تقييم التعقيد الجذعي الحصين في الفئران المسنين باستخدام طريقة جولجي-كوكس

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هنا نقدم بروتوكول جولجي-كوكس في التفاصيل واسعة النطاق. هذا الأسلوب موثوقة وصمة عار النسيج يسمح لتقييم ذات جودة عالية من الهندسة المعمارية الخلوية في الحصين، وفي جميع أنحاء الدماغ بأكمله، مع الحد الأدنى من استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Groves, T. R., Wang, J., Boerma, M., Allen, A. R. Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method. J. Vis. Exp. (124), e55696, doi:10.3791/55696 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الشواك العمود الفقري هي النتوءات من مهاوي العصبية الجذعية التي تحتوي على نقاط الاشتباك العصبي الإثارة. الاختلافات المورفولوجية والمتفرعة من التشعبات العصبية داخل الحصين متورطة في الإدراك وتكوين الذاكرة. هناك العديد من النهج لتلطيخ غولجي، وكلها كانت مفيدة لتحديد الخصائص المورفولوجية من الشجيرات أربورس وإنتاج خلفية واضحة. وقد تم تصميم طريقة جولجي-كوكس الحالية، (تباين طفيف للبروتوكول الذي يتم توفيره مع مجموعة تلطيخ غولجي التجارية)، لتقييم كيفية جرعة منخفضة نسبيا من العلاج الكيميائي 5-فلوروراسيل (5 فو) سوف تؤثر على التشكل التغصني ، وعدد من العمود الفقري، وتعقيد الشجرة داخل الحصين. 5-فو شكلت بشكل كبير التعقيد شجيري وانخفاض كثافة العمود الفقري في جميع أنحاء الحصين بطريقة محددة المنطقة. وتظهر البيانات المقدمة أن طريقة تلطيخ جولجي إفملطخة بشكل فعال الخلايا العصبية الناضجة في CA1، CA3، والتلفيف المسنن (دغ) من الحصين. هذا البروتوكول تقارير تفاصيل لكل خطوة بحيث يمكن للباحثين الآخرين يمكن وصمة عار موثوق الأنسجة في جميع أنحاء الدماغ مع نتائج ذات جودة عالية والحد الأدنى من استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

Introduction

التشعبات هي أكبر جزء من الخلايا العصبية التي تتلقى ومعالجة المدخلات بريسينابتيك 1 . العمليات التشنجي لها هندسة معقدة، حيث فروع القريبة لديها أكبر قطرها من الفروع البعيدة. كما تتطور التشعبات، فإنها تشكل العديد من الاتصالات مع الخلايا العصبية الأخرى في عملية يشار إليها باسم أربوريزاتيون شجيري. مدى ونمط هذا المتفرعة يحدد كمية المدخلات متشابك أن دندريت يمكن معالجة كافية 2 .

تشنج شجيري هو عملية ضرورية للالمعتمد على النشاط اللدونة والتنمية السليمة للدوائر العصبية. التمديد، التراجع، المتفرعة، و سينابتوجينيسيس هي العمليات المعقدة التي تشمل البرامج الوراثية الجوهرية والتأثيرات من العوامل الخارجية. الاختلافات المورفولوجية والمتفرعة من التشعبات العصبية داخل الحصين متورطة في الإدراك وتشكيل الذاكرةf "> 3 ، 4. ترتبط التغيرات في التعقيد شجيري مع التغيرات الفيزيولوجية المرضية والسلوكية 5. تشوهات ترتبط عدة حالات المرض، بما في ذلك متلازمة X الهشة ومتلازمة داون 6 .

الشواك العمود الفقري هي المقصورات تحت الخلوية المتخصصة من أربورس المتغصنة التي تتلقى مدخلات مثيرة داخل الجهاز العصبي المركزي. هناك ثلاث فئات مورفولوجية من العمود الفقري شجيري، مع اسم كل فئة على أساس حجمها وشكلها: 1) الفطر العمود الفقري، والتي لديها الكثافات بوستسينابتيك معقدة مع المزيد من مستقبلات الغلوتامات من غيرها من العمود الفقري 7 ؛ 2) العمود الفقري ستبي، التي تفتقر إلى الجذعية. و 3) العمود الفقري رقيقة، والتي تتكون من الجذعية الضيقة المطولة ورأس كروي 8 . يتم استخدام حجم العمود الفقري شجيري جزئيا لتعريفها، مع العمود الفقري رقيقة عموما أصغر (0.01 ميكرون 3 3 ) 9 ، 10 . يستقر العمود الفقري مع النضج. على سبيل المثال، فإن العمود الفقري الرقيق إما يتراجع بعد بضعة أيام أو يتطور إلى أشواك الفطر. بدلا من ذلك، فإن العمود الفقري الفطر مستقرة نسبيا ويمكن البقاء على قيد الحياة لفترة طويلة.ويعتقد أن قوة الاتصالات العصبية أن تستند إلى عدد من العمود الفقري و / أو حجمها 11 ، 12 ، 13 .

الأسلوب الكلاسيكي غولجي تلطيخ والاختلافات أكثر حداثة كانت كلها مفيدة لدراسة التشكل العمود الفقري شجيري والكثافة. جانب واحد فريد من تلطيخ غولجي هو أنه البقع عشوائيا حوالي 5٪ من مجموع الخلايا العصبية، والذي يسمح لتعقب الخلايا العصبية الفردية 14 ، 15 . على الرغم من أن الآلية الدقيقة التي ميلي جولجيبقع أود الخلايا العصبية الفردية لا تزال غير معروفة، ويستند مبدأ الأسلوب على تبلور كرومات الفضة (أغ 2 كرو 4 ) 16 ، 17 . هناك ثلاثة أنواع رئيسية من أسلوب جولجي: غولجي السريع، و غولجي-كوكس، و غولجي-كوبش 18 ، 19 . تبدأ جميع الطرق الثلاث مع مرحلة الحضانة الأولية في أملاح الكروم لعدة أيام إلى أشهر، ولكن هناك بعض الاختلافات الرئيسية بينهما. يستخدم جولجي السريع رباعي أكسيد الأوسيميوم في الخطوة الأولى، في حين أن غولجي-كوبش يتضمن بارافورمالدهيد. تلطيخ في كل من غولجي السريع و غولجي-كوبش تليها حضانة في محلول نترات الفضة 1-2٪ لمدة 7 أيام. طريقة جولجي-كوكس تستخدم كلوريد الزئبق وديكرومات البوتاسيوم بدلا من نترات الفضة ولها وقت تشريب 2-4 أسابيع. ثم يتم تقسيم الأنسجة وسرعان ما وضعت في الأمونيا المخففةالحل، تليها المثبت الفوتوغرافي لإزالة الأملاح. من بين ثلاثة أنواع، ويعتقد أن طريقة جولجي كوكس أن يكون أفضل في تلطيخ الشجيرات المتغصنة دون الكثير من التدخل الخلفية، في جزء منه، لأن التحف الكريستال لا تحدث على سطح الأنسجة (على عكس الطريقة غولجي السريع) 17 ، 20 ، 21 .

الطريقة الحالية هي تباين طفيف للبروتوكول المقدم مع مجموعة تلطيخ غولجي التجارية، وتم تصميمه لتقييم كيفية جرعة منخفضة نسبيا من 5 فو تؤثر على الخصائص المورفولوجية شجيري وكثافة العمود الفقري. أي بيانات تم الحصول عليها يمكن أن توفر المزيد من التبصر في كيفية العلاج العلاج الكيميائي يؤثر على الدوائر العصبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت التجارب وفقا للمعايير الأخلاقية التي وافقت عليها اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدامها في أومز.

1. الحيوانات و 5-فو حقن باراديجم

  1. شراء الذكور البالغ من العمر 6 أشهر C57Bl6 / J البرية من نوع الفئران وبيتهم تحت المستمر 12 ساعة ضوء / دورة مظلمة حتى تصل إلى 1 سنة من العمر.
  2. تمييع 5-فو في 0.9٪ محلول ملحي معقم. استخدام 60 ملغ / كغ الجرعة المطلوبة في الماوس.
  3. إعطاء الحقن داخل الصفاق من 5 فو (مرة واحدة في الأسبوع لمدة ثلاثة أسابيع).
    1. إعطاء الحقن داخل الصفاق في نفس الوقت في كل يوم. على سبيل المثال، بين 0900-1200 ح.
  4. الموت ببطء الحيوانات واستخراج العقول بعد 30 يوما من الحقن النهائي.

2. القتل الرحيم الإجراء واستخراج الدماغ

  1. كبح القوارض والاستيلاء على قاعدة الذيل. مع جهة أخرى، ضع الإبهام أو الإصبع الأول في ثه قاعدة من الرقبة القوارض. الضغط بسرعة على الرقبة القوارض ودفع إلى الأمام في حين أن جهة أخرى عقد الذيل يسحب إلى الوراء.
  2. عقد القوارض بيد واحدة ومقص جراحي كبير مع الآخر. وضع الرقبة القوارض بين شفرات اثنين وقطع رأس الرأس بسرعة.
  3. خذ رئيس الماوس قطعت، واستخدام مقص غرامة لتقليم الفراء فوق الجمجمة، وتصل إلى العينين. المقبل، ضع نصائح من مقص في كل مأخذ العين وإغلاق مقص مع قوة طفيفة.
  4. استخدام مقص الربيع لقطع الجمجمة إلى اليسار واليمين من المخيخ.
  5. استخدام ملقط لرفع جزء من الجمجمة المحيطة المخيخ مباشرة وخارجها.
  6. استخدام مقص الربيع لقطع على طول خط ميدساجيتال من الجمجمة.
  7. استخدام ملقط لرفع الجزء المتبقي من الجمجمة قبالة الدماغ.
  8. استخدام ملعقة ومسبار لنسف الدماغ إلى الحاوية المطلوبة. باستخدام الفولاذ المقاوم للصدأتيل، بليد، جرح، كل، دماغ، على طول، ال التعريف، ميدساجيتال، بلان. تنفيذ الأسلوب غولجي-كوكس التالية على نصفي الكرة اليمنى.

3. غولجي تلوين وإعداد الأنسجة

  1. تزج نصف العقول حصادها حديثا إلى 5 مل كلوريد الزئبق الحل القائم على (الحل A من عدة) في أنبوب مخروطي 10 مل. محلول كلوريد الزئبق حساس للضوء. تغطية أنبوب مع احباط. تخزين العينة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يتم توفير الحل A في المجموعة المسردة في جدول المواد. الحذر! يحتوي الحل A (يسمى أيضا محلول كلوريد الزئبق) على الكواشف السامة مثل ثنائي كرومات البوتاسيوم وكلوريد الزئبق وكرومات البوتاسيوم. ارتداء قفازات واقية والعمل في غطاء الدخان.
  2. بعد يوم واحد، صب ببطء الحل في وعاء مؤقت (مثل قارب وزن كبير)، والتخلص منه في حاوية النفايات البيولوجية. تزج العقول (لا يزال في الأصلي 10 مل أنابيب مخروطية) مع 5 مل منمحلول كلوريد الزئبق، وعودة العينة إلى الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 13 يوما أخرى.
  3. إضافة 30 غرام العازلة بعد التشريب إلى 90 مل الماء المقطر أو منزوع الأيونات (د 2 O). ملء كل بئر من لوحة 6 جيدا مع 6.5 مل من العازلة ما بعد التشريب، بئر واحد في الدماغ
    ملاحظة: يتم توفير المخزن المؤقت بعد التشريب في المجموعة التي يتم سردها في جدول المواد.
    1. بعد 14 يوما (في المجموع) في محلول كلوريد الزئبق، وشطف الأنسجة مع د 2 O، ثم نقلها إلى لوحات 6 جيدا مع العازلة بعد التشريب. تغطية لوحات مع احباط وتخزينها في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  4. ماصة من العازلة بعد التشريب بعد 1 يوم من الغمر والتجديد مع الطازجة العازلة بعد التشريب. تخزين لمدة 1 يوم في الظلام في درجة حرارة الغرفة. إذا لزم الأمر، تخزين هذا في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر 22 .

4. سيكتيونينغ

  1. تسمية لوحات 12 جيدا على الأغطية مع الأرقام في ترتيب تصاعدي من اليسار إلى اليمين وما يصل إلى أسفل.
  2. إعداد اثنين أو ثلاثة لوحات 12 جيدا في الدماغ إذا باجتزاء الدماغ بأكمله.
    1. تسمية الجزء العلوي من كل 12 لوحة جيدا غطاء مع عدد تحديد الدماغ مقطوع.
    2. ماصة 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X في كل بئر من كل لوحة.
  3. إعداد المرحلة وتشغيل فيبراتوم. تأكد من أن هناك ما يكفي من برنامج تلفزيوني 1X في الحاوية لتغطية الأنسجة.
    1. قطع قطعتين من فيلم البارافين البلاستيك وأضعاف لهم أكثر من مرتين. وضعها على الثقوب للمقابض حامل العينة لمنع برنامج تلفزيوني 1X من تسرب على العداد.
    2. وضع الشريط أسفل على كتلة الأنسجة من حامل العينة ثم وضع الغراء لاصقة سيانوكريلات (انظر الجدول من المواد) على ذلك.
  4. إزالة الدماغ من لوحة 6 جيدا ووضعه على طبق من البلاستيك أو الزجاج. استخدام الفولاذ المقاوم للصدأالصلب ذو حدين شفرة لقطع حوالي نصف المخيخ.
    1. قطع المخيخ كودالي. تأكد من أن الجزء من المخيخ المتبقية حتى.
  5. وضع على الفور سطح مستو من المخيخ المتبقية على الغراء.
    ملاحظة: الجزء الظهري من الأنسجة (القشرة المخية) يجب أن تواجه اليسار أو اليمين نسبة إلى شفرة. نهاية منقاري التي كانت تحتوي سابقا لمبة الشم المرفقة يجب أن تواجه صعودا.
    1. انتظر على الأقل بضع دقائق للتأكد من أن الغراء يجف تماما.
  6. في حين أن الغراء الذي هو عقد الدماغ في مكان تجفيف، صب 1X بس في حمام العينة. بعد الغراء الجاف، وضع حامل العينة مع الأنسجة في حمام العينة.
    1. إذا لم يتم تغطية عينة الأنسجة بشكل كامل، صب أكثر 1X بس في حمام العينة.
  7. إرفاق شفرة إلى حامل شفرة فيبراتوم وببطء لاور شفرة في حمام العينة حتى يتم المغمورة تماما في برنامج تلفزيوني 1X. استمر في خفض النصل حتى يكون أقل قليلا من الجزء العلوي من الأنسجة.
  8. تعيين سرعة فيبراتوم إلى 7، السعة إلى 6، وزاوية القطع إلى 12 درجة (انظر الجدول من المواد لنموذج فيبراتوم). بدء الاهتزاز وقطع 200 ميكرون أقسام 23 .
    1. استخدام فرشاة الطلاء كبيرة لنقل أقسام الأنسجة من حمام عينة في كل بئر معين من لوحات 12 جيدا.
  9. الاستمرار في قطع الأنسجة حتى يتم الوصول إلى العدد المطلوب من أقسام الأنسجة.

5. بعد تلطيخ

  1. لكل من الخطوات تلطيخ التالية والشطف، واستخدام 2 مل من الحل المشار إليه لكل بئر. استخدام حشو الماصة الآلية (انظر جدول المواد) لنقل الحلول في الآبار. استخدام ماصة نقل (انظر جدول المواد) لنقل الحلول من الآبار وإلى النفايات المناسبةالحاويات.
  2. شطف المقاطع في غسل 30 دقيقة واحدة من 0.01 M بس-T (إضافة 3.0 مل من المنظفات (انظر الجدول من المواد) إلى 1000 مل 0.01 M بس).
  3. تمييع محلول هيدروكسيد الأمونيوم (الحذر) 3: 5 من حيث الحجم مع د 2 O مباشرة قبل الاستخدام. وصمة عار أقسام في محلول هيدروكسيد الأمونيوم المخفف لمدة 19-21 دقيقة.
    1. حماية محلول هيدروكسيد الأمونيوم حساسة للضوء مع احباط.
      ملاحظة: هيدروكسيد الأمونيوم داخل محلول لديه تركيز ~ 10٪ وتصنف على أنها "خطرة". قد ينتج محلول هيدروكسيد الأمونيوم حروق إذا اتصل بالجلد. قد يسبب تهيج الجهاز التنفسي إذا استنشاقه. ارتداء قفازات واقية والعمل في غطاء الدخان.
  4. وصمة عار أقسام في العازلة ما بعد تلطيخ (إضافة 90 غرام من كاشف D في 500 مل د 2 O) لمدة 19-21 دقيقة. العازلة ما بعد تلطيخ هو حساسة للضوء. حمايتها مع احباط 22 .
  5. شطف المقاطع في ثلاثة، 5-10 يغسل دقيقة من 0.01 M بس-T.

6. تصاعد، تنظيف، وتغطية

  1. جبل المقاطع على 1٪ الجيلاتين المغلفة الشرائح مع فرشاة الطلاء كبيرة. السماح لهم لتجف لمدة 20-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ومن ثم وضعها في جرة كوبلين بين عشية وضحاها.
  2. إزالة الشرائح مع أيدي قفاز من جرة كوبلين ووضعها في رف من البلاستيك (انظر الجدول من المواد). وضع رف من البلاستيك في طبق تلطيخ (انظر الجدول من المواد) التي تحتوي على الإيثانول بنسبة 100٪. يذوى لهم مع ثلاث دقائق 5 يغسل.
  3. غسل الشرائح مرتين لمدة 5 دقائق كل في 99٪ زيلين. وضع الشرائح في رف الزجاج وانخفاض الرف في طبق تلطيخ الزجاج التي تحتوي على زيلين مع مقبض معدني (انظر الجدول من المواد).
    ملاحظة: الحذر، الزيلين ضارة إذا استنشاقه ويسبب تهيج إذا كان يمس الجلد. وهو قابل للاشتعال للغاية في الدول السائلة والبخار. ارتداء قفازات واقية والعمل في غطاء الدخان.
  4. إزالة الشرائح من زيلإين واحدة في وقت واحد وتغطي بسرعة الأنسجة مع ~ 0.25 مل من وسائل الإعلام المتزايدة (انظر الجدول المادي). المقبل، واتخاذ الأغطية الشريحة ووضعها على وسائل الإعلام.
    1. دفع أي فقاعات الهواء المحاصرين تحت غطاء الشريحة إلى حافة مع كائن حادة، مثل نهاية فرشاة الطلاء.
  5. وضع الشرائح في منطقة بعيدا عن ضوء الشمس والسماح لهم لتجف لمدة 2-3 أيام.
  6. الشروع في الحصول على الصور باستخدام المجهر وتحليل مع البرامج المناسبة.

7. اكتساب صورة المكدس

  1. افتح برنامج التصوير (انظر جدول المواد ). وضع الشريحة على خشبة المسرح من المجهر. في القائمة في الجزء العلوي من البرنامج، انقر فوق "اكتساب" ثم انقر فوق "صورة حية".
  2. تعيين المجهر إلى 10X. تحديد الخلايا العصبية تفضيل ثم جلب المؤشر، الذي يظهر مثل X الأحمر، على مركز سوما. انقر بزر الماوس الأيمن لتعيين النقطة المرجعية.
  3. تعيين المجهر إلى 40X. انقر فوق "نقل" من القائمة في الجزء العلوي من البرنامج ثم انقر فوق "إلى نقطة مرجعية".
  4. البدء في إنشاء كومة الصورة عن طريق التمرير يدويا مع هدف جيد فوق الأنسجة حتى قليلا من التركيز.
    1. انقر على "تعيين أعلى" في الركن السفلي الأيسر من البرنامج تحت عنوان "إيماج أكيسيتيون."
    2. انتقل قليلا تحت الأنسجة حتى قليلا من التركيز ثم انقر فوق "تعيين أسفل" تحت "اكتساب صورة". بعد ذلك، انقر على "اكتساب صورة المكدس".
  5. بعد الحصول على كومة الصورة، اكتب الاسم المطلوب لملف الصورة في النافذة التي تظهر. حفظ باسم "ملف مبف أسكي".
    1. عند المطالبة، حدد نوع الملف كملف كومة مبف JPEG2000 ثم انقر فوق "حفظ".

8. الخلايا العصبية تتبع

  1. في تولباr أسفل القائمة، انقر على المربع المسمى "اسم كونتور". حدد "سوما" من القائمة المنسدلة.
  2. تتبع سوما يدويا. ثم انقر بزر الماوس الأيمن وحدد "إنهاء خلية الجسم" عند اكتمال التتبع.
  3. حدد "أوتونيورون" لإظهار علامة تبويب أخرى بعنوان "أوتونونيورون سير العمل."
  4. ضمن "نوع التهيئة"، حدد "جديد". تعيين المعلمات ثم انقر فوق "الخطوة التالية" لإظهار "سوما كشف" العنوان الفرعي.
    1. لتعيين المعلمات، حدد "برايتفيلد". بعد ذلك، تحت "أقصى عملية القطر"، انقر فوق "بدء قياس". باستخدام المؤشر، انتقل إلى قاعدة من دندريت وتعيين القطر يدويا.
  5. انقر على "نعم" في النافذة التي تطلب من المستخدم تتبع الصورة بأكملها. تتبع سوما يدويا. قم بإلغاء النقر ثم انقر فوق "الخطوة التالية" لإظهار العنوان الفرعي "وضع البذور".
  6. انقر على "التحقق من صحة البذور"s "ثم انقر فوق" الخطوة التالية "لإحضار العنوان الفرعي" إعادة الإعمار العصبي ".
  7. ضمن "نيورون"، انقر على "إنتيراكتيف". إجراء تتبع تفاعلي باتباع الاتجاه من برنامج التشعبات والنقر بزر الماوس الأيمن لإكمال المنطقة أبرزها تتبعها البرنامج. بعد تتبع جميع التشعبات، انقر فوق "الخطوة التالية".
  8. بعد ظهور نافذة جديدة، احفظ التكوين الجديد مع العنوان المطلوب. انقر على "حفظ".

9 - التحليل

  1. افتح برنامج التحليل (انظر جدول المواد).
  2. انقر فوق "ملف" من القائمة العلوية ثم انقر فوق "فتح ملف البيانات". حدد الملف محل الاهتمام.
  3. تحت عنوان فرعي تحليل، حدد "تحليل شول".
  4. في إطار "تحليل شول"، تعيين دائرة نصف قطرها البداية إلى 10 ميكرون. ضمن "تحليل"، انقر فوق مربعات "دندريتس" و "أوامر فرع".
  5. الحق كلإيك النوافذ التي تم فتحها حديثا وانقر على "تصدير إكسيل". انقر على "حفظ".
  6. ضمن التحليل، انقر على "تحليلات بنية فرع". حدد "كل التحليلات المحتملة".
  7. انقر بزر الماوس الأيمن فوق النافذة التي تم فتحها حديثا ثم انقر فوق "تصدير إكسيل" 24 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم قياس آثار العلاج 5-فو على أربوريزاتيون شجيري والتعقيد في قرن آمون من أقسام الدماغ ملطخة جولجي وتعقبها باستخدام برامج التصوير المتاحة تجاريا. بعد تتبع، تم تحليل أربوريزاتيون شجيري، وكثافة العمود الفقري، وتشكل العمود الفقري باستخدام تحليل شول ومؤشر التعقيد شجيري (دسي). تحليل شول هو الأسلوب التحليلي الكمي التي يمكن استخدامها لتحديد التشكل شجري شجيري 25 . بدءا من سوما، دوائر 10 ميكرون وبصرف النظر عن بعضها البعض تراكب اقتفاء أثر الشجيري. يتم تحديد طول التشعبات من قبل عدد من الدوائر التي تشنجات عبر. ويستند تحليل نقطة الفرع، وسيلة للتأكد من تعقيد الشجرة شجيري، على العدد الإجمالي وترتيب نقاط فرع.

يتم تعريف نقطة فرع كما هو عندما aفرع ينقسم إلى فرعين فرعيين. ترتيب الفرع هو مقياس للتعقيد على أساس عدد المرات التي تقسم الفروع. على سبيل المثال، نقطة الفرع الأول من الدرجة الأولى هي التشفير الأصلي الذي يمتد من سوما، في حين أن نقطة الفرع الثاني من الدرجة الثانية ستكون النقطة التي ينقسم فيها الفرع إلى فرعين فرعيين. من خلال فحص كل من نقاط الفرع وأمر الفرع، وتعقيد الشجرة الجذعية (على أساس عدد من نقاط الفرع) وعلى ما يشير المتفرعة يحدث (أمر فرع أصغر هو أقرب إلى سوما، في حين أن ترتيب فرع أكبر هو أكثر من سوما) يمكن تحديدها. تم تطبيق هذه المعايير على دسي. تم تقسيم CA1 و CA3 إلى أجزاء قمي والقاعدية وتحليلها بشكل مستقل 26 ، 27 .

تم تحليل التشعبات من الخلايا العصبية الهرمية CA1 و CA3 والخلايا العصبية الحبيبية في دغ. جميع الخلايا العصبية اختيار فوr كل مجموعة تجريبية الوفاء بالمعايير التالية: 1) كان التشعبات الظلام وتلطيخ غولجي تلطيخ عبر طولها بأكمله، 2) كانت التشعبات واضحة في اللباقة، و 3) كل الخلايا العصبية لديها مساحة كافية بينهما لمنع التدخل أثناء التحليل 28- الشكل 1 يوضح الخلايا العصبية التي تفي بالمعايير المذكورة أعلاه. تم التعبير عن البيانات كمتوسط ​​± سيم. ولتحديد الفوارق الإحصائية بين المجموعتين الشاميتين و 5 فو، تم استخدام t -test المقترن ثنائي الذيل. أجريت جميع التحاليل الإحصائية باستخدام البرمجيات التحليلية (انظر جدول المواد)، و p <0.5 اعتبرت كبيرة. تم استخدام تحليل مختلط العوامل التباين (أنوفا) لتقييم آثار العلاج 5-فو ونصف قطرها شول. وقد استخدمت فيشر لسد الاختبارات بعد أنوفا بعد أنوفا عند الاقتضاء 29 .

في كلا كا 1 ( t = 7.68، p <0.01؛ الشكل 2 أ ) و CA3 ( t = 7.54، p <0.01؛ الشكل 3 أ ) التشعبات الهرمية القمية، كان هناك انخفاض عام كبير في العمود الفقري بعد العلاج 5-فو. في حين أن العلاج 5-فو لم يؤثر بشكل كبير على كثافة العمود الفقري القاعدي من CA1 ( ر = 1.79، p = 0.15؛ الشكل 2 ب )، فإنه أدى إلى انخفاض كبير في CA3 القاعدية شجرية الهرمية الشوكية ( ر = 5.57، p <0.05؛ الشكل 3 ب ). وعلاوة على ذلك، كشفت اختبارات فيشر لسد بعد انخفاض في تشنج التغصنية من التشعبات الهرمية قمية CA1 في 40-100 ميكرون (لسد فيشر، p <0.001، الشكل 2 C ) و 130-160 ميكرون (لسر فيشر، p < 0.05.إيغ "> الشكل 2 ج ) بعيدا عن سوما مقارنة مع الضوابط المعالجة المالحة.وقد شوهدت ظاهرة مماثلة في التشعبات القمي القاعدي CA1 في 30-60 ميكرون (لسد فيشر، p <0.001؛ الشكل 2 D ) و 70-110 ميكرون (لسد فيشر، p <0.05؛ الشكل 2 D ) بعيدا عن سوما 29 .

فيما يتعلق بالتشعبات الهرمية القشرية CA3، لم يكن هناك فرق كبير في طول الشظية القطعي بعد العلاج 5-فو مقارنة مع الضوابط المعالجة المالحة ( F (28،87) = 0.91؛ p = 0.59؛ الشكل 3 C ). ومع ذلك، بالنسبة ل D3 التشعبات الهرمية القاعدية، كان هناك فرق كبير بين العلاج 5-فو والسيطرة على المياه المالحة الضوابط في طول شجيري قطعي ( F (25، 78) =1.85. p <0.05؛ الشكل 3 د ). كشفت دراسة لسد أن العلاج 5-فو انخفض من الشجرة الجذعية في 90-100 ميكرون ( p <0.01؛ الشكل 3 D )، 70-80 ميكرون و 110-120 ميكرون (لسد فيشر، p <0.05؛ الشكل 3 D ) بعيدا عن سوما 29 .

لتحديد التعقيد شجيري، تم استخدام تحليل ترتيب فرع لمقارنة 5-فو المعالجة والمالحة مجموعات التحكم المعالجة. في إطار الحكم الديمقراطي، أظهر تحليل ترتيب الفرع فرقا كبيرا بين كل معاملة وأمر فرع ( F (8، 36) = 25.61، p <0.001؛ الشكل 4 ). وقد تم تحليل ذلك باستخدام لسد فيشر، والتي أشارت إلى أن هناك انخفاض طول في 4 و 6 ثالنظام بعد العلاج 5-فو ( p <0.001؛ الشكل 4 ) 29 .

شكل 1
الشكل 1 : غولجي الخلايا العصبية الملون الذي يمثل معايير للتصوير والمزيد من التحليل. ويمكن رؤية جميع أنواع العمود الفقري الثلاثة بسهولة بعد تلطيخ غولجي. تلطيخ يتسق عبر كامل طول دندريت ويتم عزل دندريت من الخلايا العصبية الأخرى. شريط مقياس، 5 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2 : ملون غولجي ن أظهرت الاورونات اختلافات كبيرة في كثافة العمود الفقري بين 5-فو تعامل والمجموعات المالحة المعالجة في CA1 القمي، ولكن ليس CA1 القاعدية. كان هناك فرق كبير في طول العمود الفقري بين 5-فو المعالجة والمالحة المجموعات المعالجة في كل من قمي و CA1 القاعدية. ( أ ) في التشعبات الهرمية قمية CA1، 5-فو انخفاض كبير في كثافة العمود الفقري. ( ب ) في التشعبات القاعدية، لم تكن هناك تغييرات كبيرة في كثافة عامة من العمود الفقري. ( ج ) كشف تحليل شول أن العلاج 5-فو انخفض بشكل كبير الشجرة التغصنية في 40-100 ميكرون و 130-160 ميكرون بعيدا عن سوما في التشعبات الهرمية القمي CA1. ( د ) في التشعبات القاعدية، انخفض العلاج 5-فو أربوريزاتيون شجيري في 30-60 ميكرون و 70-110 ميكرون بعيدا عن سوما. متوسط ​​± سيم (ن = 6). * p <0.05؛ ** p <0.01، أنوفا 29 .= "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55696/55696fig2large.jpg" تارجيت = "_ بلانك"> الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل 3 : أظهرت الخلايا العصبية الملون غولجي اختلافات كبيرة في كثافة العمود الفقري بين 5-فو المعالجة والمالحة المجموعات المعالجة في كل من قمي و CA3 القاعدية. كان هناك فرق كبير في طول العمود الفقري بين 5-فو المعالجة والمالحة المجموعات المعالجة في CA3 قمي، ولكن ليس CA3 القاعدية. ( أ ) في التشعبات الهرمية قمية CA3، 5-فو انخفضت بشكل كبير كثافة العمود الفقري. ( ب ) في التشعبات القاعدية، 5-فو خفضت بشكل ملحوظ من كثافة عامة من العمود الفقري. ( ج ) لم يكن هناك تأثير كبير من 5 فو العلاج في المنطقة القمياء كا 3. ( د ) في التشعبات القاعدية، 5-فو ترياانخفض تيمنت شجري شجرية 70-120 ميكرون بعيدا عن سوما. متوسط ​​± سيم (ن = 6). *، p <0.05؛ **، p <0.01، أنوفا 29 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4
الشكل 4 : أظهرت الخلايا العصبية الملون غولجي داخل دغ انخفاض طول في الترتيب 4 و 6 بعد العلاج 5 فو مقارنة مع مجموعة معالجة المياه المالحة. طول لكل فرع النظام في الخلايا العصبية الهرمية من منطقة الحصين CA1. متوسط ​​± سيم (ن = 6). * p <0.05؛ ** p <0.01، أنوفا 29 . حجةسي انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بالمقارنة مع التقنيات الحديثة، فإن طريقة غولجي-كوكس لها العديد من المزايا التي تجعلها الطريقة المفضلة لدراسة مورفولوجيا العمود الفقري: 1) يمكن استخدام التلطيخ أساسا لأي نسيج، 2) إعداد المجهر الضوئي الأساسي هو كل ما هو مطلوب الحصول على الصور المستندة إلى جولجي، 3) التصوير جولجي كوكس أسرع من التصوير متحد البؤر، و 4) أقسام ملطخة غولجي قابلة للحياة لعدة أشهر لسنوات أطول من العينات التي هي فلورزنتلي المسمى. حتى مع هذه المزايا، طريقة جولجي-كوكس لا تزال لديها بعض القيود. أولا، العملية برمتها تستغرق وقتا طويلا جدا، الأمر الذي يتطلب عدة أسابيع من تلطيخ تليها تحليل الصور. كما رأينا مع هذا البروتوكول، فإنه يأخذ 14 يوما في حل A و 1 يوم في حل B قبل سيكتيونينغ يمكن أن تبدأ. بالإضافة إلى ذلك، أداء التقسيم، بعد تلطيخ، وتركيب سوف يستغرق 2-3 ساعات في الدماغ. يجب أن تجف كل شريحة لمدة يوم واحد قبل التنظيف وتغطيتها. وبعد ذلك، مقدار الوقتوسوف يستغرق إلى صورة وتحليل الأقسام سوف تعتمد على الفرد. ثانيا، قد تكون هناك قضايا من الاتساق بين البيانات من المحللين بسبب الاختلافات في تصنيف العمود الفقري 30 . لهذا السبب، فمن المستحسن أن شخص واحد يؤدي جزء التصوير والتحليل من كل تجربة، مما يزيد من تمديد الوقت من الوقت لإنجاز المشروع.

هناك عدة خطوات حاسمة من طريقة جولجي-كوكس التي تتطلب التوقيت الدقيق والاهتمام. عندما تلطيخ المقاطع مع محلول هيدروكسيد الأمونيوم، فمن الضروري أن تبقى الأقسام في الحل لمدة 19 دقيقة على الأقل، ولكن ليس أكثر من 21 دقيقة. إذا كانت المقاطع ليست في محلول هيدروكسيد الأمونيوم لوقت كاف، فإنها لن تكون ملطخة بشكل صحيح، وهذا يعني أن الخلايا العصبية سوف تبدو أقل تحديدا عند التصوير، مما يجعل من الصعب تحليلها. إذا كانت الأقسام في محلول هيدروكسيد الأمونيوم لأكثر من 21 دقيقة، فإنها قد تصبح أوفإيه-ملطخة، مما يجعل من الصعب تحديد الخلايا العصبية الفردية. لذلك، عند تبديل الحلول، يجب على الباحث التحرك بسرعة. خطوة هامة أخرى هي نقل الأقسام على الشرائح. قبل نقل المقاطع مع فرشاة الطلاء كبيرة، فمن الأفضل أن تضيف أولا كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني- T على الشريحة. وهذا يسمح للأقسام بسهولة أن توضع على الشريحة والمناورة دون أن يحتمل كسرها. خطوة واحدة أكثر أهمية هي خطوة التجفيف بعد وضع الأقسام على شريحة. إذا كانت الشرائح لا تجف لمدة 20 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة، ثم أقسام معينة على الأرجح تسقط خلال خطوات الجفاف. إذا كانت الشرائح الجافة لمدة أطول من 30 دقيقة، فإنها على الأرجح تصبح هشة وتفكك خلال خطوات الجفاف.

عند تنفيذ هذا الإجراء، هناك بعض الخطوات التي قد تكون مزعجة. على سبيل المثال، إذا تم قطع المخيخ بأكمله قبل وضع الدماغ على المواصفاتإيمن حامل و سيكتيونينغ، الدماغ قد كسر بعيدا قبل دغ مقطوع تماما، مما يجعل أي أقسام أخرى غير صالحة للاستعمال. ولذلك، فمن المهم أن تقطع فقط كودالي من خلال حوالي نصف المخيخ. الخطوة الأخرى التي قد تؤثر سلبا على الأقسام هي سرعة فيبراتوم والاتساع. في حين أن الإعدادات الموصى بها هي 7 و 6 على التوالي، عند القطع، قد تتفكك أقسام معينة في برنامج تلفزيوني أو تظهر متفاوتة. لتصحيح ذلك، ضبط دقيق إما سرعة فيبراتوم أو السعة، واحدة في كل مرة حتى المقاطع هي في براعة وحتى، بين إعدادات 6-8.

على الرغم من أن مجموعات تجارية لتلطيخ جولجي متوفرة، فإنها غالبا ما تفتقر التفاصيل الدقيقة لكل خطوة على حدة. مع هذا البروتوكول، ونحن تقرير بالتفصيل جميع الخطوات التي تم استخدامها للسماح مختبرات أخرى لصق عار بشكل موثوق الأنسجة في ذات جودة عالية مع الحد الأدنى من استكشاف الأخطاء وإصلاحها. المواد المستخدمة متوفرة لمعظم مختبرات علم الأعصاب. الانحرافات في دندريت الموربهيولوغي وتعديلات في عدد من العمود الفقري شجيري ترتبط بعدد وافر من الاضطرابات العصبية 31 . وعلاوة على ذلك، فإن هذه الاضطرابات في الشجرة التغصنية قد تمثل علامة مميزة مورفولوجية للإصابة الناجمة عن العلاج الكيميائي في الدماغ 32 . في المستقبل، وسوف ندرس كيف التعديلات الهيكلية التي يسببها 5 فو قد تتعلق التغييرات السلوكية، الخلوية، والجزيئية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل منحة تجريبية تحت المعاهد الوطنية للصحة P20 GM109005 (أرا) ومركز مركز العلوم العصبية متعدية إيدا جائزة P30 GM110702.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
superGolgi Kit  Bioenno Lifesciences 30100  Contains hazardous materials. 
PBS 10x powder concentrate Fisher  BP665-1
Triton X-100 Sigma 9002-93-1
Permount  Fisher  SP 15-100
Slide cover  Fisher  12-546-14
7 mL Transfer pipette  Globe Scientific  135030
10 mL Falcon tubes  BD Biosciences  352099
Foil  Fisher  01-213-105
12-well plate  BD Biosciences  353043
200 proof Ethanol  Pharmco-AAPER 111000200
Xylene  Acros Organics  1330-20-7 Hazardous. 
Permabond 200 Permabond LLC GF2492
25 mL serological pipette Sigma SIAL1489
Parafilm Midsci HS234526C 
Vibratome  World Precision Instruments  NVSLM1
C57Bl/6 Male Mice  The Jackson Laboratory  000664
Axio Imager 2 ZEISS Multiple components, see website for details. 
AxioCam MRc Camera ZEISS 426508-9902-000
Staining Dish , Green Tissue-Tek 62541-12
Staining Dish Set  Electron Microscopy Sciences  70312-20
Motorized Pipet Filler  Fisher  03-692-168
Neurolucida  mbf Bioscience 
Neurolucida Explorer  mbf Bioscience 
Prism  GraphPad

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18, (12), 1713-1721 (2015).
  2. Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11, (5), 316-328 (2010).
  3. Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50, (1), 10-20 (2012).
  4. Kasai, H. Structural Dynamics of Dendritic Spines in Memory and Cognition. Trends Neurosci. 33, (3), 121-129 (2010).
  5. von Bohlen Und Halbach, O. Structure and function of dendritic spines within the hippocampus. Ann Anat. 191, (6), 518-531 (2009).
  6. Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50, (6), 897-909 (2006).
  7. Bourne, J. N., Harris, K. M. Balancing structure and function at hippocampal dendritic spines. Ann Rev Neurosci. 31, 47-67 (2008).
  8. Lai, K. O., Ip, N. Y. Structural plasticity of dendritic spines: the underlying mechanisms and its dysregulation in brain disorders. Biochim Biophys Acta. 1832, (12), 2257-2263 (2013).
  9. Harris, K. M. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Current Op Neurobiol. 9, (3), 343-348 (1999).
  10. Harris, K. M., Kater, S. B. Dendritic spines: cellular specializations imparting both stability and flexibility to synaptic function. Ann Rev Neurosci. 17, 341-371 (1994).
  11. Leuner, B., Shors, T. J. Stress, anxiety, and dendritic spines: what are the connections. Neuroscience. 251, 108-119 (2013).
  12. Harris, K. M., Fiala, J. C., Ostroff, L. Structural changes at dendritic spine synapses during long-term potentiation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, (1432), 745-748 (2003).
  13. Kasai, H., Matsuzaki, M., Noguchi, J., Yasumatsu, N., Nakahara, H. Structure-stability-function relationships of dendritic spines. Trends Neurosci. 26, (7), 360-368 (2003).
  14. Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
  15. Koyama, Y. The unending fascination with the Golgi method. OA Anat. 1, (3), 24 (2013).
  16. Pasternak, J. F., Woolsey, T. A. On the "selectivity" of the Golgi-Cox method. J Comp Neurol. 160, (3), 307-312 (1975).
  17. Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150, (1), 90-95 (2006).
  18. Rosoklija, G., et al. Optimization of Golgi methods for impregnation of brain tissue from humans and monkeys. J Neurosci Methods. 131, (1-2), 1-7 (2003).
  19. de Castro, F., Lopez-Mascaraque, L., De Carlos, J. A. Cajal: lessons on brain development. Brain Res Rev. 55, (2), 481-489 (2007).
  20. Gabbott, P. L., Somogyi, J. The "single" section Golgi-impregnation procedure: methodological description. J Neurosci Methods. 11, (4), 221-230 (1984).
  21. Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox staining step by step. Front Neuroanat. 10, (38), (2016).
  22. superGolgi Kit. Available from: http://www.ihcworld.com/products/ssdatasheets/superGolgi%20Kit%20Datasheet%20Protocol.pdf (2017).
  23. Vibroslice NVSL & Vibroslice NVSLM123. Available from: https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf (2000).
  24. Neurolucida 11.03. MBF Bioscience. Williston, VT USA. (2017).
  25. Sholl, D. A. Dendritic organization in the neurons of the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87, (4), 387-406 (1953).
  26. Pillai, A. G., et al. Dendritic morphology of hippocampal and amygdalar neurons in adolescent mice is resilient to genetic differences in stress reactivity. PLoS ONE. 7, (6), (2012).
  27. Morley, B. J., Mervis, R. F. Dendritic spine alterations in the hippocampus and parietal cortex of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor knockout mice. Neuroscience. 233, 54-63 (2013).
  28. Titus, A. D., et al. Hypobaric hypoxia-induced dendritic atrophy of hippocampal neurons is associated with cognitive impairment in adult rats. Neuroscience. 145, (1), 265-278 (2007).
  29. Groves, T. R., et al. 5-Fluorouracil chemotherapy upregulates cytokines and alters hippocampal dendritic complexity in aged mice. Behavioral Brain Research. 316, 215-224 (2017).
  30. Risher, W. C., Ustunkaya, T., Singh Alvarado, J., Eroglu, C. Rapid Golgi analysis method for efficient and unbiased classification of dendritic spines. PloS One. 9, (9), (2014).
  31. Kaufmann, W. E., Moser, H. W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cerebral cortex. 10, (10), 981-991 (2000).
  32. Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50, (1), 10-20 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics