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परमाणु पैमाने पर Macromolecular विधानसभाओं के संरचनात्मक अध्ययन ठोस राज्य परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा

Biochemistry
 

Summary

परमाणु संकल्प पर अणुकणिका प्रोटीन सभाओं की संरचनाएं क्योंकि जैविक घटना की एक किस्म में उनकी महत्वपूर्ण भूमिकाओं के उच्च प्रासंगिकता के हैं । इस के साथ साथ, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए एक उच्च संकल्प संरचनात्मक अध्ययन पर अघुलनशील और गैर क्रिस्टलीय macromolecular प्रोटीन विधानसभाओं जादू-कोण से कताई ठोस राज्य परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (MAS SSNMR) ।

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Loquet, A., Tolchard, J., Berbon, M., Martinez, D., Habenstein, B. Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. J. Vis. Exp. (127), e55779, doi:10.3791/55779 (2017).

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Abstract

अणुकणिका प्रोटीन विधानसभाओं जैविक neurodegenerative विकारों के प्रसार के लिए रोगज़नक़ बातचीत, वायरल संक्रमण से लेकर प्रक्रियाओं में मौलिक भूमिका निभाते हैं । इस तरह की विधानसभाओं में एक गैर-आबंध रास्ते में आयोजित कई प्रोटीन उपइकाइयों में शामिल है कि बड़ी macromolecular वस्तुओं है कि सेलुलर कार्यों की एक किस्म को निष्पादित या हानिकारक परिणाम कर सकते है फार्म । विधानसभा तंत्र में परमाणु अंतर्दृष्टि और उन macromolecular विधानसभाओं के कामकाज अक्सर दुर्लभ रहने के बाद से उनके अंतर्निहित insolubility और गैर crystallinity अक्सर काफी तेजी से डेटा की गुणवत्ता को कम कर देता है सबसे तकनीकों से प्राप्त संरचनात्मक जीवविज्ञान में प्रयुक्त, जैसे कि एक्स-रे क्रि और समाधान नाभिकीय चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) । हम यहां वर्तमान जादू-कोण ठोस राज्य एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी (SSNMR) परमाणु संकल्प पर macromolecular विधानसभाओं की संरचनाओं की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली विधि के रूप में । SSNMR आकार और घुलनशीलता सीमाओं के बिना इकट्ठे जटिल पर परमाणु विवरण प्रकट कर सकते हैं । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल 13C/15N आइसोटोप के उत्पादन से आवश्यक चरणों का वर्णन करता है-macromolecular प्रोटीन असेंबलियों मानक SSNMR स्पेक्ट्रा और उनके विश्लेषण और व्याख्या के अधिग्रहण के लिए लेबल । एक उदाहरण के रूप में, हम एक रेशा प्रोटीन विधानसभा के एक SSNMR संरचनात्मक विश्लेषण की पाइपलाइन दिखाते हैं ।

Introduction

जादू-कोण में प्रगति ठोस राज्य परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (SSNMR) एक परमाणु संकल्प पर macromolecular प्रोटीन विधानसभाओं के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए एक कुशल उपकरण प्रदान करते हैं । इन प्रोटीन सभाओं सर्वव्यापी प्रणालियों है कि कई जैविक प्रक्रियाओं में आवश्यक भूमिका निभा रहे हैं । उनके आणविक संरचनाओं, बातचीत और गतिशीलता SSNMR अध्ययन द्वारा सुलभ हैं, के रूप में वायरल (capsids1) और जीवाणु संक्रमण तंत्र (स्राव प्रणालियों2,3, पिली4), झिल्ली के लिए दिखाया गया है प्रोटीन कॉंप्लेक्स5,6,7,8 और कार्यात्मक amyloids 9,10,11। आणविक विधानसभा के इस प्रकार भी ऐसे neurodegenerative रोगों जहां प्रोटीन में इकट्ठा के रूप में विकृतियों भड़काना कर सकते हैं, amyloid राज्यों और कारण ंयायपालिका सेल व्यवहार या सेल मौत 12,13। प्रोटीन विधानसभाओं अक्सर तंतुओं, रेशा, pores, ट्यूब, या नैनोकणों सहित विभिन्न आकृतियों के बड़े अणुकणिका वस्तुओं में प्रोटीन उपइकाईयों की एकाधिक प्रतियां के सममित oligomerization द्वारा निर्मित कर रहे हैं । चतुर्धातुक वास्तुकला प्रोटीन उपइकाईयों के बीच कमजोर बातचीत से परिभाषित करने के लिए स्थानिक और लौकिक विधानसभा का आयोजन और परिष्कृत जैविक कार्यों के लिए अनुमति है । इन विधानसभाओं पर एक परमाणु पैमाने पर संरचनात्मक जांच उच्च संकल्प तकनीक के लिए एक चुनौती है उनके आंतरिक insolubility के बाद से और बहुत बार उनके गैर crystallinity पारंपरिक एक्स-रे क्रि या समाधान के उपयोग को प्रतिबंधित एनएमआर दृष्टिकोण. जादू-कोण कताई (MAS) SSNMR एक उभरती तकनीक को अघुलनशील macromolecular विधानसभाओं पर परमाणु संकल्प डेटा प्राप्त है और अपनी क्षमता साबित करने सहित जटिल आणविक प्रणालियों की बढ़ती संख्या के लिए 3 डी परमाणु मॉडल को हल करने के लिए है बैक्टीरियल रेशा, amyloid विधानसभाओं और वायरल कणों 14,15,16,17,18,19,20, 21,22. उच्च चुंबकीय क्षेत्र पर तकनीकी प्रगति, methodological घटनाओं और नमूना तैयारी MAS SSNMR स्थापित किया गया है एक मजबूत विधि में अघुलनशील प्रोटीन की जांच करने के लिए विभिन्न वातावरण में, विशेष रूप से उनके जैविक रूप से प्रासंगिक macromolecular इकट्ठे राज्य या सेलुलर झिल्ली में, तकनीक अत्यधिक क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी करने के लिए पूरक बना । कई मामलों में, समरूपता के एक बहुत उच्च डिग्री ऐसी प्रोटीन सभाओं की विशेषता है । MAS SSNMR इस सुविधा का दोहन, एक homomolecular विधानसभा में सभी प्रोटीन उपइकाइयों के रूप में एक ही स्थानीय संरचना है और इसलिए लगभग एक ही SSNMR हस्ताक्षर होगा, काफी विश्लेषण की जटिलता को कम करने ।

मध्यम MAS द्वारा macromolecular प्रोटीन सभाओं के संरचनात्मक अध्ययन के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल (& #60; 25 kHz) SSNMR इस वीडियो में प्रस्तुत किया जाता है और विभिन्न चरणों (चित्रा 1) में उपविभाजित कर सकते हैं । हम एक रेशा प्रोटीन विधानसभा पर एक SSNMR संरचनात्मक अध्ययन उदाहरण के कार्यप्रवाह के महत्वपूर्ण चरणों का प्रदर्शन करेंगे ( चित्रा 1में प्रकाश डाला कदम देखें), प्रोटीन उपइकाई शुद्धि के अपवाद के साथ, प्रत्येक प्रोटीन के लिए अलग विधानसभा लेकिन संरचनात्मक अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण महत्व के, और क्या विशेष ट्यूटोरियल ऑनलाइन उपलब्ध है के लिए SSNMR स्पेक्ट्रोस्कोपी और संरचना गणना के तकनीकी/methodological विवरण में जाने के बिना । जबकि वर्तमान प्रोटोकॉल मुख्यतः ठोस राज्य एनएमआर प्रयोगों पर ध्यान केंद्रित करेंगे MAS शर्तों के तहत प्रदर्शन किया, गठबंधन जैविक वातावरण के उपयोग 23,24,25,26 , 27, इस तरह के रूप में संरेखित bicelles, प्रोटीन के रूप में की जांच के लिए अनुमति और गतिशील प्रोटीन-झिल्ली में प्रोटीन बातचीत MAS प्रौद्योगिकी के बिना मीडिया की तरह । हम प्रोटीन अभिव्यक्ति और विधानसभा कदम के रूप में अच्छी तरह से महत्वपूर्ण SSNMR स्पेक्ट्रा की रिकॉर्डिंग और उनके विश्लेषण और व्याख्या दिखाएगा । हमारा उद्देश्य संरचनात्मक विश्लेषण पाइप लाइन में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए पाठक SSNMR तकनीक द्वारा एक macromolecular विधानसभा के एक परमाणु संकल्प संरचनात्मक अध्ययन करने के लिए सक्षम है ।

प्रोटोकॉल 3 वर्गों शामिल हैं:

1. ठोस-राज्य एनएमआर नमूना उत्पादन

एक शर्त के रूप में एक ठोस राज्य एनएमआर विश्लेषण के लिए, macromolecular विधानसभा के प्रोटीन घटकों के लिए व्यक्त की जरूरत है, आइसोटोप-लेबल, शुद्ध और मूल की तरह जटिल राज्य में इन विट्रो में इकट्ठे (एक उदाहरण के लिए चित्रा 2देखें) . उच्च एनएमआर संवेदनशीलता को सुनिश्चित करने के लिए, 13सी और 15एन लेबलिंग में आइसोटोप संवर्धन न्यूनतम बैक्टीरियल अभिव्यक्ति मीडिया के उपयोग के माध्यम से आवश्यक है 13सी और 15एन सूत्रों के साथ पूरक, ऐसे समान रूप से 13 सी-लेबल ग्लूकोज ग्लिसरॉल और 15NH4सीएल क्रमशः । प्रोटोकॉल के बाद के चरण में, चुनिंदा 13सी-चुनिंदा नमूनों के साथ उत्पादित 13सी-लेबल स्रोतों जैसे (1, 3-13सी)-और (2-13सी)-ग्लिसरॉल (या (1-13सी)-और (2-13सी)- ग्लूकोज) एनएमआर विश्लेषण की सुविधा के लिए उपयोग किया जाता है । या तो ५०% 15N-और ५०% 13सी-लेबल या ५०% (1, के एक equimolar मिश्रण करने के लिए इसी नमूना मिश्रित लेबल 3-13सी)-और ५०% (2-13सी)-ग्लूकोज आणविक का पता लगाने का वर्णन करने के लिए पेश कर रहे हैं बातचीत. प्रोटीन पवित्रता के एक उच्च डिग्री के रूप में अच्छी तरह के रूप में विधानसभा चरण के दौरान कठोर परिस्थितियों के अंतिम नमूना के एक सजातीय संरचनात्मक आदेश बीमा करने के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं ।

2. प्रारंभिक संरचनात्मक लक्षण वर्णन पर आधारित एक आयामी (1 डी) ठोस राज्य एनएमआर

हम SSNMR द्वारा एक संरचनात्मक विश्लेषण के लिए आवश्यक प्रयोगों प्रस्तुत करते हैं । एक आयामी (1 डी) पार ध्रुवीकरण (वाणिज्यिक पत्र) और अयोग्य/RINEPT28 प्रयोगों, 13सी नाभिक पर पाया विधानसभा में कठोर और लचीले प्रोटीन क्षेत्रों का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है, क्रमशः, और संरचनात्मक की डिग्री का अनुमान एकरूपता और स्थानीय बहुरूपता (उदाहरण के लिए चित्र 3देखें) ।

रॉंग > 3. गठन विश्लेषण और 3d संरचना निर्धारण

उपधारा 1 और 2 जो कि प्रोटीन असेंबली के सभी कठोर अवशेषों के SSNMR प्रतिध्वनि असाइनमेंट पर आधारित है, के रूप में रासायनिक बदलाव स्थानीय पर्यावरण के लिए बहुत ही संवेदनशील जांच कर रहे हैं, और के फी/साई की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि गठन विश्लेषण, चिंता । द्वितल कोण और इस तरह माध्यमिक संरचना का निर्धारण । चित्रा 4 एक प्रोटीन विधानसभा के कठोर कोर में एक अनुक्रमिक प्रतिध्वनि काम का एक उदाहरण दिखाताहै । 3d संरचना निर्धारण संरचनात्मक डेटा के संग्रह पर आधारित है जैसे दूरी संयम एंकोडिंग बंद proximities (& #60; 7-9 Å), दोनों इंट्रा और आणविक जानकारी युक्त । 3 उपधाराएं और 4 लंबी दूरी दूर संयम संग्रह और व्याख्या का वर्णन । लंबी दूरी के संपर्क intramolecular के रूप में परिभाषित कर रहे हैं 13सी-13सी proximities से उत्पन्न होने वाले अवशेष i से j, के साथ | i-j | ≥ 4, इस प्रकार तृतीयक प्रोटीन monomeric उपइकाई के गुना, या आणविक 13सी-13सी proximities के रूप में परिभाषित, विधानसभा में प्रोटीन उपइकाईओं के बीच आणविक इंटरफेस को परिभाषित । इंट्रा और आण्विक इंटरफेस चित्रा 5में सचित्र हैं । SSNMR संयम के माध्यम से पता लगाया 13सी-13सी और 15एन-13सी reयुग्मन प्रयोगों आमतौर पर परमाणु दूरी के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना & #60; 1 एनएम । उपधारा 4 आणविक दूरी संयम का पता लगाने के लिए बताते हैं । सममित प्रोटीन सभाओं में, homogeneously लेबल के नमूनों का उपयोग (यानी १००% समान रूप से या चुनिंदा लेबल) आणविक उपइकाई की पहचान के लिए-उप इकाई बातचीत सीमित है, दोनों के रूप में अंतर और परस्पर आणविक संपर्कों के लिए नेतृत्व जासूसी संकेतों । आणविक proximities का अस्पष्ट पता लगाने मिश्रित लेबल नमूने का उपयोग करके हासिल की है, दो अलग लेबल नमूनों की एक equimolar मिश्रण युक्त, एकत्रीकरण से पहले संयुक्त. उपखण्ड 5 संक्षेप संरचना मॉडलिंग का परिचय ।

Figure 1
चित्र 1 : ठोस राज्य एनएमआर द्वारा एक परमाणु संकल्प संरचनात्मक अध्ययन के कार्यप्रवाह । 13 C, 15N आइसोटोप लेबल प्रोटीन उत्पादन, उपइकाई शुद्धिकरण, उपइकाई विधानसभा, विधानसभा गठन के नियंत्रण, SSNMR प्रयोगों, SSNMR प्रयोग विश्लेषण और दूरी संयम का निष्कर्षण, और संरचना मॉडलिंग दिखाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Protocol

< p class = "jove_title" > 1. सॉलिड-स्टेट एनएमआर सैंपल productiona

  1. का उत्पादन समान रूप से 13 C/ 15 N-लेबल प्रोटीन उपइकाईयों
    1. हौसले में तब्दीली, pET24-पेप्टाइड-6his प्लाज्मिड-युक्त का उपयोग ई. कोलाई BL21 (DE3) कोशिकाओं, उन्हें तैयार आगर प्लेट से फसल.
    2. लगाना एक 15 मिलीलीटर पूर्व की संस्कृति एक कॉलोनी के साथ पूर्व गरम पौंड मध्यम । ३७ पर मशीन & #176; सी २०० rpm के साथ रात भर मिलाते हुए ।
    3. पूर्व-गर्म M9 मध्यम की मुख्य संस्कृति के 1 एल में पहले संस्कृति हस्तांतरण ( तालिका 1 में संरचना देखें), आवश्यक आइसोटोप युक्त-कार्बन और नाइट्रोजन स्रोतों लेबल.
      नोट: यह समान रूप से 13 सी-लेबल ग्लूकोज हो सकता है, चुनिंदा (1- 13 सी)-या (2- 13 ग)-लेबल ग्लूकोज < सुप वर्ग = "xref" > 29 , < सुप वर्ग = "xref" > 30 , < सुप वर्ग = "xref" > 31 या ( 1, 3- 13 ग)-या (2- 13 ग)-त्यसपछि ग्लिसरॉल < सुप वर्ग = "xref" > ३२ , < सुप वर्ग = "xref" > ३३ .
    4. इस पर ३७ & #176; ग और मापने आयुध डिपो ६०० जैसे ही संस्कृति पंकिल हो जाता है । जब आयुध डिपो ६०० ०.८ के एक मूल्य तक पहुंच गया है, 4 ज.
      के लिए ०.७५ mM IPTG के साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित नोट: इष्टतम प्रेरण शर्तों एक प्रोटीन से दूसरे में भिंन हो सकते हैं ।
    5. ६००० x g पर 30 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त और 4 & #176; C.
  2. शुद्धि स्केच (वीडियो प्रोटोकॉल में नहीं दिखाया गया है)
    1. लाइसे कोशिकाओं जैसे sonication या lysozyme उपचार के रूप में मानक तकनीकों का उपयोग और प्रोटीन की स्थापना की तकनीक का उपयोग कर या अनुकूलित इकाई शुद्ध जांच की गई प्रोटीन असेंबली.
      नोट: प्रोटीन शामिल निकायों में व्यक्त किया जा सकता है, सेल lysis और बाद के केंद्रापसारक द्वारा प्रोटीन स्थानीयकरण के लिए जांच करें । यदि कोशिका के मलबे के साथ तलछट में प्रोटीन पाया जाता है तो उसमें समावेशी निकायों में संचित कर लिया गया है.
    2. परीक्षण अभिव्यक्ति और प्रोटीन नमूने की शुद्धता उदाहरण के लिए एक मानक 12-15% द्वारा Tris-Tricine एसडीएस-पृष्ठ, see < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 2a . यदि शुद्धता पर्याप्त हो तो प्रोटीन इकट्ठा किया जा सकता है, अन्यथा पूरक शुद्धिकरण कदम का प्रदर्शन करें ।
  3. इन विट्रो असेंबली ऑफ प्रोटीन रेशा
    1. शुद्ध समाधान में प्रोटीन एकाग्रता की जांच करें । यदि प्रोटीन अवशेषों को अवशोषित शामिल है, एक यूवी spectrophotometer में २८० एनएम पर अवशोषण को मापने । spectrophotometer में अंशांकन और उपाय के रूप में शुद्ध बफर डालें तो प्रोटीन अवशोषक ।
    2. प्रोटीन एकाग्रता के अवशोषण के साथ प्रोटीन उपइकाई के गुणांक का उपयोग कर की गणना अनुकूलित बीयर-Lambert कानून: a & #955; = & #949; & #955; x l x c; यहां एक दिया तरंग-लम्बाई पर ऑप्टिकल घनत्व है & #955;;; & #949; है विशिष्ट अवशोषण गुणांक; एल सेमी में ऑप्टिकल पथ की लंबाई है; सी है मॉल में एकाग्रता/एल
    3. एक केंद्रापसारक फिल्टर इकाई में 1 मिमी की एकाग्रता के लिए प्रोटीन ध्यान केंद्रित । केंद्रापसारक फिल्टर इकाई में नमूना परिचय और 30 मिनट के लिए ४००० x g पर केंद्रापसारक, फिल्टर इकाई में एक प्लास्टिक के साथ धीरे समाधान मिश्रण करने के लिए फिल्टर पर प्रोटीन जमाव से बचने के । प्रक्रिया को दोहराएँ जब तक वांछित एकाग्रता तक पहुँच जाता है.
      नोट: इष्टतम विधानसभा एकाग्रता प्रणाली पर निर्भर करता है और (आमतौर पर ०.१-1 मिमी के बीच) अनुकूलित किया जाना चाहिए । यदि एक equimolar मिश्रित दो अलग लेबल प्रोटीन बैचों के नमूने लेबल तैयार है ( जैसे (50/50) (u- 15 N)-/(u- 13 सी)-लेबल), मिश्रण या तो पहले या सही एकाग्रता कदम के बाद जगह ले जाना चाहिए सुनिश्चित करने के लिए मिश्रित हल के homogenization.
    4. एक ट्यूब में नमूना हस्तांतरण और कमरे के तापमान पर एक सप्ताह के लिए आंदोलन के तहत यह मशीन ।
    5. प्रायः उपइकाईयों के तंतुओं में बहुलकीकरण पंकिल बनने वाले घोल के साथ होता है. उदाहरण के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (आवर्धन 6300X-45000X) द्वारा सूक्ष्म फाइब्रिल आकृति विज्ञान और समरूपता की जांच करें, < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा b .
    6. २०००० x g पर 1 ज के लिए नमूना केंद्रापसारक और 4 & #176; C. supernatant के बहुमत को दूर, नमूना सुखाने से बचने के लिए सतह को कवर करने के लिए केवल पर्याप्त तरल छोड़ दें । यूवी spectrophotometer.
    7. पर गैर इकट्ठे उपइकाइयों के लिए supernatant की जाँच करें
    8. धो H 2 ओ और सावधान एक पिपेट के साथ सामग्री reसस्पेंड जोड़कर नमूना । भंवर मत करो । २२००० x g पर 30 मिनट के लिए नमूना स्पिन और 4 & #176; C. धुलाई चरण 3 बार दोहराएँ. सभी धुलाई चरणों के दौरान जांच करें अगर गोली केंद्रापसारक के बाद अपने पहलू को बरकरार रखता है और गैर के लिए supernatant की जांच यूवी spectrophotometer.
    9. पर उप इकट्ठे-यूनिटों
    10. जोड़ें ०.०२% (w/v) सोडियम azide (नण 3 ) जीवाणु संदूषण से बचने और नमूने को माप तक संग्रह करने पर 4 & #176; C.
  4. सॉलिड-स्टेट एनएमआर रोटर फिलिंग
    1. . दो बार 30 मिनट के लिए २२००० x g पर और 4 & #176; C. supernatant की अधिकतम मात्रा निकालें; परिणामस्वरूप नमूना निरंतरता प्रोटीन असेंबली पर निर्भर करता है, और आमतौर पर एक जेल की तरह है माज.
    2. SSNMR रोटर में नमूना सम्मिलित करने के लिए एक केशिका प्लास्टिक का उपयोग करें ।
      नोट: यहाँ, हम एक 4 मिमी व्यास रोटर पर प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं ।
      1. एक मेज पर रोटर केंद्रापसारक को धीरे से रोटर में नमूना परिचय । जब तक रोटर भरा है प्रक्रिया को दोहराएँ । रोटर कैप के साथ रोटर को बंद करने के लिए न्यूनतम स्थान रखें । नमूना मात्रा पर्याप्त नहीं है, तो रोटर में नमूना वितरण एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए शेष स्थान को भरने के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सम्मिलित करें परिचय ।
        नोट: इकट्ठे नमूना स्थिरता पर निर्भर है, यह एक पतली रंग का उपयोग करने के लिए अधिक पर्याप्त हो सकता है, विशेष रूप से बहुत घने नमूनों के लिए. २.५ से 4 मिमी के व्यास के साथ रोटर उदारवादी MAS आवृत्तियों पर इस्तेमाल कर रहे हैं.
    3. आंतरिक रासायनिक बदलाव और तापमान अंशांकन के लिए 4, 4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic एसिड (DSS) के निशान जोड़ें ।
    4. बंद करने वाली डिवाइस के साथ कैप बं द कर ᱶ ।
    5. एक ताल के तहत जांच अगर टोपी अच्छी तरह से डाला और पूरी तरह से बंद है ।
< p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर । भीतर-पृष्ठ = "1" > < img alt = "चित्रा 2" class = "xfigimg" src = "//cloudflare2.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig2v3.jpg"/>
< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा २ : प्रतिनिधि परिणाम के लिए प्रोटीन उपइकाई शुद्धि और विधानसभा । क) 15% Tris-tricine एसडीएस-प्रोटीन उपइकाई के पृष्ठ (अपने 6 -टैग सहित) शुद्धि के विभिंन चरणों में । लेन 1-प्रोटीन आणविक वजन मार्कर; लेन 2- ई. कोलाई BL21 (DE3) कोशिकाओं को प्रेरित नियंत्रण; लेन 3- ई. कोलाई BL21 (DE3) कोशिकाओं ०.७५ mM IPTG के साथ प्रेरित; लेन 4-solubilized समावेशी निकाय लेन 5-सेल lysate के supernatant अंश; लेन 6-निकल मैटीरियल धातु संबध क्रोमैटोग्राफी (IMAC) FPLC और नमक के बाद शुद्ध अंश । ख) उनि इमेजिंग द्वारा नकारात्मक दाग प्रोटीन तंतुओं । < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig2v2large.jpg" target = "blank" > इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

< p class = "jove_title" > 2. प्रारंभिक संरचनात्मक लक्षण वर्णन के आधार पर एक आयामी (1 डी) ठोस राज्य एनएमआर

  1. प्रारंभिक सेट अप और 1 डी पार ध्रुवीकरण (सीपी)
    1. एनएमआर चुंबक में रोटर डालें
    2. शुरू करने के लिए 5 khz की एक आवृत्ति पर रोटर स्पिन और & #177 के स्थिरीकरण के लिए प्रतीक्षा करें; 10 हर्ट्ज, तो 7 kHz तक तेज. धुन और मैच 1 ज, 13 ग और 15 एन चैनल । तापमान सेट करने के लिए 2-10 & #176; ग (275-283 K); 7 kHz MAS पर नमूना हीटिंग कम है और तापमान समायोजन इस MAS आवृत्ति पर आमतौर पर आवश्यक नहीं है ।
    3. रिकॉर्ड एक एकल स्पंदित 3 डी 1 एच स्पेक्ट्रम 16 स्कैन का उपयोग कर.
      नोट: पावर स्तर पहले किसी संदर्भ यौगिक पर ऑप्टिमाइज़ किया गया होना चाहिए (जैसे कोई 13 C/< sup > 15 N histidine या glycine), लक्ष्य नमूने पर प्रयोगों में पावर स्तरों को ऑप्टिमाइज़ करने के लिए प्रारंभिक मान प्रदान करने के लिए; यह कार्यविधि एक रूटिन कार्य है और इसलिए इस प्रोटोकॉल में क्षेत्र से बाहर है ।
    4. के बीच सभी प्रयोगों के दौरान तापमान रखें 2-10 & #176; ग, हाइड्रेटेड नमूनों में तापमान थोक जल के सापेक्षिक बदलाव में परिलक्षित होता है 1 H अनुनाद के संबंध में DSS संकेत < सुप वर्ग = "xref" > ३४ . संबंध के बाद के तापमान को मापने & #948;(H 2 O) = ७.८३-T/96.9 की शुद्धता के साथ 1-2 & #176; C < सुप वर्ग = "xref" > 35 .
    5. वांछित MAS आवृत्ति सेट और & #177 के स्थिरीकरण तक इंतजार; 10 हर्ट्ज.
      नोट: यहां यह 11 kHz के एक आवृत्ति के लिए प्रदर्शन किया है.
    6. ट्यून और मैच 1 एच और 13 सी चैनल फिर से और एक 1 डी की मदद से तापमान समायोजित एच प्रयोग ।
    7. सेट अप एक 3 डी 1 H- 13 C धय < सुप class = "xref" > 36 .
      नोट: सीपी प्रयोगों एक कठोर अनुरूप में अवशेषों से उत्पन्न होने वाले संकेतों को दिखाते हैं. पल्स अंशांकन और युग्मन मापदंडों सीधे नमूने पर अनुकूलित किया जा सकता है जब संवेदनशीलता काफी उच्च है के बाद संकेतों का निरीक्षण करने के लिए कम से ~ ३२ स्कैन. प्रारंभिक ऑप्टिमाइज़ेशन मान पर एक संदर्भ यौगिक मानक ऑप्टिमाइज़ेशन से लिया जाता है । वाणिज्यिक पत्र संपर्क समय और शक्ति का स्तर अधिक से अधिक संकेत तीव्रता के आधार पर चुना जाता है । प्रोटीन नमूनों में इष्टतम सीपी संपर्क समय आमतौर पर २०० & #181; s और 2 ms के बीच है. युग्मन पैरामीटर भी एक संदर्भ यौगिक पर अंशांकन से फिर से समायोजित किया जाना चाहिए.
      1. ध्यान से दी MAS आवृत्ति पर कताई sidebands के स्थानीयकरण का निरीक्षण ।
    8. एक संदर्भ 1 डी 13 सी सीपी स्पेक्ट्रम है कि 1 डी वर्णक्रमीय फिंगरप्रिंट के रूप में कार्य करता है रिकॉर्ड । ठेठ पैरामीटर १२८ स्कैन, 1 एमएस सीपी संपर्क समय, १०० kHz युग्मन ताकत, 3 एस के एक रीसायकल देरी और अधिग्रहण के 25 ms हैं.
    9. 1 H र 13 ग केमिकल शिफ्टर आईयूपीएसी सिफारिशों का पालन < सुप class = "xref" > 37 . 1 एच DSS सिग्नल (0 पीपीएम के रासायनिक बदलाव) की प्रतिध्वनि आवृत्ति का निर्धारण; १३ सी रासायनिक बदलाव 1 एच पाली को संदर्भित कर रहे है (आमतौर पर ~ ०.२५१४४, 13 सी के अनुपात से व्युत्पंन 1 H अनुनाद आवृत्ति < सुप वर्ग = "xref" > ३७ ).
    10. प्रक्रिया 3 डी 1 एच- 13 सी सीपी प्रयोग के बिना apodization समारोह (देखें < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा एक और बी एक अच्छी तरह से आदेश दिया प्रोटीन विधानसभा पर पता लगाने के लिए). नमूने में linewidth का अनुमान लगाने के लिए एक पृथक शिखर चुनें, संरचनात्मक आदेश और समरूपता का संकेत है । ठेठ 13 सी linewidths के लिए अच्छी तरह से आदेश दिया जैविक प्रोटीन विधानसभाएं MAS के तहत उच्च चुंबकीय क्षेत्र में 20-150 हर्ट्ज के बीच सीमा (पूर्ण-चौड़ाई के रूप में आधा ऊंचाई (FWHH) पर मापा) ।
    11. सीपी स्पेक्ट्रम में सिग्नल-टू-शोर (S/N) अनुपात का अनुमान है ।
      नोट: S/N अनुपात कई कारकों पर निर्भर करता है, मुख्य रूप से रोटर में नमूना की मात्रा, प्रोटीन संरचना की कठोरता की डिग्री और एक एकल आणविक अनुरूपता की उपस्थिति भी शामिल है । अंगूठे का एक नियम के रूप में, एक नमूना बहुआयामी SSNMR स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त होना चाहिए अगर एक संकेत एक अनुकूलित 1 डी में मनाया जाता है १ एच 13 सी सीपी स्पेक्ट्रम ६४ स्कैन के साथ दर्ज की गई.
    12. प्रोटीन रीढ़ carbonyl अनुनादों के वर्णक्रमीय क्षेत्र में ज़ूम (मुख्य रूप से) १६५-& #160 के बीच स्थानीयकृत; १८० पीपीएम । प्रोटीन रीढ़ की स्थिति के द्वारा विधानसभा में माध्यमिक संरचना सामग्री का अनुमान carbonyl के अवशेषों से अनुनादों के साथ अनुनादों & #945;-पेचदार या & #946;-किनारा क्षेऽ downfield खिसकाया या आउटफील्ड, क्रमशः (देखें < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा बी सी for a अधिकतर & #945;-पेचदार उपइकाई) < सुप वर्ग = "xref" > ३८ .
  2. १ d अयोग्य प्रयोग
    1. सेट अप एक 1 डी 1 एच- 13 सी अयोग्य प्रयोग उच्च मोबाइल पार्ट्स की जांच करने के लिए (उप & #181; s) प्रोटीन विधानसभा के.
      नोट: अधिग्रहण के दौरान कुछ kHz के GARP युग्मन < सुप वर्ग = "xref" > 39 की जांच को नुकसान पहुंचाए बिना छोटे स्कैन देरी (आम तौर पर 1 s) के लिए अनुमति देने के लिए, आमतौर पर प्रयोग किया जाता है.
    2. मोबाइल प्रोटीन क्षेत्रों के लिए फिंगरप्रिंट के रूप में कार्य करता है कि एक संदर्भ अयोग्य स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड; विशिष्ट पैरामीटर १२८ स्कैन कर रहे हैं और 25 ms.
    3. के एक अधिग्रहण समय
    4. प्रोसेस द एच- १३ सी अयोग्य प्रयोग. राशि और संकेतों की स्थिति में क्रमशः मोबाइल अवशेषों और अमीनो अम्ल संरचना की मात्रा का संकेत मिलता है.
      नोट: यह भी एक 2d 1 एच- 13 सी अयोग्य प्रयोग रिकॉर्ड अगर संकेत 1 डी अयोग्य स्पेक्ट्रम में मौजूद है (एक उदाहरण के लिए चित्रा 3 सी देखें) के लिए एक और अधिक विशिष्ट एमिनो एसिड पहचान की अनुमति । अस्पष्ट असाइनमेंट मामलों में, हम बफ़र घटक संकेत स्थिति समाधान एनएमआर.
    5. द्वारा जाँच की अनुशंसा करते हैं
    6. का उपयोग BMRB डेटाबेस < सुप वर्ग = "xref" > 40 और प्रकाशित डेटा < सुप वर्ग = "xref" > 38 के पास यादृच्छिक कुंडल अनुरूप में उनके इसी अमीनो एसिड के लिए अनुनादों आवंटित करने के लिए; स्पेक्ट्रम में केवल मोबाइल बफ़र घटक होते हैं यदि कोई अवशेषों एक अत्यधिक मोबाइल शासन में हैं ।
< p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर । भीतर-पृष्ठ = "1" > < img alt = "चित्रा 3" class = "xfigimg" src = "//cloudflare2.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig3v2.jpg"/>
< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 : प्रतिनिधि परिणाम एक अच्छी तरह से संरचित प्रोटीन विधानसभा के लिए SSNMR स्पेक्ट्रा अधिग्रहण । क) 13 ग-पया फिड का एक 1 ज- 13 ग पार-ध्रुवीकरण प्रयोग । ब) ज- १३ सी पार-ध्रुवीकरण प्रयोग. c) 1 H- 13 C अयोग्य एक कठोर प्रोटीन असेंबली का प्रयोग; केवल बफ़र घटक दृश्यमान होते हैं । < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig3large.jpg" target = "blank" > इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

< p class = "jove_title" > 3. अनुरचनात्मक विश्लेषण और 3d संरचना निर्धारण

  1. अनुक्रमिक अनुनाद असाइनमेंट
    1. सेट अप एक 2d 13 c- 13 c प्रोटॉन-चालित स्पिन प्रसार (PDSD) < सुप वर्ग = "xref" > ४१ प्रयोग अंतरराज्यीय अवशेषों का पता लगाने के लिए 13 सी- 13 सी सहसंबंध, साइड चेन सहित । के लिए मूल्यों पर ले लो प्रारंभिक 1 ज- 13 सी पार--1 डी से ध्रुवीकरण कदम एच- 13 सी सीपी प्रयोग ।
      1. समान रूप से 13 c-लेबल के नमूनों के लिए ५० ms के लिए मिश्रण का समय निर्धारित करें और चुनिंदा 13 c-लेबल किए गए नमूनों के लिए १०० ms. 5-25 ms और 15-25 ms के बीच प्रत्यक्ष अधिग्रहण के बीच अप्रत्यक्ष अधिग्रहण का समय निर्धारित करें आंतरिक वर्णक्रमीय संकल्प है, जो मुक्त प्रेरण क्षय (फिड) लंबाई में दिखाई संकेत द्वारा अनुमान किया जा सकता है पर निर्भर (उदाहरण में < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 ए ).
      2. परीक्षण कई प्रसंस्करण मानकों के संबंध में इष्टतम मूल्यों को खोजने के लिए संकेत करने के लिए शोर और स्पेक्ट्रम में संकल्प, आमतौर पर पर्याप्त प्रसंस्करण 2.5-4 की एक साइन बेल पारी (एसएसबी) के साथ एक qsine खिड़की समारोह का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है.
    2. सेट अप, रिकॉर्ड और प्रक्रिया एक 2d 13 सी- 13 सी PDSD एक मध्यवर्ती मिश्रण समय प्रयोग के साथ अनुक्रमिक का पता लगाने के लिए 13 सी- 13 सी सहसंबंध ज्यादातर मैं-i & #177; 1, लेकिन यह भी i & #177; 2 और i & #177; 3 अवशेष, प्रोटीन रीढ़ कठोरता और माध्यमिक संरचना तत्वों पर निर्भर करता है । मिश्रण समय 100-200 ms के बीच समान रूप से लेबल किए गए नमूनों के लिए सेट किया जाना चाहिए । अंय सभी मूल्यों से अधिक लिया जा सकता है कम मिश्रण समय 2d 13 ग- 13 ग PDSD.
    3. सेट अप, रिकॉर्ड और प्रक्रिया एक 2d 15 n- 13 ग n i कै i र n i सह i प्रयोग एक धय का उपयोग करते हुए 1 H- 15 n र एक विशिष्ठ धय 15 n- 13 ग अंतरण < सुप वर्ग = "xref" > ४२ . ऑप्टिमाइज़ करें 15 एन- 13 सी एक 1 डी फैशन में सीधे ब्याज के नमूने पर, सीए या carbonyl क्षेत्र में अधिकतम तीव्रता के आधार पर, क्रमशः ध्रुवीकरण हस्तांतरण । Typiविशिष्ट सीपी संपर्क समय के लिए काल मान 2-6 ms.
    4. सेट अप के बीच रहे हैं, रिकॉर्ड और प्रक्रिया 2d की एक श्रृंखला 15 N-( 13 सी-) 13 सी प्रयोग असाइनमेंट प्रयोजन के लिए ।
      नोट: प्रथम 15 n- 13 C ध्रुवीकरण अंतरण पैरामीटर मान से अधिक लिया जा सकता है n i CA i /n i सह i उपाययोजना. इंट्रा-अवशेष सहसंबंध N i से स्थापित हैं (ca i ) सीबी i और n i (ca i ) कं i , क्रमशः ड्रीम < सुप वर्ग का उपयोग करना = "xref" > 43 और PDSD 13 सी- 13 ग ध्रुवीकरण स्थानान्तरण । अवशेषों (i) से अवशेषों (i-1) अनुक्रमिक कनेक्टिविटी N i (कं i-1 ) से प्राप् त है कै i-1 और n i (कं i-1 ) CX i-1 गडबड, दोनों का प्रयोग एक PDSD 13 सी- 13 ग ध्रुवीकरण अंतरण.
    5. कोई एनएमआर विश्लेषण प्रोग्राम चुनें जैसे CcpNmr विश्लेषण < सुप class = "xref" > 44 या स्पार्कल < सुप क्लास = "xref" > ४५
    6. सॉफ्टवेयर में 2d स्पेक्ट्रा लोड (CcpNmr विश्लेषण के साथ उदाहरण) और प्राथमिक प्रोटीन अनुक्रम लोड ।
    7. लघु मिश्रण में दिखाई देने वाले अमीनो अम्ल प्रकारों की पहचान के साथ प्रारंभ करें 13 c- 13 c PDSD स्पेक्ट्रम. स्पिन प्रणालियों के कार्बन परमाणुओं को जोड़ने के लिए अनुमति देने के लिए & #34; अवशेष-प्रकार & #34; विशिष्ट असाइनमेंट; एक Threonine अवशेषों के असाइनमेंट के लिए < मज़बूत वर्ग = "xfig" > फिगर 4a देखें । जितने संभव हो उतने अवशेषों को पहचानें; यह प्रोटीन उपइकाई आकार, वर्णक्रमीय संकल्प और फैलाव पर निर्भर करेगा ।
    8. कम-मिश्रण के साथ मध्यवर्ती मिश्रण 13 सी- 13 सी PDSD स्पेक्ट्रम.
      नोट: मध्यवर्ती मिश्रण PDSD में दिखाई अनुपूरक चोटियों ज्यादातर अनुक्रमिक से उत्पन्न (अवशेषों मैं-अवशेषों मैं & #177; 1) संपर्क. एक दो-अवशेष अनुक्रमिक असाइनमेंट के लिए एक उदाहरण < सशक्त वर्ग में सचित्र है = "xfig" > चित्र 4B .
      1. एक स्पिन प्रणाली की प्रतिध्वनि चोटियों निशान और अन्य स्पिन प्रणालियों की प्रतिध्वनि आवृत्तियों के साथ मध्यवर्ती मिश्रण PDSD में सहसंबंध लगता है. छोटे प्रोटीन या पेप्टाइड्स में, यह संभव हो सकता है 2 डी के आधार पर पूरे अनुक्रमिक अनुनाद असाइनमेंट प्राप्त करने के लिए 13 c- 13 c PDSD गडबड.
        नोट: In & #946;-कतरा द्वितीयक संरचना रूपांकनों अवशेष i-अवशेष i & #177; 2 13 c- 13 c संपर्क अंतरिक्ष में अपनी निकटता के कारण अनुक्रमिक संपर्कों की तुलना में अधिक तीव्र संकेतों को दिखा सकते हैं; in & #945;-पेचदार माध्यमिक संरचना रूपांकनों अवशेष i-अवशेष i & #177; 3 13 ग- 13 ग संपर्क भी तीव्र संकेतों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
    9. अगर मध्यवर्ती-मिश्रण PDSD प्रयोगों पर चुनिंदा 13 सी-लेबल नमूने उपलब्ध हैं, उन्हें कम मिश्रण स्पेक्ट्रम पर ओवरले (चुनिंदा 13 ग-लेबल नमूने पर उपलब्ध है) और पूरक असाइन चोटियों, खाते में ले चयनात्मक 13 सी लेबलिंग पैटर्न (1, 3- 13 ग और 2- 13 ग ग्लिसरॉल < सुप class = "xref" > 32 , < सुप class = "xref" > 33 या 1- 13 सी और 2 13 सी ग्लूकोज < सुप वर्ग = "xref" > २९ , < सुप वर्ग = "xref" > ३० , < सुप वर्ग = "xref" > ३१ .
      नोट: उदाहरण के लिए, किसी 2- 13 c ग्लिसरॉल में लेबल किए गए नमूना कई अमीनो अम्ल प्रकार पर लेबल होते हैं c & #945; निकटवर्ती कार्बन के बिना स्थिति (c & #946; और c & #39;) लेबल, इसलिए इष्ट c & #945;-c & #945; सन्निकट अवशेषों के बीच स्थानांतरण. चुनिंदा लेबल नमूनों में, लंबी दूरी 13 सी- 13 सी सहसंबंध पहले से ही मध्यवर्ती मिश्रण में निर्माण हो सकता है 13 सी- 13 सी PDSD गडबड । यदि एक चोटी एक अनुक्रमिक सहसंबंध द्वारा समझाया नहीं जा सकता है, यह एक लंबी दूरी के संपर्क से पैदा कर सकता है । के लिए उच्च macromolecular विधानसभा में सजातीय उपइकाई संरचनाओं का आदेश दिया, अनुनादों का केवल एक सेट स्पेक्ट्रा में दिखाई होने की उंमीद है । यदि दोगुनी (या आगे गुणा) अनुनादों 13 सी परमाणुओं या प्रोटीन रीढ़ हिस्सों के लिए दिखाई दे रहे हैं, दो (या अधिक) परमाणु या विधानसभा में प्राथमिक अनुक्रम खिंचाव के लिए अनुरूप, क्रमशः मौजूद हैं ।
    10. का उपयोग 2 डी NCA स्पेक्ट्रम युक्त इंट्रा-अवशेष 15 N- 13 C & #945; सहसंबंध की पहचान करने के लिए 15 N अनुनाद आवृत्तियों प्रत्येक अवशेषों के लिए । यदि 13 c आयाम में समाधान पर्याप्त नहीं है, तो c & #946 के बारे में अनुपूरक जानकारी का उपयोग करें; 2 डी NCACB में अनुनाद की पहचान करने के लिए अंतर-अवशेष 15 N अनुनाद आवृत्ति.
    11. का उपयोग 2d NCACB और NCACO स्पेक्ट्रा युक्त इंट्रा-अवशेष 15 एन- 13 सी- 13 सी सहसंबंध के लिए (i) 13 c- 13 c में अस्पष्टता को हल करने के लिए अंतर-अवशेष 15 N आवृति और (ii) को पहचानें अतिरिक्त 15 N आयाम की मदद से PDSD । स्वप्न अंतरण के कारण संकेत का उलटा ठेठ सी & #945 के अवलोकन की ओर ले जाता है;-c & #946; सहसंबंध जिसके लिए c & #945; संकेत धनात्मक है और c & #946; संकेत ऋणात्मक है । आगे की ओर चेन 13 सी, अगर स्पेक्ट्रम में दिखाई दे, फिर से सकारात्मक रहे हैं ।
< p class = "jove_content" फो: साथ-साथ रखें । भीतर-पृष्ठ = "1" > < img alt = "चित्रा 4" class = "xfigimg" src = "//cloudflare2.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig4v3.jpg"/>
< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा ४ : २ आयामी १३ सी- 13 ग SSNMR PDSD गडबड पर एक अच्छी तरह से आदेश दिया, समान रूप से 13 ग, 15 N-लेबल प्रोटीन विधानसभा । क) कम मिश्रण समय PDSD (५० एमएस मिश्रण) । ख) 2 के काम-अवशेषों खिंचाव Ile32-Thr33 एक लंबे मिश्रण समय PDSD (२०० एमएस मिक्सिंग) के साथ कम मिश्रण समय PDSD के ओवरले का उपयोग कर । < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig4v2large.jpg" target = "blank" > इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

< राजभाषा प्रारंभ = "2" >
  • माध्यमिक संरचना निर्धारण
    1. उपयोग 13 C & #945;, 13 C & #946; द्वितीयक रासायनिक shift की गणना करने के लिए रासायनिक shift मान ४६ & #916; & #948; ग & #945;-& #916; & #948; ग & #946; , द्वितीयक संरचना का संकेत है । गणना 13 ग & #945;(गरिनेछ)- 13 c & #945;(रैंडम कुंडल) व 13 ग & #946;(गरिनेछ)- 13 c & #946;(यादृच्छिक कुंडल).
      नोट: यादृच्छिक कुंडल रचना में अवशेषों के लिए रासायनिक बदलाव मान < सुप वर्ग से प्राप्त किया जा सकता है = "xref" > 38 .
      1. प्लाट & #916; & #948; ग & #945;-& #916; & #948; C & #946;, ऋणात्मक या धनात्मक मान के लिए & #62; 3 अवशेषों को एक पंक्ति में इंगित & #946;-किनारा या & #945;-पेचदार अनुरूपता क्रमश; glycine और रेखा के अवशेष असामान्य रासायनिक shift मान दिखा सकते हैं, के रूप में वे प्रायः & #34 के रूप में कार्य करते हैं; द्वितीयक संरचना breaks & #34;.
    2. की भविष्यवाणी प्रोटीन द्वितल कोण से सौंपा रासायनिक पाली का उपयोग TALOS + < सुप वर्ग = "xref" > ४७ , < सुप class = "xref" > 48 या PREDITOR < सुप class = "xref" > 49 , < सुप class = "xref" > 50 . अनुमानित फी/साई द्वितल कोण प्रोटीन के माध्यमिक संरचना को प्रतिबिंबित सुबुnit और मॉडलिंग की प्रक्रिया में संरचनात्मक संयम के रूप में उपयोग किया जाता है ।
  • संरचनात्मक संयमता का संग्रह
    1. सेट अप और रिकॉर्ड एक 2d 13 सी- 13 सी PDSD प्रयोग के साथ एक लंबे समय के मिश्रण के लिए लंबी दूरी का पता लगाने के 13 सी- 13 सी सहसंबंध । ठेठ मिश्रण टाइंस ४०० ms से 1 एस के लिए रेंज का उपयोग चुनिंदा 13 सी-लेबल नमूने, के रूप में स्पिन कमजोर पड़ने बहुत दूर कार्बन के बीच ध्रुवीकरण हस्तांतरण में सुधार ।
    2. लंबे मिश्रण 2 डी 13 सी- 13 सी PDSD मध्यवर्ती मिश्रण 13 सी- 13 सी PDSD पर चुनिंदा लेबल नमूना पर दर्ज की, यदि संभव हो तो एक ही चुनिंदा लेबल नमूना पर दर्ज की गई । पूरक चोटियों से अधिक दूर 13 सी परमाणुओं के बीच सहसंबंध से उठता है । प्रतिध्वनि असाइनमेंट के दौरान, चयनित लेबलिंग योजना खाते में ले ।
    3. ध्यान से स्पेक्ट्रम के संकल्प का मूल्यांकन करने के लिए एक असाइनमेंट सहिष्णुता खिड़की, यानी एक निश्चित पीपीएम रेंज में वर्णक्रमीय संकल्प अनुनादों पर निर्भर परिभाषित यह संकेत करने के लिए योगदान कर सकते हैं । असाइनमेंट शुद्धता के मानक विचलन स्वचालित रूप से CcpNmr विश्लेषण या स्पार्कल जैसे एनएमआर असाइनमेंट प्रोग्राम्स में परिकलित की जाती है ।
    4. यदि कोई संकेत अनुक्रमिक (अवशेष i-अवशेष i & #177 से समझाया जा सकता है; 1) या एक मध्यम दूरी 13 c- 13 c contact (अवशेष i-अवशेष i & #177; 2, 3 या 4), इस असाइनमेंट को बनाए रखने के बाद से relayed ध्रुवीकरण स्थानांतरण समझा जा सकता सहसंबंध भले ही 13 c- 13 c दूरी अपेक्षित दृश्यमान संपर्क श्रेणी के ऊपर है ।
    5. लंबी दूरी के कार्य 13 सी- 13 सी संपर्क आवृत्ति अस्पष्ट और अस्पष्ट संकेतों में वर्गीकृत । आवृत्ति अस्पष्ट कार्य के मामले में, केवल एक प्रतिध्वनि असाइनमेंट असाइनमेंट सहिष्णुता विंडो के संबंध में संभव है ।
      नोट: अस्पष्ट असाइनमेंट्स में सहनशीलता विंडो के भीतर सभी संभव प्रतिध्वनि असाइनमेंट होते हैं । अस्पष्टता केवल अस्पष्ट संयम का उपयोग कर गणना के आधार पर अस्पष्टता के चलने दौर द्वारा संरचना गणना के दौरान एक साथ एक साथ उठाया जा सकता है, जैसे कि अभिकलनी दिनचर्या में ARIA जैसे प्रदर्शन < सुप वर्ग = "xref" > ५१ या उनिो < सुप वर्ग = "xref" > ५२ . इसके अलावा, विभिंन भौतिक स्रोतों से संरचनात्मक डेटा ( जैसे हल एनएमआर या एक्स-रे क्रि, जन-लंबाई माप, क्रायो-em नक्शा) भी अस्पष्टता के स्तर को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के लिए के रूप में रूपांतरित या काट दिया उप इकाई संरचना उदाहरण देखें < सुप वर्ग = "xref" > 1 , < सुप क्लास = "xref" > ३ , < सुप class = "xref" > 53 , < सुप class = "xref" > 54 , < सुप class = "xref" > 55 , < सुप class = "xref" > 56 , < सुप वर्ग = "xref" > ५७ , < सुप वर्ग = "xref" > ५८ .
  • आणविक दूरी एक सममित प्रोटीन विधानसभा में संयम का पता लगाने
    1. एक 2d 15 N- 13 सी दर्द-सीपी < सुप वर्ग = "xref" > ५९ प्रयोग चालू एक मिश्रित (50/50) u- 15 N-/u- 13 C-लेबल्ड नमूना । दर्द सीपी स्पेक्ट्रम पर पाया संकेतों अंतर आणविक 15 N- 13 सी proximities से उत्पन्न होना चाहिए. पहले से सौंपा अनुनादों का प्रयोग करने के लिए आणविक संपर्कों के काम करते हैं ।
    2. एक 2d 13 सी- 13 सी PDSD को लम्बे मिश्रण के समय के साथ सेट करें (& #62; ६०० ms) पर (50/50) मिश्रित (1, 3- 13 c)-/(2- 13 c)-ग्लिसरॉल or (1- 13 c)-/(2- 13 c)-ग्लूकोज नमूना.
      नोट: इस में पता लगाए गए सिग्नल 13 सी- 13 सी स्पेक्ट्रम से उत्पन्न इंट्रा-आणविक और अंतर-आणविक 13 सी- 13 सी proximities. हालांकि, दो लेबलिंग योजनाओं के उच्च complementarity विशेष अनुनाद जोड़े की सुविधा देता है स्पष्ट रूप से अंतर-आणविक संपर्कों से उठता है, जैसे एक Serine CA (2- 13 C)-ग्लूकोज लेबल उपइकाई है कि एक Serine सीबी में सहसंबंधी बनाना (1- 13 C)-ग्लूकोज लेबल उपइकाईयों.
      1. 2 डी के लिए मिश्रित नमूने के स्पेक्ट्रम ओवरले 13 सी- 13 सी स्पेक्ट्रा पर दर्ज homogeneously लेबल नमूने ((1, 3- 13 ग)-व (2- 13 ग)-ग्लिसरॉल या (1- 13 ग)-व (2- 13 ग)-ग्लूकोज लेबल नमूने) । मिश्रित नमूने पर दर्ज किए गए स्पेक्ट्रम में अतिरिक्त सिग्नल अंतर-आणविक इंटरैक्शन से उत्पन्न होने चाहिए.
  • संरचना मॉडलिंग से SSNMR डेटा
    1. संरचना गणना के लिए आवश्यक SSNMR संयम सूचियाँ तैयार करें: (१) प्रोटीन अनुक्रम; (2) अंतर आणविक अस्पष्ट दूरी संयम; (3) अंतर आणविक अस्पष्ट दूरी संयम; (४) TALOS आधारित द्वितल कोण संयमी; (5) अंतर आणविक अस्पष्ट दूरी संयम; (6) अंतर-आणविक अस्पष्ट दूरी संयम; (7) अन्य बायोमास तकनीकों से अतिरिक्त डेटा ( उदा मास-प्रति-लंबाई, समरूपता पैरामीटर).
    2. कई समीक्षाएँ SSNMR डेटा के आधार पर संरचना मॉडलिंग में अंतर्दृष्टि प्रदान करती हैं और पूरक संरचनात्मक डेटा के साथ संयोजन के रूप में < सुप class = "xref" > 14 , < सुप class = "xref" > 60 , < सुप class = "xref" > 15 , < सुप class = "xref" > 19 , < सुप class = "xref" > 61 , < सुप क्लास = "xref" > 62 ध्यान दें कि अस्पष्ट दूरी संयमी प्रारंभिक के संबंध में संरचना गणना के दौरान disambiguated जा सकता है संरचनात्मक मॉडल अस्पष्ट दूरी संयम पर आधारित है । संरचना सटीकता सुनिश्चित करने के लिए, ध्यान से निरीक्षण अगर संरचना एक एकल गुना करने के लिए एकाग्र ।
  • < p class = "jove_content" > < img alt = "figure 5" class = "xfigimg" src = "//cloudflare2.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig5v3.jpg"/>
    < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 5 < सशक्त शैली = "फ़ॉन्ट-आकार: 14px;" >: इंट्रा-ऐंड आणविक सममित प्रोटीन विधानसभाओं में संपर्क. & #160; इंट्रा-& #160 के योजनाबद्ध निरूपण; बनाम & #160; आणविक & #160; 13 सी- 13 सी लंबी दूरी के संपर्क एक पेचदार macromolecular विधानसभा में । उपइकाईयों को मिश्रित लेबलिंग का वर्णन करने के लिए सफेद और लाल रंग के होते हैं; & #160; यानी & #160; विधानसभा से पहले दो अलग लेबलिंग योजनाओं का 1:1 मिश्रण किया गया था ( उदा. & #160; 1- 13 C ग्लूकोज और 1- 13 सी ग्लूकोज). & #160; A ) Intramolecular & #160; 13 c- 13 c लंबी दूरी वाले संपर्क (नीला डैश्ड तीर); & #160; B ) आण्विक & #160; 13 c- 13 c लंबी दूरी के संपर्क (लाल धराशायी तीर). & #160; < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig5v2large.jpg" > इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

    Representative Results

    विशिष्ट SSNMR कार्यप्रवाह में आरेख 1में सचित्र कई चरण शामिल होते हैं । आमतौर पर प्रोटीन उपइकाईयों में इन विट्रो heterologous अभिव्यक्ति ई. कोलाईमें द्वारा उत्पादित कर रहे हैं, शुद्ध और मिलाते हुए के तहत इकट्ठे लेकिन कभी भी स्थैतिक परिस्थितियों में । प्रोटीन उपइकाई की अभिव्यक्ति और शुद्धि एसडीएस जेल क्रोमैटोग्राफी (चित्रा 2a) के बाद किया जाता है । macromolecular विधानसभाओं के गठन तो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) विश्लेषण द्वारा पुष्टि की जा सकती है (एक रेशा विधानसभा का एक उदाहरण के लिए चित्रा बी + देखें).

    SSNMR रोटर में प्रोटीन विधानसभा की शुरूआत के बाद, रोटर स्पेक्ट्रोमीटर में डाला जाता है, MAS आवृत्ति और तापमान विनियमित रहे हैं और स्पेक्ट्रा दर्ज कर रहे हैं. पहली अंतर्दृष्टि 1 डी SSNMR तकनीकों से प्राप्त किया जा सकता है । चित्रा 3 एक ठेठ SSNMR फिड एक संरचनात्मक रूप से सजातीय प्रोटीन नमूना पर 13सी चैनल पर पाया पता चलता है, एक 1एच13सी सीपी स्पेक्ट्रम, में प्रोटीन उपइकाई के कठोर कोर में मौजूद13सी अनुनादों का खुलासा विधानसभा, और एक 2d 1एच-13सी अयोग्य स्पेक्ट्रम, मोबाइल अवशेषों का प्रतिनिधित्व । विधानसभा संरचना के कठोर कोर में परमाणु अंतर्दृष्टि के लिए, बहुआयामी SSNMR प्रयोगों को समान रूप से और चयनात्मक रूप से लेबल के नमूनों पर दर्ज की जरूरत है पहले SSNMR अनुनादों आवंटित करने के लिए और फिर लंबी दूरी की proximities का पता लगाने ( चित्रा 4 देखें ).

    सभी स्पेक्ट्रा संसाधित और SSNMR अनुनादों को आवंटित करने के लिए पर्याप्त सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण कर रहे हैं और इंट्रा और आणविक दूरी संयम (चित्रा 5) निकालने । SSNMR दूरी संयम या तो अकेले या पूरक तकनीक है, जो मॉडलिंग कार्यक्रम में एकीकृत किया जा सकता है से डेटा के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं ।

    SSNMR तकनीक द्वारा हल macromolecular विधानसभाओं के प्रतिनिधि परमाणु संरचनाओं के लिए चित्रा 6 बैक्टीरियल उपांग और amyloid तंतुओं से कई तंतु सभाओं को दिखाता है.

    Figure 6
    चित्रा 6:एक ठोस राज्य एनएमआर दृष्टिकोण द्वारा निर्धारित रेशा macromolecular संरचनाओं: बैक्टीरियल रेशा और amyloid प्रोटीन तंतुओं. क) प्रकार 1 pilus के uropathogenic ई. कोलाई, PDB कोड 2N7H 4; ) ए एस सी रेशा, PDB कोड 2N1F ६३; ) प्रकार III स्राव प्रणाली सुई, PDB कोड्स 2MME, 2LPZ और 2MEX 2,3,६४; ) Amyloid-बीटा AB42 तंतुओं, PDB कोड 2NAO, 5KK3, 2MXU ६५,६६,६७ और ओसाका उत्परिवर्ती PDB कोड 2MVX ५७, आयोवा उत्परिवर्ती PDB कोड 2MPZ ५८; ) अल्फा-synuclein तंतुओं, PDB कोड 2N0A ६८; ) हेत-एस prion डोमेन, PDB कोड 2RNM, 2KJ3 ६९,७०. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Discussion

    सॉलिड-स्टेट एनएमआर (SSNMR) एक परमाणु स्तर पर निस्र्पक macromolecular प्रोटीन सभाओं के लिए पसंद की एक विधि है । SSNMR में केंद्रीय मुद्दों में से एक संरचना निर्धारण आधारित जांच प्रणाली के वर्णक्रमीय गुणवत्ता है, कि विभिंन परिशुद्धता के 3 डी संरचनात्मक मॉडल की स्थापना की अनुमति देता है, आमतौर पर कम संकल्प मॉडल से लेकर (माध्यमिक युक्त संरचना तत्वों और थोड़ा 3 डी जानकारी) छद्म परमाणु 3d संरचनाओं के लिए । मात्रा और संरचनात्मक बहु आयामी SSNMR प्रयोगों से निकाली गई जानकारी की गुणवत्ता के लिए विधानसभा के एक उच्च संकल्प एनएमआर संरचना की गणना करने के लिए महत्वपूर्ण है.

    वर्णित प्रोटोकॉल 13सी-13सी और 15एन-13सी संरचनात्मक कई 2d की रिकॉर्डिंग की आवश्यकता होती है (और 3 डी) स्पेक्ट्रा उच्च संकेत के साथ-शोर के बारे में पता लगाने पर निर्भर करता है । मॉडरेट MAS आवृत्तियों पर (& #60; 25 kHz), नमूना 3.2 के आकार के साथ रोटर में पेश किया गया है 4 मिमी व्यास अप करने के लिए प्रोटीन की मात्रा के लिए अनुमति ~ ५० मिलीग्राम, नमूना जलयोजन पर निर्भर. रोटर के अंदर नमूना की राशि सीधे SSNMR स्पेक्ट्रा में सिग्नल-टू-शोर अनुपात के लिए आनुपातिक है, लंबी दूरी की दूरस्थ संयम और उनके अस्पष्ट असाइनमेंट का पता लगाने के लिए एक निर्णायक कारक है ।

    वर्णक्रमीय संकल्प अनुक्रमिक अनुनाद असाइनमेंट और संयमी संग्रह के दौरान एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है । इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए, नमूना तैयार करने के मापदंडों विशेष रूप से उपइकाई और विधानसभा की स्थिति की शुद्धि में अनुकूलित करने की आवश्यकता है (पीएच, बफर, मिलाते हुए, तापमान, आदि.) । नमूना ऑप्टिमाइज़ेशन के लिए, यह कई विशिष्ट स्थितियों के लिए जो असेंबली स्वीकार्य किया गया है के लिए अनलेबल्ड नमूने तैयार करने के लिए अनुशंसित है, और प्रत्येक तैयार नमूने पर एक 1 d 1H-13C सीपी स्पेक्ट्रम (चरण २.१ में वर्णित) रिकॉर्ड करने के लिए । स्पेक्ट्रा वर्णक्रमीय संकल्प और विभिन्न तैयारियों के बीच फैलाव, जिसके आधार पर इष्टतम स्थितियों निर्धारित किया जा सकता की तुलना करने के लिए सेवा करते हैं ।

    SSNMR डेटा की गुणवत्ता विशेष रूप से ध्रुवीकरण हस्तांतरण कदम के लिए एनएमआर अधिग्रहण मापदंडों के चयन पर दृढ़ता से निर्भर करता है । उच्च चुंबकीय क्षेत्र शक्तियों का उपयोग (≥ ६०० मेगाहर्ट्ज 1एच आवृत्ति) उच्च संवेदनशीलता और वर्णक्रमीय संकल्प के लिए आवश्यक है, जब ऐसे macromolecular प्रोटीन विधानसभाओं के रूप में जटिल लक्ष्य का सामना करना पड़ ।

    कई मामलों में एक सीमित कारक स्पेक्ट्रोमीटर उपलब्धता है । इसलिए, तैयार किए जाने वाले नमूनों का एक विवेकपूर्ण विकल्प स्पेक्ट्रोमीटर सत्र से पहले होना चाहिए । किसी भी मामले में, एक समान रूप से 13सी, 15N-लेबल नमूना एक शर्त के लिए अनुक्रमिक और अंतर अवशिष्ट प्रतिध्वनि काम प्रदर्शन है । सॉलिड-स्टेट एनएमआर तकनीकों द्वारा असाइन किए गए प्रोटीन के लिए७१देखें । उदारवादी MAS आवृत्तियों पर macromolecular विधानसभाओं के संरचना निर्धारण चुनिंदा 13सी-लेबल नमूनों की आवश्यकता है; लंबी दूरी की पहचान के लिए 13सी-13सी और 13सी-15एन संपर्कों के नमूनों पर आधारित 1, 3-13सी-और 2-13सी-gylcerol और/या 1-13सी-और 2-13सी-ग्लूकोज लेबलिंग आमतौर पर इस्तेमाल किया, के रूप में ऊपर वर्णित । दो लेबलिंग योजनाओं के बीच चुनाव वर्णक्रमीय संकेत करने वाली शोर अनुपात और संकल्प पर आधारित है । अंतर और आणविक लंबी दूरी के संपर्कों के बीच अंतर करने के लिए, मिश्रित लेबल और पतला नमूने कुशल पता चला है ।

    संक्षेप में, एक परमाणु SSNMR संरचनात्मक अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं: (i) उपइकाईयों और विधानसभा की तैयारी के लिए उत्कृष्ट नमूना मात्रा और गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है, (ii) स्पेक्ट्रोमीटर क्षेत्र शक्ति और अधिग्रहण मानकों के लिए है ध्यान से चुना; (iii) 3d संरचना निर्धारण के लिए चुनिंदा लेबलिंग कार्यनीतियों की आवश्यकता होती है और आवश्यक डेटा की मात्रा डेटा की गुणवत्ता और पूरक डेटा की उपलब्धता पर निर्भर करती है.

    अणुकणिका झिल्ली प्रोटीन से homomultimeric नैनो-वस्तुओं को लेकर प्रणालियों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अपनी प्रयोज्यता के बावजूद, SSNMR अक्सर मिलीग्राम के लिए की जरूरत द्वारा सीमित है isotopically लेबल सामग्री की मात्रा । अल्ट्रा फास्ट MAS में हाल ही में तकनीकी विकास (≥ १०० kHz) SSNMR अप करने के लिए एवेंयू खुला 1H-पाया एनएमआर, और पुश करने के लिए न्यूनतम नमूना मात्रा की सीमा उप-mg ७२,७३,७४. फिर भी, विस्तृत संरचनात्मक अध्ययन के लिए 13सी-लेबल के नमूनों अपरिहार्य है, जो इन विट्रो में इकट्ठे नमूनों के लिए या प्रणालियों के लिए SSNMR के आवेदन सीमा है कि कम माध्यम पर जीवित जीवों में व्यक्त कर रहे हैं, जहां सेल SSNMR एक उभरती हुई विधि है (समीक्षा के लिए ७५,७६,७७,७८) देखें ।

    उच्च संकल्प 3 डी संरचनाओं को प्राप्त करने के लिए SSNMR आवेदन में एक महत्वपूर्ण कारक वर्णक्रमीय संकल्प है: एक विधानसभा में आंतरिक गठन विविधता वर्णक्रमीय संकल्प और स्पेक्ट्रा विश्लेषण को सीमित कर सकते हैं । अवशेषों विशिष्ट 13सी लेबलिंग कुछ मामलों में हो सकता है एक विकल्प प्रदान करने के लिए रणनीतिक अवशेषों पर विशिष्ट दूरी की जानकारी प्राप्त करने के लिए संरचनात्मक मॉडल प्राप्त करने के लिए (हाल के उदाहरणों के लिए ७९,८०देखें) ।

    3d संरचना निर्धारण के लिए SSNMR अभी भी परिष्कृत उपकरणों पर अक्सर लंबे समय तक डेटा संग्रह समय के साथ कई डेटासेट के संग्रह की आवश्यकता है, दृष्टिकोण और प्रणाली के आधार पर कई दिनों के लिए सप्ताह के लिए एक 600-1000 मेगाहर्ट्ज (1H आवृत्ति) स्पेक्ट्रोमीटर. इसलिए, स्पेक्ट्रोमीटर समय तक पहुंच एक में गहराई SSNMR अध्ययन में एक सीमित कारक हो सकता है ।

    homomultimeric प्रोटीन सभाओं के मामले में, पर्याप्त गुणवत्ता के SSNMR डेटा के लिए अग्रणी के रूप में संरचनात्मक संयम की एक उच्च संख्या की पहचान करने के लिए 3,५७,६४,७०, SSNMR अभी भी सूक्ष्म आयामों तक पहुंच नहीं देता है । इसलिए, एक homomultimeric विधानसभा के एक de नोवो SSNMR संरचना निर्धारण में, EM या बड़े पैमाने पर प्रति-लंबाई (MPL) डेटा आदर्श SSNMR डेटा पूरक समरूपता मापदंडों प्राप्त करने के लिए. SSNMR डेटा अकेले परमाणु इंट्रा और आणविक इंटरफेस प्रदान

    SSNMR उच्च ऐसे EM या MPL माप के रूप में संरचनात्मक तकनीक के साथ पूरक है, लेकिन डेटा भी पूरी तरह से परमाणु एक्स द्वारा प्राप्त संरचनाओं के साथ संयुक्त किया जा सकता है-रे क्रि या रूपांतरित या कटा हुआ उपइकाईयों पर समाधान एनएमआर । अध्ययन की बढ़ती संख्या साहित्य में पाया जा सकता है, जहां विभिंन संरचनात्मक डेटा के संयोजन macromolecular विधानसभाओं के परमाणु 3d मॉडल निर्धारित करने के लिए अनुमति दी है (देखें प्रतिनिधि उदाहरण के लिए चित्रा 6 ) ।

    संरचनात्मक जीवविज्ञान के क्षेत्र में, SSNMR अध्ययन करने के लिए होनहार तकनीक के रूप में उभरपरमाणु स्तर पर अघुलनशील और गैर-क्रिस्टलीय विधानसभाओं, यानी परमाणु पैमाने पर संरचनात्मक डेटा प्रदान करना. इस संबंध में, SSNMR आणविक सभाओं के लिए समाधान एनएमआर और एक्स-रे क्रि के लिए लटकन है, जिसमें झिल्ली प्रोटीन उनके देशी पर्यावरण और प्रोटीन सभाओं जैसे वायरल लिफाफे, जीवाणु रेशा या amyloids, साथ ही आरएनए और आरएनए-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स (उदाहरण के लिए देखें८१) । इसके विट्रो में उच्च बहुमुखी अनुप्रयोगों और इस तरह के माध्यमिक, तृतीयक और चतुर्धातुक संरचनात्मक परिवर्तन पर नज़र रखने के रूप में सेलुलर संदर्भ में, बातचीत की पहचान परमाणु पैमाने पर साथी अणुओं के साथ सतहों (उदाहरण के लिए ८२) और इकट्ठा परिसरों के संदर्भ में आणविक गतिशीलता मानचित्रण, जटिल आणविक विधानसभाओं पर भविष्य संरचनात्मक अध्ययन में SSNMR की महत्वपूर्ण क्षमता का संकेत.

    घटक M9 माध्यम
    nacl ०.५ g/L
    KH2पो4 3 g/L
    नाHPO ६.७ g/L
    MgSO4 1 मिमी
    ZnCl2 10 माइक्रोन
    FeCl3 1 माइक्रोन
    CaCl2 १०० माइक्रोन
    मेम विटामिन मिक्स 100X 10 एमएल/एल
    13 C-ग्लूकोज 2 g/L
    15 एनएच4सीएल 1 g/L

    तालिका 1: संयोजक प्रोटीन के लिए न्यूनतम अभिव्यक्ति माध्यम की संरचना में उत्पादन ई. कोलाई BL21 कोशिकाओं ।

    Disclosures

    लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

    Acknowledgments

    यह काम ANR (13-PDOC-0017-01 से B.H. और ANR-14-CE09-0020-01 से अल) द्वारा वित्तपोषित है, "भविष्य के लिए निवेश" कार्यक्रम IdEx बोर्डो/CNRS (PEPS २०१६ to B.H.) संदर्भ ANR-10-IdEx-03-02 ते B.H., स्नेहा नमुने ला सूक्ष्म Médicale ( FRM-AJE20140630090 को अल), FP7 कार्यक्रम (FP7-पीपल-२०१३-CIG to अल) और यूरोपियन रिसर्च काउंसिल (ईआरसी) के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (ईआरसी शुरू करने के लिए अनुदान अल, समझौता सं ६३९०२०) और परियोजना " WEAKINTERACT. "

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Instruments
    NMR Spectrometer (> 11.7 Tesla) Bruker -
    triple resonance MAS SSNMR probehead  Bruker -
    SSNMR rotors 4mm Bruker K1910
    Centrifuge 5804 R  Eppendorf 5805000629
    GeneQuant 1300 spectrometer Dutscher 28-9182-13
    IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L Dutscher 228001
    MaxQ 4450 bench top orbital shaker Dutscher 78376
    Tube Revolver Agitator Dutscher 79547
    sonopuls HD 3100 Bandelin 3680
    MicroPulser electroporator Biorad 165-2100 
    mini-PROTEAN tetra cell system Biorad 165-8000
    AKTA pure system GE Healthcare 29-0182-24
    capillary microman M25 pipet Gilson  F148502
    Name Company Catalog Number Comments
    Materials
    amiconR ultra-15 sigma Z740199-8EA
    capillaries and pistons Gilson  F148112
    spatula Fisher 13263799
    Name Company Catalog Number Comments
    Reagents
    D-glucose 13C6 Sigma 389374
    Ammonium-15N-chloride Sigma 299251
    1,3 13C2 glycerol Sigma 492639
    2 13C glycerol Sigma 489484
    Kanamycin Sigma K1876
    Carbenicillin Sigma C3416
    Sodium phosphate dibasic Sigma S7907
    Potassium phosphate monobasic Sigma P5655
    Sodium chloride Sigma 71380
    calcium chloride Sigma C1016
    Magnesium sulfate Sigma 208094
    Iron Chloride Sigma 157740
    Zinc chloride Sigma 793523
    MEM Vitamin Solution (100×) Sigma M68954
    IPTG Fisher BP1755
    Trizma base  Sigma T1503
    Tricine Sigma T0377
    SDS Sigma 436143
    sodium azide sigma 71289
    4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid  Sigma 178837
    Name Company Catalog Number Comments
    Softwares
    Unicorn 6.3 GE Healthcare Akta systems
    ccpNMR CCPN  spectrometer systems

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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