A متعدد حفرة Cryovial يزيل تجميد قطع أثرية عندما منغمسين الأنسجة العضلية مباشرة في النيتروجين السائل

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

يصف هذا البروتوكول إجراء لتجميد الأنسجة العضلية التي تغرق بها مباشرة في النيتروجين السائل. كما يسلط الضوء على هذا البروتوكول cryovial الجديدة التي يمكن أن تجنب "تأثير بطانية" من غاز النيتروجين عندما الاتصالات النيتروجين السائل على سطح الأنسجة من العينة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Huang, Y., He, M., Zeng, Q., Li, L., Zhang, Z., Ma, J., Duan, Y. A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen. J. Vis. Exp. (122), e55616, doi:10.3791/55616 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تواجه دراسات على فسيولوجيا العضلات والهيكل العظمي التحدي الفني للمعالجة بشكل مناسب العينات للحصول على المقاطع مع مقصورات حشوية واضحة للعيان. عقبة أخرى هي بدل ضيق من myofibers إلى الأنسجة المحيطة بها. لأن عملية تثبيت الأنسجة وتضمينها البارافين يؤدي إلى انكماش ألياف العضلات التجميد هو وسيلة مثلى لتصلب الأنسجة العضلية لباجتزاء. ومع ذلك، تحدث مشكلة شيوعا التي تواجهها، وتشكيل بلورات الثلج، أثناء إعداد الأبواب المجمدة بسبب ارتفاع محتوى الماء من العضلات. بروتوكول المعروضة هنا يصف أولا طريقة بسيطة وفعالة لتجميد أنسجة العضلات بشكل صحيح عن طريق غمر لهم في النيتروجين السائل. المشكلة باستخدام النيتروجين السائل وحده هو أنه يؤدي إلى تشكيل حاجز غاز النيتروجين بجانب الأنسجة، الذي يعمل بمثابة عازل ويحول دون تبريد الأنسجة. لتجنب هذا "بطانية البخار" تأثير، وشمال شرقوقد تم تصميم cryovial ث لزيادة سرعة تدفق السائل حول سطح الأنسجة. وقد تحقق ذلك من خلال اللكم ما مجموعه 14 الثقوب مدخل في جدار القارورة. وفقا لديناميات فقاعة، وهو معدل أعلى من النتائج تدفق السائل في فقاعات أصغر وأقل فرص لتشكيل حاجز الغاز. عندما يتدفق النيتروجين السائل في cryovial من خلال الثقوب مدخل، وسرعة تدفق في جميع أنحاء الأنسجة سريعة بما يكفي للقضاء على حاجز الغاز. مقارنة لطريقة تجميد أنسجة العضلات باستخدام نظير البنتان قبل المبردة، وهذا البروتوكول هو أبسط وأكثر كفاءة، ويمكن استخدامها لتجميد العضلات بطريقة الإنتاجية. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب هو الأمثل للمؤسسات التي ليس لديها إمكانية الوصول إلى نظير البنتان، وهي قابلة للاشتعال للغاية في درجة حرارة الغرفة.

Introduction

الهيكل العظمي والعضلات هي العنصر الأكثر قيمة من الحيوانات المنتجة للحوم من الناحية التغذوية وتجهيز الرأي. في صناعة اللحوم، هناك جانبان خصوصا الحرجة: كفاءة نمو العضلات ونوعية اللحوم الناتجة عن ذلك. كعنصر رئيسي من العضلات، وألياف العضلات هي ذات الصلة مباشرة إلى أداء النمو وجودة اللحوم الطازجة في الحيوانات 1. على سبيل المثال، فإن العدد الإجمالي للألياف (TNF) ومنطقة مستعرضة للألياف (CSAF) تحديد معظمهم من كتلة العضلات وجودة اللحوم. أيضا، نوع من الألياف التركيب (FTC) تؤثر بقوة جودة اللحوم الطازجة 2. ولذلك، فإن التلاعب في خصائص الألياف العضلية في الحيوانات هي طريقة فعالة للغاية لزيادة الربحية الأساسية والقدرة التنافسية للمزارع 1.

حتى الآن، وقد تم تحديد العديد من العوامل الجوهرية وخارجي لمعالجة الألياف العضلية characteristICS 1. هذا التلاعب لا يمكن أن يتحقق من خلال اختيار المستهدفة من الحيوانات مع جينات معينة، مثل الجين Myostatin في الماشية والجينات Callipyge في الأغنام وRYR1 والجينات IGF2 الخنازير 5. أيضا، مراقبة النظام الغذائي والعلاجات مع هرمونات معينة تلعب دورا هاما في خصائص الألياف العضلية 6. وهكذا، وهو نهج يجمع بين العوامل الوراثية والغذائية قد تكون قادرة على تحسين محتوى اللحوم الخالية من الدهون وجودة اللحوم. ومع ذلك، تقتصر الدراسات على ألياف العضلات في صناعة اللحوم لاستجلاء هيكل من ألياف العضلات لا يزال يشكل تحديا.

يتم تحديد خصائص الألياف العضلية باستخدام أساليب النسيجية، مثل فحص الميوسين الأدينوزين فسفاتاز (أتباز). ويعتمد هذا الأسلوب على حقيقة أن الإنزيمات الموجودة في أقسام رقيقة (6-8 ميكرون) المجمدة منألياف العضلات يمكن أن يتفاعل كيميائيا مع بعض المنتجات. ومع ذلك، فإن المحتوى المائي للعضلات أكبر من 75٪ في الخنازير والأرانب والفئران والبشر، بغض النظر عن موقف (أي والظهر والبطن، أو hindlimb) 7. هذا نسبة عالية من الرطوبة في العضلات يسبب مشكلة تصادفها - تجميد التحف - أثناء إعداد cryosections، كما هو موضح سابقا 8 و 9. في معظم الحالات، فإنه يكاد يكون من المستحيل لتجميد الأنسجة العضلية بشكل مناسب في خط إنتاج المسلخ، وفقا لتجربتنا.

بروتوكول المعروضة هنا يصف طريقة بسيطة وفعالة المستخدمة في المختبر لدينا لتجميد الأنسجة العضلية لcryosectioning بطريقة عالية الإنتاجية. تسليط الضوء على هذا الأسلوب هو cryovial الجديد الذي تم تصميمه لأنسجة العضلات فلاش تجميد في النيتروجين السائل. سير العمل الحالي يمكن أن تسهل في الوقت نفسه الأنسجةتجميد وتصنيع لcryosection العضلات ممتازة، مع حجرة حشوية واضحة للعيان وبدل ضيق من myofibers إلى الأنسجة المحيطة بها. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق هذا البروتوكول لمجموعة واسعة من الخيارات لتحليل الأنسجة لأن النيتروجين السائل لا يمتزج مع الأنسجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تأسيس الطريقة الحالية والتحقق من صحتها لحصاد وتخزين أكثر من 1000 عينة العضلات لتلطيخ النسيجي في مختبرنا. وجاءت جميع الإجراءات التي تنطوي على رعاية الحيوان واستخدام المبادئ التوجيهية التي وضعتها وزارة الزراعة في الصين.

1. المعدات اللازمة لجمع العينات

  1. تسمية هوية العينة على كل قارورة المبردة.
    ملاحظة: قارورة المبردة صمم خصيصا لتجميد عينات أنسجة جديدة لهذا الإجراء cryosection (الشكل 1A). مصنوعة من قوارير من البولي بروبلين في قالب المصنع (الشكل 1C).
  2. الحصول على المعدات التالية: النيتروجين السائل في خزان النتروجين السائل المناسب، ونظارات السلامة أو درع الوجه، والقفازات الثلاجة، 10 سم ملقط، 25 ملاقط سم، برودة الستايروفوم (الأبعاد الداخلية: 20 سم × 12 سم واسعة × 13.5 سم ارتفاع ؛ الأبعاد الخارجية: 24 سم × 16 سم × 15 سم ارتفاع)، فيلم من البلاستيك (2.5 سم × 0.8 سم واسعة × 0.1 مم)،مشرط، ويغطي ملزمة A4 PVC (21 سم × 29.5 سم) (الشكل 1B).

2. إعداد عينات العضلات

  1. ملء برودة الستايروفوم مع النتروجين السائل 5 دقائق قبل جمع العينة.
    ملاحظة: عمود كبير من النيتروجين السائل أمر ضروري لأن جزءا من النيتروجين السائل يغلي بعيدا ويتحول إلى غاز عندما تلمس عينات جديدة منه. من أجل الحد من وتيرة نقل النيتروجين السائل لتجديد الخسارة، يجب أن تكتسب برودة الستايروفوم بحجم مناسب مقدما وفقا لعدد من العينات.
  2. مرة واحدة يتم الحصول على العينة، وضع بلطف على قطعة من غطاء ملزمة A4 PVC ومراقبة اتجاه الألياف العضلية.
    ملاحظة: هنا، استخدمنا المقطع العرضي للعضلة الطولى دوريس من الأول إلى فقرة القطنية الأخيرة في الخنازير. العينات هي حوالي 12 سم، 8 سم واسعة، وارتفاع 5 سم.
  3. استخدام مشرط لجعل اثنين من الشقوق موازية من خلال ط عينةن اتجاه الألياف العضلية، ما يقرب من 3 سم في الطول و 0.6 سم عن بعضها البعض. تقليم العضلات قطعي في مستطيل حوالي 0.6 سم واسعة × 0.6 سم ارتفاع × 1.5 سم.
    ملاحظة: موثوقية لقياس مساحة المقطع العرضي للألياف العضلات يعتمد في الغالب على اتجاه الألياف في عضلة قطعي.
  4. استخدام 10 سم ملقط لوضع بلطف العينة على قطعة من البلاستيك فيلم، مع المحور الطولي للبالتوازي العضلات قطعي إلى حافة طويلة من الفيلم (الشكل 2A).
    ملاحظة: فيلم من البلاستيك وظيفتين: وظيفة القابضة التي تساعد في تحديد اتجاه الألياف العضلية وظيفة التصاق أن يمنع التشققات في العينة بسبب تجميد السريع.
  5. باستخدام ملقط، ضع الأنسجة العضلية في منتصف السفلي من القارورة المبردة المسمى، فقط بين الثقوب مدخل، ثم الغطاء بإحكام القارورة (الشكل 2B).

3. تجميد وتخزين عينة العضلاتالصورة

  1. استخدام ملاقط 25 سم، وسرعان ما يغرق القارورة المبردة كاملة في النيتروجين السائل في برودة الستايروفوم تبرد قبل، والانتظار حتى النيتروجين السائل لا تغلي (حوالي 10-20 ق).
    ملاحظة: سيتم cryovial تطفو عندما النيتروجين السائل يغلي، لذلك بعناية تزج القارورة في النيتروجين السائل المغلي لمدة 10-20 ثانية.
  2. نقل عينات العضلات إلى خزان تخزين النتروجين السائل أو -80 ° C الثلاجة لمدة التخزين على المدى الطويل.

4. شريحة التحضير

  1. Precool ناظم البرد إلى ما بين -20 درجة مئوية و -22 ° C.
  2. إزالة والتخلص من شفرة مشراح القديمة، ومسح أسفل حامل سكين ولوحة مكافحة لفة في ناظم البرد، تثبيت شفرة مشراح جديدة في ناظم البرد، وتعيين سماكة القطع الى 8 ميكرون.
  3. نقل عينة العضلات في القارورة المبردة من خزان النتروجين السائل أو الفريزر -80 درجة مئوية إلى ناظم البرد، نقله في النيتروجين السائل أو على الثلج الجاف. انتظر 30 دقيقة لعينة لكي تتوازن مع درجة حرارة ناظم البرد.
    ملاحظة: أي معدات قد لمس العينة يجب أن يكون قبل تبريده، وذلك لأن درجة حرارة عالية قد تتسبب في تكوين بلورات الثلج في العينة.
  4. جبل العينة في حامل العينة تحت درجة حرارة صياغة قطع المثلى من الجليكول وراتنجات للذوبان في الماء (OCT). قطع أقسام 8 ميكرومتر.
    ملاحظة: ضبط زاوية القطع عموديا على اتجاه الألياف العضلية، لأن CSAF هو منطقة مستعرضة من الألياف العضلية.
  5. جبل أقسام نحو وسط شريحة مجهرية درجة حرارة الغرفة. المكان على الفور الشريحة في مربع الشريحة في الفريزر -80 درجة مئوية. لا تسمح الشريحة لتجف في RT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وتظهر التوضيح cryovial والمعدات المختبرية الشائعة لتجميد العضلات أثناء إعداد أقسام المجمدة في الشكل 1. مصنوعة من مادة البولي بروبيلين cryovials في مصنع العفن. كل قارورة لديها ما مجموعه 14 الثقوب مدخل: واحد على الغطاء. وآخر هو في الأسفل. والباقي 12 شكل أربعة خطوط متوازية، مع كل أربعة ثقوب في 90 درجة مع بعضها البعض. ويمكن لهذه الثقوب مدخل تسريع سرعة تدفق النيتروجين السائل بجانب الأنسجة لتجنب "بطانية البخار" تأثير عندما الاتصالات النيتروجين السائل الأنسجة. ونتيجة لذلك، شكل عدد قليل جدا من بلورات الجليد في العينات المجمدة. الأهم من ذلك، نظير البنتان، السائل متقلبة للغاية وقابل للاشتعال مع نقطة الغليان عند 28 درجة مئوية، وليس من الضروري في هذا الإجراء.

لمزيد من تسليط الضوء على الاستفادة من هذا الأسلوب، نحن جمدت الطولى الظهرية العضلاتفي الخنازير باستخدام خمس طرق التجميد ثم لاحظ خصائص تلطيخ وتفاصيل النسيجية باستخدام الهيماتوكسيلين / يوزين (HE) وصمة عار (الشكل 3). وكانت القضية التي تعترض عادة تشكيل بلورات الجليد خلال إعداد العضلات لcryosection. عندما وضعت العينة مباشرة في الفريزر -80 درجة مئوية (الشكل 3A)، بلورات الثلج الكبيرة شكلت ثم تسبب في المعروف "الجبن السويسري" تأثير في cryosection العضلات. وعلاوة على ذلك، شكلت بلورات الثلج أيضا عندما كانت مغمورة الأنسجة العضلية مباشرة في النيتروجين السائل (الشكل 3B). على الرغم من النيتروجين السائل هو سائل بارد جدا (-190 ° C)، ثابت حرارتها منخفضة للغاية. عند أي اتصالات عينة النيتروجين السائل، وبطانية بخار يمكن أن تتراكم بجانب الأنسجة وعزل تغلغل البرد في الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك، وهو إجراء روتيني لتجميد العينات في مختبرات علم الأمراض هو لم ينطبق على الأنسجة العضلية. اق هو مبين في الشكل 3C، العديد من تشبه الإبرة بلورات الثلج التي تشكلت في حجرة هيولي من myofibers بعد تراجع الأنسجة العضلية في أكتوبر المتوسطة المتزايدة في الاتجاه الصحيح ومن ثم تجميدها بسرعة في الطين من نظير البنتان (-160 درجة مئوية). وفي الختام، فإن معدل التجميد المناسب لأنسجة العضلات يجب أن اجتمعت بدقة في العملية.

البروتوكول الحالي يحقق سلامة عينة ممتازة، مع حجرة حشوية واضحة للعيان وبدل ضيق من myofibers إلى الأنسجة المحيطة بها (الشكل 3D). انها تسمح لرؤية ممتازة من خصائص التمثيل الغذائي من الألياف العضلية باستخدام فحص الميوسين أتباز (الشكل 3E). لهذا الاختبار، تم تحليل للميوسين النشاط أتباز استنادا إلى حقيقة أن ألياف العضلات التعاقد سريع (نوع الثدييات 2A و 2B) يتحلل ATP أسرع من ألياف بطيئة المقاولات (نوع الثدييات 1). عندما تعطى equivaقدمت مرة والألياف التعاقد سريع تظهر ضوء، مع درجتين، والألياف بطيئة التعاقد تظهر سوداء. الأهم من ذلك، هذه الطريقة يمكن استخدامها بكفاءة في بيئة عالية الإنتاجية لأنه من السهل القيام بها ويوفر الوقت (الشكل 4). في الوقت الحاضر، وهي طريقة تجميد راسخة هو غمر الأنسجة العضلية في الطين من نظير البنتان من دون اتصال مع أكتوبر المتوسطة المتزايدة، كما هو موضح سابقا 8 و 9 (الشكل 3F). في هذا الإجراء، فإنه يأخذ تقريبي 30 دقيقة لحالة الطين الصلبة والسائلة من 240 مل من نظير البنتان التي يتعين تحقيقها بحلول ما قبل التبريد ونظير البنتان في النيتروجين السائل واثارة حتى تظهر رواسب بيضاء صغيرة في الجزء السفلي (الشكل 4). هناك ثلاث صعوبات عملية من قبل الباحثين واجهتها أثناء محاولة تجميد الأنسجة العضلية في نظير البنتان قبل المبردة: (1) الدولة الطين الصلبة والسائلة من isopantane صعبة للحفاظ عندماأخذ العينات الوقت أكثر من 1 ساعة. في محاولاتنا السابقة، وعادة ما حدث التحف التجمد في العينات التي تم القيام به في المراحل المتوسطة والمتأخرة من العملية، عندما جمعت العشرات من الأنسجة العضلية مرة واحدة. (2) وسائل خطرة، لا يسمح isopantane في أي مكان على وسائل النقل العام. (3) نظير البنتان غير متاحة إلا في المختبرات. كثير من الباحثين في العلوم اللحوم عادة تجميد الأنسجة العضلية في مسلخ التي هي بعيدة عن المختبر والتي لا يسمح لها نظير البنتان. وبالإضافة إلى ذلك، خزعات العضلات التشخيص وغالبا ما تكون فرعية على النحو الأمثل معالجتها نظرا لعدم وجود نظير البنتان في المرافق الطبية. وبالتالي، لدينا بروتوكول تطور مهم لتجميد عينات العضلات في الحالات التي يكون فيها نظير البنتان غير متوفر.

شكل 1
الشكل 1: جهاز لتجميد العضلات. (A) والرسوم التوضيحيةمن cryovial المستخدمة في هذه الدراسة. واللكم ثقوب 14 مدخل في جدار أنبوب: واحد هو على الغطاء. وآخر هو في الأسفل. والباقي 12 شكل أربعة خطوط متوازية، مع كل أربعة ثقوب في 90 درجة مع بعضها البعض. (B) صورة لجهاز التجميد. وسيلة آمنة وفعالة لتجميد العضلات في النيتروجين السائل ينطوي على استخدام cryovial، فيلم من البلاستيك، ونظارات السلامة والقفازات الثلاجة، 10 سم ملقط، 25 ملاقط سم، برودة الستايروفوم، مشرط، وغطاء ملزمة A4 PVC. (C) والرسوم التوضيحية من العفن cryovial المقدمة من مهندس، يونوا وانغ، في مصنع القوالب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: إعداد عينات العضلات. (A يجب وضع (B) والأنسجة العضلية بين الثقوب مدخل في القارورة المبردة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): صور التمثيلية للتقييم نسيجية من عضلات خنزير الطولى الصدرية بعد مجمدة وهي استخدام خمسة طرق مختلفة.
بلورات الثلج تدمير قراءة من cryosections العضلات تصوير مع سعادة تلطيخ عندما يتم تجميد العضلات للتحليل النسيجي باستخدام أساليب غير لائقة، كما هو مبين في (AC). وقعت التحف تجميد كبيرة عندما عينات العضلات وضعها مباشرة في 80 ° C الفريزر (A) أو تراجع في السائلالنيتروجين (B). العديد من بلورات الجليد ما يشبه الإبرة شكلت داخل خلايا العضلات الفردية بعد تراجع الأنسجة العضلية في أكتوبر ومن ثم وضع مباشرة في الطين من نظير البنتان (C). بروتوكول المعروضة في هذه الدراسة يمكن القضاء على تكوين بلورات الثلج عندما يتم غمر الأنسجة العضلية ببساطة في النيتروجين السائل (D). هذا البروتوكول ينطبق على تحليل نشاط الإنزيم في العضلات المجمدة على أساس فحص الميوسين أتباز (E). طريقة تجميد القياسي لالعضلات لا أداء أفضل. وانخفض الأنسجة العضلية في الطين من نظير البنتان دون اتصال مباشر مع تصاعد المتوسط أكتوبر (F). جميع الصور هي تحت هدف 10X، باستثناء تلك مع حواف سوداء (20X). الحانات مقياس: 100 ميكرون. رأس السهم في الشكل 3C يشير صغيرة، بلورات الثلج ما يشبه الإبرة. رأس السهم والنص في الشكل 3E تشير إلى نوع من الألياف العضلية: النوع 1 يمثل ألياف بطيئة الميوسين السلسلة الثقيلة، ريب] 2A يعني الميوسين المتوسط ​​الألياف السلسلة الثقيلة، واكتب 2B يشير ميوسين السريع الألياف السلسلة الثقيلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: مقارنة سير العمل لإجراءات التجميد المستندة إلى النيتروجين السائل، وبناء نظير البنتان. في البروتوكول القائم على النيتروجين السائل، ومغمورة الأنسجة العضلية في cryovial جديد في النيتروجين السائل. في البروتوكول القائم نظير البنتان، دولة الطين من نظير البنتان يجب أن يتحقق في وقت مبكر عن طريق precooling ونظير البنتان في النيتروجين السائل واثارة حتى تظهر صغيرة، رواسب بيضاء في القاع. ثم، وتراجع الأنسجة العضلية في نظير البنتان precooled. مقارنة مع 35 دقيقة في الإجراء القائم نظير البنتان، كما هو موضح في الشكل 3F، فإنه يأخذ فقط 5 دقائق ر س استكمال إجراءات تجميد الواردة في هذا البروتوكول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5: النيتروجين السائل تدفق من خلال فتحة حاد ذو حدين. عندما غمر كامل cryovial متعددة حفرة في النيتروجين السائل، والقوات الضغط الجوي النيتروجين السائل في أنبوب من خلال الثقوب مدخل 14. وجود الثقوب يجعل تدفق تسريع خلالهم، وبالتالي زيادة السرعة. وتدفق إعادة تدوير (باللون الأزرق) يتطور المصب على الفور من الفوهة (باللون البرتقالي). D1 يشير إلى قطر فتحة على جدار الأنبوب وD2 يمثل المسافة بين فتحة وعينة العضلات (باللون الأحمر).= "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، نحن تصف الجديد، cryovial متعددة حفرة لتجميد وتخزين الأنسجة العضلية لإجراء عمليات تقييم النسيجية وظيفة العضلات. الخطوة تعديل حاسمة في هذا البروتوكول هو أن العينة في cryovial متعددة ثقب مغمورة مباشرة في النيتروجين السائل. على حد علمنا، وهذا هو أبسط وrapidest طريقة للحصول على العينات المجمدة ممتازة لcryosectioning العضلات بين الأساليب تجميد القائمة (انظر نتائج ممثل).

التحدي الفني من قبل الباحثين العضلات واجه هو أن بلورات الثلج هي الأكثر احتمالا لتشكيل عند استخدام تجميد كوسيلة لتصلب الأنسجة العضلية لباجتزاء. كما لوحظ في نتائج تمثيلية، ثلاثة عوامل تلعب دورا هاما في تحديد تجميد العضلات السليم للدراسات المرضية، بما في ذلك اختيار مصدر البارد المناسب، والتقليل من الرطوبة في العينة، وزيادة نسبة المساحة الإجمالية في اتصال مع مصدر البارد. الأول،معدل تجميد أمر بالغ الأهمية لتجنب الضرر أثناء إعداد الأنسجة المجمدة لباجتزاء. عندما تجميد بطيء، تظهر عضلات المجمدة المعروفة "الجبن السويسري" تأثير لأن تتشكل بلورات الثلج الكبيرة خارج الخلية. عندما التجميد السريع ولكن ليست سريعة بما فيه الكفاية، وتشكل أعداد كبيرة من الصغيرة، وبلورات الثلج ما يشبه الإبرة داخل خلايا العضلات الفردية. هذه بلورات الثلج ما يشبه الإبرة تسبب القليل من الضرر الهيكلي للكشف، ولكنها تجلب التأثيرات التالية: معطوبة الميتوكوندريا 10، حجم الألياف العضلية وزيادة مصطنعة 11، ودمرت وحدة من هياكل ليفية 11. وهكذا، فإن مصدر بارد عند درجة حرارة باردة بما فيه الكفاية وسرعة تجميد كافية ضرورية لتجنب تكوين بلورات الثلج في cryosections العضلات.

من الناحية المثالية، مصدر الباردة في درجات حرارة شديدة البرودة ويتم ترتيب رس الاتصال جميع الأسطح. كل من النيتروجين السائل (-190 درجة مئوية) ونظير البنتان في حالة مختلطة الصلبة والسائلة (-160 درجة مئوية) تلبية هذا الشرط. ومع ذلك، واثنين من وسائل الإعلام تجميد لها عيوبها الخاصة. النيتروجين السائل لديه منخفضة للغاية ثابت الحرارة معين. والنتيجة هي أن الاتصال بين النيتروجين السائل والأنسجة يؤدي إلى حاجز بخار أن يبني بجوار الأنسجة وكثيرا يبطئ تغلغل البرد في الأنسجة (12). وهكذا، تحدث التحف تجميد كبيرة داخل العضلات المجمدة. الدولة الطين من نظير البنتان هي وسيلة تجميد المثالي الذي لا يشكل حواجز بخار، ولكن المشكلة الرئيسية هي أن يجب استخدام نظير البنتان بالتزامن مع النيتروجين السائل من أجل تحقيق درجة حرارة الحمام السائلة من 160 ° C. وبالإضافة إلى ذلك، نظير البنتان هو السائل متقلبة للغاية وقابل للاشتعال في درجة حرارة الغرفة. ثانيا، تحتوي العضلات المفرط للمياه (> 75٪)، لذلك أي وسيلة لإدخال الرطوبة الخارجية في عينة قد يسبب تجميد التحف. على سبيل المثال، أكتوبر المتوسطة المتزايدة يضيف الماء الزائد لعضلة، لذلك بلورات الثلج هي أكثر وضوحا بكثير في تلك cryosections العضلات مقارنة بأخرى دون أكتوبر المتوسطة المتزايدة. وأخيرا، سمك الأنسجة العضلية مهم أيضا لتجميد الأنسب لأن نسبة تجميد يعتمد جزئيا على نسبة من إجمالي السطح في اتصال مع مصدر الباردة (عادة، وسمك <0.5 سم). وبناء على ذلك، فإن الطريقة الوحيدة القائمة لتجميد الأنسجة بشكل صحيح هي أن تزج الأنسجة العضلية مع سمك أقل من 0.5 سم إلى نظير البنتان تبرد قبل (160 ° C)، كما هو موضح سابقا 8.

يصف هذا البروتوكول لأول مرة كيفية تجميد أنسجة العضلات بشكل صحيح عن طريق غمر بها مباشرة في النيتروجين السائل. المشكلة باستخدام النيتروجين السائل وحده هو تشكيل غاز النيتروجين على سطح الأنسجة، وتعمل بمثابة عازل وتثبيط تبريد الأنسجةو "> 13. مثل بطانية بخار يمكن أن تشكل إلا عند دمج فقاعات سريعا حتى يتسنى للغاز النيتروجين يمكن فصل الأنسجة من النيتروجين السائل. ووفقا لديناميات فقاعة، فإن تدفق أسرع السائل يؤدي إلى فقاعات صغيرة، لأنها لديها فرص أقل لدمج 14. ولذلك، فإننا لكمات 14 ثقوب في جدار cryovial لزيادة سرعة تدفق السائل في جميع أنحاء الأنسجة وللمساعدة في تجنب "بطانية البخار" تأثير عندما الاتصالات النيتروجين السائل الأنسجة.

وبالنظر إلى أن أحد العوامل التي تحدد نجاح التجربة هو سرعة تدفق السائل في جميع أنحاء الأنسجة، وثلاث معلمات من cryovial مهمة جدا، بما في ذلك الموقف، وعدد من الثقوب، وقطره من الثقوب مدخل، والمسافة بين فتحة و العينة. معارض ديناميات السائلة أن معدل التدفق من خلال فتحة يتم تحديدها من قبل قطر الثقوب وأن تدفق إعادة تدوير يتطور على الفور إلى أسفلتيار من الفوهة (الشكل 5) 15، 16. في المقابل، فإن المسافة بين فتحة والعينة يحدد في الغالب منطقة التماس بين تدفق السوائل عالية السرعة والعينة، كما هو مبين في الشكل (5). وبالتالي، فإن cryovial متعددة ثقب في الشكل 1A هو مناسبة لعينة العضلات التي هي 0.6 سم واسعة × 0.6 سم ارتفاع × 1.5 سم. لشظايا العضلات الكبيرة، الأمر يستحق المحاولة هذا الأسلوب مع أنبوب أكبر والمزيد من الثقوب. ومع ذلك، هذا البروتوكول ليست مناسبة لتجميد عينات العضلات من الحيوانات الصغيرة، كما هو الحال في نموذج الفئران، لأن الثقوب مدخل قد تكون كبيرة جدا للحصول على عينات أصغر.

وبالإضافة إلى ذلك، ثلاث خطوات حاسمة يجب أن يتبع بدقة في البروتوكول. أولا، يجب أن يكون النيتروجين السائل الكافي لتزج cryovial كله، ويجب أن تكون القارورة المبردة كليا تحت مستوى سطح السائل. ثانيا، من الضروري لالاتصال العرضي باطلا بين العضلات المجمدة وحاويات درجة حرارة الغرفة أو الصكوك. على سبيل المثال، من دون نقل دقيق، قد تشكل بلورات الثلج جديدة عند نقل العينة المجمدة من خزان النتروجين السائل أو الفريزر -80 درجة مئوية إلى ناظم البرد. ثالثا، لا ينبغي أن يكون هناك الكثير من أكتوبر استخدامها عندما يتم تركيب العينات على حامل نظرا لاحتمال كبير لتشكيل الكريستال الجليد في جميع أنحاء منطقة التماس بين العضلات المجمدة وأكتوبر

في صناعة اللحوم، وهو إجراء العضلات cryosection أمر لا غنى عنه لعملية الفورمالين التثبيت والبارافين التضمين تسبب انكماش في الألياف العضلية، الذي يعوق تقييم بعض الصفات العضلات، مثل TNF وCSAF. وبالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة عضلة المجمدة عند تقييم FTC باستخدام فحص الميوسين أتباز. كما هو مبين في الشكل 3E، يمكن هذا البروتوكول تلبية متطلبات كل من التحليل المرضي والبقع النسيجية في العضلات. الإعدادمن cryosection هو عملية روتينية في مختبرات علم الأمراض السريرية العضلات. كما وصفها منغ وآخرون. وإجراءات التشغيل القياسية لتجميد الأنسجة العضلية هو أن تزج عينات التشريح في نظير البنتان تبريد مسبقا. ومع ذلك، نظير البنتان غير متوفر لتجميد عينات التشريح في المؤسسات دون مختبرات علم الأمراض السريرية العضلات. ونتيجة لذلك، غالبا ما تتم معالجة خزعات العضلات التشخيص في الحالات النادرة في العديد من المرافق الطبية. وهكذا، يمكن أن لدينا بروتوكول تحسين كبير في قدرة المستشفيات الصغيرة أو مختبرات لإجراء خزعات العضلات التشخيص ذات جودة كافية. وبالنظر إلى كفاءة عالية وعملية بسيطة من هذا البروتوكول، قد يكون بديلا واعدا لطريقة التجميد الحالي القائم على نظير البنتان ويمكن تطبيقها على نطاق واسع في الدراسات النسيجية في المستقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

أي تضارب في المصالح أو مالية أو خلاف ذلك، أعلن من قبل المؤلفين.

Acknowledgments

وقد أيد هذا المشروع من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (NSFC): 31301950 و31671288.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryostat Microtome  Leica Leica CM1950
Digital Microscope  Nikon Nikon DS-U3
 Cryogenic Vial   Plastic film Designed by ourself
Liquid Nitrogen Commomly-used
Scalpel Commomly-used
10 cm forceps Commomly-used
25 cm tweezer Commomly-used
Safety glass Commomly-used
Freezer gloves Commomly-used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics. Meat Sci. 95, (4), 828-836 (2013).
  2. Lefaucheur, L. A second look into fibre typing--relation to meat quality. Meat Sci. 84, (2), 257-270 (2010).
  3. Fiems, L. O. Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat. Animals (Basel). 2, (3), 472-506 (2012).
  4. Cockett, N. E., et al. The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep. Genet Sel Evol. 37, Suppl 1 65-81 (2005).
  5. Stinckens, A., et al. The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy. Anim Genet. 38, (1), 67-71 (2007).
  6. Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation. Proc Nutr Soc. 57, (2), 207-217 (1998).
  7. Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. Tissue water content in rats measured by desiccation. J Pharmacol Toxicol Methods. 38, (2), 87-92 (1997).
  8. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
  9. Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), e52793 (2015).
  10. Meijer, A. E., Vloedman, A. H. The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria. Histochemistry. 69, (3), 217-232 (1980).
  11. Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis). Food Bioprocess Technol. 8, (4), 916-925 (2015).
  12. Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. Elsevier. Ch. 15 407-422 (2007).
  13. Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. Elsevier. (2008).
  14. Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe. J Appl Sci. 12, (23), 2464-2468 (2012).
  15. Fukutomi, K., et al. A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field. Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53, (496), 3516-3521 (1987).
  16. Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation. Chem Eng Sci. 71, (9), 300-309 (2012).

Comments

2 Comments

  1. Excellent article! Could you please provide information on how to obtain the special cryovials?

    Reply
    Posted by: Teresa Z.
    April 28, 2017 - 10:54 AM
  2. Glad to hear that you are interested in this article.

    As for the information of obtaining the special cryovial, here are my suggestions. If your sample number is not very large, you can just use a red hot nail to create holes along common cryovial directly (More details can be seen in the paper in Figure 1. The Apparatus for Muscle Freezing). While, if the sample you need are in a large number, please follow this patent (http://epub.sipo.gov.cn/patentoutline.action) and make it in bulk-production. We are willing to provide some sample template if necessary.

    Best wishes!

    Reply
    Posted by: Yanyu D.
    May 2, 2017 - 9:13 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics