מדידת צפיפות של משקפיים מימיים בטמפרטורות קריוגניות

* These authors contributed equally
Engineering

Your institution must subscribe to JoVE's Engineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

פרוטוקול לקביעת צפיפות השלב הזגוגי של טיפות בגודל של מיקרו-פיקו-ליטר מתוארות בטמפרטורות קריוגניות.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shen, C., Julius, E. F., Tyree, T. J., Dan, R., Moreau, D. W., Thorne, R. Measuring the Densities of Aqueous Glasses at Cryogenic Temperatures. J. Vis. Exp. (124), e55761, doi:10.3791/55761 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

אנו מדגימים שיטה לקביעת צפיפות טמפרטורה קריוגנית שלב זגוגי של תערובות מימיות, ודגימות אחרות הדורשות קירור מהיר, כדי להכין את השלב הרצוי טמפרטורה קריוגני. Microliter כדי טיפות בגודל picoliter הם מקורר על ידי הקרנה לתוך תערובת חנקן נוזלי (N 2- AR) תערובת. השלב הטמפרטורה הקריוגני של הירידה מוערכת באמצעות assay חזותי כי בקורלציה עם מדידות עקיפה X- קרן. הצפיפות של N 2 נוזל תערובת נוזלי מותאם על ידי הוספת N 2 או Ar עד ירידה הופך נייטרלי ציפה. הצפיפות של תערובת זו ולכן של ירידה נקבע באמצעות מסה הבדיקה עקרון ארכימדס. עם טיפול הולם בהכנה טיפה, ניהול של גז מעל תערובת קריוגן נוזלי כדי למזער את הדובדבן, ערבוב קבוע של תערובת cryogenic כדי למנוע ריבוד צפיפות הפרדת פאזה, צפיפות מדויקת עד 0.5% של טיפות קטנה כמו 50 pL יכולייקבע בקלות. מדידות על תערובות cryoprotectant מימית לספק תובנה לפעולה cryoprotectant, ולספק נתונים כמותיים כדי להקל על ההתאמה תרמית תרמית ב cryopreservation ביולוגי.

Introduction

המאפיינים הפיזיים של מים ותערובות מימיות בשלבים השונים שלהם הם בעלי עניין בסיסי, והם חשובים ב vivo ובבדיקות הבנה של מערכות ביולוגיות. ב cryobiology עכשווי cryopreservation ביולוגי, שלבי זגוגי או אמורפי של תערובות cryoprotectant מימיים הם בעלי עניין מיוחד 1 , 2 . נוקלאציה וצמיחה של גבישי קרח יכולים לשבש תאים ורקמות, ולקדם denaturation חלבון צבירה, כך פרוטוקולים cryopreservation כי מזין את הממס הפכו פופולריים יותר ויותר. ב קריסטלוגרפיה biomolecular, התגבשות של ממס בערוצים בין biomolecules משבש סריגים קריסטל ו degrades תכונות עקיפה. ויטריפיקציה מושגת באמצעות שילוב של קירור מהיר, התייבשות, וכן הוספת ממיסים cryoprotective כגון גליצרול, אתילן גליקול, פוליאתילן גליקולים (PEGs)אלכוהולים ומלחים.

ויטריפיקציה מגבילה את התגבשות הקרח וצמיחתו, אך אינה מבטלת את כל הנזק המדוייק הקשור לקירור. לדוגמה, פסיפס קריסטל (מדד של התפלגות האוריינטציות של המטוס הבדולח) עולה באופן שגרתי על ידי גורם של 10 עד 100 כאשר גבישי חלבון מתקררים למצב מבושל 3 , ושיעורי ההישרדות שלאחר ההפשרה של תאי זרע וביציות מזוקקים משתנים במידה רבה .

מנגנון נזק אחד הוא התכווצות דיפרנציאלית של חומר ממס וסובב במהלך קירור 3 , 4 , 5 . שיווי המשקל ריכוזי ממס ממסרים בתוך גביש, תא או רקמות הם תלויים הטמפרטורה, ואת ממס בתוספת המומס ואת החומר שמסביב יכול חוזה בחוזים שונים. הקירור המהיר עשוי למנוע החלוקה מחדש של הממס והחלץ לפני הזיקוק, וקבלנים שונים על עלול לגרום גדול, unhomogenous, nonequilibrium מדגיש לגרום נזק מדגם.

גישות רציונליות להקטנת הנזק הנגרם על ידי קירור יכולות, לפיכך, להפיק תועלת מהידע על צפיפות תלויה בטמפרטורה של תערובות מימיות נוזלות ומזוהמות. ב ריכוזי מומס מעל 50% משקל של מומס למשקל של פתרון (w / w), תערובות cryoprotectant מימית ביותר יכול להיות מבושל עם שיעורי קירור צנוע של 10 K / s או פחות, המאפשר ייצור של מדידות צפיפות באמצעות דגימות זגוגית גדולה 6 . צפיפות אז ניתן לקבוע באמצעות עקרון ארכימדס, על ידי מדידת המשקל הנראה של המדגם כאשר מושעה קריוגן נוזלי כמו חנקן. עם זאת, כמו ירידה ריכוזיות סולידית, שיעורי הקירור הדרושים זיקוק לגדול במהירות: שיעורי קירור של תערובות גליצרול מימיים עולה מ <10 K / s ב 50% משקל של מומס ב G כדי נפח הפתרון מ"ל (w / v) ל 1,000 K / s ב 25% w / vהתחת = "xref"> 7. העברת חום הופך גבול הגבול שכבת מוגבלת, כך השגת שיעורי קירור גדול דורש דוגמאות קטנות וקטנות יותר 8 .

מדידות הצפיפות של מים זגוגיים טהורים וקרח הושגו על ידי הפקדת טיפות קוטר מיקרומטר (femtoliter נפח) טיפות בתוך ואקום על גבי קירור cryogenically השטח כדי לבנות מדגם macroscopic (מסה גרם). הצפיפות של מדגם זה נקבעה על ידי cryoflotation בתערובת חנקן נוזלי ארגון, שבו צפיפות של נוזל cryogenic היה מותאם עד המדגם הפך נייטרלית ציפה 9 . עם זאת, יצירת דגימות גדולות ממספר גדול של טיפות קטנות בצורה שמפחיתה את נפח הריק - מקור חשוב לטעויות במדידות צפיפות פאזה זגוגיות קודמות - אינה טריוויאלית. עבור תערובות מימיות, התאדות דיפרנציאלי של מרכיבי פתרון במהלך aerosolization ותצהיר בתוך ואקום יכול להובילאי ודאויות משמעותיות בריכוזים שהופקדו.

פיתחנו שיטה, המבוססת על cryoflotation, המאפשר קביעת צפיפות מדויקת של תערובות מימיות באמצעות טיפות בודדים קטנים כמו 50 pL 10 . טיפות אלה יכולים להיות מקורר במהירות תוך שמירה על הריכוזים המקוריים שלהם, ואת מצב הטמפרטורה cryogenic שלהם (מזוקק או גבישיים) ניתן להעריך באמצעות assay חזותי פשוט כי בקורלציה עם מדידות עקיפה X- קרן. שיטה זו מיושמת באופן נרחב לתערובות מימיות ולא מימיות, וניתן להאריך אותה במגוון של דגימות ביולוגיות, כולל תאים ( למשל , גזע וביצה), דגימות רקמות וגבישי חלבון בעלי צפיפות טמפרטורה נמוכה בין 0.8 ל 1.4 גרם / מ"ל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

זהירות: עיין בכל הגיליונות הרלוונטיים של נתוני בטיחות (MSDS) לפני השימוש. יש להשתמש בכל נוהלי הבטיחות המתאימים בעת שימוש בגזים דחוסים, כולל גופי גז מכוילים המתאימים לגז, ושסתומי גז מאושרים. מגע עם cryogens נוזלי יכול לגרום כוויות קור קשות נמק. השתמש בציוד מגן אישי מתאים (מגן פנים, כפפות, מעיל מעבדה, מכנסיים באורך מלא ונעליים סגורות), אשר כולם חייבים להיות בלתי חדירים לחנקן נוזלי. להישאר עומד ולהבטיח נתיב היציאה unobstructed מהמכשיר בעת שימוש cryogens נוזלי. להיות מודעים לסיכונים asphyxiation בעת שימוש בגזים דחוסים ו cryogens נוזלי, ולעבוד באזור מאוורר היטב עם איפור אוויר מספיק (מכסה קטר או שיעור גבוה מחזור האוויר בחדר).

1. הכנת פתרונות מימיים למדידות צפיפות

הערה: בגלל משקולות נמדדים בקלות רבה יותר לדיוק גבוה מאשר volאדים, ריכוזי הפתרון נמדדים ביחידות w / w. כל הצפיפויות והטמפרטורות הנמסות או הרתיחה מניחות לחץ אטמוספרי של 100 kPa. השלבים הבאים מתארים את ההכנה של 35% w / גליצרול פתרון W. אותו נוהל יכול לשמש ריכוזים אחרים וממסים.

  1. עבור כל סוג מומס וריכוז אינטרסים, יש להעריך את המסה המומלצת הנדרשת כדי להשיג את הריכוז הסופי הרצוי ( למשל , בין 25% w / w לבין 100% w / w) עבור נפח פתרון כולל, V טוט = 10 מ"ל נפח פתרון . לדוגמה, עבור 35% w / w פתרון גליצרול ( ρ s = 1.26 g / mL), המסה המומס, מ ' s הוא:
    משוואה
    כאשר x הוא חלק המסה המומס (0.35) ו- ρ w = 1 g / mL הוא צפיפות המים.
  2. מניחים צינור צנטריפוגות 15 מ"ל (או מכל נפח אחר מכויל מים בלתי חדיר) על המחבתשל מיקרובינציה אנליטית. לוותר על המסה הרצויה של המומס / cryoprotectant ( למשל , 3.77 g גליצרול לפתרון 35% w / w) לתוך הצינור, ולהקליט את המסה המומס בפועל.
  3. הוסף טוהר גבוהה (> 18 MΩ) מים deionized להביא את המסה הכוללת עד 10.0 גרם
  4. וורטקס המיכל עבור 30 שניות (עבור נוזלי נוזלי) או 5 דקות (עבור סוליות מוצקות), עד הפתרון הוא הומוגנית אופטית.
  5. למדוד ולהקליט את המסה הסופית של הפתרון. אטום את המיכל עם מכסה אטום לחנות בטמפרטורה קבועה (293-298 K).

2. הכנת חדר קירור הדגימה

  1. מניחים את מתקן הניסוי המתואר להלן במארז וזרימה אוויר יבש (> 5% לחות יחסית (rh)) לתוך המתחם.
    הערה: המתחם עשוי להיות מסגרת מתכת פשוטה עם ראש שלה ושלושה צדדים חתומים עם סדין פלסטיק ברור עם גישה הניסוי באמצעות צד רביעי מכוסה גיליון פלסטיק גמיש. לִלבּוֹשׁמגינים פנים כיסוי הגוף מלא כדי למזער לחות הציג על ידי הנסיין. עיבוי לחות והיווצרות קרח עלולים להפריע למדידות צפיפות טמפרטורה בצפיפות במספר דרכים, ולכן יש למזער.
  2. מניחים דיסק של גומי ניאופרן על החלק התחתון של בקבוק L 4.5 כוס דיואר, כדי להגן על בקבוק דיוואר מפני נזק.
  3. בזהירות הכנס גבוהה מוליכות תרמית נחושת קאמרית (גליל חלול עם תחתית אטום) לתוך הבקבוק עד שהוא נשען על דיסק הגומי. התאם תמוכות הקרנת החוצה מהחדר אל קירות דיואר כך החדר מרוכז ואין לו נטייה רוק.
    הערה: בקבוק דיואר יחזיק חנקן נוזלי, ואת נפח נחושת קטן בהרבה נפח יחזיק N 2 נוזל תערובת נוזלית. החנקן הנוזלי מספק אמבט תרמי ששומר על תא הנחושת ותכולתו בטמפרטורה קבועה של 77 K ומקטין הפסדים רותחים ואדירים בתא. התא&#קוטר קטן של מדכא גלי פני השטח שיכולים להפריע מדידות ציפה, ומסייע לבודד את הנוזל בתוך החדר מן הכפור והקרח נוצר במקום אחר במנגנון.
  4. הכנס את שקע של צינור גז עם יבש N 2 גז זורם ב ~ 2 L / min למטה לתחתית החדר נחושת, ו לטהר את החדר של אוויר לח.
  5. לאט לשפוך חנקן נוזלי לתוך בקבוק דיואר, מחוץ לתא נחושת, המאפשר זמן חנקן- boil-off.
    הערה: רמת מילוי הסופי, לאחר רותחים חדלה, צריך להיות בתוך כ 4 ס"מ של החלק העליון של החדר נחושת.
  6. מכסים את החלק החיצוני של בקבוק דיואר עם מכסה קצף בידוד בידוד. הסר את צינורית גז יבש N 2 גז מן החדר נחושת ולהכניס לתוך פתח תואם המכסה.
    הערה: השילוב של גז N 2 מ רותחים כבוי בבקבוק Dewar ומזרימת הטיהור מרחיק כל אוויר לח ומנע ממנו עיבוי או קריסטל o.משטחים קרים.
  7. לאט לשפוך חנקן נוזלי לתוך החדר נחושת. רמת מילוי הסופי, לאחר הרתיחה הפסיק, צריך להיות בתוך כ 4 ס"מ של החלק העליון של החדר נחושת.
  8. הניחו גיליון פלסטיק דק או שקוף מעל פתח או פתח מרכזי במכסה, והפחיתו את קצב הזרימה של N 2 ל- 0.2 ליטר לדקה, והותירו לחץ יתר של גז N 2 בתוך חללי הגז מעל נוזלים קריוגניים.
    הערה: כל עוד נוזלים cryogenic נמצאים דיואר ואת החדר, להמשיך להתאים את זרימת הגז N 2 כנדרש כדי לשמור על לחץ יתר זה ולמנוע לחות להיכנס דיואר ויצירת קרח.

3. קביעת נפח וצפיפות המסה הבדיקה ב- T = 298 K ו- T = 77 K

  1. לקבוע את המסה לכאורה של ~ 1 גרם, ~ 0.4 מ"ל PTFE המסה הבדיקה ( טבלה של חומרים ) באוויר ב T = 298 K על ידי הנחת אותו על המחבתשל microbalance אנליטית מכויל.
  2. קביעת נפח V (298 K) של המסה הבדיקה ב T = 298 K באמצעות גז pycnometer, או על ידי מדידות ממדי באמצעות מחוגה. אם באמצעות מדידות מימדי, המסה הבדיקה חייב להיות פשוט, צורה מדויקת (לא tapers או פינות מעוגלות) ואת נפח החור דרך (עבור השעיית קו) צריך להיקבע.
  3. לחשב את המסה m של המסה הבדיקה על ידי תיקון המסה הנמדדת נמדד עבור כוח ציפה המופעל על ידי האוויר על פי הדברים הבאים:
    משוואה
    שם ρ אוויר = 1.23 גרם / L (תיקון 0.1% ~).
  4. מניחים את שיווי המשקל על פלטפורמה יציבה בערך 10 ס"מ מעל בקבוק דיוואר ולאמת כיול שלה. להשעות את המסה הבדיקה באמצעות 2 מיליון (50 מיקרומטר) קו מונופילמנט מתוח מן הוו על החלק התחתון של microbalance (המיועד לתלות מדידות המונית) ו throuGh חור במסה הבדיקה. לקבוע את מסת הנראה באוויר, ולהשוות עם המדידה בשלב 3.3, תיקון לפי הצורך עבור המוני של הקו.
  5. קביעת נפח V (77 K) של המסה הבדיקה ב T = 77 K על ידי מדידת המסה לכאורה שלה חנקן נוזלי טהור, מ ' ב LN2 . להנמיך את המסה הבדיקה לתוך חנקן נוזלי בתוך החדר נחושת עד שהוא שקוע לחלוטין. כאשר רתיחה חדלה, למדוד את המסה לכאורה.
    הערה: אם החנקן הנוזלי בתא הנחושת הוא שקט וזרמי אוויר בין המיקרובלנס לבין המשטח הנוזלי הם מינימליים, ניתן למדוד את המסה הזו ליותר מ -0.2000 גרם דיוק.
  6. מעריכים את כוח הציפה על החלק השקוע של הקו, ולוודא כי הוא קטן לעומת שגיאות המדידה.
  7. חישוב נפח וצפיפות המסה הבדיקה ב 77 K באמצעות מסה ידועה שלה מסה נמדד לכאורה ב LN2 ב 77 K, מ ' אני AppN LN2, על פי הדברים הבאים:
    משוואה
    כאשר ρ LN2 ( (77 K) = 0.807 גרם / מ"ל.

הכנת נוזל ראשוני N 2 -Ar תערובת

  1. תזרים Ar גז בקצב זרימה של ~ 2 L / min דרך צינור מפותל לשקע שלה. מניחים את צינור מפותל על גבי העליון תמוכות לייצב את המיקום של החדר נחושת, בדיוק מעל רמת החנקן הנוזלי מתחת למשטח העליון של הדיואר. הקרה N 2 ו Ar גז יהיה לבנות מעל נוזלים cryogenic, הולכה תרמית, הסעה, והקרנות יהיה מגניב את צינורות הגז Ar בתוך.
  2. לאחר המאפשר צינור מפותל להתקרר במשך 5 דקות, מניחים את השקע של הצינור בתא נחושת, לפחות 10 ס"מ מתחת לפני השטח של החנקן הנוזלי. לאחר מכן לכסות את הדיואר עם מכסה ניילון גיליון שקוף.
  3. התאם את קצב הזרימה Ar עד בועות Ar לעלותמן השקע צינור על פני השטח העליון של החנקן הנוזלי. לאחר מכן להפחית את קצב הזרימה עד בועות טופס על שקע אבל להתמוסס או נוזלי רק לפני שבירת משטח חנקן נוזלי.
    הערה: כאשר ריכוז Ar בחדר נחושת מגביר, מעת לעת להתאים את קצב הזרימה Ar לפי הצורך כדי לשמור על היווצרות בועות. אם קצב הזרימה של AR נמוך מדי, האר עלול לקפוא בתוך הצינור ולחסום את הזרימה.
  4. הוסף חנקן נוזלי לפי הצורך כדי לשמור על רמת הדיואר הסובבת. הסר קרח כפי שהוא מצטבר על משטחים קרים.
  5. מערבלים מעת לעת את הנוזל על ידי הוספת רזה ( למשל , 35 מיקרון), גיליון מעוגל של רדיד נחושת מחוברת מוט בידוד דק לתוך תא נחושת, לאט להזיז אותו למעלה ולמטה כמו בוכנה. זה יקטין gradients הריכוז ואת הנטייה של Ar כדי להתגבש מתוך הפתרון.

5. מדידת והתאמת הצפיפות של תערובת N 2- AR הראשוניTure

  1. חישוב צפיפות היעד של תערובת N 2- AR על ידי אמידת צפיפות T = 77 K של המדגם להימדד, למשל , מדידות בריכוזים גבוהים יותר של רכיב הלא מימית של המדגם.
  2. צרף את המסה הבדיקה באמצעות קו monofilament ל וו על החלק התחתון של מחצבת מדידה microbalance, למדוד את המסה לכאורה שלה באוויר, ולאשר הסכם עם המדידה בשלב 3.1.
  3. מערבבים את N 2- AR פתרון כדי למנוע ריכוז ו צפיפות gradients כמו בשלב 4.5.
  4. Precool המסה הבדיקה ל T = 77 K על ידי הורדת אותו לתוך חנקן נוזלי מחוץ לחדר נחושת. הרם את המסה הבדיקה לשכבה הקרה של גז חנקן מעל חנקן נוזלי, לחכות חנקן נוזלי שיורי להתאדות את המסה הבדיקה, ולאחר מכן להוריד את מסה הבדיקה יבש, יבש לתערובת N 2- Ar עד שהוא שקוע לגמרי בתוך 2 ס"מ של משטח נוזלי.
  5. T = 77 K נפח V (77K) משלב 3.7, לפי הפירוט הבא:
    משוואה
  6. הגדל את צפיפות הפתרון על ידי זרימת Ar נוסף עד צפיפות הראשונית הרצוי מתקבל. טיפות לדוגמא כיור יכול בקלות ללכת לאיבוד, ולכן הצפיפות הראשונית צריכה להיות לפחות כמה אחוזים גבוה יותר מאשר צפיפות המדגם הצפוי. המדגם יהיה לצוף, ובכך קל יותר לעקוב אחר זה, ואת צפיפות N 2- AR תערובת אז רק צריך להיות מותאם כלפי מטה על ידי הוספת N נוזלי.
  7. הסר את הצינור המפותל של Ar, ואפשר לחמם ולהתייבש לפני השימוש הבא.

6. קירור טיפות של פתרון לדוגמה

  1. מיד לפני ירידה מחלק וקירור, חזור על שלב 1.5 עד מיילX חנקן / ארגון קריוגני נוזלי. היזהר לא להציג את כל הבועות.
  2. הסר את מכסה צינור אטום של מדגם. באמצעות מזרק נקי 1 מ"ל, לחלץ עד 1 מ"ל של פתרון, ולהחליף את הכובע. צרף 27 עד 33 G מחט על המזרק, ולאחר מכן לדחוף כמות קטנה של מדגם דרך המחט לגרש אוויר וכל שאריות מחלק הקודם.
  3. שתי שיטות ניתן להשתמש בפרויקטים טיפות מדגם לתערובת N 2- AR.
    1. עבור דגימות עם ריכוזים גדולים שאינם מימיים רכיב (45% w / w), כי יכול להיות מבושם עם שיעורי קירור צנוע, לחץ קלות על המזרק כדי לתפוס קטן (250 מיקרומטר עד 1 מ"מ) קוטר, ~ 10 nL כדי ירידה 1 μL זה תלוי על קצה המחט על ידי מתח הפנים. בעדינות להקיש על המחט לנתק ולפרוש את הירידה לכיוון N נוזלים N 2 תערובת.
    2. עבור דגימות הדורשות קירור מהיר יותר עבור vitrification, מניחים את שקע של צינור גז מחובר generat ואקוםאו (מסופק על ידי מעבדה האוויר דחוס) במרחב הגז מעל התערובת N 2- Ar נוזלי, בעדינות יניקה משם את שכבת הגז הקרה כי צורות. זה מגדיל את שיעורי הקירור עבור דוגמאות קטנות 11 .
      1. בזהירות לגעת קצה המחט על 25-75 מיקרומטר רצועת פולימר עבה ברורה כדי לוותר על נפח קטן (<10 nL, המקביל לקוטר ירידה <200 מיקרומטר) של המדגם.
        הערה: כדי להשיג את הקטן ביותר, כמעט כדורית כמעט, טיפות להסיר בקלות, להשרות את רצועה פתרון ציפוי הידרופובי במשך 10 דקות ולתת להתייבש לפני מדגם dispensing.
      2. תפוס את רצועת באמצעות פלסטיק המצורפת או מוט עץ, באופן ידני לצלול את מוט פלוס רצועת לתוך תערובת N 2- N נוזלי.
      3. לאחר טיפה יש solidified ו רותח חדל, לתפוס את קצה רצועת מול המוט באמצעות פינצטה. להגמיש את הרצועה, לשמור אותו שקוע בנוזל N 2 -Ar, עד טיפת המדגם קופץ מעל וצף לגלושאֵס.

7. הערכת מצב המדגם

  1. באמצעות מרחק עבודה ארוך (5-10 ס"מ) מיקרוסקופ המשקפת תאורה בהירה, מגניב מן LED או סיב אופטי מאיר, לבחון היטב את הירידה, תוך שמירה על אותה שקוע נוזלי N 2 -Ar. טיפות מזוהמות צריך להיראות ברור 12 , 13 . דחה טיפות מעורפל או מעונן (סביר להניח המכיל יותר משלב אחד) ו / או להראות פגמים אופטיים כולל סדקים (אשר עשוי להיות קשור חללים ששינו את הצפיפות הממוצעת).
    הערה: ציור פני השטח הפנימי של החדר נחושת לספק רקע שחור יכול להקל על זיהוי פגמים מדגם.

8. קביעת צפיפות הדגימה

  1. הירידה המופרזת תתחיל לצוף, לשקוע, או (לעתים נדירות) להיות נייטרלי ציפה בתערובת N 2- AR.טיפות צפות לפעמים עשוי להיות מוחזק על ידי מתח פני השטח, בועות זעירות, או חלקיקי קרח דבקים. בדוק את כל משטח ירידה עם מיקרוסקופ. מעקפים את הירידה כלפי מטה מן המשטח הנוזלי באמצעות קטן (2-3 מ"מ קוטר, 10 ס"מ) precooled פלסטיק או מוט עץ ולצפות התגובה שלה.
  2. אם טיפת טיפות, להגדיל את הצפיפות של N נוזלי N 2- AR באמצעות הליך בשלב 4 עד טיפה הופך נייטרלי ציפה או צף.
  3. אם ירידה צף, להקטין את הצפיפות של נוזל N 2- AR ידי הוספת חנקן נוזלי באמצעות 1.8 cryovial מ"ל. בצפיפות התערובת הראשונית (1.2-1.3 גרם / מ"ל), הוספת N 2 במרווחים של 1 מ"ל מעניקה שינויי צפיפות ניכרים, אך יש להגדיל זאת לכיוון 5 מ"ל בצפיפות נמוכה (0.8-0.9 גרם / מ"ל). בעדינות לערבב את N 2- AR (כדי לא לאבד את המסלול של טיפת המדגם) באמצעות גיליון דק מחורר נחושת נייר למעלה ולמטה בתא נחושת.
  4. לאחר כל תוספת N 2, להשתמש מוט קטן מקורר מראש בעדינות לתפוס את הירידה צף כלפי מטה לתוך הנוזל, ולצפות המהירות שלה כפי שהוא חוזר אל פני השטח.
  5. כאשר צפיפות הפתרון הותאמה כך שהטיפה תיראה נייטרלית צפויה או עולה לאט מאוד (<50 מיקרומטר / s יבטיח ~ 0.1% או דיוק צפיפות טוב יותר עבור טיפות עם נפחים עד 50 pL), למדוד את N 2 - Ar צפיפות תערובת כמתואר בשלב 5. ואז להוסיף נוזל נוסף N 2 עד טיפה הראשון מתחיל לשקוע לאט, ולמדוד את צפיפות תערובת N 2- AR שוב. אלה שתי המדידות תספק גבולות על צפיפות ירידה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מדידות צפיפות ב T = 77 K עבור טיפות מזוקקים של גליצרול מימי ואתילן גליקול לעומת ריכוז cryoprotectant מוצגים באיור 1 A ו איור 1 B בהתאמה, ואת השינוי המקביל בנפח מסוים בין T = 298 K ו 77 K, מחושב באמצעות בעבר שנקבע T = 298 K צפיפות, מוצג באיור 2 . בריכוז גבוה cryoprotectant, החוזה פתרונות על קירור המדינה מזוקק, בעוד מים טהורים מתרחב. קרוב ל 20-25% w / w פתרונות של שני cryoprotectants צפויים להראות שום התרחבות נטו או התכווצות. המדרון של שינוי נפח לעומת ריכוז יש את הגודל הגדול ביותר מתחת 40% w / w, שבו ההשפעות של cryoprotectant נוסף על טטרהראלדה טמפרטורה נמוכה המבנה של המבנה בולטים ביותר.

איור 1
איור 1: שלב זיקוק T = 77 K צפיפות לעומת ריכוז Cryoprotectant . T = 77 K צפיפות לעומת ריכוז טיפות מימיות מזוקק המכיל ( א ) גליצרול ו ( ב ) אתילן גליקול. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM של שלוש טיפות בודדות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: שינוי נפח ספציפי על קירור מ נוזלי ב 298 K לשלב זגוגית ב 77 K. אחוז שינוי נפח על קירור מ 298 K ל 77 K עבור סולוטי מימיתשל גליצרול ואתילן גליקול. צפיפות תמיסות T = 298 K מתקבלות ממדידות קודמות 14 , 15 . הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM של שלוש טיפות בודדות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המנגנון והשיטות הנוכחיים, שפותחו בעיקר על-ידי סטודנטים לתואר ראשון עם גישה מוגבלת לכלי ומכשירים לבניית מכשירים, מספקים בכל זאת מדידות צפיפות מדויקות ביותר עבור טיפות נוזלים בודדות קטנות כמו 50 pL. בטווח הריכוז ליד ומעל 50% w / w, כאשר שיעורי קירור קטנים מספיקים כדי לקבל דגימות מזוהמים, צפיפויות מסכים עם אלה שהתקבלו במדידות קודמות על דגימות בתפזורת. אקסטרפולציות של צפיפות הנוכחית ריכוז 0% - מים טהורים - גם מסכים די טוב עם הצפיפות המקובלת של צפיפות נמוכה אמורפי קרח ב 77 K 9 .

יצירת N 2- AR תערובות נדרש בין 30 דקות ל 5 שעות של זרימת Ar, בהתאם הסופי N 2 צפיפות AR צורך לתת טיפה נתון ירידה נייטרלית ציפה. הפעם עשוי להיות מופחת באמצעות מפזר או מספר צינורות גז כדי להגדיל את שטח הפנים עבור mixin Arגרם נוזל קריוגני. התאמת צפיפות N 2- AR עד ירידה היא כפי שנקבע להיות נייטרלי ציפה יכול גם להיות זמן רב, במיוחד עבור רדיוס קטן ( טי ) טיפות כי יש מהירויות מסוף קטן ( משוואה R 2 ) ולכן דורשים תצפיות זהירות יותר. תערובת N 2- Ar נוטה לפתח צפיפות אנכית / הרכבה צבע, ולכן חייב להיות מעורב באופן קבוע. כתוצאה מכך, קביעת נקודת צפיפות בשלב אחד זגוגית עבור סוג המומס נתון ריכוז, הדורש מדידות על 3-5 טיפות לפחות, יכול לקחת כמה שעות.

בכל ריכוז, צפיפות של שניים או שלושה טיפות נמדדים בדרך כלל. "הצפיפות" של כל טיפה נאמדת כממוצע של הגבולות העליונים והתחתונים הנמדדים על הצפיפות, שניתנה על ידי הצפיפות הגדולה ביותר שנמדדה על ידי N 2- AR שהפילה את הכיור ואת הצפיפות הקטנה ביותר שגרמה לו לצוף. מכיוון שגם החוזק העליון והמתח התחתון - כאשר העומס על ידי העלאה או ירידה של הירידה - לא תמיד מתקבלים במדידות על ירידה מסוימת ( למשל , הירידה עלולה ללכת לאיבוד במהלך ערבוב), מדידות על טיפות של ריכוז וגודל זהה שולבו לפעמים לאומדן צפיפות יחיד.

כדי להקטין את זמני הניסוי, נעשו ניסיונות להכין ולאחסן תערובות N 2- AR בצפיפות גבוהה במיכלי אחסון קריוגניים לשימוש אחד עד שלושה ימים מאוחר יותר. בכל המקרים, Ar התגבשה מתוך הפתרון וצפיפות נוזלים ירד עם זמן האחסון. Ar solidification וצפיפות נוזלית פוחתת התרחשה גם במהלך מדידות צפיפות ירידה אם N 2 נוזלי לא היה מעורב באופן קבוע.

האתגר העיקרי במדידות אלה הוא מזעור התהוות קרח והקרח. אדי מים התעבות, היווצרות קרח, ואת הצטברות קרח עלחדר קירור לדוגמה, על משטחים קרים אחרים, בגז קר מעל התערובת N 2- AR, וכן בתערובת N 2 -A עצמו יכול לזהם דגימות המשמש מדידות צפיפות, לקדם נוקלאציה קרח בתוכם, ולשנות את הצפיפות לכאורה שלהם. קרח על המדגם וצף על ועל הנוזל N 2- תערובת יכולה לעשות הערכת מצב הטמפרטורה נמוכה של המדגם (זגוגי או polycrystalline) קשה. כדי למזער היווצרות קרח, לבדוק בקביעות את כל המשטחים הקרים לקרח. בזהירות להסיר כל קרח מכני או באמצעות גז יבש יבש N 2 . אם הקרח מצטבר בתא הנחושת, להסיר אותו באמצעות רשת רשת בסדר, או אחר להסיר, ריק, יבש, ולמלא את החדר.

הקירור המינימלי (קריטי) קצב הקירור הנדרש כדי לקבל מדגם מזוקק עולה עם ירידה ריכוז המומס, מתקרב 10 6 K / s עבור מים טהורים 7 . שיעורי קירור לדוגמא תלויים בצורת הצורה והגודל (תוספתכמו עם הקוטר יורד), את המהירות שבה טיפה מוקרן לתוך קריוגן נוזלי, נוכחות של גז קר מעל קריוגן נוזלי (אשר בדרך כלל מקטין את שיעורי הקירור), ואת המאפיינים של קריוגן נוזלי. בדרך כלל, שיעורי קירור גדולים מ -1,000 K / s דורשים טיפות עם כרכים (בקטרים) קטן מ ~ 1 nL (~ 100 מיקרומטר).

הריכוז הנמוך ביותר או ריכוז cryoprotectant אשר צפיפות זגוגית ניתן למדוד נקבע על ידי ירידה מקסימלית שיעורי הקירור, ועל ידי טיפות בגודל הקטן ביותר אשר assay חזותי עבור vitrification ניתן להשתמש באופן אמין. שיעורי הקירור ניתן להגדיל לפי גורם של ~ 5 על ידי דגימות קירור בנזין נוזלי או תערובת פרופאן אתאן נוזלי. שלא כמו נוזלי N 2 , נוזלים אלה cryogenic יש הפרדה גדולה בין טמפרטורות רותחים להתכה ולכן יכול לספוג הרבה יותר חום ללא העברת חום להגביל את פני השטח רותחים. טיפות מקורר יכול להיות מועבר אל N 2- ARתערובת למדידות צפיפות. המעבר בין טיפות ברורות ל טיפות מעורפל או מעונן הוא פתאומי, המתרחשים על טווח צר של ריכוז מומס (בערך 2% w / w) וקירור קצב, ו היה בקורלציה עם מראה טבעות הקרח של רנטגן דפוסי השתברות 16 , 17 . עם זאת, הערכה מדויקת הבהירות החזותית הופך להיות קשה יותר כמו ירידה בנפח ירידה לכיוון 10 pL.

טווח נגיש של צפיפות המדגם באמצעות תערובות N 2- AR מוגדר על ידי צפיפות של נוזלים טהורים, 0.81 גרם / מ"ל ​​ו 1.40 גרם / מ"ל, בהתאמה. תערובות נוזלי Ar-Kr רגישים התגבשות Kr, אבל יכול לשמש כדי להאריך את טווח צפיפות בתנאי נוזל היו מעורבים כל הזמן.

השיטות המתוארות כאן חלות באופן נרחב על קביעת צפיפות של תערובות מימיות, תאים, אגרגטים תא, חומרים ביולוגיים אחרים, ומערכות אחרות שבהן דגימות קטנותשיעורי קירור גדולים נדרשים כדי להשיג את השלב הרצוי טמפרטורה נמוכה. צפיפויות אלו יסייעו בהבנת ומזעור הנזק המדגם בהקפאה, ובהבנת התנהגות המים בפתרונות מימיים ובסביבות מצומצמות וצפיפות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לגלות.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NSF תחת פרס MCB-1330685. DWM מודה תמיכה חלקית של קורנל אוניברסיטת של אוניברסיטת מולקולרית ביופיסיקה הדרכה גרנט (NIH T32GM0082567).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
centrifuge tube Falcon 6029236 15 mL conical centrifuge tube
glycerol, >99.5% Sigma  G9012-100 mL
ethylene glycol, >99.8% Sigma 324558-100 mL
analytical microbalance Mettler AE240 Analytical balance, 0.01 mg resolution, has hook on bottom for weighing below the balance 
vortexer Scientific Industries SI-0236 Vortex-Genie 2
Apparatus enclosure framing Unistrut  1-5/8" metal framing 48" wide x 24" deep x 40" tall 
Apparatus enclosure air barrier any clear plastic sheeting
neoprene rubber disk 4" diameter, 1/8" thick
dewar flask Scilogix Dilvac SS333 4.5 liter dewar flask with steel case and clamp lid
copper chamber This fabricated part is comprised of a 1.43" diameter, 0.017" wall thickness copper tube with a solid cylindrical copper base soldered to seal one end.  The copper base is 0.87" tall and the overall chamber height is 7".
nitrogen gas Airgas NI HP300 99.998% pure N2 gas
argon gas Airgas AR HP300 99.998% pure Ar gas
rotameter Omega FL3692ST 2.52 L/min max flow rate
foam insulating lid This part is fabricated from 4 lb/ft3 crosslinked polyethylene foam (supplied by Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), and has an OD of 2.42", and ID of 1.52", and a thickness of 0.79".    
PTFE test mass This fabricated part is a 0.246" diameter, 0.580" tall cylinder with a 0.060" diameter hole running perpendicular to and intersecting the cylinder axis ~0.10" from one end. 
microbalance platform Unistrut 1-5/8" metal framing 11" wide x 24" long x 24" high rectangular frame with an top aluminum sheet containing a hole for the monofilament and hanging test mass
2 mil (50 um) monofilament line Berkley NF1502-CM Nanofil fishing line
Argon precooling coil tubing VWR 60985-512 1/8" ID x 1/4" OD PVC tubing
perforated copper foil mixer 1.4" diameter,  35 micron thick copper disk, cut from 1 ounce/ft2 copper sheet and perforated with holes using an awl or other sharp pointed tool.  Insert 1-2 mm diameter rigid thermally insulating (plastic or wood) rod into the center and fix using epoxy as needed.
syringe BD 309628 1 mL Luer-Lok tip syringe
vacuum generator Gast VG-015-00-00 compressed air venturi single stage vacuum generator
hydrophobic coating spray RainX 620036 plastic water repellent
long focal length stereo microscope Bausch and Lomb Stereozoom 6 0.67-4 x zoom pod with 20X eyepieces, 10 cm working distance 
LED ring illuminator Amscope LED144S
LED spot illuminator Newhouse Lighting NHCLP-LED 3W LED gooseneck clamp lamp
1.8 ml cryo vial Nunc V7634-500EA Any 1.8 or 2 mL cryovial is adequate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of Cryopreservation by Vitrification. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. 21-82 (2015).
  2. Nagy, Z. P., Nel-Themaat, L., Chang, C. -C., Shapiro, D. B., Berna, D. P. Cryopreservation of eggs. Human Fertility: Methods and Protocols. 439-454 (2014).
  3. Kriminski, S., Caylor, C. L., Nonato, M. C., Finkelstein, K. D., Thorne, R. E. Flash cooling and annealing of protein crystals. Acta Cryst Sect D. 58, (3), 459-471 (2002).
  4. Juers, D. H., Matthews, B. W. Reversible lattice repacking illustrates the temperature dependence of macromolecular interactions. J Mol Biol. 311, (4), 851-862 (2001).
  5. Juers, D. H., Matthews, B. W. Cryo-cooling in macromolecular crystallography: advantages, disadvantages and optimization. Q Rev Biophys. 37, (2), 105-119 (2004).
  6. Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta Cryst Sect D. 66, (4), 366-373 (2010).
  7. Warkentin, M., Sethna, J., Thorne, R. Critical Droplet Theory Explains the Glass Formability of Aqueous Solutions. Phys Rev Lett. 110, (1), 15703 (2013).
  8. Kriminski, S., Kazmierczak, M., Thorne, R. E. Heat transfer from protein crystals: implications for flash-cooling and X-ray beam heating. Acta Cryst Sect D. 59, (4), 697-708 (2003).
  9. Loerting, T., Bauer, M., Kohl, I., Watschinger, K., Winkel, K., Mayer, E. Cryoflotation: Densities of amorphous and crystalline ices. J Phys Chem B. 115, (48), 14167-14175 (2011).
  10. Shen, C., Julius, E. F., Tyree, T. J., Moreau, D. W., Thorne, R. E. Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection. Acta Cryst Sect D. 72, (6), 742-752 (2016).
  11. Warkentin, M., Berejnov, V., Husseini, N. S., Thorne, R. E. Hyperquenching for protein cryocrystallography. J Appl Cryst. 39, (6), 805-811 (2006).
  12. McFerrin, M. B., Snell, E. H. The development and application of a method to quantify the quality of cryoprotectant solutions using standard area-detector X-ray images. J Appl Cryst. 35, (5), 538-545 (2002).
  13. Chinte, U., Shah, B., DeWitt, K., Kirschbaum, K., Pinkerton, A. A., Schall, C. Sample size: An important parameter in flash-cooling macromolecular crystallization solutions. J. Appl. Cryst. 38, (3), 412-419 (2005).
  14. Bosart, L. W., Snoddy, A. O. Specific gravity of glycerol. Ind Eng Chem. 20, (12), 1377-1379 (1928).
  15. Rodrigues, M., Francesconi, A. Z. Experimental study of the excess molar volumes of binary and ternary mixtures containing water + (1,2-ethanediol, or 1,2-propanediol, or 1,3-propanediol, or 1,2-butanediol) + (1-n-butyl-3-methylimidazolium bromide) at 298.15 K and atmospheric pressure. J Solution Chem. 40, (11), 1863-1873 (2011).
  16. Berejnov, V., Husseini, N. S., Alsaied, O. A., Thorne, R. E. Effects of cryoprotectant concentration and cooling rate on vitrification of aqueous solutions. J Appl Cryst. 39, (2), 244-251 (2006).
  17. Meisburger, S. P., Warkentin, M., et al. Breaking the Radiation Damage Limit with Cryo-SAXS. Biophys J. 104, (1), 227-236 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics