FRET de alta precisión a nivel de molécula única para la determinación de estructuras de biomoléculas

Biochemistry

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Summary

Aquí se presenta un protocolo para experimentos FRET de alta precisión en el nivel de una sola molécula. Además, esta metodología puede usarse para identificar tres estados conformacionales en el dominio de unión al ligando del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinar las distancias exactas es el primer paso hacia la construcción de modelos estructurales basados ​​en experimentos FRET.

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Ma, J., Yanez-Orozco, I. S., Rezaei Adariani, S., Dolino, D., Jayaraman, V., Sanabria, H. High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination. J. Vis. Exp. (123), e55623, doi:10.3791/55623 (2017).

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Abstract

Aquí se presenta un protocolo sobre cómo realizar mediciones de distancia interdye de alta precisión utilizando la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) a nivel de molécula única en el modo de detección de fluorescencia multiparámetro (MFD). MFD maximiza el uso de todas las "dimensiones" de la fluorescencia para reducir los artefactos fotofísicos y experimentales y permite la medición de la distancia interdye con una precisión de hasta 1 Å en biomoléculas rígidas. Este método se utilizó para identificar tres estados conformacionales del dominio de unión al ligando del receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) para explicar la activación del receptor tras la unión del ligando. Al comparar las estructuras cristalográficas conocidas con mediciones experimentales, acordaron dentro de menos de 3 Å para biomoléculas más dinámicas. La reunión de un conjunto de restricciones de distancia que cubre toda la dimensionalidad de las biomoléculas haría posible proporcionar un modelo estructural de biomolécula dinámicaEs

Introduction

Un objetivo fundamental de los estudios de biología estructural es desentrañar la relación entre la estructura y la función de las máquinas biomoleculares. La primera impresión visual de las biomoléculas ( por ejemplo, proteínas y ácidos nucleicos) se produjo en la década de 1950 a través del desarrollo de la cristalografía de rayos X 1 , 2 . La cristalografía de rayos X proporciona información estructural estática de alta resolución restringida por el empaque de cristal. Por lo tanto, la inmovilidad inherente de los modelos estructurales de rayos X evita la naturaleza dinámica de las biomoléculas, un factor que afecta a la mayoría de las funciones biológicas [ 3 , 4 , 5] . La resonancia magnética nuclear (RMN) 6 , 7 , 8 proporcionó una solución alternativa al problema resolviendo modelos estructurales en soluciones acuosas. Una gran ventajaDe la RMN es su capacidad para recuperar la naturaleza intrínseca dinámica de las biomoléculas y conjuntos conformacionales, lo que ayuda a aclarar las relaciones intrínsecas entre la estructura, la dinámica y la función 3 , 4 , 5 . Sin embargo, la RMN, limitada por el tamaño de la muestra y grandes cantidades de muestra, requiere complejas estrategias de etiquetado para sistemas más grandes. Por lo tanto, existe una necesidad acuciante de desarrollar métodos alternativos en biología estructural.

Históricamente, la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) 9 no ha tenido un papel importante en la biología estructural debido a la idea errónea de que FRET proporciona medidas de distancia de baja precisión. Es el propósito de este protocolo revisar la capacidad de FRET para determinar las distancias en la escala nanométrica, de tal manera que estas distancias pueden ser utilizadas para construir modelos estructurales de biomoléculas. El primer experimento verificLa dependencia de R - 6 de la eficiencia de FRET fue realizada por Stryer en 1967 10 midiendo poliprolinas de varias longitudes como una "regla espectroscópica". Un experimento similar se llevó a cabo a nivel de una sola molécula en 2005 [ 11] . Las moléculas de poliprolina resultaron ser no ideales y, por lo tanto, las moléculas de ADN de doble cadena se utilizaron más tarde 12 . Esto abrió la ventana para medidas de distancia precisas y la idea de utilizar FRET para identificar las propiedades estructurales de las biomoléculas.

FRET es óptimo cuando el rango de distancia entre interditos es de ~ 0.6-1.3 R 0 , donde R 0 es la distancia de Förster. Para fluoróforos típicos usados ​​en experimentos de FRET de molécula única, R $ . $ Es de aproximadamente 50 Å. Típicamente, FRET ofrece muchas ventajas sobre otros métodos en su capacidad de resolver y diferenciar las estructuras y la dinámica enHeterogéneos: i) Debido a la máxima sensibilidad de la fluorescencia, los experimentos FRET de una sola molécula 13 , 14 , 15 , 16 pueden resolver conjuntos heterogéneos contando directamente y caracterizando simultáneamente las estructuras de sus miembros individuales. (Ii) Las vías de reacción complejas pueden ser descifradas directamente en estudios FRET de molécula única porque no es necesaria la sincronización de un conjunto. (Iii) FRET puede acceder a una amplia gama de dominios temporales que abarcan más de 10 décadas en el tiempo, cubriendo una amplia variedad de dinámicas biológicamente relevantes. (Iv) Los experimentos de FRET pueden realizarse en cualquier condición de solución, tanto in vitro como in vivo . La combinación de FRET con microscopía de fluorescencia permite el estudio de estructuras moleculares y las interacciones directamente en las células vivas [ 15 , 16 , Sup> 17 , 18 , 19 , incluso con alta precisión 20 . (V) FRET se puede aplicar a sistemas de casi cualquier tamaño ( por ejemplo, oligómeros de poliprolina 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp9025, transcriptasa inversa 26 de HIV y ribosomas 27 ). (Vi) Por último, una red de distancias que contiene toda la dimensionalidad de las biomoléculas podría utilizarse para derivar modelos estructurales de moléculas estáticas o dinámicas 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref "> 35 , 36 , 37 .

Por lo tanto, la espectroscopia FRET de una sola molécula se puede utilizar para derivar distancias que son lo suficientemente precisas para ser utilizado para modelado estructural restringido a distancia [ 26] . Esto es posible aprovechando la detección de fluorescencia multiparámetro 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , que utiliza ocho dimensiones de información de fluorescencia ( es decir, espectro de excitación, espectro de fluorescencia, anisotropía, duración de la fluorescencia, rendimiento cuántico de fluorescencia, El tiempo macroscópico, las intensidades de fluorescencia y la distancia entre los fluoróforos) para proporcionar con exactitud y precisión las restricciones de distancia. Además, la excitación intercalada pulsada (PIE) se combina con MFD(PIE-MFD) 42 para monitorear la fluorescencia del aceptor de excitación directo y seleccionar eventos de molécula única que surgen de muestras que contienen una estequiometría de donante a aceptor de 1: 1. Una configuración típica de PIE-MFD usa láseres de excitación entrelazados de dos pulsos conectados a un cuerpo de microscopio confocal, donde la detección de fotones se divide en cuatro canales diferentes en diferentes ventanas espectrales y características de polarización. Más detalles se pueden encontrar en la Figura 1 .

Es importante señalar que FRET debe combinarse con métodos computacionales para lograr atomístico-como los modelos estructurales que son coherentes con los resultados FRET 26 , 30 . No es el objetivo del presente protocolo revisar la metodología asociada para construir modelos estructurales con distancias derivadas de FRET. Sin embargo, estos enfoques se han aplicado en combinación con otras técnicas ( por ejemplo, dispersión de rayos X de ángulo pequeñoO la resonancia paramagnética electrónica), dando origen al campo de la biología estructural integradora 43 , 44 , 45 , 46 . El objetivo actual es allanar el camino para FRET como una herramienta cuantitativa en biología estructural. Como ejemplo, esta metodología se utilizó para identificar tres estados conformacionales en el dominio de unión al ligando (LBD) del receptor N-metil-D-aspartato (NMDA). El objetivo final es superar las limitaciones antes mencionadas y traer FRET entre los métodos integradores utilizados para la determinación estructural de biomoléculas proporcionando distancias medidas con alta precisión.

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Protocol

1. Preparación de tampón PBS y tratamiento de cámara

NOTA: Use una capa de laboratorio y guantes desechables cuando realice experimentos químicos húmedos. Utilice protección para los ojos cuando alinee el láser.

  1. Preparación del tampón PBS
    1. Se disuelven 4,5 g de Na2HPO4, 0,44 g de NaH2PO4 y 3,5 g de NaCl en 400 mL de agua destilada. Asegúrese de un pH de 7,5 y esterilice la solución en autoclave en un ciclo de líquido durante 1 h (dependiendo del sistema de autoclave).
    2. Tomar 15 ml de la solución de PBS y mezclarla con 0,1 g de carbón vegetal. Filtrar la mezcla utilizando un filtro de jeringa normal de 20 ml con un tamaño de poro de 0,2 μm . Sellar y almacenar el tampón de PBS a temperatura ambiente.
  2. Microscopio cubierto con cámara de tratamiento de vidrio
    1. Añadir 500 μl de agua destilada y 5 μl de surfactante no iónico polisorbato 20 (ver la Lista de Materiales)A un sistema de vidrio cubierto de cámara (vea la lista de materiales) y mezcle bien. Déjelo remojar durante 30 min. Quitar la solución de polisorbato 20 y lavar la cámara con agua destilada dos veces. Déjalo secar.
      NOTA: La cámara está lista para usar.

2. Preparación de la muestra de ADN

NOTA: Utilice hebras de ADN etiquetadas diseñadas (vea la Lista de Materiales) para la creación de muestras estándar de ADN bicatenario (dsDNA). Los oligos diseñados no deben tener colorantes en el extremo de un polímero para evitar artefactos que pueden comprometer la distancia determinada. La secuencia de ADN debe ser elegida para comportarse como un cuerpo rígido.

  1. Añadir 1,5 μl de una cadena de ADN marcada con donante y 4,5 μL de una cadena de ADN complementaria (aceptada o no) en un tubo de microcentrífuga y mezclarlos con 24 μl de agua libre de nucleasa.
    NOTA: Dependiendo de la mezcla de los oligonucleótidos seleccionados, se generarán las siguientes muestras: no-FRET, loW-FRET, o dsDNAs de alta FRET.
  2. Hibridar el ADN usando un mezclador térmico y el siguiente proceso: 95 ° C durante 10 min, 90 ° C durante 10 min, 80 ° C durante 10 min, 70 ° C durante 10 min, 60 ° C durante 10 min, 50 ° C Durante 10 min, 40ºC durante 10 min, 30ºC durante 10 min, 20ºC durante 10 min, 10ºC durante 10 min y mantenimiento a 5ºC.
    NOTA: Los estándares de dsDNA generados pueden mantenerse en un congelador de -20 ° C para almacenamiento a largo plazo o pueden usarse inmediatamente.

3. Preparación de la muestra de proteínas

Nota: Comenzando con el ADN recombinante para la expresión de la proteína de interés en sistemas bacterianos, es posible mutar los residuos a partir de los cuales las distancias deben medirse en cisteínas. Para ello, utilizar el estándar dirigido a la mutagénesis técnicas [ 47] . Para facilitar la purificación de proteínas, clonar el ADN recombinante y mutado en un vector que contiene una etiqueta de purificación ( por ejemplo,Un His-tag). Se usó el dominio de unión al ligando de la subunidad 1 de glutamato (LBD) del receptor ionotrópico de glutamato NMDA (GluN1) LBD ( es decir, NMDA GluN1 LBD clonado en el vector pET-22b (+)).

  1. Expresión de la proteína
    1. Transformar el plásmido de ADN de construcción en el sistema de expresión de elección [ 48] .
      NOTA: Los pasos siguientes asumirán que la expresión de una proteína soluble se transforma en Escherichia coli . También es posible la purificación de, por ejemplo, células de mamífero 49 transfectadas o células de insecto transducidas 50 , y se pueden encontrar etapas detalladas en otra parte. Asegúrese de que la cepa de E. coli seleccionada sea apropiada para la proteína de interés. Por ejemplo, la expresión de proteínas que contienen puentes disulfuro requiere una cepa de células competentes con un compartimento intracelular menos reductor (véase la Lista de Materiales).
    2. Inocular un iniciador <Em> E. Coli utilizando una punta de pipeta estéril para recoger una única colonia transformada [ 48] . Se deja caer en 100 ml de medio LB selectivo (véase la Lista de Materiales) y se deja crecer el cultivo durante la noche a 37ºC.
    3. Preparar caldo LB (ver la Lista de Materiales). Autoclave para esterilizar.
    4. Inocular cultivos a gran escala de E. coli transformada añadiendo el cultivo durante la noche a 2 L de medio LB selectivo en una relación 1: 500.
    5. En las próximas horas, evaluar el crecimiento del cultivo mediante el control de las lecturas de absorbancia (Abs) del cultivo a 600 nm, a veces denominado densidad óptica a 600 nm (DO 600 ), o utilizando un medidor de densidad celular. Tenga en cuenta que las lecturas aumentan con el tiempo.
    6. Inducir la expresión de la proteína con una concentración final de 0,5 mM de isopropil-β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG) cuando el cultivo alcanza un OD 600 de 0,7. Agitar induce E. coli a 20 ° C durante 20-24 h.
    7. Después de la inducción de la proteína, pellet la E. coli por hilatura durante 20 min a 3000 xg y 4 ° C. Desechar el sobrenadante y almacenar el sedimento de E. coli que contiene la proteína intracelular a -80 ° C hasta su uso.
  2. Purificación de proteínas
    1. Lyse E. coli usando un método de lisis de elección ( por ejemplo, sonicación, prensa francesa, cavitación con nitrógeno, etc. ) 51 .
    2. Hacer girar la membrana y los restos celulares centrifugando el lisado durante 1 h a 185.000 xg y 4 ° C.
    3. Para una proteína marcada con His, cargue el sobrenadante en una columna de cromatografía de afinidad de metal (IMAC) inmovilizada, cargada con níquel, equilibrada usando un sistema de cromatografía líquida de proteína rápida (FPLC) (véase Tabla de Materiales ) 52 .
      NOTA: Tampón de equilibrio para el NMDA GluN1 LBD: NaCl 200 mM, Tris 20 mM y Glicina 1 mM, pH 8. Tampón de elución para NMDA GluN1 LBD: NaCl 200 mM, Tris 20 mM, Glicina 1 mM y Imidazol 400 mM, pH 8.
      1. Lavar la columna IMAC con un tampón que contiene una cantidad baja (~ 12 mM) de imidazol.
      2. Eluir la proteína de la columna IMAC usando un gradiente lineal de imidazol de 12 mM a 400 mM.
    4. Dializar la proteína durante la noche en tampón de equilibrio sin imidazol 53 colocando el eluido de la etapa 3.2.3.2 en un tubo de diálisis y sumergiéndolo en el tampón de equilibrio bajo agitación continua durante 2-3 horas. Repita al menos una vez más.
      NOTA: Los pasos 3.2.3-3.2.6 suponen la purificación de una proteína marcada con His. Si la purificación a través de algún otro método, ajustar el protocolo en consecuencia.
    5. Cuantificar la cantidad de proteína tomando la absorbancia a 280 nm de la proteína dializada y utilizando la ley de Beer ( unidad de Absorbancia = ε L c , donde ε Es el coeficiente de extinción (M -1 cm -1), Que se puede obtener aquí 54 ; L es la longitud de la trayectoria de la luz (cm); Yc es la concentración de proteína (M)).
      NOTA: Se dispone de varios ensayos de cuantificación de proteínas, incluyendo el ensayo de Bradford y el ensayo de ácido bicinconínico. Ambos proporcionan resultados precisos.
  3. Etiquetado de proteínas
    1. Se añaden fluoróforos dador (colorante verde ciano-maleimida reactivo) y aceptor (colorante color rojo lejano reactivo a maleimida) a la proteína purificada a una relación molar proteína: donador: aceptor 1: 1: 8.
    2. Incubar la proteína y la mezcla de fluoróforo en hielo durante 30 min. Los tiempos de incubación más largos son posibles.
    3. Empaque una columna de 0,5 mL de Ni-Nitrilotriacético (Ni-NTA) agarosa (ver la Lista de Materiales) y equilibre usando el mismo tampón de equilibrio que en el paso 3.2.3 mientras la proteína está incubando.
      NOTA: Mantenga la cantidad de proteína cargada de acuerdo con la capacidad de unión a la resina.
    4. Después de los 30 minutos enCubicación, cargar la mezcla de proteína / fluoróforo sobre la columna preparada en la etapa 3.3.3 y purificar por flujo por gravedad.
    5. Lavar el exceso de fluoróforo con 5 ml de tampón de equilibrio.
    6. Eluir la proteína marcada por gravedad de la columna cuatro veces con 0,5 ml de tampón de elución. Debido a que la proteína ya ha sido purificada a partir de otras proteínas, no es necesario un gradiente.
    7. Compruebe cada eluato con un espectrómetro UV-Vis para identificar qué fracción contiene la proteína marcada. Escanear la absorbancia de 230-700 nm para poder asegurar que los picos de absorbancia de la proteína (280 nm) y cada fluoróforo (493 nm para el fluoróforo verde cian y 651 nm para el fluoróforo rojo lejano) son visibles en la Eluato.
      NOTA: Típicamente, la proteína se eluye en la fracción 2.
    8. Equilibrar una columna de desalación (véase la tabla de materiales ) con PBS tratado con carbón (etapa 1.1).
    9. Cargue la proteína marcada en la columna desalinizadora por flujo de gravedad.
      NOTA: Mantenga la cantidad de proteína cargada de acuerdo con la capacidad de la columna de desalinización seleccionada 55 .
    10. Eluir usando 3,5 ml de PBS tratado con carbón por flujo de gravedad y recoger fracciones de 0,5 ml del eluido.
    11. Utilizar un espectrómetro UV-Vis para escanear la absorbancia de cada eluato desde 230-700 nm para identificar qué fracción contiene proteína marcada.
      NOTA: Los pasos 3.3.8-3.3.11 sirven básicamente como un paso de intercambio de búfer. Otros protocolos que sirven a este propósito también son posibles ( por ejemplo, diálisis extensa). Alternativamente, uno podría ir directamente al paso 3.3.8 de la etapa 3.3.2.

4. Mediciones necesarias en condiciones de conjunto (en Cuvette)

  1. Determinación de la constante de Förster
    1. Scan f D , la emisión de fluorescencia fluoróforo (cps), en un fluorímetro mediante la excitación del donante a 15 nm a su máxima longitud de onda de absorbancia con el fin de obtener el pleno emEspectro de emisión. Supervisar la emisión comenzando 5 nm después de la longitud de onda de excitación y terminando 150 nm más tarde. Utilice las condiciones de ángulo mágico ajustando el polarizador de emisión a 54,7 ° Y los polarizadores de excitación a 0 ° 56 .
      NOTA: Para el fluoróforo donante usado aquí, el Abs máximo ocurre a 490 nm; Se utiliza 475 nm como longitud de onda de excitación y se controla la emisión desde 480-650 nm. Para el aceptor, el Abs máximo ocurre a 645 nm; Se utiliza 630 nm para la longitud de onda de excitación y se controla la emisión desde 635-735 nm.
    2. Utilice el fluorímetro para realizar una exploración de excitación del fluoróforo aceptor (Abs A ) que oscila entre 400 y 700 nm y utilizar condiciones de ángulo mágico ajustando el polarizador de emisión a 54,7 ° Y los polarizadores de excitación a 0 ° 56 . Ajuste el monocromador de emisión a 15 nm después de la longitud de onda de emisión máxima. Normalizar al máximo de excitaciónTación.
    3. En las tablas publicadas, localice el coeficiente de extinción del aceptor, ε A (M -1 cm -1 ) 56 , o utilice los valores proporcionados por el fabricante.
      NOTA: El valor publicado para el fluoróforo aceptor utilizado en este manuscrito es ε A647 = 270.000 cm -1 M -1 56 .
    4. Calcular la superposición espectral utilizando J = Σf D · (Abs A · ε A ) · λ 4 , donde f D , Abs A y ε A se han definido anteriormente λ y es la longitud de onda (nm). Utilice una hoja de cálculo para enumerar en columnas todos los valores dependientes de la longitud de onda obtenidos en los pasos 4.1.1-4.1.3. Alinearlos según la longitud de onda. Realizar la sumación a partir de la longitud de onda mínima de la emisión del donante (λ min ) a la longitud de onda máxima de la absorción del aceptorE ( lambda _ { max }).
    5. Calcular la constante de Förster (R o ) usando la siguiente fórmula R o 6 = 8.79 x 10 -5 · J · κ 2 · Φ F, D · n -4 , donde J es el solapamiento espectral previamente calculado en el paso 4.1.4, Κ 2 Es el factor de orientación, ΦF , D Es el rendimiento cuántico de fluorescencia del fluoróforo donante, yn es el índice de refracción del medio en el que está situado el fluoróforo.
      NOTA: Utilice n = 1,33 (si se utiliza tampón acuoso) y κ 2 = 2/3.
    6. Localizar el valor de rendimiento cuántico del fluoróforo donante (ΦF , D , Dependiente del entorno) en las tablas publicadas (véase la referencia 57) y utilizar el valor de la superposición espectral obtenida en el paso 4.1.4 para calcular el valor final de la constante de Förster utilizando la ecuaciónCión del paso 4.1.5.
      NOTA: Si el rendimiento cuántico no está disponible, siga el paso 4.2, a continuación, para calcularlo. En este caso, utilice ΦF , D = 0.8, que corresponde a una vida de donante τ D, r = 4.0 ns.
  2. Determinación del rendimiento cuántico de fluorescencia
    NOTA: El siguiente procedimiento supone sólo quenching dinámico. Para considerar el enfriamiento estático, refiérase a la Referencia 56. Sin embargo, los experimentos PIE-MFD también son útiles para determinar el rendimiento cuántico, incluso en el caso del enfriamiento estático (ver los Resultados).
    1. Seleccione un fluoróforo de referencia con perfiles de absorción y emisión similares para los fluoróforos aceptor y donante para los cuales se ha determinado el rendimiento cuántico (Φ r ).
      NOTA: Para el donante, Φ r = 0.8 y τ r = 4 ns, mientras que para el aceptor, Φ r = 0.32 y τ r = 1.17 ns, WQue corresponden a los Φ r y τ r para el fluoróforo verde cian-y los oligonucleótidos marcados con fluoróforo rojo, respectivamente 57 .
    2. Mida el decaimiento de fluorescencia resuelto en el tiempo (f (t)) usando el método de contaje de fotones únicos (TCSPC) correlacionado con el tiempo en condiciones de ángulo mágico.
    3. Ajustar el decaimiento de fluorescencia con una función de decaimiento mono- o multi-exponencial en forma de f (t) = Σ i x i e -t / τ i , donde x i Es la fracción de población y τ i Es la vida de fluorescencia de la población.
    4. Calcular las vidas medias de la especie, <τ> x = Σx i τ i , Donde x i Es la fracción de población y τ i Es la vida de fluorescencia de la población.
    5. UsoE fórmula Φ F, D = <τ D > x * Φ r / τ r Para calcular el rendimiento cuántico de fluorescencia del fluoróforo donador mediante la interconexión de la vida de fluorescencia y el rendimiento cuántico de la referencia, así como la vida de fluorescencia del fluoróforo donante.
      NOTA: Este método asume el apagado dinámico. Para otros Φ F, D determinaciones, siga Lakowicz [ 56] .

5. Alineación del experimento para PIE-MFD Detección de una sola molécula (SMD)

NOTA: Es mejor apagar las luces al tomar medidas.

  1. Ajuste del equipo (Figura 1)
    NOTA: Para este experimento se utiliza una configuración MFD construida en el hogar representada en la Figura 1 , con dos láseres pulsados ​​y 4 canales de detección en un cuerpo de microscopio invertido. Existen sistemas comerciales similares.
    1. Encienda los láseres de 485 nm y 640 nm y todos los detectores de la configuración MFD. Abra el software que controla la adquisición de TCSPC y los láseres. Asegúrese de que la frecuencia de repetición del láser es de 40 MHz.
    2. Ajustar la potencia del láser pulsado de 485 nm a 60 μW en un plano de imagen del objetivo de inmersión en agua 60X 1.2 NA y la potencia láser pulsada de 640 nm a 23 μW en modo de excitación intercalada pulsada (PIE-MFD) 42 .
      NOTA: Para configurar PIE-MFD, los dos pulsos láser se retrasan en el software del controlador láser. Para la excitación por láser de 485 nm, los canales TCSPC de detección (canales TAC) son 1-12.499 (canal "prompt"). Para la excitación por láser de 640 nm, los canales TCSPC de detección (canales TAC) son 12.499-50.000 (canal de "retardo").
    3. Añadir el líquido de inmersión objetivo (una gota de agua doblemente destilada) entre la lente de objetivo del microscopio y una diapositiva de vidrio de cubierta. Para asegurarse de que el plano de la imagen está dentro de la solución y lejos del vidrio surfaGire el botón de ajuste una vuelta y media después de encontrar el segundo punto focal brillante debido a la reflexión de los láseres en la interfaz vidrio-líquido.
    4. Añadir 1 μl de Rhodamine 100 nM 110 a 50 μl de agua destilada al centro de la cubierta. Asegúrese de que la solución esté también en el centro del objetivo del microscopio.
    5. Ajuste las posiciones del agujero de alfiler (tamaño: 70 μm) (dirección xey en cada momento) mientras se controla la tasa de recuento de fotones en el software de adquisición para maximizar el número de fotones detectados.
  2. Medición estándar SMD (trabajo en un cuarto oscuro)
    1. Utilice el ejemplo del paso 5.1.4 y registre 120 s de la tasa de recuento haciendo clic en el botón "Inicio" en el panel de control resuelto en el tiempo marcado con tiempo (TTTR) en formato "* .ht3" 58 en el software de adquisición.
    2. Calcular la espectroscopia de correlación de fluorescencia offline (FCS) 59 , </ Sup> 60 , 61 ( es decir, medición FCS) para determinar el tiempo característico de difusión, el número de moléculas en el volumen confocal, la cinética del estado triplete y el brillo molecular 62 .
      1. Abra el software para FCS (Kristine, MFD suite). Seleccione la configuración experimental haciendo clic en "Opciones" -> "Seleccione Configurar". Seleccione un archivo con parámetros experimentales similares y haga clic en "obtener parámetros del archivo" para leer la información del encabezado del archivo.
      2. Seleccione "Operate" -> "Correlate" para realizar FCS.
        NOTA: Asegúrese de que los números de canal están correctamente especificados y de que la "TAC Gate" (canales TCSPC) está marcada para seleccionar en consecuencia los canales de aviso o retardo.
      3. Seleccione "Operar" -> "Ajuste global de las curvas de correlación" para abrir la rutina de ajuste. Utilice la "ecuación # 24" en laE y haga clic en "iniciar".
        NOTA: La ecuación 24 del software describe la función de autocorrelación ( G c ) de moléculas fluorescentes de difusión libre sobre un perfil de iluminación gaussiana tridimensional, tal como 61 :
        Ecuación 36
        Donde T es el número medio de moléculas en el volumen de detección, x T es la fracción de moléculas que ejercen la cinética triplete con el tiempo característico t T , t c , es el tiempo de correlación, t diff es el tiempo de difusión relacionado con la geometría Parámetro ω , y ω describe el perfil de iluminación gaussiana. Después del ajuste, tome nota del tiempo de difusión y del número de moléculas en el volumen confocal.
    3. Añadir 10 μl de Rhodamina 101 100 nM en 50 μl de solución destiladaAgua y mezclar bien. Coloque esta mezcla en la parte superior de la cubierta de vidrio y asegúrese de que la gotita está en el centro de la lente objetivo. Haga clic en el botón "iniciar" en el panel de control TTTR para grabar 120 s de datos en formato TTTR.
    4. Añadir 1 μl de 100 nM de fluoróforo rojo lejano en 50 μl de agua destilada y mezclar bien. Coloque esta mezcla en el centro del objetivo. Haga clic en el botón "Inicio" y grabar 120 s de datos en formato TTTR.
    5. Coloque 50 μl de agua destilada en el centro del objetivo. Haga clic en el botón "Inicio" y grabe 300 s de datos en formato TTTR.
    6. Coloque 50 μl de tampón PBS en el centro de la lente objetivo. Haga clic en el botón "Inicio" y grabe 300 s de datos en formato TTTR.
    7. Tomar 1 μl de la mezcla del paso 5.1.4 y mezclar con 50 μl de agua destilada. Coloque esta mezcla en el cristal de la cubierta. Primero, haga clic en el botón "Inicio" y recoja 10 s de datos en el modo TTTR. Luego, analice el TTTR utilizando el software de análisis de vida de fluorescencia de integración (BIFL) de Burst (Paris, MFD suite), como se describe en el paso 5.3.
      NOTA: Verifique el número de ráfagas por segundo del software 26 y 61 de selección y análisis de ráfagas. Si el nivel de ráfaga es alrededor de 35 cada 10 s, es apropiado para la medición de una sola molécula.
    8. Continúe registrando la tasa de contaje en formato TTTR durante 1,5 h ( es decir, TCSPC en SMD) para tratar como un estándar de medición de una sola molécula.
      NOTA: Debido al tamaño de archivo grande, dividir archivos "* .ht3" en archivos de menor tamaño para cargar y procesar utilizando BIFL.
  3. Análisis de muestras estándar utilizando BIFL
    1. Abrir el software BIFL (París).
    2. Seleccione la configuración de PIE en la ventana emergente automática "Confirmar configuración" y lea el encabezado seleccionando el archivo con configuraciones experimentales similares. Haga clic en "get parameters fromM archivo ". Haga clic en" Aceptar ". Observe que la ventana emergente se cierra y se integra en el front-end de París Haga clic en" Aceptar "en" Siguiente ".
    3. Elija los archivos para analizar haciendo clic en "Seleccionar" en "Array de ruta de datos" para seleccionar la medida a analizar.
      1. Haga clic en "Dispersión verde" (para una medición de agua), "Green BG" (para una medición de buffer), "Green thick" (para una medición de 2 nM Rhodamine 110), "Red scatter" (para una medición de agua) Red BG "(para una medición de buffer o agua)," Red thick "(para una medición de Rhodamine 101 de 20 nM)," Yellow scatter "(para una medición de agua)," Yellow BG "(para una medición de buffer) y "Amarillo Grueso" (para una medición de fluoróforo de 2 nM).
      2. Haga clic en "Aceptar" en "Siguiente".
        NOTA: El canal "Verde" corresponde a la señal de los detectores verdes en los canales TCSPC "prompt". losEl canal "amarillo" corresponde a la señal de los detectores rojos en los canales TCSCP de retardo.
    4. Haga clic en "Ajustar" junto a "Datos cortados en ráfaga" para ajustar los parámetros de selección de una sola molécula. En la nueva ventana emergente, seleccione eventos de molécula única con dos desviaciones estándar del tiempo de llegada interphoton medio ("dt") cambiando el tiempo de llegada interphoton bajo "Umbral" y el número mínimo de fotones por evento de molécula única en "min Unesdoc.unesco.org unesdoc.unesco.org Haga clic en "Volver" para cerrar la ventana emergente. Haga clic en "Aceptar" en "Siguiente".
      NOTA: El umbral, en unidades ms, depende de la velocidad de recuento de fondo. El número mínimo típico de fotones utilizados es 60.
    5. Ajustar la duración de fluorescencia inicial "Parámetros de ajuste de color" ( por ejemplo , de, a, y convolución) para la generaciónD parámetros de decaimiento de fluorescencia en los colores "Verde", "Rojo" y "Amarillo". En la misma ventana, ajuste los valores "from" y "to" para "Prompt" y "Delay". Haga clic en "Volver" para cerrar la ventana emergente. Haga clic en "Aceptar" en "Siguiente".
      NOTA: Asegúrese de que la casilla de verificación de excitación de 2 colores está seleccionada. "De" y "a" corresponden a los compartimientos inicial y final en el histograma de decaimiento de fluorescencia (número de canal de TAC). Si los parámetros de ajuste inicial se seleccionan correctamente, se agrega una función de ajuste a los decaimientos de fluorescencia en cada canal.
    6. Seleccione la ubicación en la unidad de disco duro a la que guardar todos los archivos ASCII procesados ​​en una carpeta principal.
      NOTA: París procesa todas las ráfagas seleccionadas y crea múltiples archivos de salida ascii que pueden ser utilizados por otros programas para la visualización ( por ejemplo, Margarita MFD suite).

6. Estándares dsDNA y Muestra de MedidaInformes

  1. Añada 500 μl de tampón de PBS a un cristal de tapa con cámara y coloque una gota de agua destilada entre la cámara y el objetivo. Haga clic en el botón "Inicio" en el pedal de control y recoger 5 min de datos en el modo TTTR para utilizar para el análisis.
  2. Tome una pequeña cantidad (normalmente alrededor de 0,1 μL, concentración de alrededor de 1 μM) de estándar de dsDNA, añádala al tampón PBS y mezcle bien. Primero, recoja 10 s de datos haciendo clic en "Inicio". A continuación, compruebe la ráfaga para obtener 35 ráfagas por 10 s (como en los pasos 5.2.7 y 5.3). Finalmente, recoja> 2 h de datos en formato TTTR, como se describió anteriormente.
  3. Analizar los datos recogidos para las muestras de dsDNA, como en el paso 5.3.3.
  4. Visualice los histogramas de ráfaga utilizando la suite MFD (Margarita) y muestre la eficiencia de FRET frente a <τ D (A) > f o F D / F A frente a <τ D (A) > f .
    1. AbiertoEl software de Margarita y seleccione "Archivo" -> "Importar todos los archivos *. 4 y *. MTI." Seleccione la carpeta principal que contiene varias subcarpetas.
    2. Seleccione los parámetros a visualizar haciendo clic al lado de la "X" (abscisa) de uno de los parámetros derivados de París ( por ejemplo, tau green o <τ D (A) > f ); Similarmente, repita esto para la ordenada "Y" para seleccionar el parámetro deseado para visualizar ( por ejemplo, eficiencia de FRET, F D / F A o S PIE PIE).
      NOTA: En este caso, la eficiencia FRET, F D / F A o S PIE corregir la tasa de recuento de fondo adecuada en los canales verde, rojo y amarillo; Para rendimientos cuánticos del donante y aceptor; Para la relación de eficiencia de detección (g G / g R ); Y para crosstalk (α). Aquí, g G / g R = 3,7 y α = 0,017, dependiendo únicamente del instrumento. Tasa de contaje de antecedentesDependen del tampón usado, y los valores de rendimiento cuántico se determinan previamente.
    3. Agregue una línea FRET abriendo la ventana "Overlay Equation" haciendo clic en "Display" -> "Overlay Equation". Seleccione la línea de FRET estática en el menú emergente. Seleccione los tiempos de vida del donante y los parámetros de rendimiento cuántico adecuados para generar la línea FRET adecuada.
      NOTA: Se pueden generar líneas FRET para correlacionar varios indicadores FRET.
  5. Determine el factor de corrección para la excitación del aceptor por la fuente de excitación del donante (β) usando el parámetro de estequiometría mostrando la eficiencia de FRET frente a la estequiometría (S PIE ) en Margarita (Ecuación 1).
    NOTA: β se elige de modo que la muestra del donante tenga un pico en S PIE = 1,0 en la escala de estequiometría; La muestra sólo aceptor debe tener una estequiometría de S PIE = 0.0, y el dsDNA con ambas etiquetas debe tener una estequiometría de S PIE ~ 0.5. <Br /> NOTA: El instrumento ya está listo, y es posible medir las muestras marcadas con FRET.
  6. Mida y analice las muestras marcadas con FRET preparadas en la sección 3 siguiendo los pasos 6.3-6.4.

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Representative Results

En experimentos típicos de smFRET usando una configuración de MFD (líneas de láser: 485 nm a 60 μW y 640 nm a 23 μW, sección 5.1), la muestra de fluorescencia se diluye a una concentración picomolar baja ( 10-12 M = 1 pM) y se coloca En un microscopio confocal, donde un pulso de láser sub-nanosegundo excita las moléculas marcadas que se difunden libremente a través de un volumen de excitación. Un volumen confocal típico es <4 femtolitros (fL). A concentraciones tan bajas, solo se detectan moléculas individuales una a la vez. La fluorescencia emitida de las moléculas marcadas se recoge a través del objetivo y se filtran espacialmente usando un agujero de alfiler. Este paso define un volumen confocal efectivo de detección. Entonces, la señal se divide en componentes paralelos y perpendiculares en dos (o más) ventanas espectrales diferentes ( por ejemplo, "verde" y "rojo"). Cada canal de detector de fotones se acopla entonces a un recuento de fotones únicos correlacionado con el tiempo (TCSPC) Para el registro de datos ( Figura 1 ).

Después de seguir la calibración de la configuración MFD, se puede iniciar un procedimiento resumido en la Tabla 1 (etapas 5-6), medición de los estándares dsDNA. A continuación, PIE-MFD se utiliza para analizar múltiples parámetros, tales como macrotime media, vida de fluorescencia, anisotropía integrada en ráfaga, relación de la señal en verde sobre la señal en rojo, la duración de ráfaga en el canal de solicitud (T (G + R) D ), duración de la ráfaga en el canal retardado (T R | A ), y otros 65 , 66 ( Figura 2 ). Importante en este análisis es el parámetro de estequiometría ( S PIE ), definido como:

Ecuación 45

Donde f G | D = F _ { D} , F _ {R} | D = F A , y F R | UN Son de fondo corregido las intensidades de fluorescencia [ 63] . Por ejemplo, F G | D = I G | D - < B G >, Donde I G | re Es la intensidad detectada en el canal verde del donante y < B G > Es la media de la cuenta de antecedentes en el canal verde. Se realizan correcciones similares para la fluorescencia del aceptor por excitación directa del aceptor ( F R | A ) y para la emisión sensibilizada del aceptor ( F R | D ). En la Ecuación 1, α es el factor de corrección para el donante-fluoCrosstalk de rescencia en el canal aceptor; Β es el factor de corrección para la excitación del aceptor por la fuente de excitación del donante; Y γ , donde

Ecuación 56

Es una función de los rendimientos cuánticos donador y aceptador, ΦF , D Y Delta F, A , Respectivamente, y de las eficiencias de detección en los detectores verde y rojo, g G y g R. Utilizando S PIE , es posible calibrar los factores instrumentales apropiados, tales como α, β y γ , para satisfacer S PIE = 1 para la muestra marcada únicamente para donantes, S PIE = 0 para la muestra sólo aceptor y S PIE = 0,5 para la muestra FRET. Alternativamente,Es posible utilizar:

Ecuación 59

Para obtener el rendimiento cuántico de una segunda muestra, dado que el rendimiento cuántico de una muestra ( Ecuación 60 ) Y que el Ecuación 61 y Ecuación 62 Se determinan a partir del experimento PIE-MFD. En este caso, se supone que el rendimiento cuántico de la alta FRET dsDNA es de 0,32 y el rendimiento cuántico de la baja FRET dsDNA se determina. La razón para hacer este procedimiento es porque se ha observado que la S PIE es diferente tanto para las muestras de baja FRET y alta FRET, a pesar de que ambos tienen un donante en la misma ubicación y sólo un aceptor, pero a diffDiferentes lugares. Después de determinar el rendimiento cuántico adecuado de las muestras estándar, como se describe en la Ecuación (3), la eficiencia de FRET ( E ) frente a < τ D ( A ) > f Y F D / F A frente a < τ D ( A ) > f representaciones se utilizan para la evaluación posterior. La relación paramétrica entre la eficiencia de FRET ( E estática ), F D / F A , y < τ D ( A ) > f Se describe mediante el siguiente conjunto de ecuaciones (Ecuación 4):

Ecuación 63

Ecuación 64

Aquí, F D | D es la fluorescencia del donante detectada en el canal donante o verde; F A | re Es la emisión sensibilizada por aceptor; Ecuación 67 Es la vida de fluorescencia del donante en ausencia del aceptor; Y < τ D ( A ) > x Es la vida media de la especie, que está relacionada con la vida media de fluorescencia por un polinomio empírico Ecuación 69 56 , 57 . Estas ecuaciones se conocen como las líneas FRET estáticas 57 , 67 porque las líneas deben cruzar ambas poblaciones igualmente bien, en ausencia deF dinámica ( Figura 3 ).

A continuación se presenta el análisis de los histogramas de eficiencia de FRET ( Figura 4 ) utilizando el análisis de distribución de probabilidad (PDA) para las dos muestras de dsDNA 68 , 69 . PDA se ha utilizado para modelar los histogramas smFRET con alta precisión 57 . La información de especies únicas o multiestaticas se puede obtener de un solo histograma. Después de ajustar la forma de la distribución esperada a los datos experimentales obtenidos, se puede revelar la distancia entre el donante y el aceptor. En resumen, se calcula la eficiencia de FRET, o distribuciones FD / F A , obteniendo primero la probabilidad [Ecuación] de observar una cierta combinación de fotones recogidos en los canales de detección "verde" ( G ) y "rojo" ( R ) Dado un cierto tiempo-viento Ay; Utilice la ecuación 5:

Ecuación 71

En este caso, la distribución de intensidad de fluorescencia P ( F ) se obtiene a partir de la distribución de intensidad de señal total P ( S ), suponiendo que las señales de fondo B G y B R se distribuyen según las distribuciones de Poisson, P ( B G ) y P ( B R ), con intensidades conocidas de intensidad de contaje de fondo, < B G > y < B R >. La probabilidad condicional P ( F G , F R | F ) es la probabilidad de observar una combinación particular de fotones de fluorescencia verde y rojo, F G y F R , para un estado FRET dado.

Análisis de PDA muestra que la distancia interdye para el dsDNA de alta FRET es < R DA > E (HFRET) = 45,7 Å, mientras que para el dsDNA de bajo FRET, La distancia < R DA > E (LFRET) = 59,7 Å Cuando se comparó con las distancias esperadas utilizando el sistema de posicionamiento y cribado FRET (FPS) 26 , se esperaba una distancia entre haces esperada < R DA > E , AV (HFRET) = 44,7 Å Encontrado como derivado usando FPS para el dsDNA de alta FRET y < R DA > E , AV (LFRET) = 59,1 Å para el dsDNA de bajo FRET. AV significa el cálculo de volumen accesible incrustado en el kit de herramientas FPS. Simulación de Monte Carlo, donde los fluoróforos representan tres modelos de radios de esfera dura conectados a un punto de unión en la biomasaCon un conector de conexión flexible 26 , 57 . Se requiere una corrección para el rendimiento cuántico para el dsDNA de baja FRET, basándose en la PIE S medida. Con estas condiciones, es posible obtener un acuerdo de ~ 1 Å entre el valor experimental y el valor esperado de las simulaciones AV.

A continuación, se mide el NMDA GluN1 LBD. El receptor NMDA (NMDAR) es un canal catiónico heteromérico, no selectivo que requiere la unión de glicina y glutamato para el gating 70 . Se sabe que el LBD, que tiene una estructura parecida a una concha, adopta una configuración de concha abierta y una configuración cerrada de concha en forma de concha al ligarse el ligando sobre la base de información cristalográfica 71 , 72 . Para los experimentos MFD, el NMDA GluN1 LBD se mutó en Ser507 y Thr701 (secuencia de longitud completa) en lados opuestos deLa hendidura, como se ha descrito previamente. Después se marcó usando el par FRET de un fluoróforo de color verde cian y un fluoróforo de color rojo lejano (véase la Lista de Materiales), con un R $$ de 52 Å. Esta construcción se usó para estudiar el movimiento del dominio de unión al ligando, sin la complejidad asociada con el trabajo con un receptor solubilizado. Utilizando este constructo, se encontraron al menos tres configuraciones del LBD. Se sugirió que un mecanismo de selección conformacional poblado selectivamente una de las poblaciones identificadas sobre ligando vinculante [ 73] . En la forma inactivada, o en presencia del antagonista ácido 5,7-dicloroquinurénico (DCKA), se exploran en su mayor parte estados de FRET de medio a bajo, con un tiempo de vida de fluorescencia de donador más largo y una relación de fluorescencia de donador a aceptor mayor que alcanza su máximo En F _ {D} / F _ { A } = 3,3 ( Figura 5A ). Esto es consistente con la estabilización de una conformación de hendidura abierta.PDA y el análisis de ventana de tiempo se utilizaron para identificar tres configuraciones que el LBD puede adoptar (el alto FRET (HF) (< R DA > E = 33,9 Å), medio FRET (MF) (< R DA > E = 45,8 Å ) Y estados de bajo FRET (LF) (< R DA > E = 55,8 Å)). Sin embargo, sobre todo el medio-FRET y el bajo-FRET se poblaron. Esto sugiere que el alto FRET es el estado que conduce a la activación del NMDAR. Cabe señalar que se compararon las distancias derivadas experimentalmente y las derivadas por el FPS usando el etiquetado in silico y utilizando la información cristalográfica (PDBID): 1PB7 y 1PBQ). Se encontró que la distancia interdye para el medio de FRET y baja FRET poblaciones fueron < R DA > E , AV = 48,7 Å y 54,2 Å para ambas estructuras, respectivamente ( Figura 5B). La mayor desviación de 2,9 Å se encontró en el estado de FRET medio. Al considerar la incertidumbre de la distribución, a partir de la suposición de κ 2 = 2/3, hay un error máximo de 2,5% en la distancia medida. En resumen, se puede concluir que es posible alcanzar la exactitud de Angstrom en distancias determinadas experimentalmente.

Figura 1
Figura 1: Configuración experimental y registro de datos para PIE-MFD. ( A ) Se muestra una configuración de detección de fluorescencia multiparamétrica típica y consta de cuatro detectores que cubren dos ventanas espectrales diferentes. Los detectores están conectados a la electrónica de conteo de un solo fotón (TCSPC) correlacionada con el tiempo. ( B ) En TCSPC, cada fotón se identifica por tres parámetros: (i) micro-tiempo, o tiempo después del impulso de excitación; (Ii) macro-tiempo, o el númeroDe los impulsos de excitación desde el inicio del experimento; Y (iii) el número de canal. Estos tres parámetros son necesarios para el análisis off-line. ( C ) Las moléculas individuales difunden libremente a través del volumen confocal, y los fotones son emitidos, dejando una explosión de fotones en función del tiempo. ( D ) Cada ráfaga seleccionada se ajusta adecuadamente y se utiliza para mostrar histogramas multidimensionales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Análisis de burst utilizando varios parámetros de fluorescencia. ( A ) Eficiencia de FRET versus macro-tiempo, ( B ) eficiencia de FRET frente a T (G + R) | D - T R | A , y ( C ) eficiencia de FRET frente a S PIE para elBajo-FRET o 15 bp dsDNA. T (G + R) | D es la duración de la ráfaga en el canal de aviso, y T R | A es la duración de la ráfaga en el canal retardado (T R | A ) Pulse aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: F D / F A y duración de la eficacia del donante frente a FRET. Histogramas bidimensionales para representar la eficiencia de FRET ( A ); La relación de la fluorescencia del donante sobre el aceptor, F _ { D} / F _ { A }, ( B ); Y anisotropía del donante r D ( C ) frente a la vida media de fluorescencia del donante en presencia de aceptor < τ D ( A ) > f . La corrección determinadaEn los factores son: < B G > = 0,64, < B R > = 0,37, β = 0,08 (la fracción de la excitación directa del aceptor con el láser de excitación del donante), α = 0,017 y g G / g R = 3,7 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: PDA comparaciones de alto-FRET y de bajo-FRET dsDNA. Análisis PDA de la ventana de tiempo a 2 ms, con una media anchura del 6% de la distancia media de eficiencia FRET. Cada distancia es Gaussiana distribuida con el 6% de la < R DA > E como la anchura (hw DA ). ( A ) Para la muestra HFRET, la distancia interdye es < R DA > E (HFRET) = 45,7 ring {A}. ( B ) Para la muestra LFRET, la distancia es < R DA > E (LFRET) = 59,7 Å. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5: PIE-MFD del dominio de unión al ligando del receptor NMDA en presencia del antagonista, DCKA. ( A ) Histograma bidimensional de F D / F A frente al tiempo de vida del donante en presencia de aceptor < τ D ( A ) > f y la anisotropía del donante frente a < τ D ( A ) > f Para el LBD con DCKA. Una dimensiónAl para F D / F A y también se muestran. La línea FRET estática se muestra en rojo. Se corrigen la fluorescencia de donador puro y aceptor ( F _ { D} y F _ { A }) para el fondo (< B _ { G } = 0,940 kHz y < B _ {R} = 0,522 kHz), interferencia espectral ( G G / g R = 3,7). En la anisotropía versus < τ D ( A ) > f histogramas, la ecuación de Perrin tiene una correlación de rotación de ρ = 2,5 ns. ( B ) PDA en una ventana de tiempo de 10 ms Δt. Se necesita un solo estado. El modelo se adapta a todas las ventanas de tiempo muy bien. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Acción Gol
Láser central.
Alinee el agujero de alfiler. FCS (sección 5).
Alinee los detectores. Maximice el CPM.
Ajuste el anillo de corrección objetivo. Minimizar t diff y maximizar CPM.
Determine la función de respuesta del instrumento (IRF). TCSPC @ SMD en modo TTTR. Medir el patrón de desintegración de la dispersión.
Determinar el factor G para cada ventana espectral. TCSPC @ SMD en modo TTTR. Compare las intensidades de las colas de decadencia que encajan para las polarizaciones.
Determine la proporción de eficiencia de detección en las ventanas espectrales (g Rg G ). (I) Mediciones de intensidad de un colorante con amplio espectro de emisión (concentración de nM). (Ii) Medir los patrones FRET de referencia (pM concentrCión). En MFD la subpoblación debe caer en la línea de FRET estática.
Realizar la verificación final (vida útil y anisotropía). El control ajustó la vida útil y la anisotropía de la medición de una sola molécula de colorante de difusión libre con una única decaimiento exponencial ( por ejemplo, Rhodamine 110).
Determinar la proporción de aceptor sobre el rendimiento cuántico del donante. (I) Esquema de estequiometría (S PIE ) Eq. 1. y 4.2.
Determinar la tasa de recuento de antecedentes. Medidas de intensidad del "buffer" seleccionado.
Determine la conversación cruzada (α). Las mediciones de intensidad del colorante donante tienen en cuenta el espectro de emisión de fluorescencia y las eficiencias de detección.

Tabla 1: Pasos de calibración para experimentos FRET en experimentos de molécula única.

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Discussion

En este trabajo se presenta el protocolo para alinear, calibrar y medir las distancias de interdye con alta precisión usando experimentos FRET de una sola molécula PIE-MFD. Al calibrar cuidadosamente todos los parámetros instrumentales, se puede aumentar la precisión de las distancias medidas y alcanzar la precisión de Angstrom. Para ello, se utilizan varios histogramas multidimensionales para analizar e identificar poblaciones para su posterior caracterización. Utilizando el tiempo macro medio para verificar la estabilidad de las muestras medidas, es posible corregir el fotoblanqueo del donante y el aceptor y seleccionar poblaciones de FRET basadas en el parámetro de estequiometría. Sin embargo, las propiedades fotofísicas del aceptor pueden cambiar dependiendo de la ubicación de la etiqueta. Por lo tanto, se puede usar una distribución S PIE para corregir adecuadamente el rendimiento cuántico del aceptor. La caracterización fotofísica adecuada es necesaria para determinar el factor gamma (ƴ), que, junto con otro factor de correcciónOrs ( por ejemplo, α para crosstalk y β para la excitación del aceptor con el láser donante), puede usarse para incrementar la precisión de la distancia de interdye medida. Este enfoque fue corroborado utilizando dos diseñados dsDNA muestras estándar, y una precisión de ~ 1 Å cuando se compara con los valores esperados se determinó.

Diferentes selecciones de tinte requieren la adaptación de los elementos ópticos del microscopio, tales como los filtros dicroicos y de paso de banda, para acomodar la ventana espectral apropiada de los tintes seleccionados. En consecuencia, los láseres pulsados ​​necesitan ser seleccionados. Más importante aún, la selección de tintes es crucial debido a varios artefactos fotofísicos posibles, tales como el blanqueo del aceptor y del donante, el parpadeo del tríceple o del tinte, o el tinte que se pega a las superficies de la proteína. Estos artefactos podrían comprometer la interpretación de los datos experimentales. MFD es ideal en este escenario porque, al inspeccionar múltiples parámetros, es posible identificar las fuentes de estos artefactos, corregirPara ellos, o al menos ser conscientes de su existencia. El parámetro de orientación del dipolo, la mayor parte del tiempo asumido como κ 2 = 2/3, puede causar desviaciones mayores de la distancia determinada si el tinte se pega preferentemente a la superficie de las biomoléculas. La anisotropía de la muestra del donante, la muestra aceptora y el aceptor del donante pueden ayudar a resolver si esta suposición es válida o no. En este experimento, se ha encontrado que existe un error máximo de ~ 2,5% en la distancia medida, en comparación con no realizar la corrección apropiada y obtener un error de 10-20%. El rendimiento cuántico del aceptor puede crear una mayor fuente de error. Por lo tanto, S PIE es importante para abordar esta importante cuestión.

Es posible aplicar una estrategia similar para comprender el paisaje conformacional del dominio de unión al ligando del receptor NMDA para comprender el mecanismo del agonismo en el NMDAR. Se encontró que el LBD en tLa presencia de un antagonista evita la accesibilidad de un estado de alta FRET, postulado para ser responsable de abrir el canal 73 . Al comparar las distancias derivadas experimentalmente y los valores esperados basados ​​en información cristalográfica, se logró un acuerdo dentro de 3 Å. Más importante aún, los nuevos estados de baja población pueden identificarse con una precisión similar.

En resumen, los experimentos FRET de una sola molécula en el modo MFD 42 permiten que se tengan en cuenta adecuadamente los artefactos experimentales y se obtenga una distancia entre hilos en el intervalo de ~ 30-70 Å. Si, en lugar de una sola distancia medida, se obtiene una red de distancias, es posible utilizarlas como restricciones en el modelado estructural, particularmente para estados que son difíciles de caracterizar con métodos más estándar de biología estructural.

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Disclosures

Todos los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia con el contenido de este artículo.

Acknowledgments

VJ y HS reconocen el apoyo de NIH R01 GM094246 a VJ. HS reconoce fondos de puesta en marcha del Programa de Investigación Creativa de la Universidad de Clemson y el Centro de Ciencia de Materiales Ópticos y Tecnologías de Ingeniería en la Universidad de Clemson. Este proyecto también fue apoyado por una beca de formación del Centro Keck para el Entrenamiento Interdisciplinario en Biociencias de los Consorcios de la Costa del Golfo (NIGMS Subvención No. 1 T32GM089657-05) y la Beca de la Fundación Schissler para Estudios Traslacionales de Enfermedades Humanas Comunes a DD. El contenido es exclusivamente responsabilidad de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
charcoal Merck KGaA K42964486 320
syringe filter Fisherbrand 09-719C size: 0.20 µm
chambered coverglass Fisher Scientific 155409 1.5 borosilicate glass, 8 wells
microscope cover glass Fisher Scientific 063014-9 size: 24 x 60-1.5
Nuclease free water Fisher Scientific 148859 nuclease free
tween-20 Thermo Scientific 28320 10% solution of Polysorbate 20
acceptor DNA strand (High FRET) Integrated DNA Technologies 178124895 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
acceptor DNA strand (Low FRET) Integrated DNA Technologies 177956424 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
donor DNA strand Integrated DNA Technologies 177951437 5´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)
DNA strand (No FRET) Integrated DNA Technologies 5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
thermal cycler Eppendorf E6331000025 nexus gradient
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide Thermo Scientific A10254 termed cyan-green fluorophore in the manuscript
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide Thermo Scientific A20347 termed far-red fluorophore in the manuscript
Rhodamine 110 Sigma-Aldrich 83695-250MG
Rhodamine 101 Sigma-Aldrich 83694-500MG
LB Broth, Miller Fisher Scientific BP1426 For culture of E. coli
Ampicillin Sigma-Aldrich A0166 Used at 100 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection
Tetracyline  Calbiochem 58346 Used at 12.5 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Used at 15 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation
Origami B(DE3) Competent Cells Millipore 70837-3 Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Fisher Scientific BP1755 For induction of E. coli protein expression
HiTrap Chelating HP GE Life Sciences 17-0409-01 For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein
Imidazole Sigma-Aldrich 56749
Ni-NTA Agarose  Qiagen 30210
PD-10 Desalting Column GE Life Sciences 17-0851-01
AktaPurifier GE Life Sciences 28406264 FPLC Instrument
Dialysis tubing Spectrum labs 132562 15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll
Dichroics Semrock FF500/646-Di01-25x36 500/646 BrightLight
50/50 Beam splitter polarizer Qioptiq Linos  G33 5743 000 10 x 10 film polarizer
Green pass filer Chroma ET525/50m ET525/50m 25 mm diameter mount
Red pass filter Chroma ET720/150m ET720/150m 25 mm diameter mount
Power Meter ThorLabd PM200
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary300Bio
Fluorolog 3 fluorometer Horiba FL3-22-R3
Fluorohub TCSPC controller Horiba Fluorohub-B TCSPC electronics for ensemble measurements
NanoLed 485L Horiba 485L Blue diode laser
NanoLed 635L Horiba 635L Red diode laser
Olympus IX73 Microscope Olympus IX73P2F Microscope frame
PMA 40 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932200, PMA 40 Optimized for green detection
PMA 50 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932201, PMA 50 Optimized for ed shifter sensitivity
485 nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-485
640 nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-640
Hydraharp 400 and TTTR acqusition software PicoQuant 930021 Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software
SEPIA II SLM 828 and SEPIA software PicoQuant 910028 Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.
computer Dell optiplex 7010 cpu: i7-3770 ram:16GB
FRET Positioning and Screening (FPS) software Heinrich Heine Unviersity It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html
MFD suite Heinrich Heine Unviersity It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html

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