Un método para probar el efecto de las señales ambientales sobre el comportamiento de apareamiento en

Behavior

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Summary

Se demuestra un ensayo para analizar las señales ambientales y genéticas que influyen en el comportamiento de apareamiento en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster .

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Gorter, J. A., Billeter, J. C. A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (125), e55690, doi:10.3791/55690 (2017).

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Abstract

El impulso sexual de un individuo está influenciado por el genotipo, la experiencia y las condiciones ambientales. Cómo estos factores interactúan para modular comportamientos sexuales sigue siendo mal entendido. En Drosophila melanogaster , las señales ambientales, como la disponibilidad de alimentos, afectan la actividad de apareamiento, ofreciendo un sistema manejable para investigar los mecanismos que modulan el comportamiento sexual. En D. melanogaster , las señales ambientales a menudo se perciben a través de los sistemas gustativo y olfativo quimiosensoriales. Aquí, presentamos un método para probar el efecto de las señales químicas ambientales en el comportamiento de apareamiento. El ensayo consiste en una pequeña arena de apareamiento que contiene medio de alimento y una pareja de apareamiento. La frecuencia de apareamiento para cada pareja se controla continuamente durante 24 h. Aquí presentamos la aplicabilidad de este ensayo para probar compuestos ambientales de una fuente externa a través de un sistema de aire presurizado, así como la manipulación de los componentes ambientales directamente en el campo de apareamiento. El uDe un sistema de aire a presión es especialmente útil para probar el efecto de compuestos muy volátiles, mientras que la manipulación de componentes directamente en el campo de acoplamiento puede ser de valor para determinar la presencia de un compuesto. Este ensayo puede adaptarse para responder a preguntas sobre la influencia de las señales genéticas y ambientales en el comportamiento de apareamiento y la fecundidad, así como otros comportamientos reproductivos masculinos y femeninos.

Introduction

Los comportamientos reproductivos suelen tener altos costos de energía, especialmente para las hembras, que producen gametos más grandes que los machos y deben escoger cuidadosamente las condiciones para criar a sus descendientes en desarrollo. Debido al costo energético, no es de extrañar que la reproducción esté relacionada con las condiciones nutricionales. Esto es cierto en la mayoría de los animales, incluso en los mamíferos, cuya pubertad puede ser retardada por la desnutrición y cuyo impulso sexual puede verse afectado negativamente por la restricción de los alimentos 1 .

La reproducción del organismo genético modelo Drosophila melanogaster también se ve afectada por las condiciones nutricionales. Los varones corte en el nivel más alto en la presencia de los volátiles del alimento 2 , y las hembras son sexualmente más receptivas en presencia de la levadura, un nutriente importante para la producción del huevo y la supervivencia de la descendencia 3 , 4 , 5 . EstaLa respuesta reproductiva evolutiva conservada a los alimentos ofrece la oportunidad de estudiar mecanismos que conectan la disponibilidad de alimentos ambientales a la reproducción sexual en un organismo geneticamente manejable y eficiente en el tiempo. De hecho, el trabajo en D. melanogaster ha implicado la vía de la insulina como un importante regulador de la conexión entre la comida y el comportamiento de acoplamiento [ 6] . También ha demostrado que el acto de apareamiento a sí mismo cambia la preferencia alimentaria de las hembras, así como las neuronas quimiosensoriales asociadas 7 , 8 , 9 .

Está claro que las señales alimentarias afectan los comportamientos reproductivos en D. melanogaster . Estos efectos parecen afectar principalmente a las hembras, específicamente a las que ya se han apareado 5 . Sin embargo, para probar estos efectos agudos de las condiciones ambientales, el ensayo clásicamente utilizado para el comportamiento de apareamiento femenino podríaNo ser muy adecuado debido a las largas interrupciones entre los episodios de apareamiento. En el clásico ensayo de remate, una hembra virgen se aparea primero con un macho, y se aísla inmediatamente y se presenta con un nuevo macho 24 a 48 h después. Este ensayo clásico se ha utilizado con gran éxito para identificar componentes del eyaculado masculino que modifican el comportamiento femenino y la respuesta femenina 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . El ensayo de apareamiento continuo demostrado aquí es, por lo tanto, una adición a los ensayos de apareamiento clásicos que pueden usarse para estudiar el efecto agudo de las condiciones ambientales en los comportamientos reproductivos.

Utilizando el ensayo continuo para el comportamiento de apareamiento que se explica aquí, hemos demostrado previamente que un par de moscas expuestas a la levadura remate sCada vez durante un período de observación de 24 h 5 , 19 , 20 , 21 , mientras que las moscas no expuestas a los alimentos sólo remate una vez 5 . Este hallazgo puede ser desconcertante a la luz de una gran parte de la literatura de D. melanogaster que indica que las hembras no remate durante varios días después de un apareamiento inicial (revisado en las referencias 10 , 11 ). Sin embargo, esta discrepancia puede ser fácilmente explicada por condiciones de ensayo, donde una hembra se aísla de uno a varios días antes de que se proporcione una nueva oportunidad de apareamiento. Si la pareja no se aparea en este período de observación de una hora, la hembra se caracteriza por no ser receptiva. Por otra parte, la alta frecuencia de apareamiento no debe ser sorprendente, dado que los datos de las moscas capturadas en el medio silvestre muestran que las hembras contienen espermatozoides de 4 a 6 machos en sus órganos de almacenamiento; Por lo tanto enIndicando que las hembras naturalmente remate varias veces 22 , 23 .

Aquí, demostrar el uso de este ensayo de apareamiento continuo para desentrañar cómo las moscas recopilar y combinar la información sobre las condiciones ambientales para modular la frecuencia de apareamiento. Este ensayo permite probar un número relativamente grande de parejas de apareamiento para estudios genéticos y probar la influencia de señales ambientales volátiles y no volátiles. El ensayo típicamente dura 24 h, pero se puede extender hasta 48 h, permitiendo la prueba de ciclos ambientales como el ciclo luz-oscuridad (LD). Demostramos este ensayo mediante la prueba de la influencia de las señales volátiles de un cultivo de levadura dentro de un sistema de aire presurizado en combinación con la disponibilidad de nutrientes no volátiles de levadura en el sustrato de alimentos.

El sistema de aire presurizado bombea continuamente señales volátiles en una arena de acoplamiento que contienenUn sustrato alimenticio y una pareja de prueba (cuyo comportamiento de apareamiento es controlado). Para determinar adicionalmente las especificidades a través de las cuales la levadura influye en el apareamiento, probamos un compuesto volátil principal de levadura, a saber ácido acético 24 , en combinación con un contenido de aminoácidos que corresponde al de la levadura en el sustrato alimenticio, en forma de peptona Ácidos derivados de la digestión enzimática de proteínas animales). Juntos estos experimentos demuestran cómo el efecto de señales ambientales en el comportamiento de apareamiento de D. melanogaster puede ser probado con este ensayo.

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Protocol

1. Caja de acoplamiento ambientalmente controlada

  1. Para asegurar un área de prueba controlada y fácil de limpiar, configure un gabinete de cocina de acero inoxidable de 120 cm x 64 cm x 85 cm como se ilustra en la Figura 1A.
    1. Taladre un agujero en la parte posterior del gabinete justo debajo del techo y cuatro juegos de cuatro agujeros en los lados, cada uno con un diámetro de 2 cm. Perfore los dos primeros conjuntos de cuatro orificios, a cada lado de la caja a una altura de 7 cm desde el fondo de la caja y con 12,5 cm entre los agujeros. Taladre los otros dos conjuntos en cada lado de la caja a una altura de 35 cm desde el fondo.
      NOTA: Los cuatro juegos de cuatro orificios se utilizan para cables de alimentación de cámara y tubos de bomba de aire para entrar y salir del gabinete. El agujero en la parte posterior se utiliza para los cables de alimentación de una placa de luz.
    2. Construir un tablero de luz con 18 filas de 40 diodos electroluminiscentes blancos y rojos alternos (LED) con un espacio de 2,5 cm entre cada luz. Montar los LEDs blancos y rojos en un circuiT con fuente de alimentación. Conecte cada LED en serie con una resistencia de 560 Ω, 0,25 W y 5% de tolerancia.
      NOTA: Las longitudes de onda de emisión de la luz roja se extendieron desde 590-661 nm con un pico pronunciado a 627 nm. La intensidad luminosa resultante en el área experimental es de aproximadamente 900 lux con las luces encendidas y 90 lux con sólo las luces rojas encendidas; Esto se midió usando una aplicación de medidor de luz de smartphone.
    3. Coloque la placa de luz en la parte superior del gabinete de acero inoxidable y pasar los cables de alimentación a través del agujero en la parte posterior.
    4. Conecte el adaptador de los LED blancos a un temporizador de control de potencia para permitir el apagado del LED blanco durante la fase oscura del experimento. Conecte el adaptador de la luz roja, que vuela son ciegos a 25 , a una fuente de alimentación regular para mantenerlos encendidos durante toda la duración del experimento.
    5. Fijar uno de 110 cm y dos soportes de metal de 54 cm de largo, cada uno con un ancho de 0,5 cm, a los lados interiores de la caja a una altura de 50Cm desde el fondo de la caja. Coloque una placa de difusión de vidrio esmerilado (dimensiones de 119,0 cm x 54,5 cm x 0,5 cm) en estos soportes.
    6. Añadir tres capas de papel de filtro (120 cm x 50 cm) entre el tablero de luz y la placa de vidrio para difundir la luz y limitar el deslumbramiento en la superficie de las arenas de apareamiento (descritas en la sección 4). Pin de dos hojas de papel de filtro juntos en su borde largo en barras de madera de 120 cm de largo con imanes (en el lado), para pegarlos en el interior del gabinete de metal; Realizar esta acción 3 veces.
    7. Coloque cuatro ventiladores en los lados de la caja para crear una corriente de aire que aísle continuamente la caja de acoplamiento. Coloque el primer conjunto de ventiladores de 8 cm entre la placa de luz y la placa de vidrio, con la entrada de aire en el lado izquierdo y el escape en el lado derecho de la caja, para minimizar la acumulación de calor generado por la placa de luz.
    8. Conecte el segundo juego de ventiladores de 12 cm a 25 cm por encima del fondo del gabinete para crear un flujo de aire hacia afueraNside del gabinete y lo enfría a una temperatura estable de 26 ° C. Conecte los ventiladores en el lado de escape a una manguera de succión y conduzca la corriente de aire fuera de la habitación para evitar el reciclaje del aire en el gabinete.
  2. Montar dos stands (aproximadamente 48 cm de altura) montados con dos pinzas, una a 28 cm y una a 30 cm de la base del soporte. Fije una webcam en cada una de las abrazaderas. Conecte las 4 cámaras a un ordenador que ejecute el software de supervisión.
  3. Coloque hojas A4 debajo de cada webcam. Use hojas o hojas blancas no impresas con una cuadrícula pre numerada de 7 por 5 cuadrados con ejes de 4 cm para acomodar las arenas de apareamiento (descritas en la sección 4).
    NOTA: Una cámara web HD con una gran angular de 78 ° y una resolución de 5 millones de píxeles puede cubrir un área de 21 cm x 30 cm correspondiente a una hoja A4 y monitorizar entre 20 y 35 arenas de acoplamiento.

2. Cría y recolección de moscas

  1. Coloque 20 machos y 20 hembras de tipo salvaje Canton-SVuela en botellas de cría de moscas que contienen 45 ml de medio rico en moscas (ver sección 3) durante tres a cuatro días. Transferir los mismos adultos tres veces primero golpeándolos hacia abajo y luego en botellas frescas.
    1. Colocar las botellas en una incubadora a 25 ° C, y 12 h: ciclo de luz-oscuridad de 12 h con las luces encendidas a las 09:00 (hora Zeitgeber (ZT) 0). Una nueva generación aparecerá unos 10 días más tarde.
  2. Anestesiar las moscas recién cerradas resultantes en las almohadillas del dióxido de carbono por no más de 5 minutos y recogerlas en viales del mosca del alimento usando un cepillo de pintura.
    1. Recolecte las hembras vírgenes (recién cerradas) y los machos virginales de las botellas salvajes de tipo salvaje Canton-S en frascos de cría de moscas de 2,5 cm x 9,5 cm con 6,5 ml de medio rico en moscas.
  3. Age las moscas en grupos del mismo sexo de 20 moscas cada uno en viales de cría de moscas durante 5 a 8 días a 25 ° C y 12 h: ciclo de luz-oscuridad de 12 h y se enciende a las 09:00 (ZT 0).
  4. TransfEr las moscas a viales de cría de mosca fresca en el día antes del experimento.

3. Preparación del alimento

  1. Prepare 1 L de medio de mosca rica como sigue.
    1. Vierta 1 L de agua del grifo en un vaso de precipitados de vidrio de 2 l con una barra de agitación magnética y coloque el vaso en una placa caliente magnética. Mantenga la agitación apagada y gire el calentamiento hasta 300 ° C hasta alcanzar la temperatura de ebullición.
      NOTA: Durante el tiempo de ebullición largo en los siguientes pasos se evaporará una proporción de agua, pero junto con los ingredientes añadidos, este protocolo da como resultado 1 L de medio de mosca rica cuando se prepara a temperatura ambiente de aproximadamente 22ºC.
    2. Se añaden los siguientes ingredientes al agua hirviendo: 10 g de agar, 30 g de glucosa, 15 g de sacarosa, 15 g de harina de maíz, 10 g de germen de trigo, 10 g de harina de soja, 30 g de harina de soja Melaza, 35 g de levadura seca activa. Espere a que la levadura espuma vigorosamente, luego baje la temperatura de la placa calienteHasta 120 ° C.
    3. Después de 10 minutos, gire la placa caliente hasta 30ºC y deje que la mezcla se agite hasta que se enfríe a 48ºC. Controle la temperatura insertando un termómetro directamente en el alimento.
    4. Disolver 2 g de éster metílico del ácido p-hidroxibenzoico (tegosept, 100%) en 10 ml de etanol al 96%. Añadir esto y 5 ml de ácido propiónico 1 M a la mezcla. Se agita durante 3 min.
    5. Vierta el medio alimenticio de la mosca en las arenas (descrito en la sección 4) para crear una capa de 0.3 cm de espesor en la parte inferior de la arena.
      1. Utilice un vaso de precipitados de vidrio de 200 ml para verter. Cuando las cantidades exactas son importantes, use una pipeta serológica de 10 ml.
  2. Preparar mosca medio menos levadura exactamente como se describe en el paso 3.1.1 hasta 3.1.5, pero dejar de levadura en el paso 3.1.2.
  3. Preparar el medio con agar con o sin peptona mezclando 10 g de agar y 35 g de peptona en 1 L de agua hirviendo y realizar los pasos 3.1.4 a 3.1.5.

4. MatinG Preparación de la arena

  1. Perfore un orificio de aproximadamente 0,3 cm de diámetro en la parte superior de una placa de plástico de 3,5 cm x 1,0 cm de plástico usando una aguja de preparación calentada (calentada a rojo en un quemador Bunsen). Como alternativa, utilice un soldador.
  2. Cuando se prepara un medio alimenticio con compuestos olorosos, primero se pipetean 30 μl (1% del medio alimentario final, por ejemplo, ácido acético glacial 100%) del compuesto deseado en el plato para la mitad de los platos experimentales. Deje la otra mitad de los platos vacíos para la comparación.
    NOTA: Con la configuración descrita aquí, se puede probar un máximo de 140 arenas a la vez.
  3. Utilizando una pipeta serológica de 10 ml, vierta 3 ml de medio alimenticio en la parte inferior del plato en la parte superior del compuesto deseado. Cubrir con un paño de queso para evitar la contaminación, y dejar el medio para solidificar durante aproximadamente 1 h a temperatura ambiente.
  4. Coloque una tapa en los platos y cinta cada uno cerrado en dos lados. Prepare pequeños tapones de película de parafina para cubrir los orificios deLos platos enrollando trozos de película de parafina en rodillos de 0,2 cm de espesor y luego cortarlos en segmentos de 0,5 cm.

5. Cultura de la levadura para el olor

  1. Crecer levadura activa seca en extracto de levadura de agar dextrosa peptona (YPD) en una placa de Petri de 14,0 cm x 2,06 cm. Use guantes para evitar la contaminación en este paso.
    1. Preparar las placas de agar YPD añadiendo 10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona, 22 g de glucosa (monohidrato de 0 (+) - glucosa) y 15 g de agar (puro) a 1 L de agua ultrapura hirviendo. Capa el fondo de la placa de Petri una vez que todo se disuelve y se almacena boca abajo en el refrigerador a 4 ° C, durante un máximo de 2 meses.
    2. Espolvorear unos cuantos granos de levadura seca en una placa mediana de YPD, dejar que se disuelvan. A continuación, seque la placa mediana con un bucle estéril. Guarde la placa en un incubador a 30 ° C durante la noche. Después, almacene el cultivo en el refrigerador por no más de 1 semana.
  2. Preparar el medio líquido YPD iN 1 L de botellas añadiendo 10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona, 22 g de glucosa (monohidrato de 0 (+) - glucosa) y una barra de agitación a 1 L de agua ultrapura.
    1. Autoclave durante 25 min a 120 ° C y 1 bar de presión. A continuación, guarde las botellas a 4 ° C durante un máximo de 2 meses hasta su uso.
  3. Coloque tapas de botellas abiertas (4,5 cm) con un tabique de silicona de 0,32 cm de espesor.
    1. Cortar dos pequeños orificios en el tabique para ajustarse perfectamente a los accesorios de mamparos de púas. Conecte el tubo pequeño de cloruro de polivinilo (PVC) (diámetros: exterior 0,8 cm e interior 0,5 cm) a ambas salidas que salen de la botella ya sólo una de las entradas que entran en la botella. Vea la figura 1B para ilustración.
    2. Envuelva las tapas y el tubo en papel de aluminio y autoclave durante 25 min a 120 ° C y 1 bar de presión.
  4. Use guantes para protegerse contra la contaminación en este paso. Sumerja una punta de pipeta estéril de 100 μL en una de las colonias de levadura de la placa de agar YPD (dDescrito en 5.1) y colóquelo en la botella de medio líquido YPD esterilizada en autoclave.
    1. Cubra esta botella de medio líquido YPD inoculada con levadura, así como una botella de control de medio YPD (levadura no añadida) con tapas autoclavadas montadas con entrada y salida (descritas en el paso 5.3). Se ponen ambas botellas en placas magnéticas separadas y se agitan a 100 rpm a temperatura ambiente durante 24 h antes del inicio del experimento para permitir que el cultivo de levadura crezca.
    2. Conecte las entradas de ambas botellas para separar las bombas de acuario para suministrar aire al cultivo de levadura. Asegúrese de conectar la salida de la botella experimental de levadura a un tubo que ventila el olor de la levadura fuera de la sala experimental para evitar la interferencia con el experimento.

6. Configuración de la bomba de aire

  1. Conecte el tubo de PVC grande (diámetros: 1,2 cm exterior y 0,9 cm interior) a un suministro de aire presurizado y conduzca a través de dos matraces Erlenmeyer de vidrio de 1 L rellenos con carbón activado a los 800 mlLínea para purificar el aire. Utilice aire presurizado comúnmente suministrado en laboratorios como suministro de aire, o conecte los tubos a una bomba de aire (se utilizó aire a presión aquí).
    NOTA: El material de la tubería debe seleccionarse sobre la base de las propiedades químicas de los volátiles y probado para evitar que los volátiles se peguen al revestimiento de la tubería (por ejemplo, politetrafluoroetileno, nylon o acero inoxidable).
  2. Haga dos divisores de aire de tubos de 15 mL y tres puntas de pipeta de 1,000 μL cada una.
    1. Haga tres agujeros de ~ 1 cm de diámetro. Primero quemar dos agujeros, usando una aguja de preparación calentada (calentada en rojo en un quemador Bunsen), adyacentes entre sí justo debajo de la tapa del tubo de 15 mL. Luego haga el tercer orificio quitando la parte inferior del tubo.
    2. Pegue las puntas de la pipeta de 1.000 μl en los orificios con el extremo estrecho apuntando hacia fuera. Corte el extremo de las puntas de la pipeta para permitir un mayor flujo de aire.
  3. Conecte el tubo de PVC grande de la salida de la cLleno de harcoal en la punta de la pipeta en la parte inferior del tubo de 15 ml. Agregue pequeñas salidas de tubos de PVC a las dos puntas de pipeta horizontales y conduzca hacia un control y una botella experimental.
  4. Para evitar la contaminación del medio YPD con microorganismos, fije el tubo pequeño a un filtro de jeringa estéril (tamaño de poro de 0,45 μm) con un empuje de plástico en el conector de la tubería del mamparo que va hacia el filtro y un tornillo en el conector plástico del tabique que sale del filtro. A continuación, conecte el tubo a la entrada de la botella de cultivo YPD (ver Figura 1B ).
  5. Para evitar que la levadura transportada por el aire se desplace desde el matraz de cultivo al campo experimental, coloque un tubo de vidrio (6,5 cm de largo, diámetro exterior = 0,5 cm y diámetro interior = 0,3 cm) a la salida de cada botella de cultivo YPD usando tubos pequeños. Conecte el tubo de PVC al otro lado del tubo de vidrio y guíelo hacia los orificios inferiores (perforados a cada lado) de la caja del experimento.
    1. Llene el tubo con fibra de vidrio y autoclavelo antes de usarlo.
  6. Agregue otro tubo de 15 ml (descrito en la sección 6.2) a la tubería pequeña de PVC, a cada lado de la caja experimental, para que dos tubos entren en la caja en el lado experimental (más cercano al escape de la corriente de aire del ventilador, a la derecha) Y el lado de control (más cercano a la entrada de la corriente de aire del ventilador, a la izquierda).
  7. Prepare 8 pipetas serológicas de 25 ml cada una con 10 salidas para probar 80 pares de machos al mismo tiempo, es decir , 40 para cada condición de aire.
    1. Quemar 10 agujeros de ~ 0,8 cm de diámetro, 2 cm de distancia en la pipeta.
    2. Corte la parte externa de una jeringuilla de 1 ml en una pequeña (2,5 cm) y una gran (5 cm) de salida.
    3. Pegue estas salidas en los orificios con pegamento caliente.
    4. Envuelva una pequeña banda de película de parafina de plástico alrededor del extremo de los enchufes y adjunte una punta de pipeta de 1000 μL. El diámetro de la abertura de la punta es de 0,1 cm. Utilice consejos limpios para cada experimento.
  8. Coloque dos pipetas serológicas, utilizando un divisor T con diámetro exterior ≥ 0,5 cm y piezas cortas de tubo pequeño de PVC, a cada una de las dos salidas en ambos lados. Tape las pipetas sobre la hoja de papel blanco (debajo de las cámaras en la caja de acero).
  9. Utilizando un monitor de flujo de aire, ajuste el flujo de aire de modo que la velocidad del aire a la salida de la punta de la pipeta de 1000 μL sea de 0,5 m / s. Esto corresponde a un flujo de aire de 0,0017 L / s por punta.

7. Supervisión del comportamiento de apareamiento

  1. Use una pipeta de boca (como se describe en la referencia 26 ) para colocar una hembra experimental en una pequeña placa de Petri (descrita en la sección 4) a las 15:00 (ZT 6) y darle 1 h para aclimatarse a la arena de apareamiento.
  2. Configure la caja experimental (descrita en la sección 1) como sigue:
    1. Encienda las luces, es decir , los LED de luz blanca en un ciclo de 12h: 12 h luz-oscuridad conectado a un temporizador queLuz a las 09:00 (ZT0) y LEDs de luz roja continua para permitir el monitoreo de las moscas durante la fase oscura del experimento. Encienda los ventiladores para limitar el calentamiento del gabinete por la fuente de luz y para asegurarse de que los excesos de olores se ventilan fuera del área de prueba.
    2. Conecte las cámaras de la webcam a una computadora e inicie con el software de monitoreo para monitorear la imagen.
    3. Para cada cámara, ajuste el enfoque, el brillo y el zoom en el software de monitoreo.
      1. Haga clic con el botón derecho en la pantalla de la cámara, abra "propiedades de la cámara" y desactive "enfoque automático". Ajuste el "enfoque" para aclarar la cuadrícula o cualquier palabra escrita en la hoja de papel. Si es necesario, cambie el "brillo" y el "zoom".
    4. Ajuste el programa del software de monitoreo para capturar 1 imagen cada 2 min. Haga clic con el botón derecho en cada pantalla de la cámara y seleccione "editar cámara" y luego la opción "Acciones". Haga clic para iniciar las acciones "At regular intErvals "y cambie el tiempo a" 2 minutos ". Elija" Take Photo "para seleccionar acciones para realizar y finalmente haga clic en" ok ".
    5. Haga clic con el botón derecho del ratón en cada pantalla de la cámara y seleccione "iniciar el monitoreo".
  3. Después de 1 h (en ZT 7), transfiera un macho de tipo salvaje a la placa de Petri usando la pipeta de boca, coloque el plato en las hojas de papel A4 debajo de las cámaras de webcam y haga clic en "start monitoring" durante 24 h. Para el experimento con la bomba de aire, coloque el plato de tal manera que una salida de pipeta esté conectada al orificio de entrada de la arena de acoplamiento.
  4. Para analizar el comportamiento de apareamiento de la pareja, haga lo siguiente.
    1. Seleccione y abra todas las imágenes de un software de visualización de imágenes y haga una página a través de ellas en orden cronológico.
    2. Anote la fecha, el número del experimento, el número del plato y la hora de inicio en una hoja de cálculo dentro de la misma fila. Tome la hora de inicio de cada arena desde el momento en que se coloca bajo la webcaM cámara Registre la marca de tiempo de las imágenes.
    3. Marque la hora de inicio de cada copulación en la misma fila en la hoja de cálculo. Contar un apareamiento como un incidente cuando el macho ha montado la hembra y la pareja permanece moderadamente estacionaria y en la misma postura por lo menos cinco cuadros consecutivos (10 min).
      NOTA: Este criterio se basa en la longitud reportada de cópula, que oscila entre 12 y 27 min en D. melanogaster , y la observación de que las copulaciones de 10 min y más son fértiles 27 , 28 .
    4. Contar el número de copulaciones para cada fila en la hoja de cálculo para determinar la frecuencia de apareamiento. Alternativamente, restar el tiempo de inicio del experimento desde el momento del primer apareamiento para cada fila como una medida de la latencia de acoplamiento, o restar el tiempo del primer acoplamiento del momento del segundo acoplamiento como una medida de la latencia remate.
      1. Para calcular la latencia de remate, asegúrese deDefinir las fechas del primer y el segundo apareamiento como días consecutivos en el software de la hoja de cálculo.
    5. Analizar los datos con modelos de efectos mixtos, suponiendo una distribución normal de los datos e incluyendo la fecha del experimento como un factor aleatorio, utilizando un software estadístico (ver tabla de materiales) para determinar la significación estadística de las variables independientes -medio alimentario, El tipo de aire y la interacción-como se ha descrito previamente 5 .
    6. Seleccione el mejor modelo de explicación realizando la eliminación hacia atrás de variables independientes no significativas usando pruebas de razón log-verosimilitud y la información Akaike asociada. Después de ejecutar el modelo, inspeccione visualmente los datos residuales para confirmar la normalidad. Confirmar la homogeneidad de las varianzas mediante la prueba de Levene. En el caso de homogeneidad desigual, la raíz cuadrada transforma los datos.

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Representative Results

Usando este ensayo continuo, el comportamiento de apareamiento, y la frecuencia de apareamiento en específico, se puede determinar bajo condiciones ambientales experimentales. Para controlar las condiciones ambientales, transformamos un gabinete de cocina de acero inoxidable en un área de prueba, con su propia fuente de luz y difusión, lo que garantiza una gran cantidad de luz y una mínima cantidad de reflejos desde la parte superior de las arenas de apareamiento ( Figura 1A ) . El área de prueba interna está completamente encerrada por acero inoxidable y vidrio, lo que permite la limpieza con disolventes orgánicos, como hexano o etanol. Además, el gabinete está equipado con orificios que actúan como entradas para el tubo, trayendo señales volátiles del sistema de aire presurizado (ver Figuras 1A y 1B ). El sistema de aire a presión, ajustado para olores de levadura, consiste en un flujo de aire guiado a través de un cultivo líquido de levadura antes de entrar en los campos de prueba a través de 4 divisores de pipeta con10 salidas cada uno ( Figura 1C ). Todo el sistema es hermético y equipado con varios filtros de partículas, tanto antes como después de entrar en el cultivo de levadura, para minimizar la contaminación con olores de confusión ( Figura 1B ).

Para demostrar el uso de este ensayo, probamos si las señales volátiles de un cultivo de levadura pueden influir en el comportamiento de apareamiento. Se burbujeó aire a través de un cultivo de levadura líquido durante 24 h, y las salidas de aire se colocaron en la entrada de cada arena de acoplamiento (véase la Figura 2A ). La mitad de las arenas de apareamiento contenían alimento para moscas con levadura (alimento + levadura), y la otra mitad contenía alimento de mosca sin levadura añadida (alimento - levadura). Un macho y una hembra de tipo salvaje fueron expuestos a los olores procedentes del cultivo de levadura externo, y se registró su frecuencia de apareamiento. Para determinar cuáles son las variables necesarias para explicar los resultados del gráfico, hemos realizado modelos de efectos mixtos, incluyendo o excluyendoLas variables independientes del medio alimentario, el aire de la levadura, y una interacción de los dos. Los datos de la Figura 2B se representan mejor mediante un modelo que incluya las variables independientes del medio alimentario (p = 0,001) y el aire de la levadura (p = 0,061), pero no existe un efecto de interacción explicativo. Aunque la variable de aire de levadura no es significativa en este conjunto de datos completo, es necesario explicar los resultados. El análisis del aire de levadura separado para el medio alimenticio muestra que un par de apareamiento no responde a los olores de la levadura cuando no hay levadura presente en el medio alimenticio (aire: p = 0,992), pero aumentan su frecuencia de apareamiento en el aire de levadura cuando la levadura es También se añadió al medio alimenticio (aire: p = 0,018). En conjunto, estos resultados demuestran la aplicabilidad del sistema de aire presurizado para probar la influencia de los olores ambientales en combinación con las condiciones del medio alimenticio.

También ilustramos cómo el sistema de aire presurizado puede ser bypAsed agregando las señales químicas ambientales directamente a la arena de la prueba. Para demostrar qué compuestos específicos de levadura afectan la frecuencia de apareamiento, probamos la hipótesis de que el contenido de aminoácidos de la levadura es necesario para su efecto sobre el apareamiento colocando una dosis de peptona (proteínas hidrolizadas) correspondiente a los aminoácidos suministrados por la levadura en el agar Sustrato que alinea el campo de apareamiento. También probamos la necesidad de ácido acético, uno de los principales productos de fermentación volátil de la levadura, para aumentar la frecuencia de apareamiento. Esto se hizo añadiendo ácido acético directamente al medio alimenticio. Un macho y una hembra de tipo salvaje se probaron en arenas que contenían agar o agar con peptona, con o sin ácido acético directamente en el medio alimentario ( Figura 3B ). Esto hace para un medio de alimento muy simple y un ambiente pobre; Por lo tanto, la frecuencia de apareamiento promedio también disminuye en comparación con la figura 2B. Los datos de la figura 3B se representan mejor mediante un modelo que incluye la(P = 0,002), aire ácido acético (p = 0,001), y la interacción de los dos (p = 0,022). La receptividad femenina aumenta con la presencia de ácido acético, pero sólo en la condición en que está presente peptona en el medio. Esto demuestra que las moscas necesitan detectar simultáneamente aminoácidos y ácido acético para aumentar su frecuencia de apareamiento ( Figura 3B ). Esto demuestra que la adición de compuestos olorosos directamente al campo de ensayo puede influir en el comportamiento de apareamiento y que estas influencias pueden detectarse en condiciones ambientales muy sencillas.

Figura 1
Figura 1: Diagrama de la caja experimental y sistema de aire a presión con levadura. ( A ) Ilustración esquemática de la caja de apareamiento ambientalmente controlada descrita en la sección 1. Descripción de los números anotados y las flechas: 1. placa de luz con al Luces blancas y rojas de ternating; 2. pequeño ventilador; 3. 3 capas de papel de filtro, cada capa que consta de dos hojas de papel de filtro; 4. placa de difusión de vidrio que descansa sobre soportes unidos a 3 lados de la caja; 5. ventilador grande; 6. orificios para tubos y cables; 7. área experimental; Flecha grande, 50 cm a la placa de vidrio; Flecha media, altura de 35 cm para los agujeros del cable; Y una pequeña flecha de 7 cm de altura para los agujeros de la tubería. ( B ) Ilustración esquemática del cultivo de levadura líquido con flujo de aire, como se describe en las secciones 5, 6,4 y 6,5. Descripción de los números anotados: 1. unidad de filtro desechable; 2. tapón con tabique de silicona y salidas y entradas; 3. medio líquido; Y 4. tubo de vidrio con fibra de vidrio. ( C ) Ilustración esquemática de las salidas de aire como se describe en la sección 6.7. Descripción de los números anotados: 1. pipeta serológica; 2. corte de la tubería de la jeringuilla de 1 mL, y 3. 1.000 μL de la punta de la pipeta.Target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: El olor de levadura aumenta la receptividad femenina en presencia de levadura en el sustrato alimenticio. ( A ) Ilustración esquemática de una arena de acoplamiento con un macho y una hembra y una punta de pipeta desde la salida de aire en la Figura 1C que entra a través del orificio de entrada. ( B ) Presentación gráfica de la respuesta en la frecuencia de apareamiento de un par de parejas de Canton-S al olor de levadura con y sin levadura en el medio alimenticio de la mosca (Alimento - levadura: aire medio n = 12, aire de levadura n = : Aire medio n = 24, aire de levadura n = 23). Gráfico de líneas con barras de error SEM y salida estadística de modelos de efectos mixtos con aire como variable independiente y la fecha como variable aleatoria para cada medio de alimento independientemente. La estadística principalL incluye alimentos (p = 0,001) y aire de levadura (p = 0,061). Adaptado de la referencia 5 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: El ácido acético en el sustrato de alimento de mosca aumenta la receptividad femenina en presencia de peptona. ( A ) Ilustración esquemática de una arena de apareamiento, con medio de alimentación de moscas que contiene ácido acético y un tapón de plástico de película de parafina que cierra el orificio de entrada. ( B ) Una presentación gráfica de la frecuencia de apareamiento de un par conjugado Canton-S en respuesta al ácido acético en medio agar o peptona (agar: ácido acético n = 52, ácido acético n = 40 y peptona: ácido acético N = 28, + ácido acético n = 25). Gráfico de línea con barras de error de SEM y el stati(P = 0,002), aire de ácido acético (p = 0,001) y aire de alimento * (p = 0,022) como variables independientes y la fecha como variable aleatoria. Adaptado de la referencia 5 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo describe un ensayo para probar el comportamiento de apareamiento durante 24 horas mientras se controlan continuamente las señales ambientales que se supone que una pareja conjugada usa para determinar la frecuencia de apareamiento. Es posible aumentar la frecuencia de apareamiento en respuesta al aire de levadura suministrado a través de un sistema de aire presurizado cuando el medio contiene levadura también ( Figura 2B ). Además, se puede observar una respuesta similar en la frecuencia de apareamiento con un medio alimenticio simplificado que contiene sólo agar, peptona y olor de ácido acético directamente en el medio ( Figura 3B )

Con los experimentos demostrados aquí, las conclusiones se pueden extraer solamente en el comportamiento de acoplamiento general de la pareja, puesto que ambos sexos están expuestos a las mismas condiciones ambientales. Sin embargo, sabemos de investigaciones anteriores que el 47% de la variación en la frecuencia de apareamiento es determinada por la mujer, mientras que la contribución masculina sólo representa el 11% de la variación20 . Por lo tanto, la mayoría de los cambios en la frecuencia de apareamiento observados son probablemente un resultado de la receptividad sexual femenina. El corte de machos aún mayor deja a la hembra para aceptar o rechazar el apareamiento, ya que las hembras adultas de D. melanogaster pueden desviar con éxito los intentos de apareamiento 29 . Para conclusiones firmes y para atribuir específicamente las diferencias en la frecuencia de apareamiento a la receptividad sexual femenina, es necesario probar parejas de apareamiento adicionales donde el genotipo de la hembra es variado pero que del macho se mantiene constante.

Este protocolo ha demostrado dos formas de suministrar compuestos olorosos a una pareja de apareamiento, ya sea con un sistema de aire presurizado o directamente en el medio alimenticio. El sistema de aire a presión tiene la ventaja de que se puede atribuir cualquier efecto a los compuestos que se suministran a través del aire, mientras que esto no se puede concluir cuando los compuestos se ponen directamente en el medio alimenticio. Por otro lado, wCuando no se encuentra ningún efecto con el sistema de aire a presión, no significa automáticamente que la señal no afecte al comportamiento. También podría significar que el compuesto no se suministra eficazmente a través del sistema de aire a presión. La composición del aire a la salida del sistema de suministro de aire se puede analizar colocando un filtro de hidrocarburo y analizando el contenido de aire atrapado con cromatografía de gases acoplada con espectrometría de masas. El sistema de aire a presión es un buen ensayo para probar compuestos que se pueden hacer fácilmente transportados por el aire en un rango más largo. Los compuestos menos volátiles pueden tener que ser puestos directamente en el medio alimenticio. Otra desventaja del sistema de aire presurizado es el efecto que la velocidad del aire puede tener sobre el comportamiento de la mosca. Las moscas dejan de moverse cuando la velocidad del aire es demasiado alta (por encima de 0.7-1.6 m / s) 30 . Además, el sistema de aire a presión puede hacer intolerable un entorno simple y de baja calidad al secar el medio alimenticio. En ambos casos, las moscas podrían noOrm igualmente bien, y no se pueden atribuir conclusiones a los compuestos específicos ensayados.

Varios pasos son esenciales durante la preparación para el funcionamiento óptimo de estos ensayos. El primer paso que requiere atención es la preparación del medio. Es importante que el medio, incluyendo compuestos volátiles olorosos tales como ácido acético, se prepare el día del experimento y no antes para evitar la evaporación. Además, el medio necesita endurecerse en una superficie sin flujo de aire adicional (evite usar campanas de humo para esto), porque el flujo de aire puede estimular la evaporación del olor. El segundo paso que requiere un cuidado especial es el establecimiento del sistema de aire presurizado. El flujo de aire necesita ser lo suficientemente alto para burbujear suavemente el cultivo de levadura sin transferir ningún fluido a la arena.

Este protocolo demuestra un ensayo conductual con olores de levadura en combinación con el comportamiento de apareamiento. Sin embargo, este sistema puede aplicarse a cualquierTipo de olor, así como a otros tipos de comportamientos. Para utilizar este sistema para otros olores, es necesario ajustar el flujo de aire y el medio de olor para optimizar la transferencia de los compuestos a los platos. Sin embargo, en general, cualquier compuesto que se puede transferir por aire puede ensayarse con este sistema. Además, cualquier tipo de comportamiento, tanto en machos como en hembras, puede ser probado, ya sea usando el mismo tipo de platos o ajustando el tubo para alcanzar y conectarse a áreas de prueba más grandes o más pequeñas. Además, cuando se prueban comportamientos más detallados, es necesario reconsiderar las velocidades de fotogramas y las resoluciones de las cámaras utilizadas. En cualquier caso, si ambos experimentos con y sin el olor de prueba se ejecutan al mismo tiempo y con la misma fuente de aire, se puede detectar cualquier respuesta a la señal ambiental, independientemente de los cambios en la presión o concentración de un experimento a otro. Por último, el ensayo demostrado aquí se puede extender para al menos otro ciclo LD (hasta 48 h), siempre y cuando el fEl suministro de aceite no se seca.

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Disclosures

Los autores no tienen intereses en competencia para divulgar.

Acknowledgements

Damos las gracias al Bloomington Drosophila Stock Center para las acciones de la mosca; C. Gahr, JT Alkema y S. van Hasselt por su temprano intento de desarrollar el ensayo de aire presurizado; Jasper Bosman por el consejo sobre cultivar levadura; Y Rezza Azanchi y Joel Levine por haber desarrollado originalmente el monitoreo de lapso de tiempo del comportamiento de apareamiento de Drosophila . JA Gorter recibió el apoyo de una Beca del Programa de Posgrado BCN / NWO de la Escuela de Investigación Neurocientífica. Este trabajo fue apoyado en parte por la organización holandesa para la investigación científica (NWO) (referencia: 821.02.020) a JC Billeter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cabinet
Stainless steel kitchen cabinet Horecaworld 7412.0105
White LEDs Lucky Light ll-583wc2c-001 Cold white, 20 mAmp and 2 V
Red LEDs Lucky Ligt ll-583vc2c-v1-4da Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V
Resistor Royal Ohm CFR0W4J0561A50 560 ohm, 0.25 W, 250 V and 5 % tolerance
Smartphone light meter app Patrick Giudicelli Light/Lux Meter FREE, version 1.1.1
Power timer Alecto TS-121
Metal brackets Sharp angle 5 by 5 mm,  2 x 5450 and 1 x 1100 mm long
Frosted glass plate 1190 x 545 x 5 mm
Filter paper sheets LEE filters 220 White frost
Small fan Nanoxia Deep silence 4260285292828 80 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM
Big fan Nanoxia Deep silence 4260285292910 120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM
Webcam camera Logitech 950270 B910 HD WEBCAM OEM, Angle: 78-degree, resolution: 5-million-pixel  
Camera software DeskShare Security monitor pro
Name Company Catalog Number Comments
Fly rearing
Fly rearing bottles Flystuff 32-130 6oz Drosophila stock bottle
Flypad Flystuff 59-114
Wild-type flies Canton-S
Fly rearing vials Dominique Dutscher 789008 Drosophila tubes narrow 25x95 mm
Incubator Sanyo MIR-154
Magnetic hot plate Heidolph 505-20000-00 MR Hei-Standard
Agar Caldic Ingredients B.V. 010001.26.0
Glucose Gezond&wel 1019155 Dextrose/Druivensuiker
Sucrose Van Gilse Granulated sugar
Cornmeal Flystuff 62-100
Wheat germ Gezond&wel 1017683
Soy flour Flystuff 62-115
Molasses Flystuff 62-117
Active dry yeast Red Star
Tegosept Flystuff 20-258 100%
Peptone (bacto) BD 211677
Acetic Acid Merck 1000631000 Glacial, 100%
Small petridish Greiner bio-one 627102 35 x 10 mm with vents
Paraffin film Bemis NA Parafilm
Name Company Catalog Number Comments
Yeast and pressurised air set-up
Big petridish Gosselin BP140-01 140 x 20.6 mm
Ultrapure water Millipore corporation MiliQ
Yeast extract BD 212750
Agar (pure) BD 214530 bacto
Glucose (0(+)-glucose monohydrate)  Merck 18270000004
Open caps Schott 29 240 28  GL45
Silicone septum VWR 548-0662
Barbed bulkhead fittings Nalgene 6149-0002
Large PVC tubing diameter: outer 1.2 cm and inner 0.9 cm
Small PVC tubing diameters: outer 0.8 cm and inner 0.5 cm
15 ml tube Falcon
Aquarium pump Sera precision Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W and pressure >100 mbar
Activated charcoal Superfish A8040400 Norit activated carbon
Disposible filter unit Whatman 10462100
Serological pipettes VWR 612-1600
Syringe BD Plastipak 300013
Hot glue Pattex
Syringe filter Whatman FP 30/pore size 0.45 mm CA-S
Name Company Catalog Number Comments
Analysis
Statistics software R lme4 package

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References

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