Hög precision FRET vid en-molekylnivå för biomolekylstrukturbestämning

JoVE Journal
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Ett protokoll för hög precision FRET-experiment på den enda molekylnivån presenteras här. Dessutom kan denna metod användas för att identifiera tre konformationella tillstånd i den ligandbindande domänen av N-metyl-D-aspartat (NMDA) -receptorn. Att bestämma exakta avstånd är det första steget mot att bygga strukturella modeller baserade på FRET-experiment.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ma, J., Yanez-Orozco, I. S., Rezaei Adariani, S., Dolino, D., Jayaraman, V., Sanabria, H. High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination. J. Vis. Exp. (123), e55623, doi:10.3791/55623 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ett protokoll om hur man utför precisionsintervallavståndsmätningar med hjälp av Förster resonansenergiöverföring (FRET) på molekylenivå i multiparameterfluorescensdetektering (MFD) -läget presenteras här. MFD maximerar användningen av alla "dimensioner" av fluorescens för att minska fotofysiska och experimentella artefakter och möjliggör mätning av intervallavstånd med en noggrannhet upp till ~ 1 Å i styva biomolekyler. Denna metod användes för att identifiera tre konformationella tillstånd hos den ligandbindande domänen hos N-metyl-D-aspartat (NMDA) -receptorn för att förklara aktiveringen av receptorn efter ligandbindning. När man jämför de kända kristallografiska strukturerna med experimentella mätningar, kom de överens om mindre än 3 Å för mer dynamiska biomolekyler. Att samla en uppsättning avståndsbestämmelser som täcker hela dimensionen av biomolekylerna skulle göra det möjligt att tillhandahålla en strukturell modell av dynamisk biomolekyles.

Introduction

Ett grundläggande mål för strukturella biologiska studier är att avlägsna förhållandet mellan biomolekylära systemers struktur och funktion. Det första visuella intrycket av biomolekyler ( t.ex. proteiner och nukleinsyror) inträffade under 1950-talet genom utveckling av röntgenkristallografi 1 , 2 . Röntgenkristallografi ger högupplösande, statisk strukturinformation som begränsas av kristallförpackningen. Därför illamående av röntgenstrukturen modellerar den dynamiska naturen hos biomolekylerna, en faktor som påverkar de flesta biologiska funktionerna 3 , 4 , 5 . Kärnmagnetisk resonans (NMR) 6 , 7 , 8 gav en alternativ lösning på problemet genom att lösa strukturella modeller i vattenhaltiga lösningar. En stor fördelAv NMR är dess förmåga att återvinna biomolekylernas inneboende dynamiska natur och konformationella ensembler, vilket bidrar till att klargöra de inneboende relationerna mellan struktur, dynamik och funktion 3 , 4 , 5 . Ändå kräver NMR, begränsad av provstorlek och stora mängder av prov, komplexa märkningsstrategier för större system. Därför finns det ett pressande behov av att utveckla alternativa metoder inom strukturell biologi.

Historiskt har Förster resonans energiöverföring (FRET) 9 inte spelat en viktig roll i strukturell biologi på grund av missuppfattningen att FRET ger avståndsmätningar med låg noggrannhet. Syftet med detta protokoll är att se över FRETs förmåga att bestämma avstånd på nanometerskalan, så att dessa avstånd kan användas för att bygga strukturella modeller av biomolekyler. Den första experimentella verifieringenPåverkan av R - 6 beroendet på FRET-effektiviteten gjordes av Stryer 1967 10 genom mätning av polyproliner av olika längder som en "spektroskopisk linjal". Ett liknande experiment utfördes på en-molekylenivå 2005 2005. Polyprolinmolekyler visade sig vara icke-idealiska, och sålunda användes dubbelsträngade DNA-molekyler senare 12 . Detta öppnade fönstret för exakta avståndsmätningar och idén att använda FRET för att identifiera strukturella egenskaper hos biomolekylerna.

FRET är optimal när intervallavståndet är från ~ 0,6-1,3 R 0 , där R 0 är Förster-avståndet. För typiska fluoroforer som används i enkomolekyl-FRET-experiment är R0 ~ 50 Å. FRET erbjuder typiskt många fördelar gentemot andra metoder i sin förmåga att lösa och differentiera strukturerna och dynamiken iHeterogena system: (i) På grund av fluorescens ultimata känslighet kan FRET-experiment med en-molekylen 13 , 14 , 15 , 16 lösa heterogena ensembler genom att direkt räkna och samtidigt karakterisera strukturerna hos dess individuella medlemmar. (Ii) Komplexa reaktionsvägar kan direkt dechifieras i single-molekyl-FRET-studier eftersom ingen synkronisering av ett ensemble behövs. (Iii) FRET kan komma åt ett brett spektrum av temporära domäner som sträcker sig över tio decennier i tid och täcker en mängd olika biologiskt relevanta dynamik. (Iv) FRET-experiment kan utföras under några lösningsbetingelser, in vitro såväl som in vivo . Kombinationen av FRET med fluorescensmikroskopi möjliggör studier av molekylära strukturer och interaktioner direkt i levande celler 15 , 16 , Sup> 17 , 18 , 19 , även med hög precision 20 . (V) FRET kan appliceras på system med nästan vilken storlek som helst ( t.ex. polyprolinoligomerer 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , HIV-omvänd transkriptas 26 och ribosomer 27 ). (Vi) Slutligen kan ett nätverk av avstånd som innehåller alla dimensionerna av biomolekylerna användas för att härleda strukturella modeller av statiska eller dynamiska molekyler 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref "> 35 , 36 , 37 .

Därför kan en-molekyl-FRET-spektroskopi användas för att härleda avstånd som är tillräckligt noga för att användas för distanshållen strukturell modellering 26 . Detta är möjligt genom att utnyttja multiparameterfluorescensdetektering (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , vilken utnyttjar åtta dimensioner av fluorescensinformation ( dvs excitationsspektrum, fluorescensspektrum, anisotropi, fluorescenslivstid, fluorescenskvantumutbyte, Makroskopisk tid, fluorescensintensiteterna och avståndet mellan fluoroforer) för att exakt och exakt tillhandahålla avståndsbestämmelser. Dessutom kombineras pulserad interleaved excitation (PIE) med MFD(PIE-MFD) 42 för att övervaka direkt exciteringsacceptorfluorescens och för att välja enskilda molekylhändelser som härrör från prover innehållande en 1: 1 donor-till-acceptorstökiometri. En typisk PIE-MFD-inställning använder tvåpulserade interleaved excitationslasrar kopplade till en konfokalmikroskopkropp, där fotondetektering delas upp i fyra olika kanaler i olika spektralfönster och polarisationsegenskaper. Mer detaljer finns i Figur 1 .

Det är viktigt att notera att FRET måste kombineras med beräkningsmetoder för att uppnå atomistiska strukturella modeller som överensstämmer med FRET-resultat 26 , 30 . Det är inte målet med det nuvarande protokollet att gå över den associerade metoden för att bygga strukturella modeller med FRET-avledda avstånd. Dessa tillvägagångssätt har dock tillämpats i kombination med andra tekniker ( t ex röntgenspridning med lilla vinklarIng eller elektron paramagnetisk resonans), som ger upphov till fältet för integrerande strukturbiologi 43 , 44 , 45 , 46 . Det nuvarande målet är att bana väg för FRET som ett kvantitativt verktyg inom strukturell biologi. Som ett exempel användes denna metod för att identifiera tre konformationella tillstånd i den ligandbindande domänen (LBD) hos N-metyl-D-aspartat (NMDA) -receptorn. Det ultimata målet är att övervinna ovan nämnda begränsningar och att föra FRET bland de integrerade metoderna som används för strukturell bestämning av biomolekyler genom att ge uppmätta avstånd med hög precision.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. PBS-buffertberedning och kammarbehandling

ANMÄRKNING: Använd en laboratorierock och engångshandskar när du utför våtkemiska experiment. Använd ögonskydd när laserlinjen anpassas.

  1. PBS-buffertberedning
    1. Lös 4,5 g Na2HP04, 0,44 g NaH2P04 och 3,5 g NaCl i 400 ml destillerat vatten. Se till att pH pH 7,5 och sterilisera lösningen genom autoklavering i en vätskecykel i 1 h (beroende på autoklavsystemet).
    2. Ta 15 ml av PBS-lösningen och blanda den med 0,1 g kol. Filtrera blandningen med hjälp av ett vanligt 20 ml sprutfilter med en porrstorlek på 0,2 μm . Försegla och förvara PBS-bufferten vid rumstemperatur.
  2. Mikroskopkammarehöljesglasbehandling
    1. Tillsätt 500 μl destillerat vatten och 5 μl polysorbat 20 nonjoniskt ytaktivt ämne (se materiallistan)Till ett kammarloppssystem (se Materiallistan) och blanda väl. Låt det suga i 30 minuter. Ta bort polysorbat 20-lösningen och tvätta kammaren med destillerat vatten två gånger. Låt det torka.
      OBS: Kammaren är nu klar att användas.

2. DNA-provberedning

ANMÄRKNING: Använd konstruerade märkta DNA-strängar (se Materiallistan) för skapande av dubbelsträngade DNA-analyser (dsDNA). Konstruerade oligos får inte ha färgämnen vid slutet av en polymer för att undvika artefakter som kan äventyra det bestämda avståndet. DNA-sekvensen bör väljas för att fungera som en styv kropp.

  1. Lägg till 1,5 μL av en donormärkt DNA-sträng och 4,5 μl av en gratis (acceptormärkt eller icke-märkt) DNA-sträng i ett mikrofugrör och blanda dem med 24 pl nukleasfritt vatten.
    OBS: Beroende på blandningen av de valda oligonukleotiderna kommer följande prover att genereras: nej FRET, loW-FRET eller high-FRET dsDNA.
  2. Hybridisera DNA: n med en termisk mixer och följande process: 95 ° C under 10 minuter, 90 ° C under 10 minuter, 80 ° C i 10 minuter, 70 ° C under 10 minuter, 60 ° C i 10 minuter, 50 ° C I 10 minuter, 40 ° C i 10 minuter, 30 ° C i 10 minuter, 20 ° C under 10 minuter, 10 ° C i 10 minuter och håller vid 5 ° C.
    OBS! De genererade dsDNA-standarderna kan förvaras i en -20 ° C frys för långvarig lagring eller kan användas omedelbart.

3. Proteinprovberedning

Anm .: Från och med rekombinant DNA för uttryck av proteinet av intresse för bakteriesystem är det möjligt att mutera de rester från vilka avstånden skall mätas i cysteiner. För att göra det, använd standard-riktad mutagenessteknik 47 . För att underlätta proteinrening klonar det rekombinanta och muterade DNA-en i en vektor innehållande en reningsmärkning ( t.ex.En His-tagg). Glutamat-subenhet 1-ligandbindande domänen (LBD) från NMDA glutamatjonotropreceptorn (GluNl) LBD ( dvs NMDA GluNl LBD klonad i pET-22b (+) -vektorn användes.

  1. Proteinuttryck
    1. Transformera DNA-plasmid i det önskade expressionssystemet 48 .
      OBS: Följande steg antar att uttrycket av ett lösligt protein transformeras i Escherichia coli . Rening från exempelvis transfekterade däggdjursceller 49 eller transducerade insektsceller 50 är också möjligt, och detaljerade steg kan hittas på annat håll. Se till att den valda E. coli- stammen är lämplig för proteinet av intresse. Exempelvis kräver expression av proteiner som innehåller disulfidbroar en stam av kompetenta celler med ett mindre reducerande intracellulärt fack (se materiallistan).
    2. Inokulera en starter <em> E. Coli-kulturen genom att använda en steril pipettspets för att samla en enda transformerad koloni 48 . Släpp den i 100 ml selektivt LB-medium (se materiallistan) och låt kulturen växa över natten vid 37 ° C.
    3. Förbered LB-buljong (se materiallistan). Autoklavera den för att sterilisera.
    4. Inokulera storskaliga kulturer av transformerad E. coli genom tillsats av övernattningskulturen till 2 liter selektivt LB-medium vid ett förhållande 1: 500.
    5. Under de närmaste timmarna bedömer tillväxten av kulturen genom att övervaka absorbansavläsningen (Abs) hos kulturen vid 600 nm, ibland hänvisad till som den optiska densiteten vid 600 nm (OD 600 ) eller genom användning av en celldensitetsmätare. Observera att avläsningarna ökar över tiden.
    6. Inducera proteinuttryck med en slutlig koncentration av 0,5 mM isopropyl-P-d-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) när odlingen når en OD 600 på 0,7. Skaka inducerad E. coli vid 20 ° C i 20-24 h.
    7. Efter proteininduktion pelletsar E. coli genom spinning i 20 minuter vid 3000 xg och 4 ° C. Kassera supernatanten och lagra E. coli- pelleten innehållande det intracellulära proteinet vid -80 ° C tills användning.
  2. Proteinrening
    1. Lyse E. coli med användning av en lysismetod som valts ( t.ex. sonikering, fransk press, kvävekavitation etc. ) 51 .
    2. Spin ner membranet och cellrester genom centrifugering av lysatet i 1 timme vid 185 000 xg och 4 ° C.
    3. För ett His-märkt protein, ladda supernatanten på en ekvibrerad, nickelladdad, immobiliserad metallaffinitetskromatografi (IMAC) kolonn med användning av ett snabbproteinvätskekromatografi (FPLC) -system (se materialtabellen ) 52 .
      OBS: Equilibreringsbuffert för NMDA GluNl LBD: 200 mM NaCl, 20 mM Tris och 1 mM Glycin, pH 8. Elueringsbuffert för NMDA GluNl LBD: 200 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM Glycin och 400 mM Imidazol, pH 8.
      1. Tvätta IMAC-kolonnen med buffert innehållande en låg mängd (~ 12 mM) imidazol.
      2. Eluta proteinet från IMAC-kolonnen med användning av en linjär gradient av imidazol från 12 mM till 400 mM.
    4. Dialysera proteinet över natten i jämviktningsbuffert utan imidazol 53 genom att placera eluatet från steg 3.2.3.2 i dialysrör och nedsänka det i ekvibreringsbufferten under kontinuerlig omröring i 2-3 timmar. Upprepa minst en gång till.
      OBS: Steg 3.2.3-3.2.6 antar rening av ett His-märkt protein. Om du rensar genom någon annan metod, justera protokollet i enlighet med detta.
    5. Kvantifiera proteinmängden genom att ta absorbansen vid 280 nm av det dialyserade proteinet och använda Beers Law ( Absorbance unit = E Lc , där e Är utrotningskoefficienten (M -1 cm -1), Som kan erhållas här 54 ; L är ljusbanans längd (cm); Och c är proteinkoncentrationen (M)).
      OBS: Olika proteinkvantifieringsanalyser är tillgängliga, inklusive Bradford-analysen och bicinchoninsyraanalysen. Båda ger noggranna resultat.
  3. Proteinmärkning
    1. Lägg till donator (maleimidreaktivt cyan-grönt färgämne) och acceptor (maleimidreaktiva farfärgade färgämnen) fluoroforer till det renade proteinet vid ett molförhållande 1: 1: 8 protein: donor: acceptor.
    2. Inkubera protein- och fluoroforblandningen på is under 30 minuter. Längre inkubationstider är möjliga.
    3. Packa en 0,5 ml Ni-Nitrilotriättiksyra (Ni-NTA) agaroskolonn (se Materiallistan) och jämvikla den med samma jämviktsbuffert som i steg 3.2.3 medan proteinet inkuberas.
      OBS: Håll mängden laddat protein i enlighet med hartsbindningskapaciteten.
    4. Efter 30 min inKubation, laddar protein / fluoroforblandningen på kolonnen framställd i steg 3.3.3 och renar genom gravitationens flöde.
    5. Tvätta överskott av fluorofor med 5 ml jämviktsbuffert.
    6. Eluta det märkta proteinet genom gravitation från kolonnen fyra gånger med 0,5 ml elueringsbuffert. Eftersom proteinet redan har renats från andra proteiner är ingen gradient nödvändig.
    7. Kontrollera varje eluat med en UV-Vis-spektrometer för att identifiera vilken fraktion som innehåller det märkta proteinet. Skanna absorbansen från 230-700 nm för att kunna säkerställa att absorbansen toppar från proteinet (280 nm) och varje fluorofor (493 nm för den cyangröna fluoroforen och 651 nm för den fjärra fluoroforen) är synliga i eluat.
      OBS: Typiskt elueras proteinet i fraktion 2.
    8. Ekvilibrera en avsaltningskolonn (se materialtabellen ) med kolbehandlat PBS (steg 1.1).
    9. Ladda det märkta proteinet på avsaltningskolonnen genom gravitationens flöde.
      OBS! Håll mängden laddat protein i enlighet med den valda avsaltningskolonnens kapacitet 55 .
    10. Elute med användning av 3,5 ml kolbehandlat PBS genom gravitationflöde och samla 0,5 ml fraktioner av eluatet.
    11. Använd en UV-Vis-spektrometer för att skanna absorbansen hos varje eluat från 230-700 nm för att identifiera vilken fraktion som innehåller märkt protein.
      OBS: Steg 3.3.8-3.3.11 fungerar i grunden som ett buffertbyte. Andra protokoll som tjänar detta syfte är också möjliga ( t.ex. omfattande dialys). Alternativt kan man gå direkt till steg 3.3.8 från steg 3.3.2.

4. Mätningar som behövs i ensembleförhållanden (i kyvetten)

  1. Bestämning av Förster-konstanten
    1. Skanna fD, fluoroforefluorescensemissionen (cps), i en fluorimeter genom att spänna givaren vid 15 nm till dess maximala absorptionsvåglängd för att få full emIssion spektrum. Övervaka utsläpp som börjar 5 nm efter exciteringsvåglängden och sluta 150 nm senare. Använd magiska vinkelförhållanden genom att ställa in emissionspolarisatorn till 54,7 ° Och excitationspolarisatorerna till 0 ° 56 .
      OBS: För den givare fluorofore som används här uppträder Abs-maximin vid 490 nm; 475 nm används som exciteringsvåglängden och emissionen från 480-650 nm övervakas. För acceptorn uppträder Abs max vid 645 nm; 630 nm används för excitationsvåglängden och emissionen från 635-735 nm övervakas.
    2. Använd fluorimetern för att utföra en excitationssökning av acceptorfluorforen (Abs A ) från 400-700 nm och använd magiska vinkelförhållanden genom att sätta utsläppspolariseraren till 54,7 ° Och excitationspolarisatorerna till 0 ° 56 . Ställ in emissionsmonokromatorn till 15 nm efter maximal våglängd. Normalisera till maximal exciTationsvärde.
    3. På publicerade tabeller, lokalisera extinktionskoefficienten för acceptorn, E A (M -1 cm -1 ) 56 , eller använd värden som tillhandahållits av tillverkaren.
      ANMÄRKNING: Värdet som publicerats för acceptorfluorforen som används i detta manuskript är eA647 = 270.000 cm- 1 M- 1 56 .
    4. Beräkna spektralöverlappningen med J = Σf D · (Abs A · E A ) · A 4 , där f D , Abs A och E A har definierats ovanför A och är våglängden (nm). Använd ett arbetsblad för att lista i kolumnerna alla våglängdsberoende värden som erhållits i steg 4.1.1-4.1.3. Rikta in dem enligt våglängden. Utför summeringen från minsta våglängden för givarutsläppet (X min ) till den maximala våglängden av acceptorabsorbansE (A max ).
    5. Beräkna Förster-konstanten (R o ) med följande formel R o 6 = 8,79 x 10 -5 · J · K 2 · F · D · n- 4 , där J är spektralöverlappningen som tidigare beräknats i steg 4.1.4, K 2 Är orienteringsfaktorn, Φ F, D Är fluorescenskvantumutbytet hos donorfluorforen och n är brytningsindex för mediet i vilket fluoroforen är belägen.
      OBS: Använd n = 1.33 (om vattenbaserad buffert används) och K 2 = 2/3.
    6. Lokalisera kvantavkastningsvärdet för donatorfluorforet (Φ F, D , Miljöberoende) på publicerade tabeller (se Referens 57) och använd värdet för spektralöverlapp som erhållits i steg 4.1.4 för att beräkna slutvärdet för Förster-konstanten med hjälp av ekvationenUtgående från steg 4.1.5.
      OBS! Om kvantavkastningen inte är tillgänglig, följ steg 4.2 nedan för att beräkna det. Använd i så fall Φ F, D = 0,8, vilket motsvarar en givarlivstid τ D, r = 4,0 ns.
  2. Bestämning av fluorescens kvantutbyte
    OBS! Följande procedur förutsätter endast dynamisk quenching. För att överväga statisk släckning hänvisas till Referens 56. PIE-MFD-experiment är dock också användbara vid bestämning av kvantutbytet, även vid statisk släckning (se resultat).
    1. Välj en referensfluorofor med liknande absorbans- och emissionsprofiler för både acceptorn och donorfluorforerna för vilka kvantutbytet (Φ r ) har bestämts.
      OBS! För givaren, Φ r = 0,8 och τ r = 4 ns, medan för acceptorn, Φ r = 0,32 och τ r = 1,17 ns, wSom motsvarar Φ r och τ r för de cyangröna fluorofore- och de farröda fluoroformärkta oligonukleotiderna, respektive 57 .
    2. Mät det tidsbesparande fluorescensförfallet (f (t)) med hjälp av den tidskorrelerade metakonalträkningstestningen (TCSPC) vid magiska vinkelförhållanden.
    3. Passa på fluorescensförfallet med en mono- eller multisponentiell sönderfallsfunktion i form av f (t) = Σ i x i e -t / τ i , där x i Är befolkningsfraktionen och τ i Är befolkningens fluorescenslivstid.
    4. Beräkna artens genomsnittliga livslängd, <τ> x = Σx i τ i , Där x i Är befolkningsfraktionen och τ i Är befolkningens fluorescenslivstid.
    5. Använd thE formel Φ F, D = <τ D > x * Φ r / τ r För att beräkna fluorescenskvantumutbytet hos donorfluorforet genom att plugga in fluorescenslivstiden och kvantutbytet av referensen såväl som fluorescenslivet för donatorfluorforet.
      OBS: Denna metod förutsätter dynamisk quenching. För andra Φ F, D bestämningar, följ Lakowicz 56 .

5. Experimentinriktning för PIE-MFD-enkelmolekyldetektering (SMD)

OBSERVERA: Det är bättre att stänga av lamporna vid mätning.

  1. Utrustning justering (Figur 1)
    OBS! En inbyggd MFD-inställning avbildad i Figur 1 , med två pulserande lasrar och 4 detekteringskanaler i en inverterad mikroskopkropp, används för detta experiment. Det finns liknande kommersiella system.
    1. Slå på lasrarna 485 nm och 640 nm och alla detektorer i MFD-inställningen. Öppna programvaran som styr TCSPC-förvärvet och lasrarna. Se till att laserrepetitionshastigheten är 40 MHz.
    2. Ställ in 485 nm pulsad laserkraft till 60 μW vid ett bildplan för 60X 1,2 NA-vattenfördjupsmålet och 640 nm pulsad laserkraft till 23 μW i pulserat interleaved excitation mode (PIE-MFD) 42 .
      OBS! För att ställa in PIE-MFD fördröjs de två laserpulserna i laserns styrprogram. För 485 nm laser excitation är detekterings-TCSPC-kanalerna (TAC-kanaler) 1-12 499 ("snabb" kanal). För 640 nm laser excitation är detekterings-TCSPC-kanalerna (TAC-kanaler) 12,499-50,000 ("fördröjning" -kanal).
    3. Lägg till objektiv nedsänkningsvätska (en droppe dubbeldestillerat vatten) mellan objektivets objektiv och en glasglasdosa. För att säkerställa att bildplanet ligger inuti lösningen och långt ifrån glasskärmenCe, vrid inställningsknappen en och en halv varv efter att ha hittat den andra ljusa brännpunkten på grund av laserns reflektion vid glas-vätskegränssnittet.
    4. Tillsätt 1 μl 100 nM rhodamin 110 till 50 μl destillerat vatten till mitten av täckglaset. Se till att lösningen också ligger i mitten av mikroskopets mål.
    5. Justera tapphålet (storlek: 70 μm) positioner (x och y riktning en åt gången) under övervakning av fotonantalet på uppköpsprogramvaran för att maximera antalet upptäckta foton.
  2. Standardmätning SMD (arbeta i ett mörkt rum)
    1. Använd provet från steg 5.1.4 och spela in 120 s av räntesatsen genom att klicka på "Start" -knappen på den tidtagna tidsbesparta (TTTR) kontrollpanelen i "* .ht3" -format 58 på förvärvsprogrammet.
    2. Beräkna offline fluorescens korrelationsspektroskopi (FCS) 59 , </ Sup> 60 , 61 ( dvs. FCS-mätning) för bestämning av den karakteristiska tiden för diffusion, antalet molekyler i konfokalvolymen, tripletstatskinetiken och den molekylära ljusstyrkan 62 .
      1. Öppna programvaran för FCS (Kristine, MFD suite). Välj försöksinställningarna genom att klicka på "Alternativ" -> "Välj inställning". Välj en fil med liknande experimentella inställningar och klicka på "Hämta parametrar från fil" för att läsa rubrikinformationen på filen.
      2. Välj "Operate" -> "Correlate" för att utföra FCS.
        OBS! Se till att kanalnumren är korrekt angivna och att "TAC-porten" (TCSPC-kanaler) är markerad för att välja följd- eller fördröjningskanalerna i enlighet därmed.
      3. Välj "Operate" -> "Global Fit of Correlation Curves" för att öppna passformen. Använd "ekvation # 24" på mjukvaranE och klicka på "starta".
        OBS: Ekvation # 24 på programvaran beskriver autokorrelationsfunktionen ( Gc ) av fritt diffunderande fluorescerande molekyler över en tredimensionell Gaussisk belysningsprofil, såsom 61 :
        Ekvation 36
        Där N är medelvärdet av molekyler i detekteringsvolymen, x är den fraktion av molekyler som utövar triplet-statskinetik med den karakteristiska tiden t T , tc är korrelationstiden, t diff är diffusionstiden relaterad till den geometriska tiden Parametern ω och ω beskriver den gaussiska belysningsprofilen. Efter passformen noteras diffusionstiden och antalet molekyler i konfokalvolymen.
    3. Tillsätt 10 μl 100 nM Rhodamine 101 i 50 μl destilleratVatten och blanda väl. Placera denna blandning ovanpå lockglaset och se till att droppen ligger i mitten av objektivlinsen. Klicka på "start" -knappen på TTTR-kontrollpanelen för att spela in 120 s data i TTTR-format.
    4. Tillsätt 1 μL 100 nM farrött fluorofor i 50 μl destillerat vatten och blanda väl. Placera denna blandning i mitten av objektivlinsen. Klicka på "Start" -knappen och spela in 120 s data i TTTR-format.
    5. Placera 50 μl destillerat vatten i mitten av objektivlinsen. Klicka på "Start" -knappen och spela in 300 s av data i TTTR-format.
    6. Placera 50 μl PBS-buffert i mitten av objektivlinsen. Klicka på "Start" -knappen och spela in 300 s av data i TTTR-format.
    7. Ta 1 μl av blandningen från steg 5.1.4 och blanda med 50 μl destillerat vatten. Placera denna blandning på lockglaset. Klicka först på "Start" -knappen och samla 10 s data i TTTR-läge. Analysera sedan TTTR-fil med hjälp av analysprogrammet Burst Integration Fluorescence Lifetime (Paris, MFD-suite), som beskrivs i steg 5.3.
      OBS: Verifiera antalet brister per sekund från bristningsvalet och analysprogrammet 26 , 61 . Om bristningsnivån är cirka 35 var 10: e s, är den lämplig för mätning av en molekyl.
    8. Fortsätt spela in räntesatsen i TTTR-format i 1,5 h ( dvs TCSPC vid SMD) för att behandla som en molekylmätningsstandard.
      OBS! På grund av den stora filstorleken, dela råa "* .ht3" -filer i mindre filer för att ladda och bearbeta med BIFL.
  3. Analys av standardprover med BIFL
    1. Öppna BIFL-programvaran (Paris).
    2. Välj inställningen för PIE i det automatiska popup-fönstret "Bekräfta inställning" och läs rubriken genom att välja filen med liknande experimentella inställningar. Klicka på "få parametrar frånM-fil. "Klicka på" OK ". Observera att popup-fönstret stängs och är integrerat i Paris-fronten. Klicka på" OK "under" Nästa ".
    3. Välj de filer som ska analyseras genom att klicka på "Select" på "Data Path Array" för att välja mätning som ska analyseras.
      1. Klicka på "Green scatter" (för en vattenmätning), "Green BG" (för buffertmätning), "Green thick" (för en 2 nM Rhodamine 110 mätning), "Red scatter" Röd tjock "(för en 20-nM Rhodamine 101-mätning)," Yellow scatter "(för vattenmätning)," Yellow BG "(för buffertmätning) och "Yellow Thick" (för en 2 nM farröd fluoroförmätning).
      2. Klicka på "OK" under "Nästa".
        OBS! Den "gröna" kanalen motsvarar signalen från de gröna detektorerna i "snabb" TCSPC-kanalerna. De4 "Röd" kanal motsvarar signalen för de röda detektorerna i "snabb" TCSCP-kanalerna. Den "Gula" kanalen motsvarar signalen för de röda detektorerna i fördröjning TCSPC-kanalerna.
    4. Klicka på "Justera" bredvid "Data cut Burstwise" för att justera parametrar för selektiva parametrar. I det nya popup-fönstret väljer du enskilda molekylhändelser med två standardavvikelser från den genomsnittliga ankomsttiden för interphoton ("dt") genom att ändra interphoton-ankomsttiden under "Threshold" och det minsta antalet foton per enskild molekylhändelse under "min" . #. " Klicka på "Retur" för att stänga popup-fönstret. Klicka på "OK" under "Nästa".
      OBS: Tvärskeln, i ms-enheter, beror på bakgrundsräkningskursen. Det typiska minsta antalet fotoner som används är 60.
    5. Justera den ursprungliga fluorescenslivstiden "Färgpassningsparametrar" ( t.ex. , från, till och konvolvering) för genereringenD-fluorescensförfallningsparametrar på "Gröna", "Röda" och "Gula" färgerna. I samma fönster justerar du "från" och "till" värden för "Prompt" och "Delay." Klicka på "Retur" för att stänga popup-fönstret. Klicka på "OK" under "Nästa".
      OBSERVERA: Kontrollera att kryssrutan 2-färgs excitation är markerad. "Från" och "till" motsvarar de ursprungliga och slutliga behållarna på fluorescensförfallets histogram (TAC-kanalnummer). Om de initiala anpassningsparametrarna väljs korrekt, läggs en passningsfunktion till fluorescensavfallet på varje kanal.
    6. Välj plats på hårddisken för att spara alla bearbetade ASCI-filer i en föräldramapp.
      OBS! Paris behandlar alla valda utbrott och skapar flera ASCI-utdatafiler än vad som kan användas av andra program för visualisering ( t.ex. Margarita MFD-suite).

6. dsDNA Standards and Sample Measurements

  1. Tillsätt 500 μl PBS-buffert till ett kammarplåt och placera en droppe destillerat vatten mellan kammaren och objektivlinsen. Klicka på "Start" -knappen på kontrollpedalen och samla 5 min data i TTTR-läge för analys.
  2. Ta en liten mängd (vanligen omkring 0,1 μL, koncentration av omkring 1 μM) av dsDNA-standarden, tillsätt den till PBS-bufferten och blanda väl. Samla först 10 s data genom att klicka på "Starta". Kontrollera sedan skuren för att få 35 skurningar per 10 s (som i steg 5.2.7 och 5.3). Slutligen samla> 2 h data i TTTR-format, som beskrivits ovan.
  3. Analysera de insamlade data för dsDNA-proverna, som i steg 5.3.3.
  4. Visualisera bursthistogrammen med hjälp av MFD-sviten (Margarita) och visa FRET-effektiviteten mot <τ D (A) > f eller F D / F A mot <τ D (A) > f .
    1. Öppna tHan Margarita programvara och välj "File" -> "Importera alla *. ?? 4 och *. Mti-filer." Välj föräldermappen som innehåller olika undermappar.
    2. Välj parametrarna som ska visualiseras genom att klicka bredvid "X" (abscissa) av en av parametrarna som härrör från Paris ( t ex green eller <τ D (A) > f ); På samma sätt upprepa detta för ordinaten "Y" för att välja önskad parameter för att visualisera ( t.ex. FRET-effektivitet, F D / F A eller S PIE PIE).
      OBS: I detta fall korrigerar FRET-effektiviteten, F D / F A eller S PIE för korrekt bakgrundsantal i de gröna, röda och gula kanalerna. För kvantutbyten från givaren och acceptorn För detekteringseffektivitetsförhållandet (g G / g R ); Och för crosstalk (α). Här, g G / g R = 3,7 och a = 0,017, beroende endast på instrumentet. Priser för bakgrundsräkningBeror på den använda bufferten och kvantutbytesvärdena bestäms tidigare.
    3. Lägg till en FRET-rad genom att öppna fönstret "Överlay Equation" genom att klicka på "Display" -> "Overlay Equation." Välj den statiska FRET-linjen på popup-menyn. Välj rätt donorlivstid och kvantutbyteparametrar för att generera rätt FRET-linje.
      OBS: FRET-linjer för korrelering av olika FRET-indikatorer kan genereras.
  5. Bestäm korrigeringsfaktorn för acceptor excitationen genom donator excitationskällan (β) med hjälp av stoichiometry parametern genom att visa FRET effektivitet kontra stökiometri (S PIE ) i Margarita (ekvation 1 nedan).
    OBS: β är vald så att donatorprovet har en topp vid S PIE = 1,0 i stökiometriskanalen; Det acceptor-enda provet bör ha en stökiometri av S PIE = 0,0, och dsDNA med båda etiketterna bör ha en stökiometri av S PIE ~ 0,5. <Br /> OBS! Instrumentet är nu klart, och det är möjligt att mäta FRET-märkta prov.
  6. Mät och analysera FRET-märkta prov framställda i avsnitt 3 genom att följa steg 6.3-6.4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I typiska smFRET-experiment som använder en MFD-inställning (laserlängder: 485 nm vid 60 μW och 640 nm vid 23 μW, avsnitt 5.1) spädas fluorescensprovet till en lågpikomolär koncentration (10-12 M = 1 pM) och placeras I ett konfokalt mikroskop, där en subnanosekund laserpuls exciterar märkta molekyler som diffunderar fritt genom en excitationsvolym. En typisk konfokalvolym är <4 femtoliters (fL). Vid sådana låga koncentrationer detekteras endast enstaka molekyler en i taget. Den emitterade fluorescensen från de märkta molekylerna uppsamlas genom målet och filtreras spatiellt med användning av ett pinhål. Detta steg definierar en effektiv konfokal detekteringsvolym. Därefter delas signalen i parallella och vinkelräta komponenter i två (eller flera) olika spektralfönster ( t.ex. "grön" och "röd"). Varje fotondetektorkanal kopplas sedan till tidskorrelerad enkelfotonräkning (TCSPC) Elektronik för dataregistrering ( Figur 1 ).

Efter att ha följt kalibreringen av MFD-inställningen kan ett förfarande som sammanfattas i Tabell 1 (steg 5-6), mätning av dsDNA-standarderna, startas. Då används PIE-MFD för att analysera flera parametrar, såsom genomsnittlig makrotid, fluorescenslivstid, sprängintegrerad anisotropi, förhållande av signalen i grön över signalen i röd, utbrottstid i snabbkanalen (T (G + R) | D ), utbrottstid i den fördröjda kanalen (T R | A ) och andra 65 , 66 ( Figur 2 ). Viktigt i denna analys är stökiometriparametern ( S PIE ), definierad som:

Ekvation 45

Där F G | D = F D , F R | D = F A och F R | en Är bakgrundskorrigerade fluorescensintensiteter 63 . Till exempel, F G | D = I G | D - < B G >, Där jag G | D Är den detekterade intensiteten i den gröna kanalen från givaren och < B G > Är den genomsnittliga bakgrundsräkningshastigheten på den gröna kanalen. Liknande korrigeringar görs för fluorescensen hos acceptorn från direkt excitation av acceptorn ( F R | A ) och för sensibiliserad emission av acceptorn ( F R | D ). I ekvation 1 är α korrigeringsfaktorn för donor-fluoRescence crosstalk i acceptorkanalen; P är korrektionsfaktorn för acceptor excitation genom donator excitationskällan; Och y , var

Ekvation 56

Är en funktion av donor- och acceptorkvantumutbytet, F, D Och Φ F, A , Respektive av detekteringseffektiviteten på de gröna och röda detektorerna, g G och g R. Med S PIE är det möjligt att kalibrera de korrekta instrumentala faktorerna, såsom α, β och γ , för att tillfredsställa S PIE = 1 för det givare-enda märkta provet, S PIE = 0 för det acceptor-enda provet och S PIE = 0,5 för FRET-provet. Alternativt, detÄr möjligt att använda:

Ekvation 59

Att härleda kvantutbytet av ett andra prov, med tanke på att kvantutbytet av ett prov ( Ekvation 60 ) Är känt och att Ekvation 61 och Ekvation 62 Bestäms från PIE-MFD-experimentet. I detta fall antas att kvantutbytet av hög-FRET-dsDNA är 0,32 och kvantutbytet av låg-FRET-dsDNA bestäms. Anledningen till att göra denna procedur är att det har noterats att S PIE är annorlunda för både låg-FRET- och high-FRET-prover, även om båda har en givare på samma plats och endast en acceptor, men vid diffErent platser. Efter bestämning av det korrekta kvantutbytet av standardproverna, såsom beskrivits i ekvation (3), var FRET-effektiviteten ( E ) mot < τ D ( A ) > f Och F D / F A mot < τ D ( A ) > f- representationer används för vidare utvärdering. Det parametriska förhållandet mellan FRET-effektiviteten ( E statisk ), FD / FA och < D ( A ) > f Parametrar beskrivs av följande uppsättning ekvationer (ekvation 4):

Ekvation 63

Ekvation 64

Här, F D | D är donatorfluorescensen detekterad i donatorn eller den gröna kanalen; F A | D Är den acceptor-sensibiliserade emissionen; Ekvation 67 Är donatorfluorescenslivet i frånvaro av acceptorn; Och < τ D ( A ) > x Är artens genomsnittliga livstid, som är relaterad till fluorescensens genomsnittliga livstid med ett empiriskt polynom Ekvation 69 56 , 57 . Dessa ekvationer är kända som de statiska FRET-linjerna 57 , 67 eftersom linjerna bör korsa båda populationerna lika bra, i frånvaro oF dynamik ( Figur 3 ).

Senast kommer analysen av FRET effektivitetshistogram ( Figur 4 ) med användning av sannolikhetsdistributionsanalys (PDA) för de två dsDNA-proverna 68 , 69 . PDA har använts för att modellera smFRET-histogrammen med hög noggrannhet 57 . Informationen om enskilda eller multistatiska arter kan erhållas från ett enda histogram. Efter anpassning av formen av den förväntade fördelningen till de erhållna experimentella data kan avståndet mellan givaren och acceptorn avslöjas. Kortfattat beräknas FRET-effektiviteten eller F D / F A- fördelningarna genom att först erhålla sannolikheten [ekvation] för att observera en viss kombination av fotoner samlade i de "gröna" ( G ) och "röda" ( R ) detekteringskanalerna Givet en viss tidvind aj; Använd ekvation 5:

Ekvation 71

Här erhålles fluorescensintensitetsfördelningen, P ( F ), från den totala signalintensitetsfördelningen P ( S ), förutsatt att bakgrundssignalerna BG och BR fördelas enligt Poisson-fördelningar, P (BG) och P ( P) B R ), med kända genomsnittliga räkneintensiteter för intensitet, < B G > och < B R >. Den villkorade sannolikheten P (FG, F R | F ) är sannolikheten att observera en viss kombination av gröna och röda fluorescensfotoner, FG och FR , för ett givet FRET-tillstånd.

PDA-analys visar att interdye-avståndet för hög-FRET-dsDNA är < R DA > E (HFRET) = 45,7 Å, medan för låg-FRET-dsDNA, Avståndet < R DA > E (LFRET) = 59,7 Å. I jämförelse med de förväntade avstånden med FRET-positionerings- och screeningssystemet (FPS) 26 var ett förväntat intervallavstånd < R DA > E , AV (HFRET) = 44,7 Å Hittades som härledd med hjälp av FPS för hög-FRET-dsDNA och < R DA > E , AV (LFRET) = 59,1 Å för låg-FRET-dsDNA. AV står för den tillgängliga volymberäkningen inbäddad i FPS-verktyget. AV är en grov- Kornad Monte Carlo-simulering, där fluorofor representerar tre radi-hårda sfärmodeller kopplade till en fästpunkt i biomaterialetOlecule med en flexibel kopplingslänk 26 , 57 . En korrigering för kvantutbytet för låg-FRET dsDNA krävs, baserat på den uppmätta S PIE . Med dessa förhållanden är det möjligt att få en överenskommelse om ~ 1 Å mellan försöksvärdet och förväntat värde från AV-simuleringarna.

Därefter mäts NMDA GluN1 LBD. NMDA-receptorn (NMDAR) är en heteromer, icke-selektiv katjonkanal som kräver bindning av glycin och glutamat för gating 70 . LBD, som har en clamshell-liknande struktur, är känd att anta en öppen clamshell och en sluten clamshellliknande konfiguration vid ligandbindning baserat på kristallografisk information 71 , 72 . För MFD-experiment muterades NMDA GluNl LBD vid Ser507 och Thr701 (full längdsekvens) på motsatta sidor avKlyftan, som tidigare beskrivits. Det märktes sedan med FRET-paret av en cyangrön fluorofore och en fjärrfärgad fluorofor (se Materiallistan) med en R 0 på 52 Å. Denna konstruktion användes för att studera rörelsen hos den ligandbindande domänen utan komplexiteten associerad med att arbeta med en solubiliserad receptor. Med användning av denna konstruktion hittades minst tre konfigurationer av LBD. Det föreslogs att en konformationsselektionsmekanism populärt befolkade en av de identifierade populationerna vid ligandbindning 73 . I den inaktiverade formen, eller i närvaro av antagonisten 5,7-diklorokynurensyra (DCKA), undersöks för det mesta mellan-till låg-FRET-tillstånd med en längre givarfluorescenslivstid och ett större fluorescensförhållande mellan givare och acceptor Vid FD / F A = 3,3 ( Figur 5A ). Detta överensstämmer med stabiliseringen av en öppen klyvkonformation.PDA och tidsfönsteranalys användes för att identifiera tre konfigurationer som LBD kan adoptera (hög-FRET (HF) (< R DA > E = 33,9 Å), medium-FRET (MF) (< R DA > E = 45,8 Å ) Och låg-FRET-stater (LF) (< R DA > E = 55,8 Å)). Emellertid, mestadels median-FRET och låg-FRET befolkades. Detta föreslår att hög-FRET är det tillstånd som leder till aktiveringen av NMDAR. Det är värt att notera att de experimentellt avledda avstånden och de som härrör från FPS med användning av silikomärkning och användning av den kristallografiska informationen (Protein Data Bank Identification (PDBID): 1PB7 och 1PBQ) jämfördes. Det visade sig att interdye-avståndet för median-FRET och låg-FRET-populationerna var < R DA > E , AV = 48,7 Å och 54,2 Å för båda strukturerna ( Figur 5B). Den största avvikelsen på 2,9 Å hittades i mellann-FRET-tillståndet. När man beaktar distributionens osäkerhet, från antagandet av K 2 = 2/3, det maximala felet är 2,5% i det uppmätta avståndet. Kortfattat kan man dra slutsatsen att det är möjligt att nå Angstrom-noggrannhet på experimentellt bestämda avstånd.

Figur 1
Figur 1: Experimentell inställning och dataregistrering för PIE-MFD. ( A ) En typisk multiparameterfluorescensdetekteringsinstallation visas och består av fyra detektorer som täcker två olika spektralfönster. Detektorerna är anslutna till tidskorrelerad singelfotonräkning (TCSPC) -elektronik. ( B ) I TCSPC identifieras varje foton genom tre parametrar: (i) mikrotid eller tid efter excitationspulsen; (Ii) makrotid eller numretAv excitationspulser från experimentets början; Och (iii) kanalnummer. Dessa tre parametrar krävs för off-line analys. ( C ) Enkla molekyler diffunderar fritt genom den konfokala volymen och fotoner emitteras, vilket ger en fotstörning som en funktion av tiden. ( D ) Varje vald brist är monterad i enlighet därmed och används för visning av flerdimensionella histogram. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2
Figur 2: Burstanalys med användning av olika fluorescensparametrar. ( A ) FRET-effektivitet mot makrotid, ( B ) FRET-effektivitet mot T (G + R) | D -T R | A och ( C ) FRET-effektivitet mot S PIE förLåg-FRET eller 15 bp dsDNA. T (G + R) | D är utbrottstiden i snabbkanalen, och T R | A är utbrottstiden i den fördröjda kanalen (T R | A ) Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3
Figur 3: F D / F A och livstid för givaren kontra FRET effektivitet. Tweedimensionella histogram som representerar FRET-effektivitet ( A ); Förhållandet mellan donatorn över acceptorfluorescens, FD / FA, ( B ); Och donoranisotropi r D ( C ) jämfört med givarens genomsnittliga fluorescenslivstid i närvaro av acceptor < D ( A ) > f . Den bestämda korrigeringenPå faktorer är: < B G > = 0,64, < B R > = 0,37, P = 0,08 (fraktionen av direkt excitation av acceptorn med donator excitationslasern), a = 0,017 och g G / g R = 3,7 Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4
Figur 4: PDA-jämförelser av hög-FRET och låg-FRET dsDNA. Tidsfönster PDA-analys vid 2 ms, med en halvbredd på 6% av medelvärdet FRET effektivitetsavstånd. Varje avstånd är Gaussian fördelat med 6% av < R DA > E som bredd (hw DA ). ( A ) För provet HFRET är intervallavståndet < R DA > E (HFRET) = 45,7 Å. ( B ) För provet LFRET är avståndet < R DA > E (LFRET) = 59,7 Å. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5
Figur 5: PIE-MFD hos den ligandbindande domänen hos NMDA-receptorn i närvaro av antagonisten, DCKA. ( A ) Tvådimensionellt histogram av F D / F A mot givarens livstid i närvaro av acceptor < D D > A och donans anisotropi mot < D D ( A ) > f För LBD med DCKA. En dimensionAl prognoser för F D / F A och visas också. Den statiska FRET-raden visas i rött. Ren givare och acceptorfluorescens ( F D och F A ) korrigeras för bakgrund (< B G > = 0,940 kHz och < B R > = 0,522 kHz), spektral korstal (α = 1,7%) och detekteringseffektivitet Förhållande (g G / g R = 3,7). På anisotropin mot < τ D ( A ) > f histogram har Perrins ekvation en rotationskorrelation av p = 2,5 ns. ( B ) PDA vid ett 10 ms tidsfönster At. Ett enda tillstånd behövs. Modellen passar alla tid windows fint. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Handling Mål
Center laserstråle.
Justera pinhålet. FCS-experimentet (avsnitt 5).
Justera detektorerna. Maximera CPM.
Justera objektiv korrigeringsring. Minimera t diff och maximera CPM.
Bestäm instrumentsvarfunktion (IRF). TCSPC @ SMD i TTTR-läge. Mät scatter decay mönstret.
Bestäm G-faktor för varje spektralfönster. TCSPC @ SMD i TTTR-läge. Jämför intensiteterna bildar förfallna svansar som passar för polarisationer.
Bestäm detekteringseffektivitetsförhållandet i spektralfönster (g R / g G ). (I) Intensitetsmätningar av ett färgämne med brett emissionsspektrum (nM-koncentration). (Ii) Mäta referens FRET linjaler (pM koncentration). I MFD bör subpopulationen falla på den statiska FRET-linjen.
Utför slutkontroll (livstid och anisotropi). Kontroll anpassad livstid och anisotropi från mätning av enkelmolekyler av fritt diffunderande färgämne med ett enda exponentiellt sönderfall ( t ex Rhodamine 110).
Bestäm förhållandet mellan acceptorn och givarens kvantavkastning. (I) Stoichiometriplot (S PIE ) Eq. 1. och 4.2.
Bestäm bakgrundsantalet. Intensitetsmätningar av den valda "bufferten".
Bestäm cross-talk (α). Intensitetsmätningar av donatorfärg beaktar fluorescensutsläppspektrumet och detekteringseffektiviteten.

Tabell 1: Kalibreringssteg för FRET-experiment i enkomolekylexperiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta arbete presenteras protokollet för att anpassa, kalibrera och mäta intervallavstånd med hög precision med hjälp av PIE-MFD-enkomolekyl-FRET-experiment. Genom noggrant kalibrering av alla instrumentella parametrar kan man öka noggrannheten av de uppmätta avstånden och nå oströmsnoggrannheten. För att göra det används olika multidimensionella histogram för att analysera och identifiera populationer för ytterligare karakterisering. Med hjälp av den genomsnittliga makrotiden för att verifiera stabiliteten hos de uppmätta proverna är det möjligt att korrigera för fotoradgivare och acceptor och att välja FRET-populationer baserat på stökiometri-parametern. Acceptorns fotofysiska egenskaper kan emellertid ändras beroende på etikettens placering. Således kan man använda en S PIE- fördelning för korrekt korrigering för acceptorns kvantutbyte. Korrekt fotofysisk karaktärisering är nödvändig för att bestämma gammafaktorn (ƴ), som tillsammans med andra korrigeringsfaktorerOrs ( t.ex. α för crosstalk och β för acceptor excitation med givarlasern) kan användas för att öka noggrannheten av det uppmätta intergryansavståndet. Detta tillvägagångssätt bekräftades med användning av två utformade dsDNA-standardprover, och en noggrannhet av ~ 1 Å jämfört med förväntade värden bestämdes.

Olika färgämnesval kräver att man anpassar mikroskopoptiska element, såsom de dikroiska och bandpassfiltrarna, för att rymma det lämpliga spektralfönstret för de valda färgämnena. Följaktligen måste pulserande lasrar väljas. Ännu viktigare är valet av färgämnen avgörande på grund av flera möjliga fotofysiska artefakter, såsom acceptor- och donatorblekning, triplett eller färgämne blinkande eller färgämnen som klibbar proteinytor. Dessa artefakter kan äventyra tolkningen av experimentella data. MFD är idealisk i detta scenario eftersom det genom att inspektera flera parametrar är möjligt att identifiera källorna till dessa artefakter, korrigeraFör dem, eller åtminstone vara medveten om deras existens. Dipolorienteringsparametern, för det mesta antagen som k 2 = 2/3, kan orsaka större avvikelser av det bestämda avståndet om färgämnet sticker företrädesvis till ytan av biomolekylerna. Anisotropi av givarprovet, acceptorprovet och givaracceptorn kan hjälpa till att avgöra om detta antagande är giltigt eller inte. I detta experiment har det visat sig att det finns ett maximalt fel på 2,5% på det uppmätta avståndet, jämfört med att inte göra rätt korrigering och erhålla ett 10-20% fel. Kvantutbytet av acceptorn kan skapa en större felkälla. S PIE är således viktigt för att ta itu med denna viktiga fråga.

Det är möjligt att tillämpa en liknande strategi för att förstå det konformationella landskapet hos den ligandbindande domänen för NMDA-receptorn för att förstå mekanismen för agonism på NMDAR. Det konstaterades att LBD i tHans närvaro av en antagonist skymmer tillgängligheten av en hög-FRET-stat, som postuleras för att vara ansvarig för att öppna kanalen 73 . Vid jämförelse av experimentellt avledda avstånd och de förväntade värdena baserade på kristallografisk information uppnåddes en överenskommelse inom 3 Å. Ännu viktigare är att de nya lågbefolkade staterna kan identifieras med liknande precision.

Sammanfattningsvis tillåter FRET-experiment med enkelmolekyler i MFD-läge 42 att man korrekt redovisar experimentella artefakter och att härleda interdye-avstånd inom intervallet ~ 30-70 Å. Om ett distansnät, istället för ett enda uppmätt avstånd, härleds, är det möjligt att använda dessa som restriktioner i strukturell modellering, särskilt för stater som är svåra att karakterisera med mer standardmetoder för strukturbiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alla författare förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen med innehållet i denna artikel.

Acknowledgments

VJ och HS erkänner stöd från NIH R01 GM094246 till VJ. HS erkänner startfonder från Clemson University Creative Research Program och Center for Optical Materials Science and Engineering Technologies vid Clemson University. Detta projekt stöddes också av ett stipendium från Keck Center for Tvärvetenskaplig Bioscience Training of the Gulf Coast Consortia (NIGMS Grant No. 1 T32GM089657-05) och Schissler Foundation Fellowship för Translational Studies of Common Human Diseases till DD. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella synpunkterna från National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
charcoal Merck KGaA K42964486 320
syringe filter Fisherbrand 09-719C size: 0.20 µm
chambered coverglass Fisher Scientific 155409 1.5 borosilicate glass, 8 wells
microscope cover glass Fisher Scientific 063014-9 size: 24 x 60-1.5
Nuclease free water Fisher Scientific 148859 nuclease free
tween-20 Thermo Scientific 28320 10% solution of Polysorbate 20
acceptor DNA strand (High FRET) Integrated DNA Technologies 178124895 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
acceptor DNA strand (Low FRET) Integrated DNA Technologies 177956424 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
donor DNA strand Integrated DNA Technologies 177951437 5´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)
DNA strand (No FRET) Integrated DNA Technologies 5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
thermal cycler Eppendorf E6331000025 nexus gradient
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide Thermo Scientific A10254 termed cyan-green fluorophore in the manuscript
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide Thermo Scientific A20347 termed far-red fluorophore in the manuscript
Rhodamine 110 Sigma-Aldrich 83695-250MG
Rhodamine 101 Sigma-Aldrich 83694-500MG
LB Broth, Miller Fisher Scientific BP1426 For culture of E. coli
Ampicillin Sigma-Aldrich A0166 Used at 100 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection
Tetracyline  Calbiochem 58346 Used at 12.5 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Used at 15 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation
Origami B(DE3) Competent Cells Millipore 70837-3 Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Fisher Scientific BP1755 For induction of E. coli protein expression
HiTrap Chelating HP GE Life Sciences 17-0409-01 For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein
Imidazole Sigma-Aldrich 56749
Ni-NTA Agarose  Qiagen 30210
PD-10 Desalting Column GE Life Sciences 17-0851-01
AktaPurifier GE Life Sciences 28406264 FPLC Instrument
Dialysis tubing Spectrum labs 132562 15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll
Dichroics Semrock FF500/646-Di01-25x36 500/646 BrightLight
50/50 Beam splitter polarizer Qioptiq Linos  G33 5743 000 10 x 10 film polarizer
Green pass filer Chroma ET525/50m ET525/50m 25 mm diameter mount
Red pass filter Chroma ET720/150m ET720/150m 25 mm diameter mount
Power Meter ThorLabd PM200
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary300Bio
Fluorolog 3 fluorometer Horiba FL3-22-R3
Fluorohub TCSPC controller Horiba Fluorohub-B TCSPC electronics for ensemble measurements
NanoLed 485L Horiba 485L Blue diode laser
NanoLed 635L Horiba 635L Red diode laser
Olympus IX73 Microscope Olympus IX73P2F Microscope frame
PMA 40 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932200, PMA 40 Optimized for green detection
PMA 50 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932201, PMA 50 Optimized for ed shifter sensitivity
485 nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-485
640 nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-640
Hydraharp 400 and TTTR acqusition software PicoQuant 930021 Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software
SEPIA II SLM 828 and SEPIA software PicoQuant 910028 Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.
computer Dell optiplex 7010 cpu: i7-3770 ram:16GB
FRET Positioning and Screening (FPS) software Heinrich Heine Unviersity It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html
MFD suite Heinrich Heine Unviersity It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kendrew, J. C. Architecture of a protein molecule. Nature. 182, (4638), 764-767 (1958).
  2. Kendrew, J. C., et al. A three-dimensional model of the myoglobin molecule obtained by x-ray analysis. Nature. 181, (4610), 662-666 (1958).
  3. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450, (7172), 964-972 (2007).
  4. Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450, (7171), 913-927 (2007).
  5. Henzler-Wildman, K. A., et al. Intrinsic motions along an enzymatic reaction trajectory. Nature. 450, (7171), 838 (2007).
  6. Kline, A. D., Wuthrich, K. Secondary structure of the alpha-amylase polypeptide inhibitor tendamistat from Streptomyces tendae determined in solution by 1H nuclear magnetic resonance. J. Mol. Biol. 183, (3), 503-507 (1985).
  7. Williamson, M. P., Havel, T. F., Wuthrich, K. Solution conformation of proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by 1H nuclear magnetic resonance and distance geometry. J. Mol. Biol. 182, (2), 295-315 (1985).
  8. Havel, T. F., Wuthrich, K. An evaluation of the combined use of nuclear magnetic resonance and distance geometry for the determination of protein conformations in solution. J. Mol. Biol. 182, (2), 281-294 (1985).
  9. Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann.Phys. 437, (1), 55-75 (1948).
  10. Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. 58, (2), 719-726 (1967).
  11. Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (8), 2754-2759 (2005).
  12. Wozniak, A. K., Schroder, G. F., Grubmuller, H., Seidel, C. A., Oesterhelt, F. Single-molecule FRET measures bends and kinks in DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (47), 18337-18342 (2008).
  13. Orrit, M., Bernard, J. Single Pentacene Molecules Detected by Fluorescence Excitation in a p-Terphenyl Crystal. Phys. Rev. Lett. 65, (21), 2716-2719 (1990).
  14. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283, (5408), 1676-1683 (1999).
  15. Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 93, 6264-6268 (1996).
  16. Michalet, X., Weiss, S., Jager, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chem. Rev. 106, (5), 1785-1813 (2006).
  17. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat. Biotechnol. 21, (11), 1387-1395 (2003).
  18. Sakon, J. J., Weninger, K. R. Detecting the conformation of individual proteins in live cells. Nat Methods. 7, (3), 203-205 (2010).
  19. Stahl, Y., et al. Moderation of Arabidopsis root stemness by CLAVATA1 and ARABIDOPSIS CRINKLY4 receptor kinase complexes. Curr. Biol. 23, (5), 362-371 (2013).
  20. Fessl, T., et al. Towards characterization of DNA structure under physiological conditions in vivo at the single-molecule level using single-pair FRET. Nucleic Acids Res. 40, (16), e121 (2012).
  21. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annu. Rev. Biochem. 47, 819-846 (1978).
  22. Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102, (8), 2754-2759 (2005).
  23. Best, R. B., et al. Effect of flexibility and cis residues in single-molecule FRET studies of polyproline. Proc Natl Acad Sci USA. 104, (48), 18964-18969 (2007).
  24. Hoefling, M., et al. Structural heterogeneity and quantitative FRET efficiency distributions of polyprolines through a hybrid atomistic simulation and Monte Carlo approach. PLoS One. 6, (5), e19791 (2011).
  25. Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. (2016).
  26. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat. Meth. 9, (12), 1218-1225 (2012).
  27. Hickerson, R., Majumdar, Z. K., Baucom, A., Clegg, R. M., Noller, H. F. Measurement of internal movements within the 30 S ribosomal subunit using Forster resonance energy transfer. J. Mol. Biol. 354, (2), 459-472 (2005).
  28. Margittai, M., et al. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, (26), 15516-15521 (2003).
  29. Weninger, K., Bowen, M. E., Chu, S., Brunger, A. T. Single-molecule studies of SNARE complex assembly reveal parallel and antiparallel configurations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, (25), 14800-14805 (2003).
  30. Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET. J. Struct. Biol. 173, (3), 497-505 (2011).
  31. Choi, U. B., et al. Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, (3), 318-324 (2010).
  32. DeRocco, V., Anderson, T., Piehler, J., Erie, D. A., Weninger, K. Four-color single-molecule fluorescence with noncovalent dye labeling to monitor dynamic multimolecular complexes. BioTechniques. 49, (5), 807-816 (2010).
  33. McCann, J. J., Zheng, L., Chiantia, S., Bowen, M. E. Domain orientation in the N-Terminal PDZ tandem from PSD-95 is maintained in the full-length protein. Structure. 19, (6), 810-820 (2011).
  34. McCann, J. J., et al. Supertertiary structure of the synaptic MAGuK scaffold proteins is conserved. Proc Natl Acad Sci USA. 109, (39), 15775-15780 (2012).
  35. Andrecka, J., et al. Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase II elongation complex. Nucleic Acids Res. 37, (17), 5803-5809 (2009).
  36. Muschielok, A., et al. A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat Methods. 5, (11), 965-971 (2008).
  37. Muschielok, A., Michaelis, J. Application of the Nano-Positioning System to the Analysis of Fluorescence Resonance Energy Transfer Networks. J. Phys. Chem. B. 115, (41), 11927-11937 (2011).
  38. Renner, A., et al. High Precision FRET Reveals Dynamic Structures in the Drosophila Scaffold Protein Complex Stardust-DPATJ-DLin-7 Mediated by L27 Domains. Biophys. J. 106, (2), 256 (2014).
  39. Antonik, M., Felekyan, S., Gaiduk, A., Seidel, C. A. Separating structural heterogeneities from stochastic variations in fluorescence resonance energy transfer distributions via photon distribution analysis. The Journal of Physical Chemistry B. 110, (13), 6970-6978 (2006).
  40. Gaiduk, A., Kühnemuth, R., Antonik, M., Seidel, C. A. Optical Characteristics of Atomic Force Microscopy Tips for Single-Molecule Fluorescence Applications. ChemPhysChem. 6, (5), 976-983 (2005).
  41. Eggeling, C., Fries, J., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, (4), 1556-1561 (1998).
  42. Kudryavtsev, V., et al. Combining MFD and PIE for Accurate Single-Pair Förster Resonance Energy Transfer Measurements. ChemPhysChem. 13, (4), 1060-1078 (2012).
  43. Steven, A. C., Baumeister, W. The future is hybrid. J. Struct. Biol. 163, (3), 186-195 (2008).
  44. Cowieson, N. P., Kobe, B., Martin, J. L. United we stand: combining structural methods. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, (5), 617-622 (2008).
  45. Boura, E., et al. Solution structure of the ESCRT-I complex by small-angle X-ray scattering, EPR, and FRET spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 108, (23), 9437-9442 (2011).
  46. Dominguez, C., Boelens, R., Bonvin, A. M. HADDOCK: a protein-protein docking approach based on biochemical or biophysical information. J. Am. Chem. Soc. 125, (7), 1731-1737 (2003).
  47. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J Vis Exp. (27), (2009).
  48. Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
  49. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. J Vis Exp. (117), e54792 (2016).
  50. Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), e51206 (2014).
  51. Protein Sample Preparation, Handbook. GE Healthcare. Available from: http://www.gelifesciences.com/file_source/GELS/Service%20and%20Support/Documents%20and%20Downloads/Handbooks/Protein_sample_preparation_handbook.pdf (2016).
  52. Li, Q., Richard, C. -A., Moudjou, M., Vidic, J. Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli. J Vis Exp. (106), e53432 (2015).
  53. Scopes, R. K. Protein Purification: Principles and Practice. Springer. New York. (1993).
  54. Protein Extiction Coefficient Calculator. Available from: http://www.biomol.net/en/tools/proteinextinction.htm (2016).
  55. Desalting Column Product booklet. GE. Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_20161110134421.pdf (2016).
  56. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Springer. (2007).
  57. Sindbert, S., et al. Accurate distance determination of nucleic acids via Forster resonance energy transfer: implications of dye linker length and rigidity. J. Am. Chem. Soc. 133, (8), 2463-2480 (2011).
  58. Wahl, M. Technical Note. Time Tagged Time-Resolved Fluorescence Data Collection in Life Sciences. PicoQuant. Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/14528/technote_tttr.pdf (2010).
  59. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. 13, (1), 1-27 (1974).
  60. Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. 13, (1), 29-61 (1974).
  61. Felekyan, S., et al. Full correlation from picoseconds to seconds by time-resolved and time-correlated single photon detection. Rev. Sci. Instrum. 76, (8), 083104 (2005).
  62. Iyer, V., Rossow, M. J., Waxham, M. N. Peak two-photon molecular brightness of fluorophores is a robust measure of quantum efficiency and photostability. JOSA B. 23, (7), 1420-1433 (2006).
  63. Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chem. Phys. Lett. 353, (5), 439-445 (2002).
  64. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 102, (33), 6601-6613 (1998).
  65. Kühnemuth, R., Seidel, C. A. M. Principles of Single Molecule Multiparameter Fluorescence Spectroscopy. Single Mol. 2, (4), 251-254 (2001).
  66. Widengren, J., et al. Single-molecule detection and identification of multiple species by multiparameter fluorescence detection. Anal. Chem. 78, (6), 2039-2050 (2006).
  67. Sisamakis, E., Valeri, A., Kalinin, S., Rothwell, P. J., Seidel, C. A. Accurate single-molecule FRET studies using multiparameter fluorescence detection. Methods Enzymol. 475, 455-514 (2010).
  68. Kalinin, S., Felekyan, S., Antonik, M., Seidel, C. A. Probability distribution analysis of single-molecule fluorescence anisotropy and resonance energy transfer. The Journal of Physical Chemistry B. 111, (34), 10253-10262 (2007).
  69. Kask, P., et al. Two-dimensional fluorescence intensity distribution analysis: theory and applications. Biophys. J. 78, (4), 1703-1713 (2000).
  70. Traynelis, S. F., et al. Glutamate Receptor Ion Channels: Structure, Regulation, and Function. Pharmacol. Rev. 62, (3), 405-496 (2010).
  71. Furukawa, H., Gouaux, E. Mechanisms of activation, inhibition and specificity: crystal structures of the NMDA receptor NR1 ligand-binding core. EMBO J. 22, (12), 2873-2885 (2003).
  72. Furukawa, H., Singh, S. K., Mancusso, R., Gouaux, E. Subunit arrangement and function in NMDA receptors. Nature. 438, (7065), 185-192 (2005).
  73. Dolino, D. M., Rezaei Adariani,, Shaikh, S., A, S., Jayaraman, V., Sanabria, H. Conformational Selection and Submillisecond Dynamics of the Ligand-binding Domain of the N-Methyl-d-aspartate Receptor. J. Biol. Chem. 291, (31), 16175-16185 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics