gelişimlerini değerlendirmek için faz-kontrast mikroskobu kullanılarak izlendi ( Şekil 4 ). Tek yönlü, 2 mm uzunluğunda mikro-TENN'lerde, nöronal agregalar mikro kolonun bir ucuyla sınırlandırılmış ve iç çekirdeğin içinden aksonlar demeti öngörülmüştür. Aksonlar, kolonun tüm uzunluğunu in vitro (DIV) 5 gün boyunca uzattı ( Şekil 4A ). Aksonlar, tüm mikro kolonu 3 DIV ile kapladığı için, iki yönlü 2 mm uzunluğundaki mikro-TENN'lerde başlangıçta daha büyük bir aksonal büyüme oranı vardı ( Şekil 4B ). 5 DIV ile, çift yönlü mikro-TENN'ler mikro kolonun uçlarında muhafaza edilen agregaları birbirine bağlayan yoğun aksonal yollar içeriyordu. Bu sit- mimarisi, 5-mm mikro-TEN'lerde de gözlemlendi; aksonlar, 5-DIV ile mikro-sütun boyunca uzandı ( Şekil 4C ). Her durumda gözlemlendiği gibi, lümende ECM ve geometrik restriAgaroz tarafından sunulan, yöresel nevroanatomi özelliklerini yapısal olarak taklit eden aksonal yollar oluşturmak için gereken yönlülük sağlamıştır.

Bu protokolde immünositokimya teknikleri uygulandı ve mikro-TENN mimarisinin bileşenlerini doğrulamak için konfokal görüntüler alındı. Hoechst (mavi) ile lekelenmiş hücre çekirdeği, hemen hemen tek yönlü ve iki yönlü mikro sütunların uçlarındaki agrega içinde lokalizedir ve iç kısımda esasen hiç Hoechst lekesi yoktur ( Şekil 5 ). Bu gözlem, faz-kontrast görüntülerden nelerin ortaya çıktığı teyit edildi: nöronal popülasyonlar uçlar ile sınırlıydı ve sadece aksonlar (kırmızı renkte) mikro-TENN'lerin lümenine yayılmıştı. Bununla birlikte, aksonlar agregaları geçtikten sonra, 2 mm uzunluğundaki bir bidirekt için 28 DIV içerisindeki çekirdeklerin (mavi) varlığı ile gözlemlendiği gibi, aksonal yol boyunca iç lümen içine hücre göçü gözlemlendiKantitatif mikro-TENN ( Şekil 6 ). Ayrıca, sinapsin I immünolojik işaretleme (yeşil) hücre gövdeleri ve aksonal yollar arasında bulundu ( Şekil 6 ). Sinapsin I, nörotransmitter salınımının düzenlenmesinde rol oynayan bir pre-sinaptik terminal proteindir ve bir punktat dağıtımda bulunması durumunda pre-sinaptik terminallerin varlığının göstergesidir; Daha önceleri, bütün hücre yaması kayıtları ile aktif sinapsların oluşumu ile ilişkilendirilmiştir 49 . Mikro-TENN'in akson zengini merkez bölgesinde bulunan sinapsin boyaması muhtemelen noktalamanın yanı sıra aksonlardan sinaptik öncesi terminallere doğru nakledilen sinapsin bir kombinasyonudur. Yine de, mikro-TENN agregaları içerisinde bulunan sinapsin punktasının varlığı, bu yapıların, sinapslar yoluyla iletişim kapasitesine sahip olduğunu düşündürse de, sinapsin post-sinaptik protein ile birlikte yerelleştirilmesi, fonksiyonel sinapsların daha yapısal kanıtları için gereklidir./ P>

Mikro-TENN'ler ayrıca, bu yapıların elektrofizyolojik özelliklerini önceden saptamak için GCaMP6f kalsiyum indikatörü içeren bir AAV ile dönüştürülen toplanmış nöronlar ile imal edildi. Bu yapılar hem nöronal agrega hem de aksonal yollarda flüoresan ile gösterildiği gibi, tüm uzunluğu boyunca kalsiyum göstergesi ifade ettiler ( Şekil 7A ). Agrega yoğunluğunu maksimize etmeyi amaçlayan mikroskop ayarlarından dolayı aksonal bölgedeki flüoresansın daha soluk çıktığını unutmayın. Bu dönüştürülen mikro-TENN'ler, yüksek hızlı flüoresan mikroskobu ile (dış elektriksel uyarı olmadan) analiz edildi ve bunlardaki sinyal kapasitesini karakterize etmek için birkaç hücre büyüklüğünde ilgi bölgesi (ROI), temsili bir mikro-TENN'de rasgele seçildi oluşturur. Kalsiyum konsantrasyonu patlamaları, hemen hemen bütün ROI'lerde gözlendi;( Şekil 7B ) dalgalanan flüoresans yoğunluklarını belirledi. Özellikle, çeşitli ROI'ler kalsiyum konsantrasyonu artışlarına yakın sabit bir periyodiklik göstermiştir ( Şekil 7B ). Bu kalsiyum konsantrasyon değişikliklerinin spontan, doğal aksiyon potansiyelleri, bireysel agregatlar içindeki hücre sinyalleri ve / veya farklı agregatlardan gelen aksonlar arasındaki sinyalin sonucu olduğu düşünülmektedir. Mikro-TENN'lerde nöronların ve aksonal kanalların elektrofizyolojik özelliklerini tam olarak karakterize etmek için daha fazla analiz gereklidir. Bununla birlikte, bu ilk sonuçlar, mikro-TEN'lerin güçlü endojen / bazal elektriksel aktivite sergilediklerini göstermektedir.

Şekil 3
Şekil 3: Lazer kesimli mikro-sütun imalat cihazının ve hücre agregasyonu için 3D baskılı piramidal mikro-kuyucuk kalıbının planları. ( A) - ( B ) Hidrojel mikro sütunlarının imalinde kullanılan sırasıyla silindirik kanal dizisinin alt ve üst yarılarının taslak ve görüntüsü. ( C ) Cihazı birlikte tutmak için kullanılan kapakların taslak ve görüntüsü. Hem ön hem de arka parça aynı boyutları paylaşır. ( D ) Mikro kolonların imalatı için gerekli montaj cihazının görüntüsü. Yalnızca iki kapak ve alt yarım, alttaki iki hizalama deliğinde (solda) vidalarla birlikte kelepçelenir. Kırık çizgiler akupunktur iğnelerinin her bir kapak üzerindeki beş delikteki yerleşimini göstermektedir. Sıvı agaroz silindirlerin alt yarısına ilave edilir ve daha sonra üst yarım (sağda), sıvı agarozu şekillendirmek için cihaz üzerine yerleştirilir. ( E ) PDMS mikro-kuyusu dizileri yapmak için kullanılan 3B baskılı kalıpların planı. ( F ) 3D baskılı kalıp (solda) ve PDMS mikro-kuyu dizileri (sağda) görüntüleri. Tüm boyutlar milidir Metre (mm). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 4
Şekil 4: Tek yönlü ve iki yönlü yapıların in vitro günlerin bir fonksiyonu olarak faz-kontrast görüntülemesi ile mikro-TENNS'deki aksonal büyümenin gözlenmesi. ( A ) Tek yönlü 2 mm uzunluğunda mikro-TENN'ler, 5 DIV ile mikro-sütunun hemen hemen tüm uzunluğunu uzatan aksonal yollar göstermektedir. ( B ) tek yönlü mikro-TEN'lere kıyasla, çift yönlü 2 mm mikro-TEN'ler daha hızlı bir aksonal büyüme oranını gösterir. ( C ) 5 mm çift yönlü mikro-TENN'ler için, aksonal yollar 5 DIV'de mikro kolonun uzunluğunu doldurur. Bu mimari en az 10 DIV'ye kadar sürdürülür. Ölçek çubukları = 200 μm./ftp_upload/55609/55609fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürde daha büyük bir versiyon görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 5
Şekil 5: İmmün işaretli tek yönlü ve çift yönlü mikro-TENN'lerin konfokal görüntüleri ile gözlenen Micro-TENN sitolojileri. Hücreler, hücre çekirdeği (Hoechst; mavi) ve aksonlar (Tuj1; kırmızı) için boyandı. ( A ) 5 mm çift yönlü mikro-TENN'in (28 DIV) faz kontrastlı görüntüsü. Sırasıyla 5 mm çift yönlü (28 DIV) ve tek yönlü (25 DIV) mikro-TENN'nin konfokal rekonstrüksiyonları ( D ) - ( F ) ve ( I ) - ( K ) etiketli hücre çekirdeği ( D ), ( I ) Ve aksonlar ( E ), ( J ) ve ayrıca yerpaylaşımı ( F ), ( K ). Ölçek çubukları: 500 μm. İçerikler ( A B ) - ( C ) ve konfokal ( G ) - ( H ), ( L ) - ( M ) zoom-inslarını ifade eder . Resimler, lümen hizalı aksonal yollar tarafından yayılırken mikro-TENN'in uçlarıyla sınırlanmış agregaları göstermektedir. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 6
Şekil 6: Pre-sinaptik terminal proteini synapsin I'in temsili iki yönlü mikro-TENN'de ekspresyonu. Yapı hücre çekirdeği (Hoechst; mavi), aksonlar (Tuj1; kırmızı) ve pre-sinaptik boutonlar (sinapsin I; yeşil) için boyandı. ( A ) Faz-kontr28 DIV'de 2 mm çift yönlü mikro-TENN'nin ast görüntüsü. ( D ) - ( G ) Hücre çekirdeğini ( D ), aksonları ( E ), pre-sinaptik butonları ( F ) ve üç kanalın bir üst tabakasını ( G ) gösteren konfokal rekonstrüksiyon. Kutular sırasıyla, nöronal agregalar için faz kontrastının ve bindirme görüntülerinin yakınlaştırma bileşenlerini ( B ) - ( C ), ( H ) - ( I ) gösterir. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 7
Şekil 7: Genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum göstergesinin ifadesi ile gözlemlenen iki yönlü bir mikro-TENN'de spontan sinyal faaliyeti. ( A ) FluoresensenE mikroskopisi, agregalar ve aksonlar boyunca flüoresan ile gözlemlendiği gibi, GCaMP raportörünün ifadesini teyit etti. Ölçek çubuğu = 100 μm. ( B ) Kalsiyum konsantrasyonu değişiklikleri ile ilişkili flüoresans değişiklikleri, zamanın bir fonksiyonu olarak ilgi alanlarının birkaçında (ROI'lar) harici stimülasyon olmaksızın ölçülmüştür. ( A ) numaralı renkli daireler bu ROI'leri belirtir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 8
Şekil 8: Mikro-TEN metodolojisinde ortak başarısızlık modlarının faz kontrast görüntüleri. ( A ) İmalatın ilk safhalarında DPBS'nin uzaklaştırılması ve / veya buharlaştırılmasının bir sonucu olarak tamamen kurutulmuş / kurutulmuş bir agaroz mikro-kolonu. Ölçek çubuğu = 5081 m. ( B ) Akupunktur iğnesinin kılcal boru ile eşmerkezlileştirilmemesi nedeniyle yapının dış duvarını astarlayan lümenli hidrojel mikro-kolon. Ölçek çubuğu = 100 μm. ( C ) Her iki agrega da 1 DIV'de mevcut olan mikro-TEN'dir. ( D ) Agregalardan biri, 3 DIV'de ( C ) ile aynı mikro sütundan düştü. ( E ) 4 DIV'de tek yönlü mikro-TEN. ( F ) Agrega ve aksonal kanallar, ( E ) 'deki mikro sütundan düştü ve 5 DIV'de kültür ortamında yüzen kaldı. ( C ) - ( E ) için ölçek çubuğu = 300 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CNS yaralanması ve hastalığı tipik olarak, birlikte görülen nöronal dejenerasyon ile veya olmadan, beyin connectome'yu içeren uzun mesafeli aksonal yolların kaybedilmesi veya işlevinde aksama ile sonuçlanır. Bu nörojenez ve yenilenmeyi teşvik etmek için CNS'in sınırlı kapasitesi ile karışıktır. Bireysel veya kombinatoryal yaklaşımlar olarak büyüme faktörü, hücre ve biyomalzeme sunumu gibi onarım stratejilerinin peşinde olmasına rağmen, bu teknikler aynı anda hem nöronal hücrelerin dejenerasyonunu hem de aksonal bağlantı kaybını 14 , 22 hesaba katamaz. Teknolojideki bu boşluklar, sinir ağlarını kontrollü ve sürekli biçimde onarma, değiştirme ve sorgulama kabiliyetini sınırlar. Buna göre, mikro-TENN teknolojisi, mevcut yöntemlerin aksine hem nöron replasmanını hem de uzun aksonal bağlantıların rekonstrüksiyonunu kolaylaştıran bir sinir onarımı stratejisine olan ihtiyacı gidermek için geliştirildi. MikrofonRo-TENN'ler, ev sahibi sinir devrelerinin hedeflenen yeniden yapılandırılması, değiştirilmesi ve modifikasyonu için özel olarak tasarlanmış beyin bağlantısının sistem düzeyindeki yapı taşlarına yaklaşan önceden oluşturulmuş bir sitokimyaya sahip implante edilebilir canlı iskeletlerdir. Bu iskeleler, minyatür silindirik agaroz hidrojellerinin ECM içeren lümeninde uzun aksonal yollarla birbirine bağlı nöronların ayrı popülasyonlarından oluşur. Bu yapılar kayıp yolları değiştirmek ve doğal devreleri dinamik olarak modüle etmek için sinaptik röleler olarak işlev yapabilir. Buna ek olarak, izole aksonal dejenerasyon (kaynak nöronları bozulmamış halde) durumunda, mikro-TENN'ler muhtemelen aksonla kolaylaştırılmış akson yenilenmesinin mekanizmasına dayanan aksonal rejenerasyon için kılavuzlar görevi görebilir. Bu el yazması, kontrollü geometri, fenotip ve fonksiyonel karakteristiklerle güvenilir bir şekilde mikro-TEN'ler yaratmak için üretim protokolünü sundu. Faz kontrast mikroskobu, immünositokemiStry ve konfokal mikroskopi, protokol ile üretilen mikro-TENN'lerin gerekli sitrik mimariyi sergilediğini ve pre-sinaptik terminal proteini synapsini ifade ettiğini gösterdi. Dahası, dış simülasyonun yokluğunda, muhtemelen aksiyon potansiyellerinden dolayı, mikro-TEN'lerin kendine has sinyal aktivitesine sahip oldukları gösterilmiştir. Bu, genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum muhabir ile ilişkili flüoresanda yakın senkron dalgalanmaların varlığı ile tespit edildi.

Mikro-TENN gelişimi üç aşamalı olarak özetlenebilir: (1) içi boş hidrojel tüpün imalatı, (2) tüpün lümenine ECM çözeltisinin eklenmesi ve (3) izole edilmiş nöronların agregalarının tohumlanması Tüplerin uçları. Mikro kolonlar, cam kılcal borular ile veya silindirik kanallar içeren mikro imal edilmiş bir cihazla imal edilebilir. Bu cihaz, araştırmacı tarafından kullanılabilen herhangi bir yüksek hassasiyetli mikro imalat yöntemi ile oluşturulabilir. SıvıAgaroz, cihazın kanallarına veya merkezlenmiş bir akupunktur iğnesi içeren kılcal tüplere dökülerek hidrojel mikro sütunlar oluşturulur. Agaroz jelasyonundan sonra, içi boş lümeni üretmek için akupunktur iğnesi çıkarılır. Üretim veya büyüme sırasında ortaya çıkan birkaç yaygın tuzak, Şekil 8'de vurgulanmaktadır. Şekil 4'te gösterilen bazı görüntülerin ve Şekil 8B'deki aşırı bir durumun, silindirin duvarına tehlikeli bir şekilde yakın olan lümen bölümünü gösterdiğini unutmayın. Kılcal tüp yöntemi kullanılırken düz bir duvar kalınlığı üretmek için, tüp-iğne düzeneği, agaroz ile temas ettiğinde dik durmalıdır ve iğne tüpün merkezinde tutulmalıdır. Boru iğnesi takımını agaroz yüzeyine göre bir açıyla tutmak, iğnenin merkezden uzaklaştırılmasını kolaylaştırır. Bununla birlikte, bu önlemlerin uygulanması zor ve iğne daha çok dinlenme alonuna göre değilKılcal boruların duvarları. Tersine, mikro-fabrikasyon cihazın temel özelliği silindirik kanallarla konsantrik olarak hizalanan iğne deliklerine sahip olması, sırasıyla kanal ve mikro-sütuna göre iğnenin ve lümenin yeterli bir merkezileştirilmesini teşvik etmesidir. Buna ek olarak, cihaz aynı anda birkaç mikro sütun imalatını kolaylaştırarak üretim kapasitesini artırır. Aygıtın sağladığı faydaya rağmen, merkezi olmayan lümenler eğimli akupunktur iğneleri kullanılarak oluşturulabilir. Mikro-imalat teknikleri aynı zamanda kendi etkinliklerini sınırlayan doğal bir hoşgörüye sahiptir. Genel olarak, Şekil 8A'da aşırı bir durum gösterilen mikro-sütun dehidrasyon, protokol boyunca sağlanan önerilere uyulursa, engel teşkil etmemelidir. Dış muhafaza için kullanılan agarozun fiziksel özelliklerinin alternatif nöronal alt tipler için optimizasyona gereksinim duyabileceğini unutmayın; gelişmiş kortikal nöronlarDaha düşük (% 1-2) agaroz konsantrasyonuna karşı daha yüksek (% 3-4) urvival ve nevrit büyüme gözlenmiştir 10 .

Micro-TENN gelişimi, ECM'nin mikro-sütun lümenine girmesiyle devam eder ve bu, nöronal yapışma, hayatta kalma ve dışa gelişme için yeterli bir ortam sağlamaya hizmet eder. Buna ek olarak, ECM, agaroz hidrojel tarafından sağlanan geometrik kısıtlama ve düşük porozite ile kombinasyon halinde, gerekli mimariyi üretmek için aksonal büyümeyi uzunlamasına yöne doğru kısıtlar. ECM özümünün içeriği kullanılan nöron türüne göre optimize edilebilir. Örneğin kortikal nöronlar 10 için kollajen ve laminin kombinasyonu gerekliyorken, yalnız kolajen DRG micro-TENN'lerde sağkalım ve aksonal gelişimini teşvik eder 10 . Ayrıca, hücrelerin polimerize edilmemiş ECM ile birlikte verilmesi, azaltılmış nevrit fazlalığına yol açtığı için, mikro-kolon içerisindeki ECM polimerizasyonu, hücre kaplamadan önce kritik öneme sahiptirOwth ve fasciculation 31 . Mikro kolon başlangıçta ECM çözeltisi ile doldurulmuş olsa dahi, içerikleri yumuşak bir jele polimerize olur ve inkübasyon periyodu boyunca kasılmaya meyillidir, böylece hücre agregalarının eklenmesine izin veren bir boşluk oluşur. Buna ek olarak, ECM'nin stereoskop altında incelenerek mikro sütunun içerisine girdiğini teyit etmek önemlidir; Tam eksiklik ve / veya eksik ECM'nin cepleri, agregalardan aksonal gelişim eksikliğine neden olur. Micro-TENN imalatı, skafoldun uç noktalarındaki kortikal nöron agregalarının ekimiyle sonuçlanır. Bu nöronlar, bilinen prosedürler kullanılarak sıçan fetüslerinden 48 ayrıldı. İzolasyon için kullanılan gebelik zamanındaki embriyonik fare korteksi,% 99 nöronlardan oluşur ve protokolde tanımlanan tanımlanan kültür ortamı glial proliferasyonu metabolik olarak sınırlamaktadır, çünkü izole hücrelerin çoğunluğunun nöron olduğu çıkarılabilir 49 . Sonuç olarak, belirgin belirteçler için boyama yapılması onay için gerek duyulmasına rağmen, minimal glial kontaminasyon olmalıdır. Bu el yazması, kortikal nöronlarla mikro-TENN imalatı sunarken, farklı beyin bölgelerinden ( örneğin, nigral, talamik ve hipokampal) veya farklı fenotiplere ( örneğin, eksitatör, inhibe edici ve dopaminerjik) sahip nöronlar istenen uygulamaya göre kullanılabilirdi ve İmplantasyon alanı. Mikro-TENN imalat protokolünün önceki tekrarlamaları ayrışmış hücrelerin tohumlanmasını içeriyordu 10,31,32. İstenilen hücre yapısı, ayrışmış yöntem kullanılarak elde edilmiş olsa da, her durumda elde edilememiştir. Birçok durumda, ayrışmış hücreler içeriyi sular altına almış ve lümen boyunca birçok hücre gövdesi kümelenmesine neden olmuş ve bunları geniş bir 3B şebekede birleştiren süreçlerRef "> 10 , 31.Ağaç yöntemi, diğer yandan, hücre gövdelerinin uç noktalara yayılmasını sağlar ve bu nedenle, mikro-TENN teknolojisinin başarısı için ayrılmazdır ( Şekil 5 ). Temsili mikro-TENN'ler Şekiller 4-6'da , tamamen sokulmamış daha büyük agregalarla imal edilmiştir ve bu, zaman zaman, Şekil 8D ve 8E'de gösterilen örneklerde olduğu gibi, kültürde mikro-kolonların dışına çıkan agregalara neden olabilir. Bunu önlemek için, agregalar, Mikro kolon içerisine tamamen sokulmalıdır.Bu durum önceki strateji uygulandıktan sonra bile kendini gösteriyorsa ECM'ye agrega yapışması için yeterli zaman sağlamak için başlangıç ​​inkübasyon süresi uzatılabilir Kültür sırasında mikro-TENN'lerin hafifçe tutulması Hidrojel kaplamanın ve sit- mimarinin bütünlüğünü korumak için önerilir; mikro-T sırasında ortaya çıkan problemlerAksi taktirde aksonal yollarda elde edilen eğriliklerin nedeni ENN manipülasyondur ( Şekil 5 ). Yine de, bu makalede sunulan protokolü izleyerek, beklenen nöronal / aksonal mimari, sinaptik öncesi dağılımı ve özünde elektriksel aktivite ile birlikte mikro-TENN'lerin tutarlı bir şekilde üretilmesine neden olmalı.

Mikro-TEN'lerin vaat etmesine rağmen, bu teknolojinin uygulamalarını sınırlayabilecek zorluklar var. Mevcut mikro-kolon üretim tekniği, mikro sütun lümeninin merkezden uzaklaştırılmasıyla sınırlandırılmıştır; bu, hücrelere mekanik ipuçlarının tutarsız bir şekilde sunumuna ( örn., Sertlik), mikro-sütun duvarının parçalanmasına ve daha sonra aksonal kanalların maruz kalmasına neden olabilir Dışa, implantasyon sırasında sorunlar. Mikro-fabrikasyonlu bir cihazın kullanımı, kılcal tüplere kıyasla sonuca katkıda bulunmuş olsa da, daha hassas mikro-fabrikasyonBu yapıların boyutsal tekrarlanabilirliklerini arttırmak için n tekniği gereklidir. Bu el yazmasında elde edilen sonuçlar, mikro-TEN yönteminin doğal nöroanatomiye benzeyen nöronlar ve aksonal yollardan oluşan canlı iskeleleri, özellikle de farklı beyin bölgelerini birbirine bağlayan aksonal bölgeleri güvenilir şekilde üretebildiğini gösterdi. Bununla birlikte, mikro TENN uzunluğu, ana aksonal yolun değiştirilmesi gereken uzunluğuna bağlı olarak bir engel oluşturmaktadır. Örneğin, doku mühendisliği yapılmış sinir greftleri (TENG'ler), araştırma grubumuz tarafından son derece uzun sinir yaralanmalarını onarmak için kullanılan ayrı bir canlı iskele stratejisidir. Bu uzun boşlukları değiştirmek için, TENG'lerdeki aksonlar, 1 , 23 , 50 numaralı özel mekanik biyoreaktörlerde sürekli mekanik gerilim uygulayarak on santimetreye kadar uzatılabilir. Bu "streç büyüme" tekniği de astrositik süreç uzunluğunu bette'e yönlendirmek için uygulanmıştırRadyal glial yolların yapısını taklit eder 51 . Tersine, mevcut mikro-TENN teknolojisi henüz bu kadar kontrol sağlamıyor; Ulaşılabilir maksimum uzunluk, geleneksel büyüme konisi aracılı uzamaya dayalı olarak, aksonal yolların in vitro büyüyebileceği ile sınırlıdır. Dahası, MSS çeşitli uyaranlara tepki olarak nörofizyolojik yeniden kablolama için özünde bir kapasiteye sahip olsa ve nakledilen hücreler, doğal devrelerle sinaptik olarak entegre olma kapasitesine sahip olsa da, bu teknolojinin bir başka kısıtlaması, mikro-TEN'lerin yerli beynin plastisitesine güveniyor olmasıdır Ve konakçı şebekelerin, implante edilmiş yapı 52 , 53 , 54 , 55 ile fonksiyonel olarak bütünleşebilme kabiliyeti. Son olarak, mikro-TENN'ler gibi tüm implant tabanlı yaklaşımların doğuştan bir eksikliği, invazivliktir. NöronlarGenellikle kılcal damarlara çok yakındır, her türlü cerrahi prosedür, kan-beyin bariyeri bozulmasına, kan faktörlerinin beyin parankim içine sızmasına ve akut (hatta kronik) bir inflamatuar yanıt oluşturmasına neden olabilir31. Bu yanıt, bu tekniğin faydalı yönlerini reddeden konakçı ve mikro-TENN nöronlarına zarar verebilir. Bununla birlikte, sıçanların kortikotalamik yoluna implante edilen mikro-TENN'ler en az 1 ay hayatta kaldı ve konakçı serebral korteks 10 , 31 ile yapısal bütünleşme bulgusu gösterdi. Ayrıca, araştırma grubumuzdan önceki bir yayın, sıçan beyinleri 31'e mikro-TENN'lerin iğnesiz yerleştirilmesini sağlayan bir metodoloji sundu. Bu yaklaşımda, bu hidrojel kaplama stratejisi, yumuşak dehidrasyon üzerine, nüfuz etmeye yetecek katılık gösteren, karboksimetilselülozun ince bir (~ 20 um) kaplaması içerecek şekilde artırıldı.Bir iğne veya kılavuzya gerek duymadan beyin 31 . Mikro kolonların küçük enine kesitleri ile birleşince, bu iğnesiz implantasyon yöntemi, stereotaksik implantasyon işlemi sırasında ve sonrasında beynin hasarını en aza indirmelidir.

Mikro-TENN'lerin in vivo olarak ön başarısına rağmen, gelecekteki çalışmalar bu yapıların sinaptik olarak doğal doku ile bütünleştiğini doğrulamak ve fonksiyonel iyileşmenin CNS yaralanması ve nörodejeneratif hastalık 10,31 modellerinde elde edilip edilmediğini araştırmak gerekecektir. Örneğin, uyarlanmış mikro-TENN'ler, spesifik hücre fenotipleri ile dizayn edilebilir ve şebekeyi yeniden oluşturmak ve fonksiyonu eski haline getirmek için ilgili dejenere yola implante edilebilir. İmplantasyonu takiben akut enflamatuar yanıtı azaltmak için, mikro-TENN hidrojel kabuğa anti-inflamatuar ve sağkalım önleyici maddeler katılabilir. Alternatif imalatHidrojel mikro-kolonları, lümen tutarlı bir şekilde merkezileştirilmesi ve boyutların tekrarlanabilirliği de dahil olmak üzere daha hassas ve daha hassas özelliklerle üretmek için teknikler ( örneğin, 3B baskı) geliştirilebilir. Mikro-TEN'lerde kullanılan aynı biyomateryal şeması, MSS hasarı ve hastalığının diğer karakteristik patolojileriyle baş etmeye yönelik olarak modifiye edilebilir. Örneğin, grubumuz daha önce aksonal rejenerasyonu ve nöronal migrasyonu kolaylaştırmak için yapısal olarak radyal glial yolları ve glial tüpü taklit eden bir agaroz hidrojelinin kollajen kaplı lümeni boyunca uzunlamasına şekilde hizalanmış astrositik demetlerden oluşan yapıları geliştirmiştir 56 . Buna ek olarak, insan embriyonik kök hücreleri (HESC) gibi kök hücreler, pluripotent kök hücreler (iPSC) ve adipoz kökenli kök hücreler (ASC) gibi otolog mikro-TEN'leri hastaya göre daha fazla üretmek üzere dahil edilebilir Kaybedilen sitolojik yapı ve hücre fenotipine çok benzemektedir. Bu futuYeniden modifikasyonlar mikro-TENNlerin in vivo dejenere yolakları değiştirme kabiliyetini artıracak ve diğer özellikler arasında astroglial destek ve aksonal miyelinasyon içeren daha sofistike doku mimarilerinin yeniden yapılandırılmasına izin verecektir. Genetik olarak tasarlanmış nöronlar, ya trofik faktörlerin salınması yoluyla mikro-TENN'lerin rejeneratif etkisini arttırmak ya da ışık geçiren iyon kanallarının optogenetik uyarımı ile MSS'nin modülasyonunu sağlamak için tohumlanmış olabilir 43 . Bu iskeleler, epilepsi, depresyon, uyuşturucu bağımlılığı veya ağrı bozuklukları gibi durumlarda mevcut disfonksiyonel konakçı bağlantılarını sinaptik olarak modüle etmek için eksitatör veya inhibitör nöronlarla imal edilebilir 1 . Örneğin, ağırlıklı olarak GABAerjik veya glutamaterjik sinapslar oluşturan mikro-TENN'ler sırasıyla, sinaptik entegrasyon ve / veya toplu sinir sistemi yoluyla yukarı veya aşağı regüle edilmiş yolları bastırmak veya uyarmak üzere yapılabilirOtransmitter serbest bırakılması. Önemlisi, böyle kendi kendine yeten düzenleyici yapılar, teorik olarak, ana bilgisayar ağı geribildirimine 1 dayalı tepki verecektir. Benzer şekilde, mikro-TEN'ler beyin-bilgisayar arabirimleri (BCI'ler) olarak uygulanabilir; optogenetik olarak tasarlanmış mikro-TEN'ler, beyin ile inorganik uyarıcı veya kayıt cihazları arasında ara maddeler olarak görev yaparlar. Bu uygulama, spesifik hücre hedefleme ve mekanik stabiliteye sahip olmayan ve inflamatuar yanıtlara, glial skar oluşumuna ve beyine nüfuz ederken nöronal migrasyona veya kayba neden olan mikroelektrot BCI'ye alternatif olabilir 57 , 58 .

İn vitro test yatakları gibi mikro-TENN'ler, sinir sisteminin biyo-füze modelleri olarak işlev gören nörobiyoloji ve elektrofizyoloji çalışması için güçlü bir platform sağlayabilir. Ayrıca, 3D yapılar nöral inj olarak kullanıldığında tedavi stratejileri için test yatakları olarak hizmet edebilirÜreme ve hastalık modelleri 59 . 3D yapılar olarak, mikro-TENN'ler, düzlemsel kültürlerde tam olarak gösterilemeyen tüm mekansal yönlerde karmaşık hücre hücresi ve hücre-ECM etkileşimleri ile karakterize edilen in vivo ortamı simüle edebilmektedirler 42 , 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65 . Gerçekten de, çeşitli araştırmalar, çevre tipinin, yeryüzünde sergilenen morfolojiyi, çoğalmayı, göçü, gen ifadesini, farklılaşmayı ve sinyal vermeyi sunması için hücreler için kritik olduğunu tespit etmiştir60. Bu iskeletlerin 3D ortamı ile beynin kendisi arasındaki benzerlikler, bu yapıların fiziksel ve biyokimyasal pr üzerinde sundukları kontrol derecesi ile tamamlanmaktadırOperasyonlar 42 . Bu, mekanik, haptotaksik ve kemotaksik sinyallerin farklı setleri ile mikro-TEN'lerin mühendislik etmesine, bu ipuçlarının tek tek veya sinerjistik olarak nöronal sağkalım, olgunlaşma, aksonal uzantı, sinaptojenez ve mekanotransformasyon üzerindeki etkisini incelemek için 32 , 42 , 63 izin verir. Dahası, bu mikro doku mühendisliği tekniğinin tasarım esnekliği, neokorteksin kolumnar bölünmüş yapısı olan connectome'nun aksonal yolları ile örtüşen beyin dokusunun diğer özelliklerini taklit eden yaşayan iskeletlerin yapımına izin verir; Beynin çalışılması için bir in vitro platform olarak bu sistemin gücü 65 . Araştırma platformları olan mikro-TENN'ler, tipik in vitro modellerin kontrollü ayarından yararlanır; doku içindeki tasarım parametrelerinin geniş bir şekilde kullanılabilirliğiNazik yaklaşımları ve 3D platformların fizyolojik ve patofizyolojik olarak artan nevrobiyolojik bilgisini arttırmak için ideal bir test yatağı haline gelmesini sağlamıştır. Bu teknoloji ile ilgili sayısız ileriye dönük talimatlar, mikro-TEN'lerin çok yönlülüğünü özetlemektedir. Bu el yazması, mikro-TEN protokolünün, beyin nöroanatomisinin önemli özelliklerini taklit eden, gelişme, hastalık ve onarım süreçleri de dahil olmak üzere nörobiyolojik olaylara yeni kavrayışlar sunmak için doku mühendisliği yapılmış yaşayan iskeletlerini güvenilir bir şekilde üretebildiğini göstermiştir. Bu yapılar ayrıca hasar görmüş beyaz cevher yollarını yeniden yapılandırmak, kaybolmuş nöronal hücreleri değiştirmek ve merkezi sinir sistemi yaralanması ve hastalığı takiben düzensiz yolları modüle etmek için doğal doku ile sinaptik olarak entegre olabilirler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Mali destek, Michael J. Fox Vakfı (Terapötik Boru Hattı Programı # 9998 (Cullen)), Ulusal Sağlık Enstitüleri U01-NS094340 (Cullen), T32-NS043126 (Harris) ve F31-NS090746 (Katiyar)) tarafından sağlandı. (Cullen), Penn Sciences Neuroscience Merkezi Pilot Ödülü (Cullen), Ulusal Bilim Vakfı (Yüksek Lisans Araştırma Bursu DGE-1321851 (Struzyna ve Adewole)), Gazi İşleri Departmanı (RR & D Merit İncelemesi # B1097-I (Cullen)), Amerikan Derneği Nörolojik Cerrahlar Kongresi ve Nörolojik Cerrahlar Kongresi (2015-2016 Nörotravma ve Kritik Bakımda Kod Adam Bursu (Petrov)) ve ABD Ordusu Tıbbi Araştırma ve Materiel Komutanlığı (# W81XWH-13-207004 (Cullen) ve W81XWH-15-1- 0466 (Cullen)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laser cutter Universal Laser Systems PLS4.75 Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold.
Laser-cut micro-column fabrication device Custom-made -------------- Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Screws -------------- -------------- #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Nuts -------------- -------------- #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Acupuncture needle (180 µm diameter) Lhasa Medical sj.16X40 The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish Fisher 08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Invitrogen 14200075
Polystyrene disposable serological pipet Fisher 13-678-11D
Agarose Sigma A9539-50G
Capillary tube (398 µm diameter) Fisher 21170D The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Hot plate Fisher SP88857200
Magnetic bar Fisher 1451352
Micropipette Sigma Z683884-1EA
25 mm gauge needle Fisher 14-826-49
Microscalpel Roboz Surgical RS-6270
Scissors Fine Science Tools 14081-09
Forceps World Precision Instruments 501985
Hot bead sterilizer Sigma Z378550-1EA
Stereoscope Nikon SMZ800N Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication.
Rat tail type I collagen Corning 354236 Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube Fisher 02-681-256
Mouse laminin Corning 354232 Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Neurobasal medium Invitrogen 21103049 Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher SS2661
Hydrochloric acid (HCl) Fisher SA48-1
Litmus paper Fisher 09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS) Invitrogen 14170112 Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I Sigma 10104159001 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 Supplement Invitrogen 12587010 Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine  Invitrogen 35050061 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Sprague Dawley embryonic day 18 rats Charles River Strain 001
Pasteur pipette Fisher 22-042816
15 mL centrifuge tube EMESCO 1194-352099
Vortex Fisher 02-215-414
Centrifuge Fisher 05-413-115
Hemocytometer Fisher 02-671-6
Objet30 3D-Printer Stratasys  -------------- Used to fabricate the pyramidal micro-well molds.
3D-printed pyramidal well mold Custom-made -------------- Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent Fisher NC9285739 Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood.
Funnel Fisher 10-348C
1 ml pipette bulb Sigma Z509035
Micro-spatula Fisher S50821
12-well culture plate EMESCO 1194-353043
Oven Fisher 11-475-154
Incubator Fisher 13 998 076
AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 UPenn Vector Core 36373 Store at -80ºC. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator.
Formaldehyde 40% Fisher F77P-4 Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container. 
Triton X-100 Sigma T8787 Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes.
Horse serum Gibco 16050-122
Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody Sigma T8578-200UL Store at -20ºC.
Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody Synaptic Systems 106-001 Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody Invitrogen A10037 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody Invitrogen A21206 Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride Invitrogen H3570 Store at 4ºC.  Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen.  Therefore, it must be disposed of in a separate container.
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope  Nikon -------------- Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope  Nikon -------------- Used for taking the phase-contrast images.  With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).
High-speed Fluorescence Microscope Nikon -------------- Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging.
NIS Elements AR 4.50.00 Software Nikon Instruments -------------- Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10, (5), 679-685 (2015).
  2. Tallantyre, E. C., Bø, L., et al. Clinico-pathological evidence that axonal loss underlies disability in progressive multiple sclerosis. Mult. Scler. 16, (4), 406-411 (2010).
  3. Cheng, H. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical Progression in Parkinson Disease and the Neurobiology of Axons. Ann. Neurol. 67, (6), 715-725 (2010).
  4. Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Axonal pathology in traumatic brain injury. Exp. Neurol. 246, 35-43 (2013).
  5. Hinman, J. D. The back and forth of axonal injury and repair after stroke. Curr. Opin. Neurol. 27, (6), 615-623 (2014).
  6. Li, X., Katsanevakis, E., Liu, X., Zhang, N., Wen, X. Engineering neural stem cell fates with hydrogel design for central nervous system regeneration. Prog. Polym. Sci. 37, (8), 1105-1129 (2012).
  7. Horner, P. J., Gage, F. H. Regenerating the damaged central nervous system. Nature. 407, (6807), 963-970 (2000).
  8. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, (8), 617-627 (2006).
  9. Montani, L., Petrinovic, M. M. Targeting Axonal Regeneration: The Growth Cone Takes the Lead. J. Neurosci. 34, (13), 4443-4444 (2014).
  10. Struzyna, L. A., Wolf, J. A., et al. Rebuilding Brain Circuitry with Living Micro-Tissue Engineered Neural Networks. Tissue Eng. Part A. 21, (21-22), 2744-2756 (2015).
  11. Huebner, E. a, Strittmatter, S. M. Axon Regeneration in the Peripheral and Central Nervous Systems. Results Probl. Cell Differ. 48, 339-351 (2009).
  12. Benowitz, L. I., Yin, Y. Combinatorial Treatments for Promoting Axon Regeneration in the CNS: Strategies for Overcoming Inhibitory Signals and Activating Neurons' Intrinsic Growth State. Dev. Neurobiol. 67, (9), 1148-1165 (2007).
  13. Lie, D. C., Song, H., Colamarino, S. A., Ming, G., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Brain: New Strategies for Central Nervous System Diseases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, 399-421 (2004).
  14. Gao, Y., Yang, Z., Li, X. Regeneration strategies after the adult mammalian central nervous system injury-biomaterials. Regen. Biomater. 3, (2), 115-122 (2016).
  15. Benfey, M., Aguayo, A. J. Extensive elongation of axons from rat brain into peripheral nerve grafts. Nature. 296, (11), 150-152 (1982).
  16. David, S., Aguayo, A. J. Axonal Elongation into Peripheral Nervous System "Bridges" after Central Nervous System Injury in Adult Rats. Science. 214, (4523), 931-933 (1981).
  17. Shoichet, M. S., Tate, C. C., Baumann, M. D., LaPlaca, M. C. Strategies for Regeneration and Repair in the Injured Central Nervous System. Indwelling Neural Implant. Strateg. Contend. with Vivo Environ. at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK3941/ (2008).
  18. Lu, P., Tuszynski, M. H. Growth factors and combinatorial therapies for CNS regeneration. Exp. Neurol. 209, (2), 313-320 (2008).
  19. Curinga, G., Smith, G. M. Molecular/genetic manipulation of extrinsic axon guidance factors for CNS repair and regeneration. Exp. Neurol. 209, (2), 333-342 (2008).
  20. Mehta, S. T., Luo, X., Park, K. K., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. Hyperactivated Stat3 boosts axon regeneration in the CNS. Exp. Neurol. 280, 115-120 (2016).
  21. Elliott Donaghue, I., Tam, R., Sefton, M. V., Shoichet, M. S. Cell and biomolecule delivery for tissue repair and regeneration in the central nervous system. J. Control. Release. 190, 219-227 (2014).
  22. Tam, R. Y., Fuehrmann, T., Mitrousis, N., Shoichet, M. S. Regenerative therapies for central nervous system diseases: a biomaterials approach. Neuropsychopharmacology. 39, (1), 169-188 (2014).
  23. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H., Pfister, B. J. Neural Tissue Engineering for Neuroregeneration and Biohybridized Interface Microsystems In vivo (Part 2). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, (3), 243-262 (2011).
  24. Han, Q., Jin, W., et al. The promotion of neural regeneration in an extreme rat spinal cord injury model using a collagen scaffold containing a collagen binding neuroprotective protein and an EGFR neutralizing antibody. Biomaterials. 31, (35), 9212-9220 (2010).
  25. Suzuki, H., Kanchiku, T., et al. Artificial collagen-filament scaffold promotes axon regeneration and long tract reconstruction in a rat model of spinal cord transection. Med. Mol. Morphol. 48, (4), 214-224 (2015).
  26. Silva, N. A., Salgado, A. J., et al. Development and Characterization of a Novel Hybrid Tissue Engineering-Based Scaffold for Spinal Cord Injury Repair. Tissue Eng. Part A. 16, (1), 45-54 (2009).
  27. Moore, M. J., Friedman, J. A., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27, (3), 419-429 (2006).
  28. Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J. Neurotrauma. 21, (6), 789-804 (2004).
  29. Chen, B. K., Knight, A. M., et al. Axon regeneration through scaffold into distal spinal cord after transection. J. Neurotrauma. 26, (10), 1759-1771 (2009).
  30. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27, (3), 497-504 (2006).
  31. Harris, J. P., Struzyna, L. A., Murphy, P. L., Adewole, D. O., Kuo, E., Cullen, D. K. Advanced biomaterial strategies to transplant preformed micro-tissue engineered neural networks into the brain. J. Neural Eng. 13, (1), 16019-16037 (2016).
  32. Cullen, D. K., Tang-Schomer, M. D., et al. Microtissue engineered constructs with living axons for targeted nervous system reconstruction. Tissue Eng. Part A. 18, (21-22), 2280-2289 (2012).
  33. Tate, M. C., Shear, D. A., Hoffman, S. W., Stein, D. G., Archer, D. R., LaPlaca, M. C. Fibronectin promotes survival and migration of primary neural stem cells transplanted into the traumatically injured mouse brain. Cell Transplant. 11, (3), 283-295 (2002).
  34. Denham, M., Parish, C. L., et al. Neurons derived from human embryonic stem cells extend long-distance axonal projections through growth along host white matter tracts after intra-cerebral transplantation. Front. Cell. Neurosci. 6, (11), (2012).
  35. Fawcett, J. W., Barker, R. A., Dunnet, S. B. Dopaminergic neuronal survival and the effects of bFGF in explant, three dimensional and monolayer cultures of embryonic rat ventral mesencephalon. Exp. Brain Res. 106, (2), 275-282 (1995).
  36. Mine, Y., Tatarishvili, J., Oki, K., Monni, E., Kokaia, Z., Lindvall, O. Grafted human neural stem cells enhance several steps of endogenous neurogenesis and improve behavioral recovery after middle cerebral artery occlusion in rats. Neurobiol. Dis. 52, 191-203 (2013).
  37. Ren, H., Chen, J., Wang, Y., Zhang, S., Zhang, B. Intracerebral neural stem cell transplantation improved the auditory of mice with presbycusis. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 6, (2), 230-241 (2013).
  38. Sinclair, S. R., Fawcett, J. W., Dunnett, S. B. Dopamine cells in nigral grafts differentiate prior to implantation. Eur. J. Neurosci. 11, (12), 4341-4348 (1999).
  39. Tate, C. C., Shear, D. A., Stein, D. G., Tate, M., LaPlaca, M. C., Archer, D. R. Laminin and fibronectin scaffolds enhance neural stem cell transplantation into the injured brain. J. Tissue Eng. Regen. Med. 3, (3), 208-217 (2009).
  40. Yoo, S. J., Kim, J., Lee, C. -S., Nam, Y. Simple and novel three dimensional neuronal cell culture using a micro mesh scaffold. Exp. Neurobiol. 20, (2), 110-115 (2011).
  41. Chen, H. I., Jgamadze, D., Serruya, M. D., Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H. Neural Substrate Expansion for the Restoration of Brain Function. Front. Syst. Neurosci. 10, (2016).
  42. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V. N., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, (3), 201-240 (2011).
  43. Struzyna, L. A., Katiyar, K., Cullen, D. K. Living scaffolds for neuroregeneration. Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. 18, (6), 308-318 (2014).
  44. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS One. 3, (2), (2008).
  45. Dahotre, N. B., Harimkar, S. Laser fabrication and machining of materials. Springer Science & Business Media. (2008).
  46. Kutter, J. P., Klank, H., Snakenborg, D. Microstructure fabrication with a CO2 laser system. J. Micromechanics Microengineering. 14, (2), (2004).
  47. Spicar-Mihalic, P., Houghtaling, J., Fu, E., Yager, P., Liang, T., Toley, B. CO2 laser cutting and ablative etching for the fabrication of paper-based devices. J. Micromechanics Microengineering. 23, (6), (2013).
  48. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. (63), (2012).
  49. Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
  50. Huang, J. H., Cullen, D. K., et al. Long-Term Survival and Integration of Transplanted Engineered Nervous Tissue Constructs Promotes Peripheral Nerve Regeneration. Tissue Eng. Part A. 15, (7), 1677-1685 (2009).
  51. Katiyar, K. S., Winter, C. C., Struzyna, L., Harris, J. P., Cullen, D. K. Mechanical elongation of astrocyte processes to create living scaffolds for nervous system regeneration. J. Tissue Eng. Regan. Med. (2016).
  52. Howard, M. A., Baraban, S. C. Synaptic integration of transplanted interneuron progenitor cells into native cortical networks. J. Neurophysiol. 116, (2), 472-478 (2016).
  53. Wernig, M., Benninger, F., et al. Functional Integration of Embryonic Stem Cell-Derived Neurons In Vivo. J. Neurosci. 24, (22), 5258-5268 (2004).
  54. Ganguly, K., Poo, M. Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside. Neuron. 80, (3), 729-741 (2013).
  55. Dancause, N. Extensive Cortical Rewiring after Brain Injury. J. Neurosci. 25, (44), 10167-10179 (2005).
  56. Winter, C. C., Katiyar, K. S., et al. Transplantable living scaffolds comprised of micro-tissue engineered aligned astrocyte networks to facilitate central nervous system regeneration. Acta Biomater. 38, 44-58 (2016).
  57. Adewole, D. O., Serruya, M. D., et al. The Evolution of Neuroprosthetic Interfaces. Crit. Rev. Biomed. Eng. 44, (1-2), 123-152 (2016).
  58. Cullen, D. K., Patel, A., Doorish, J. F., Smith, D. H., Pfister, B. J. Developing a tissue-engineered neural-electrical relay using encapsulated neuronal constructs on conducting polymer fibers. J. Neural Eng. 5, (4), 374-384 (2008).
  59. Cullen, D. K., Stabenfeldt, S. E., Simon, C. M., Tate, C. C., LaPlaca, M. C. In Vitro Neural Injury Model for Optimization of Tissue-Engineered Constructs. J. Neurosci. Res. 85, 3642-3651 (2007).
  60. Irons, H. R., Cullen, D. K., Shapiro, N. P., Lambert, N. A., Lee, R. H., Laplaca, M. C. Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation. J. Neural Eng. 5, (3), 333-341 (2008).
  61. Morrison, B. I., Cullen, D. K., LaPlaca, M. In Vitro Models for Biomechanical Studies of Neural Tissues. Stud. Mechanobiol. Tissue Eng. Biomater. 3, 247-285 (2011).
  62. Vukasinovic, J., Cullen, D. K., Laplaca, M. C., Glezer, A. A microperfused incubator for tissue mimetic 3D cultures. Biomed. Microdevices. 11, (6), 1155-1165 (2009).
  63. Cullen, D. K., Lessing, M. C., Laplaca, M. C. Collagen-dependent neurite outgrowth and response to dynamic deformation in three-dimensional neuronal cultures. Ann. Biomed. Eng. 35, (5), 835-846 (2007).
  64. LaPlaca, M. C., Vernekar, V. N., Shoemaker, J. T., Cullen, D. K. Three-dimensional neuronal cultures. Methods Bioeng. 3D Tissue Eng. (2010).
  65. Chwalek, K., Tang-Schomer, M. D., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vitro bioengineered model of cortical brain. Nat. Protoc. 10, (9), 1362-1373 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics