クロマチン免疫沈降法を用いたc-KITリガンドプロモーターの解析

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

DNA-タンパク質相互作用は、複数の生物学的プロセスにとって必須である。細胞機能の評価の間、DNA-タンパク質相互作用の分析は、遺伝子調節を理解するために不可欠である。クロマチン免疫沈降(ChIP)は、 インビボでそのような相互作用を分析するための強力なツールである。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zhang, P., Rojas, A., Blechacz, B. Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (124), e55689, doi:10.3791/55689 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

DNA複製および修復、DNA組換えおよび遺伝子発現を含む複数の細胞プロセスは、タンパク質とDNAとの相互作用を必要とする。したがって、DNA-タンパク質相互作用は、細胞分化、細胞増殖、細胞周期制御、染色体安定性、エピジェネティックな遺伝子調節、および細胞形質転換などの複数の生理学的、病態生理学的および生物学的機能を調節する。真核細胞では、DNAはヒストンタンパク質および非ヒストンタンパク質と相互作用し、クロマチンに凝縮する。電気泳動(ゲル)移動度シフトアッセイ(EMSA)およびDNase Iフットプリントなど、いくつかの技術的ツールを用いてDNA-タンパク質相互作用を分析することができる。しかし、これらの技術は、細胞内ではなく、インビトロでタンパク質-DNA相互作用を分析する。クロマチン免疫沈降(ChIP)は、特定のDNA結合部位でタンパク質を捕捉し、それによってDNA-タンパク質相互作用の同定を可能にする技術であるそれらのクロマチンの文脈内にある。これは、DNA-タンパク質相互作用の固定化、続いて目的のタンパク質の免疫沈降によって行われる。続いて、タンパク質が結合したゲノム部位が特徴付けられる。ここで、我々はChIPを記載し、議論し、チロシンキナーゼのプロモーター領域内のSMAD結合要素(SBE)への転写因子SMAD2の形質転換成長因子-β(TGF-β)誘導結合の同定のための分析値を示す。プロテインキナーゼキット(c-KIT)受容体リガンド幹細胞因子(SCF)。

Introduction

真核生物の核において、DNAはヒストンタンパク質および非ヒストンタンパク質と相互作用し、クロマチンに凝縮する。生理学的、病態生理学的および細胞生物学的状況において、細胞機能は、クロマチン配位遺伝子発現によって空間的および一時的に制御される。 DNA-タンパク質相互作用は、DNA複製、組換え、および修復、ならびにタンパク質発現などの細胞プロセスの調節において必須の役割を果たす。したがって、DNA-タンパク質相互作用の分析は、遺伝子発現および細胞機能の評価において不可欠なツールである。

電気泳動(ゲル)移動度シフトアッセイ(EMSA)およびDNase Iフットプリンティング1,2など、インビトロでのDNA-タンパク質相互作用を評価するいくつかの技術が存在する。しかしながら、これらの技術は、クロマチンおよび細胞の状況におけるタンパク質-DNA相互作用を分析しない。チップI特定のDNA結合部位に結合したタンパク質を捕捉し、それによってクロマチンの状況におけるDNA-タンパク質相互作用の同定を容易にする技術である。この技術は、もともとGimourとLisによって、 Escherichia coliおよびDrosophila melanogaster 3,4 における特定の遺伝子へのRNAポリメラーゼII結合の評価のために開発されました。これは、DNA-タンパク質複合体の固定化、その後のクロマチン抽出および約200塩基対(bp)断片へのDNAの切断によって行われる。続いて、目的のDNA結合タンパク質を免疫沈降によって単離する。 DNA-タンパク質架橋の逆転後、DNAを精製し、分析する。タンパク質結合部位の分析にはいくつかの方法を用いることができ、標的遺伝子5内のタンパク質結合部位の核酸配列に依存する5 。 DNA配列が既知である場合、標準的なPol既知の結合部位に隣接する特定のプライマー対を用いて、イメラーゼ連鎖反応(PCR)を適用することができる。定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)も使用できます6 。配列が未知である場合、ChIPはDNAマイクロアレイ(ChIP-on-chip)、DNA配列決定(ChIP-seq)、またはクローニング技術7,8,9と組み合わせることができる。

TGF-β経路は強力な腫瘍抑制機能を有し、細胞分化の鍵となる経路である。それはTGF-β1リガンドの同族受容体複合体への結合によって活性化され、SMAD2 / 3転写因子のセリンリン酸化をもたらす。共通のメディエーターであるSMAD4との会合後、SMAD複合体は核に移行し、標的遺伝子のプロモーター領域内のSBEに結合し、細胞周期、アポトーシスおよび細胞の区別を制御する遺伝子を制御するに。 TGF-β刺激に対する転写応答は、細胞型および状況特異的である10 。最近、我々は、TGF-βとc-KIT経路11との間の正のフィードバックループを記載した。このモデルでは、TGF-β1活性化SMAD2はc-KITリガンドプロモーターに結合し、その発現および分泌を誘導する。続いて、c-KITリガンドは、c-KIT受容体を自己および準クリニック様式で活性化する。 c-KIT受容体活性化は、JAK1 / 2を介したSTAT3 Tyr705リン酸化をもたらす。 STAT3活性化および核移行後、STAT3はTGF-β1リガンド遺伝子に結合し、その発現を調節する。

ここでは、我々は、c-KIT受容体リガンドプロモーターへのSMAD2結合の同定、およびシグナルトランスデューサー(および)転写3(TGF-β1-遺伝子)。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.ソリューションの準備

  1. 実験ごとに以下の解決策を用意してください。
    1. 固定溶液は37%ホルムアルデヒドを調製し、室温で保存します。 1.42%の最終濃度になるように1倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈する。
      注意:ホルムアルデヒドは刺激性、腐食性、突然変異誘発性、催奇性、発癌性に分類されます。摂取しないでください。ガス/フューム/蒸気/スプレーを吸入してはならない。換気が不十分な場合は、適切な呼吸器を着用する。皮膚や眼との接触を避ける。酸化剤、還元剤、酸、アルカリ、水分などの不適合物を避けてください。
    2. グリシン停止 - 固定溶液については、1×PBS溶液中に0.125Mグリシンを調製し、室温で保存する。
    3. 細胞掻爬溶液のために、dH 2 O中の1 × PBS溶液を調製し、氷上に保存する。使用直前に、プロテイナーゼ阻害剤フェニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)t0.5mMの最終濃度。
      注意:PMSFは腐食性および有毒性に分類されています。保護服を着用し、換気の良い場所で使用すること。
    4. 細胞溶解バッファー(20 mM Tris-HCl; pH 8.0,85 mM KClおよび0.5%NP40)を使用する直前に、1Xプロテアーゼインヒビターカクテル(PIC;ジメチルスルホキシド(DMSO)中100Xストック溶液:104 mM 4- (AEBSF)、80μMアプロチニン、4mMベスタチン、1.4mM E-64,2mMロイペプチン、および1.5mMペプスタチンA)および0.5mM PMSFを添加した。
    5. 核溶解緩衝液(50mM Tris-Cl; pH8.0,10mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、および1%SDS)を使用する直前に、1X PICおよび0.5mM PMSFを加える。

2.細胞固定およびせん断

  1. 10cmの組織培養プレート上で細胞を70〜80%のコンフルエンスまで増殖させる。実験目的ごとに細胞を刺激する。
  2. 組織培養培地を除去し、固定液5mLを添加し、インキュベートする細胞を振盪プラットフォーム上で室温で10分間インキュベートした。
  3. 固定溶液を除去し、10mLの氷冷1×PBSで細胞を2回洗浄する。
  4. 1x PBSを除去し、5mLのグリシン停止固定溶液を添加し、振盪プラットフォーム上でRTで5分間細胞をインキュベートする。
  5. グリシン停止固定溶液を除去し、10mLの氷冷1×PBSで細胞を2回洗浄する。
  6. 1×PBSを除去し、2mLの細胞掻き取り溶液を加え、細胞スクレーパーを用いて細胞を回収する。採取した細胞を氷上のコニカルチューブに移す。
  7. 600 xgおよび4℃で10分間サンプルを遠心分離する。
  8. 上清を除去し、ペレットを1×細胞溶解緩衝液1mLに再懸濁し、氷上で30分間インキュベートする。あるいは、液体窒素中でペレットをスナップフリーズし、-80℃で保存します。
  9. ペレットを細胞溶解バッファーに再懸濁したら、細胞懸濁液を氷冷ダウンスホモジナイザーに移し、タイプBのペストル細胞破壊のためのe。
  10. 細胞懸濁液をマイクロ遠心チューブに移し、2,400 xgおよび4℃で10分間サンプルを遠心分離します。
  11. 上清を捨て、ペレットを350μLの核消化バッファーに再懸濁し、37℃で5分間サンプルをインキュベートする。
  12. マイクロコッカルヌクレアーゼ(1U /μL)を添加し、ボルテックスで混合する。サンプルを37℃で5〜20分間インキュベートする。 2分ごとにサンプルを反転させる。
    注:時間と酵素濃度は細胞株間で異なり、最適以下の酵素的剪断の場合に最適化が必要な場合があります。
  13. あるいは、市販の超音波処理器を用いた超音波処理によるクロマチン剪断を達成する。
    注:超音波条件は最適化が必要です。 300μLのサンプル容量と25%のサンプル処理能力を用いて最適化の例のプロトコルを以下に示す。
    1. ステップ2.10の後、上清を捨て、nを再懸濁する1.0mLの商業的剪断緩衝液中に溶解した。
    2. 300μLの再懸濁した核ペレットを3つの1.7mLマイクロ遠心チューブに分注する。それらを氷上に置きます。
    3. 最適な超音波処理条件を決定するために、3つの異なる条件を使用して25%出力で固定クロマチンの3つのアリコートをせん断する:
      それぞれ20秒の5パルス、各パルスの間に氷上に30秒の休止時間があります。
      それぞれ20秒の10パルス、各パルスの間に氷上に30秒の休止時間があります。
      それぞれ20秒の20回のパルス、各パルスの間の氷上での30秒の休息。
    4. 以下に説明するように、ステップ2.15に進みます。
  14. マイクロコッカルヌクレアーゼでインキュベートした後、反応を停止させるために7μLの氷冷0.5M EDTAを加える。
  15. 剪断したDNAで16,200 xgおよび4℃で10分間サンプルを遠心分離する。
  16. 剪断したDNA含有上清を新鮮な微量遠心管に移す。 50μLを別のマイクロ遠心チューブに分注してsuを確認する。DNAの厳しい剪断(セクション3)。免疫沈降(セクション4)のために残りの容量をすぐに使用するか、-80°Cで保存してください。

3.せん断効率の確認

  1. ステップ2.16のせん断された染色質の50μLアリコートに150μLのヌクレアーゼフリーdH 2 Oおよび10μLの5M NaClを加える。
  2. サンプルを65℃で4時間インキュベートし、クロスリンクを逆にする。
  3. 2μLのRNase A(10μg/μL)を添加し、サンプルを37℃で15分間インキュベートする。
  4. プロテイナーゼK(0.5μg/μL)10μLを添加し、サンプルを42℃で90分間インキュベートする。
  5. DNAの精製のために、フェノール/クロロホルム抽出を行う12
    1. ヌクレアーゼフリーの水を200μLの最終容量に加えます。 200μLのフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)を試料に添加し、20秒間ボルテックスする。
    2. 室温で遠心する16000×gで5分間の穿孔。慎重に上部の水相を取り出し、新しいチューブに移す。ピペッティング中にフェノールを持ち込まないように注意してください。
    3. 0.1M容の3M酢酸ナトリウム(NH 4 OAc)(pH4.2)を加え、チューブを指で数回フリックすることによって混合する。 2.5容量の氷冷した100%エタノールを加え、ボルテックスで5秒間混合する。サンプルO / Nを-20℃でインキュベートするか、-80℃で少なくとも1時間インキュベートする。
    4. 4℃、16,000 xgで30分間サンプルを遠心分離し、cDNAをペレットにします。
    5. ペレットを破壊することなく上清を注意深く除去する。 1mLのRT、70%エタノールを添加し、チューブを数回反転させる。
    6. 4℃、16,000×gで2分間サンプルを遠心分離する。慎重に上清を除去する。
    7. ペレットを室温で5〜10分間乾燥する。ペレットを30μLのdH 2 Oに再懸濁する。
  6. 1%TAEを用いたゲル電気泳動のために、精製されたDNAの5および10μLアリコートを使用するアガロースゲル。
    注:成功したクロマチン剪断は、200-1,500 bpのDNAパターンをもたらす。せん断がうまくいかない場合、せん断工程(ステップ2.12)のインキュベーション時間を5分、10分および15分に変更することによって、特定の細胞の最適なせん断条件を決定する。
  7. 残りのサンプルを使用して、サンプルのDNA濃度を分析します。剪断したクロマチンサンプル中のDNA濃度を逆算する(ステップ2.16)。免疫沈降のための各処置群について同じDNA量を用いる(セクション4)。

免疫沈降

  1. 25μLのChIPグレードプロテインG磁気ビーズ、10μLの免疫沈降希釈緩衝液(ストック溶液:0.01%SDS、1.1%Triton X-100,16.7mM)と10-25μgの剪断架橋クロマチン(ステップ2.16)トリス-HCl; pH8.0,1.2mM EDTA、および167mM NaCl)、および1μLのPICを含む。
  2. 4時間のインキュベーションの後、1〜10μgの抗体(抗体濃縮物抗体の親和性に基づいて変化する;製造業者の推奨に従って最初に使用し、必要に応じて実験的に最適化する)を1.5mLマイクロ遠心チューブに加え、dH 2 Oを最終容量100μLに加える。
    注:上記の直接免疫沈降法の代わりに、間接免疫沈降法を、最初にクロマチンを抗体と組み合わせ、続いてプロテインG磁気ビーズを添加することにより使用することができる。
  3. サンプルを4〜12時間4℃でエンドツーエンド回転子にインキュベートする。

溶出

  1. 磁気スタンドにチューブを置きます。磁性ビーズがチューブの側面に集まったら、慎重に上清を除去して捨てる。
  2. 洗浄緩衝液1(0.1%SDS、1%Triton X-100,2mM EDTA pH8,20mM Tris-HCl; pH8,150mM NaCl)800μLでビーズを3回洗浄する。チューブを数回反転させて混ぜる。チューブを磁気スタンドに磁気ビーズがチューブの側面で凝集すると、注意深く洗浄バッファーを取り出して廃棄します。
  3. 800μLの洗浄緩衝液2(0.1%SDS、1%Triton X-100,2mM EDTA; pH8,20mM Tris-HCl pH8および500mM NaCl)でビーズを1回洗浄する。チューブを数回反転させて混ぜる。チューブを磁気スタンドの上に置き、磁気ビーズがチューブの側面に集まったら、注意深く洗浄バッファーを取り出して廃棄します。
  4. ビーズを50μLの溶出バッファー(1%SDSおよび100mM NaHCO 3 )に再懸濁し、サンプルをRTで15分間エンドツーエンド回転子にインキュベートする。
  5. チューブを磁気スタンドに置き、磁気ビーズがチューブの側面に集まると、上清を新しいチューブに移す。
  6. 6μLの5M NaClを添加して架橋を逆転させ、2μLのプロテイナーゼK(0.5μg/μL)を加える。サンプルを混合した後、サンプルを65℃で2時間インキュベートする。
  7. DNAの精製のために、phenol /クロロホルム抽出12 (ステップ3.5)、続いてペレットを30μLのdH 2 Oに再懸濁する。
    注:サンプルはタンパク質結合部位(セクション5)について直接解析することも、-20℃で保存することもできます。

6.結合部位分析

  1. PCRまたはqRT-PCRを使用して、既知の核酸配列内の特異的結合部位の分析を行います。プライマー設計については、従来のPCRまたはqRT-PCRプロトコールに従う。目的のタンパク質結合部位を架橋する150〜400 bpのアンプリコンを合成するためのプライマーを設計します図1 )。
  2. 目的の抗体で免疫沈降したChIP由来のDNA、非特異的なIgG抗体で免疫沈降させたChIP由来のDNA、iii)入力DNA、およびiv)H 2 Oとしての特異性を保証するために、4つの異なるDNA鋳型を用いてPCRをセットアップする。汚染を排除するためのPCRの陰性対照。経路刺激の場合免疫沈降したタンパク質の既知の結合部位に特異的な異なるプライマーセットを用いて第5の鋳型を選択する。
    注:c-KITリガンドプロモーター分析の場合、従来のPCRを使用して、c-KITリガンドプロモーター領域内のSBEでのTGF-β誘導SMAD結合を実証する。陽性対照として、TGF-β誘導性SMAD結合の既知の標的としてプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター-1(PAI-1)でPCRを行う。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TGF-β1リガンドのその同族受容体複合体への結合は、SMAD2 / 3転写因子のセリンリン酸化をもたらし、次いで共通メディエーター、SMAD4とのそれらの会合をもたらす。 SMAD複合体は核に移行する。 TGF-βは、標的遺伝子の調節領域内のSBEへのSMAD結合を介して、または関心対象の遺伝子の発現を引き続き制御する転写活性化因子またはリプレッサーのSMAD調節発現を介して間接的に、遺伝子転写を調節することができる。 c-KITリガンドSCFがSMAD2のそのプロモーターへの直接的なTGF-β1誘発結合によって転写的に調節されるかどうかを試験するために、本発明者らは、SCF遺伝子のSCFプロモーターを含む2.4kb、5'-フランキング領域をSMAD2結合モチーフ、5'-AGAC-3 '(SBE) 13,14 。我々は、7つの推定SBEsアップSCF開始コドンのトリム( 図1A )。 SCFプロモーターへのSMAD2のTGF-β1誘発結合を確認するために、本明細書に記載のChIPアッセイを行った。 TGF-β1処理は、ヒト肝臓癌細胞株HepG2およびHep3B細胞( 図1B )においてSCFプロモーターにSMAD2が結合する結果となった。 TGF-β1刺激の非存在下では、SMAD結合は認められなかった。 TGF-β1誘導SMAD活性化の陽性対照として、PAI-1に対するChIPが実施された。 PAI-1プロモーターは、TGF-β/ SMAD13の既知の標的である。 SMAD2免疫沈降の特異性を確認するために、非特異的IgG抗体を用いた。 SBEへのSMAD2の結合は、IgGによる免疫沈降後に認められなかった。

ChIP技術の別の実証のために、本発明者らは、TGF-βリガンド遺伝子の5 '隣接領域を、STAT3コンセンサス結合モチーフ5'-TT(N4)AA-3 'および5'-TT(N5)AA-3' 15 。我々は、-4384 / -4373(STB-1)および-5365 / -5357(STB-2)の位置( 図2A )のTGFB開始コドンの2つの推定上のSTAT3結合部位を同定した。 STAT3のTGF-βリガンド遺伝子へのTGF-β1誘導結合を確認するために、TGF-β1処理HepG2およびHep3B細胞を用いてChIPアッセイを行った。 TGF-β1処理は、TGFB遺伝子の第2の推定上のSTAT3結合部位(STB-2)に結合するが、第1のもの(STB-1)には結合しなかった( 図2B )。この実施例では、STB-2への正のSTAT3結合が内部陽性対照として働く。上記のChIP実験と同様に、STB-2へのSTAT3の結合は、IgGを用いた免疫沈降後も見られなかった。

図1
図1 ong>:SCFプロモーターへのTGF-β誘発SMAD2結合。 ( A )開始コドンとの相対的な位置をボックス(白いボックス= AGAC)として示す推定SBEを有するSCFプロモーターの模式図。 ChIPプライマーの位置を以下に示し、 SCF開始コドンとPCR産物のサイズとの相対的な位置を示す。 ( BSCFプロモーターへのSMAD2結合のChIP。 TGF-β1処理および未処理のHepG2およびHep3B細胞のクロマチン - タンパク質複合体を抗SMAD2抗体で免疫沈降させた。 SCF特異的プライマーを用いてPCRを行った。左には、入力DNAを用いたPCR結果が示されている。途中で、SMAD2免疫沈降特異性の確認のために、非特異的IgGによる免疫沈降後のPCR結果を示す。下のパネルに示すように、 PAI-1へのSMAD2結合に対するChIPを陽性対照として用いた。ge.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2
図2 :TGF-β誘導TGF-β遺伝子へのSTAT3結合。A )TGF-β遺伝子の概略図であり、推定STAT3結合部位は、開始コドンに対するそれらの相対位置を有する灰色のボックスとして示されている。 ChIPプライマーの位置は、以下に示すTGF-β開始コドンおよびPCR産物サイズに対するそれらの相対的な位置とともに示される。 ( B )TGF-β1がSTAT3とTGF-β遺伝子との結合を誘導するChIP。 TGF-β1処理および未処理のHepG2およびHep3B細胞のクロマチン - タンパク質複合体を抗STAT3抗体で免疫沈降させた。 TGF-β特異的プライマーを用いてPCRを行った。左には、入力DNAを用いたPCR結果が示されている。途中で、PCR非特異的IgGによる免疫沈降後の結果が、STAT3免疫沈降特異性の確認のために示される。上のパネルはSTAT3結合部位1(STB-1)に特異的なプライマーを用いたPCR結果を示し、下のパネルはSTAT3結合部位2(STB-2)へのSTAT3結合の結果を示す。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

この報告では、我々は、c-KITリガンドプロモーター内のSBEへのSMAD2のTGF-β1誘導性結合およびTGF-β1リガンド遺伝子内のその認識配列へのSTAT3のTGF-β1誘導結合を実証する。本発明者らは、クロマチン免疫沈降を用いて、両方の転写因子のサイトカイン誘導性結合を実証する。

クロマチン免疫沈降は、目的のタンパク質がDNAに直接結合することを実証し、タンパク質のDNA結合を誘導する刺激を特徴づけ、タンパク質が結合するDNA配列を特徴付ける強力なツールである。後者の情報は、目的の特定のタンパク質によって調節される遺伝子の同定を助けることができ、ChIP-on-chip、ChIP-seq、またはクローニング戦略7,8,9の使用によって達成される。 ChIPとDNA-タンパク質結合を実証する他の方法との大きな利点の1つ例えばEMSAまたはDNase Iのフットプリントは、ChIP技術において、結合がインビボで捕捉さ 、他のものではインビトロで行われるということである 。したがって、ChIPは、細胞の状況でのDNA-タンパク質の結合についての洞察を提供するが、他の技術は単離されたシステムを表す。

しかし、ChIP分析は複雑で、結果に影響を与える可能性のある複数のステップが必要であり、最適化と経験が必要です。成功したChIPにとって重要な第1のステップの1つは架橋ステップ(ステップ2.2)である。 UV架橋は不可逆的であり、したがって、ChIPには不適当である。ホルムアルデヒド架橋が好ましいが、ホルムアルデヒド濃度および架橋時間は両方ともクロマチン剪断および抗原沈降の効率に影響を及ぼし得る。一般に、低いホルムアルデヒド濃度(1%w / v)およびより短い架橋時間(5〜10分)が、せん断効率を改善するので、好ましい。しかしながら、ホルムアルデヒドは効率的ではないタンパク質とタンパク質との架橋において、したがってDNA16に直接結合しないタンパク質に対しては最適ではない。そのような場合、ChIPは2段階アプローチで行うことができます。このアプローチでは、最初にグルタール酸ジスクシンイミジルなどの架橋剤を使用してタンパク質 - タンパク質架橋を行い、続いてホルムアルデヒド媒介DNA-タンパク質架橋を行います17

次の重要なステップはクロマチン剪断である。我々の研究では、マイクロコッカスヌクレアーゼを用いた酵素的剪断を用いた。酵素的剪断は、超音波処理がDNA-タンパク質結合を破壊する非架橋ネイティブChIP(N-ChIP)に特に有用である。 N-ChIPは主にヒストンおよびヒストン修飾因子の分析に使用されます18 。ミクロコッカールヌクレアーゼは比較的非特異的エンドエキソヌクレアーゼと考えられているが、配列特異的切断を誘発することが示されている19 。これは、結果として生じるフラに配列依存性のバイアスをもたらす可能性がある特定の遺伝子座の過剰表現20 。超音波処理は、配列偏りを伴わずに無作為にサイズの決められたDNA断片を作製し、一般に架橋ChIP(X-ChIP)に好ましい。しかし、音波処理条件は、各細胞または組織タイプおよび超音波処理機モデルについて経験的に決定されなければならず、得られるDNAフラグメントは一般に酵素的せん断よりも大きい16 。また、サンプルの超音波処理または乳化は、タンパク質の変性および分解による抗体エピトープの消失をもたらし得る。

免疫沈降工程は、ChIPの結果に大きく影響する別の重要なステップである。アガロースビーズはDNAを非特異的に結合し、添加されるビーズの数の変動は特定のシグナル対バックグラウンド比に影響を及ぼし得る。したがって、アガロースビーズ「スラリー」をDNA-タンパク質サンプルに添加する際に十分に懸濁された状態に保つことが重要である。本発明に使用される抗体一般に、ChIP等級の抗体を用いるべきであり、これらが入手できない場合には、少なくとも免疫沈降グレードの抗体が好ましいはずである。特定のエピトープは架橋中にマスクすることができるので、ポリクローナル抗体はいくつかのエピトープを認識するので有利である。添加される抗体の量は、沈殿する因子を超えるべきであり、したがって、各因子/抗体について経験的に決定されるべきである。また、抗体結合の平衡に達するための動力学は各抗体ごとに異なるので、最適なインキュベーション条件を各抗体について決定しなければならない。

いくつかのコントロールを実験セットアップに含めることができます。特定のDNA-タンパク質結合反応の誘導が評価される場合、最終分析( すなわち、 PCRまたはqRT-PCR)において等しい鋳型DNA量を示すために、入力DNA対照を含むことが重要である。抗体コントロールが必要です目的のタンパク質の免疫沈降の特異性を確認する。通常、アイソタイプが一致した免疫グロブリンはネガティブコントロールとして適していますが、アガロースビーズも使用できます。場合によっては、陽性対照を用いてChIPの機能的実験フローを確認し、この目的のために抗ヒストン抗体が頻繁に使用される。刺激実験において、好ましい陽性対照は、関心対象のタンパク質の免疫沈降であり、引き続いて、タンパク質が刺激の際に結合する既知のDNA領域についての配列分析である。我々の代表的な結果では、PAI-1プロモーター内のSBEを、TGF-β1誘導SMAD結合の既知の標的として使用した。刺激されたタンパク質結合のない実験では、目的のタンパク質の標的ではないことが分かっているDNA配列を、その後のDNA分析に使用することができる。 DNA分析に関しては、汚染を排除するために鋳型DNAなしの反応を含めることが重要である。

ChIPは目的のタンパク質の遺伝子への結合を直接実証する優れた技術です。しかし、それは機能的な研究ではない。目的のタンパク質が調節的役割を有すると考えられる場合、レポーター遺伝子に基づくアッセイ( 例えば、ルシフェラーゼ)などの機能的アッセイもまた必須である。これらのプロトコルでは、目的の遺伝子がレポーター遺伝子の調節位置にクローン化される。関心のある遺伝子の誘導は、それが調節機能を有する場合、レポーター遺伝子の発現をもたらす。対象の特異的タンパク質の調節的役割のさらなる確認のために、DNA結合タンパク質が遺伝子的にサイレンシングされるノックダウン細胞またはノックイン細胞を生成することができる。追加の対照として、調節遺伝子中のタンパク質結合部位を突然変異させて目的のタンパク質の結合を防止することができる。後者の2つの実験設計のいずれにおいても、細胞刺激は、マーカーgの発現をもたらさないエン

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者らは競合する金銭的利益がないと宣言している。

Acknowledgments

この研究はテキサス州ヒューストンのテキサス大学MDアンダーソンがんセンター(スタートアップファンド、BB)の支援を受けていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HepG2 cells ATCC HB-8065
Hep3B cells ATCC HB-8064
TGF-β1 R&D Systems 101-B1 Used at a concentration of 10 ng/mL
Anti-SMAD2 antibody Cell Signalling Technology 5339 Amount used/IP: 3 µg
Anti-STAT3 antibody Cell Signalling Technology 4904 Amount used/IP: 3 µg
ChIP-IT Protein G Magnetic Beads Active Motif 53033
Protease Inhibitor Cocktail Active Motif 37490
Micrococcal Nuclease Cell Signalling Technology 10011
PCR forward primer: PAI-1 Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’
PCR reverse primer: PAI-1 Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’
PCR forward primer: SCF Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ 
PCR reverse primer: SCF Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ 
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ 
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’    
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions. Methods Enzymol. 130, 132-181 (1986).
  2. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, (13), 3047-3060 (1981).
  3. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci USA. 81, (14), 4275-4279 (1984).
  4. Gilmour, D. S. Lis J.T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 5, (8), 2009-2018 (1985).
  5. Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13, (18), 2847-2852 (2014).
  6. Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J., Tissenbaum, H. A. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nat Protoc. 3, (4), 698-709 (2008).
  7. Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters. Mol Cell Biol. 21, (20), 6820-6832 (2001).
  8. Weinmann, A. S., Farnham, P. J. Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation. Methods. 26, (1), 37-47 (2002).
  9. Weinmann, A. S., Yan, P. S., Oberley, M. J., Huang, T. H., Farnham, P. J. Isolating human transcription factor targets by coupling chromatin immunoprecipitation and CpG island microarray analysis. GenesDev. 16, (2), 235-244 (2002).
  10. Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Dev. 19, (23), 2783-2810 (2005).
  11. Rojas, A., et al. A Positive TGF-beta/c-KIT Feedback Loop Drives Tumor Progression in Advanced Primary Liver Cancer. Neoplasia. 18, (6), 371-386 (2016).
  12. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform. CSH Protoc. 2006, (1), (2006).
  13. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, (11), 3091-3100 (1998).
  14. Shi, Y., et al. Crystal structure of a Smad MH1 domain bound to DNA: insights on DNA binding in TGF-beta signaling. Cell. 94, (5), 585-594 (1998).
  15. Seidel, H. M., et al. Spacing of palindromic half sites as a determinant of selective STAT (signal transducers and activators of transcription) DNA binding and transcriptional activity. Proc Natl Acad Sci USA. 92, (7), 3041-3045 (1995).
  16. Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nat Protoc. 1, (1), 179-185 (2006).
  17. Tian, B., Yang, J., Brasier, A. R. Two-step cross-linking for analysis of protein-chromatin interactions. Methods Mol Biol. 809, 105-120 (2012).
  18. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31, (1), 76-82 (2003).
  19. Horz, W., Altenburger, W. Sequence specific cleavage of DNA by micrococcal nuclease. Nucleic Acids Res. 9, (12), 2643-2658 (1981).
  20. Chung, H. R., et al. The effect of micrococcal nuclease digestion on nucleosome positioning data. PLoS One. 5, (12), 15754 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics