3 차원 조직 설계 정렬 사이토 네트워크 발달 메커니즘을 정리 하 고 신경 재생을 촉진 하

* These authors contributed equally
Bioengineering
 

Summary

우리 쇼케이스 경도 정렬된 astrocytic somata 소설 소재 넣음 내 프로세스의 자기 조립, 3 차원 번들의 개발. 이러한 "생활 건설 기계", 아직 테스트-베드 neurodevelopmental 메커니즘을 공부 하거나 감독 신경 마이그레이션 및 axonal neuroregeneration를 용이 하 게 하 역할 수 센티미터 길이, 확장 미크론 단위 직경을 전시 설계 길입니다.

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Katiyar, K. S., Winter, C. C., Gordián-Vélez, W. J., O'Donnell, J. C., Song, Y. J., Hernandez, N. S., Struzyna, L. A., Cullen, D. K. Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration. J. Vis. Exp. (131), e55848, doi:10.3791/55848 (2018).

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Abstract

Neurotrauma 및 신경 퇴행 성 질환 자주 손실된 신경 대체 axonal 경로 재생성 하 중앙 신경 시스템 (CNS)의 제한 된 용량으로 인해 신경학 상 적자 지속 될. 그러나, 신 시스템 개발, 신경 마이그레이션 및 axonal 확장 하는 동안 자주 발생 "건설 기계 생활"로 다른 세포에 의해 형성 하는 경로 따라 합니다. 이러한 메커니즘을 에뮬레이션 circumvents CNS의 금지 환경 전략을 디자인 하 고 추구,이 원고 제공 조직 설계를 조작 하는 프로토콜 사이토 기반 "건설 기계 생활". 이러한 구조를 만들려면, 우리는 바이 폴라 경도 정렬 somata 및 프로세스의 고밀도 3 차원 번들으로 조립 자체 이다 유도 하는 소설 소재 넣음 구조 고용. 첫째, 빈 히드로 마이크로-열 조립 했다, 그리고 내부 루멘 기질-콜라겐 코팅 했다. 해리 대뇌 피 질 이다 다음의 중요 한 내부 직경, 및 원통형 마이크로 열의 루멘으로 배달 되었다 < 350 µ m, 자발적으로 자기 정렬 및 밀도 번들으로 구성 된 긴 섬유 같은 케이블을 생산 하는 계약을 체결 사이토 프로세스와 콜라겐 소 측정의 < 150 µ m 직경에 길이 몇 cm를 확장. 이러한 전시 생활 건설 기계 설계 > 97% 생존 세포와 거의 독점적으로 했다 이다 표현 하는 중간 필 라 멘 트 단백질 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP), vimentin의 조합 및 nestin의 구성. 이 사이토 네트워크 신경 첨부 파일에 대 한 관대 한 기질을 제공 하는 것을 발견 했다 고 neurite 연장 정렬 정렬. 또한, 이러한 구조에 맞춤 히드로 넣음, CNS 이식 적합 하에서 추출 될 때 무결성 유지 관리 합니다. 이러한 미리 형성한 구조는 구조적으로 자연스럽 게 발생의 주요 cytoarchitectural 요소를 에뮬레이션 "건설 기계 생활" glial 기반 에 비보. 따라서, 이러한 설계 생활 건설 기계 테스트-베드 neurodevelopmental 메커니즘에서 생체 외에서 연구 또는 신경 마이그레이션 및 CNS 변성 vivo에서 다음 axonal 길 여 neuroregeneration 촉진 역할 수 있습니다. .

Introduction

중앙 신경 조직 (CNS) 중화 손실 및/또는 신경의 외상 성 뇌 손상 (TBI), 같은 조건이 동반 axonal 경로 장애 제한 용량이 뇌졸중, 척수 상해 (SCI), 및 신경 퇴행 성 질병1 ,2,3,,45. CNS에 신생 방해 손실된 신경6,7의 복원, 두뇌에 있는 영역의 제한 된 수에 제한 됩니다. 또한, CNS에서 손실된 axonal 통로의 재생 감독된 지침의 부족, 파생물 억제제, 및 신경 조직2,8에 손상 다음 반응 astrogliosis의 존재 충분 하지 않습니다. 9,10. 이다는 일반적으로 이온 항상성, 신경 전달 물질 클리어런스, 시 냅 스 형성, 및11를 커플링 하는 혈관과 신경 지원에 다양 한 기능을가지고. 그럼에도 불구 하 고, 신경 조직에 가벼운 손상, 다음 이다 수 있습니다 받을 분자, 구조적, 기능적 변화 그들은11hypertrophic 상태 전환. 심한 neurotrauma에 대응, 이러한 변경 결과 흉터의 형성에 포함 된 마이그레이션 반응성 이다는 파열된 혈액-뇌 장벽 (BBB) microglia에서 유출 하는 백혈구를 포함 하는 병 변 코어 penumbra oligodendrocytes, 그리고 섬유 아 세포11,,1213. 이러한 반응성 이다 달성 filamentous, 비 조직 프로세스의 형태 그리고 중간 필 라 멘 트 단백질 및 신경 재생12방해 콘 proteoglycans (CSPGs)의 증가 식 전시. Glial 흉터 처음 BBB 무결성을 복원 하 고 건강 한 티슈를 에워싸는 것 염증 반응의 전송을 방지 하는 데 도움이, 비록 그것은 축 삭 재생12,14에 대 한 물리적 및 생화학 장벽 역 ,,1516. 예를 들어, glial 흉터 발생 axons 주먹코 dystrophic 성장 콘을 표시 하 고 성장12저하. 또한, 부상 후 astrocytic 프로세스의 해체는 축 삭17회생의 확장을 방해 한다. 이러한 억제 특성의 결과 종종 영구 신체적, 신경 장애 환자 겪는 심각한 neurotrauma, TBI 및 문화를 포함 한 후에 각 성

외부 직면 CNS 기능 재생에 축 삭 재생성 하는 본질적인 능력을가지고 표시 되었습니다. 예를 들어, glial 흉터 문의 dystrophic 성장 콘의 동적 특성 제안 이러한 엔딩 확장12하 그들의 능력을 유지 합니다. 따라서, 그것은 있다고 믿고 axonal 다시 성장에 주요 방해 후 부상 CNS와 감소 glial 흉터 및 흉터에서 재생 다리 것 제공을 통해 더 환경을 제공 하는 금지 환경 유리. 실제로, 이전 학문은 설명 했다 CNS 뉴런 축 삭 재생12,18에 대 한 더 많은 유리한 환경을 제시, 교량으로 주변 신경 이식 술을 사용 하 여 병 변을 통해 축 삭 연장 가능 했다 19. 여러 가지 다른 전략이 흔적 재생 능력을 악용 하 추구 되어 있다. 예를 들어 다양 한 부상 모델에서 세포 성장 신호 통로의 조작 axonal 재생 및 glial 흉터 감소10,,2021에 결과 있다. 또한, 연구 치료 chondroitinase CSPGs에 설탕 체인의 대부분을 앞, ABC CSPGs 반응 이다22분 비의 억제 효과 줄이는 나타났습니다. 도 불구 하 고 고무적인 결과, 이러한 방식을 벗어난 재생12, 잠재적으로 발생할 수 있습니다 하 고 또한 신경의 손실에 대 한 계정을 하지 않습니다 성장 콘의 지도 감독을 제공 하지 않습니다. 셀 기반 접근 시도 glial 흉터의 효과 극복 하 고 보충 손실된 세포, 특히 신경에 이용 되어 있다. 다른 CNS 병 변 축 삭 재생23,24, 을 추진 하 고 다시 상해 지역에 신경 조상 세포를 이식 하는 동안 일부 그룹 뉴런으로 반응 이다를 dedifferentiated는 그러나 25., 줄기 세포 이식 혼자 낮은 생존 율, 불 쌍 한 통합 및 손상 된 조직을5겸손 보존에 의해 제한 됩니다. 또한, 이러한 세포 기반 전략 제어 방식 특히 장거리 axonal 책자를 복원 실패. 따라서, 다른 접근에와 함께 바이오는 다양 한 신경에 대 한 배달 차량으로 탐험 되 고 조상 세포 및 성장 요인26. 소재 기반 접근 디자인 컨트롤 구문 특정 물리적, haptotaxic 모방 생산의 높은 학위와 대상 호스트 조직27의 3 차원 (3D) microenvironment chemotaxic 단서 제시 28,29,30,31,32,,3334. 이러한 환경 신호 복제는 네이티브 같은 형태학, 확산, 마이그레이션, 및 다른 neurobiological 특성29중 신호 이식된 세포에 대 한 최고입니다. 이러한 유리한 속성 시드 전통적인 셀 소재 건설 기계 넘어 발전은 동시에 감독된 장거리 axonal 재생을 촉진 하 고 손실 된 신경 세포를 대체 하는 데 필요한.

"생활 건설 기계", 다른 네이티브 neuroanatomy를 에뮬레이트하는 미리 형성한 cytoarchitecture와 살아있는 신경 세포의 존재로 인해 다른 셀 기반 접근을 설계 유망한 다른 접근은 신경 조직 기반 및 타겟된 교체, 개조, 및 신경 회로4,35의 재생을 촉진 하기 위하여 발달 기계 장치. 건설 기계 생활의 디자인에 대 한 고려 사항 포함 고기 그리고 신경 세포, 기계/물리 속성의 소스 및 생 화 확 적인 신호 어떤 동반 바이오35의 구성에 의해 결정. 제조 후 체 외에, 이러한 생활 건설 기계 이식 수 비보에 현재 세포 접착 분자 및 혈 및 科 신호 신경 세포 이동과 축 삭 가지 상태에 따라 적극적으로 규제를 하 고 재생의 진행35를처리합니다. Glial 세포는 이후 다양 한 개발 메커니즘에 vivo에서이 세포 중재 건설 기계 생활 설계 된 cytoarchitecture에 대 한 기준으로 사용할 수 있습니다. 두뇌 개발, 새로운 신경 세포 기저 프로세스 개발 외피 격판덮개로 심 실 영역에서 방사형 명과 감독된 마이그레이션36,37건설 기계 생활으로 확장에 의존 합니다. 또한, 콘은 도표 glial 세포, elicited 매력적이 고 구 충 제 신호를 감지 하 여 스스로 방향을 표시 하 고 소위 "개척" 축 삭 성장 확장 제안 하 고 폐해 미리 패턴을 따라 확장 하 여 올바른 목표 도달 35,,3839투어 따라서, glial 세포는 축 삭, 나중으로 축 삭을 기반으로 봉사 하는 개척의 지도에 필요한 "건설 기계 생활" "추종자" 축 삭의 투영을 직접. 또한, 명과 중재 성장 메커니즘 표시 되었습니다 유지 postnatally, neuroblasts 따라 rostral 철새 스트림 (RMS) 帯 (SVZ), 성체 뇌에서 신생의 몇 가지 남아 있는 분야 중 하나에서 탐색 하는 후 각 전구 (OB)40. RMS에서이 neuroblasts 경도 정렬 astrocytic 프로세스, 직접 셀 유착을 통해 이루어진 고 성 요인37, 지역화 glial 튜브 (그림 1A-1), 내 마이그레이션 41. 마지막으로, 포유류 원인에 CNS 손상 중단 astrocytic 프로세스 배열 axonal 재생17를 물리적으로 방해 glial 흉터를 형성 하는 동안 많은 비 포유류 시스템 부족 해로운 glial 흉터의 형성. 오히려, 비 포유류 종의 glial 세포 유지 더 조직, 부상된 지역17,,4243를 통해 가이드로 사용 되는 패턴을 정렬 합니다. 예를 들어, 비 포유류 과학 모델에서 축 삭 glial 다리 건너 기판 axonal 재생과 기능 회복 (촉진으로 조직 된 폐해 건설 기계에 대 한 중요 한 역할을 제안 하는 병 변와 가까운 협회에서 성장에 표시 됩니다. 그림 1A -2) 42 , 44 , 45. 신경 해부학 기능 및 위에서 설명한 발달/재생 메커니즘의 재현 부 동시에 미 숙 신경 마이그레이션 구동할 수 조작된 폐해-기반 생활 장비의 새로운 클래스를 얻을 수 있습니다 및 axonal 그렇지 않으면 비 허용 환경, 그로 인하여 잠재적으로 신경의 효과 완화를 통해 길 및 축 삭으로 변성 CNS 상해 및 질병과 관련 된.

연구 그룹은 이전 여러 종류의 재건을 위한 건설 기계 생활 설계 및 CNS와 말 초 신 경계 (PNS) 마이크로 조직 통해 axonal 책자의 재생 신경 네트워크 (마이크로-TENNs) 및 조직 설계 신경 이식 (TENGs), 각각27,,4647,48를 설계. 두 전략 biomimicry에 근본적으로 근거한 다. 마이크로-TENNs는 해부학 영감 구조 구조적 및 기능적으로 연결 하는 뇌의 뚜렷한 신경 인구 axonal 책자를 대체 하도록 설계 되었습니다. TENGs 축 삭 촉진 axonal 중생, 타겟된 호스트 axonal 재생35,,4648를 달성 하기 위해 "선구자" 축 삭을 따라 "추종자" 축 삭 성장에 의해 exemplified의 개발 메커니즘을 악용 합니다. 우리는 최근 생활 발판의 다양성에 대문자로 기술 개발을 통해 제시 하는 마이크로 TENNs로 비슷한 넣음 스키마를 사용 하 고 명과 기반 메커니즘에서 영감을 추구. 여기, 우리는 히드로 마이크로 열49의 collagenous 루멘에 걸친 정렬된 astrocytic 번들으로 구성 된 구조를 개발 했다. 이러한 astrocytic 생활 건설 기계 만들 해당 직경의 하는 외경 (OD) 및 내경 (ID)와 함께 빈 원통형 히드로 액체 agarose는 모 세관 튜브-침술 바늘 어셈블리를 작성 하 여 개발 되는 튜브와 바늘, 각각. Agarose 겔 화와 히드로 마이크로 열 모 세관 튜브에서 추출, 빈 내부는 유형 나 사이토 접착을 위한 관대 한 환경을 제공 하는 콜라겐 코팅 및 정렬 번들 형성 (그림 1B -1)입니다. 이후에, 루멘은 대뇌 피 질 이다 출생 후 쥐 새끼 (그림 1B-2)에서 절연 된 시드. 2 차원 (2D) 정렬 기법 (ECM) 단백질 패턴, 전기 분야, micropatterned 홈 및 세포 외 매트릭스의 응용 프로그램에 의존 하는 생활 발판에서 사이토 맞춤 반대로 기술에 의존 자기 조립 제어 변수 같은 기판 곡률 (열 ID), 셀 밀도 및 콜라겐 농도50,,5152에 따르면. 이다 계약, 콜라겐을 리 모델링 하 고 바이 폴라, 경도 정렬 형태에서 관찰 vivo에서 (그림 1B-3) 자연 건설 기계와 유사한 취득. 실제로, 우리는 적극적으로 추구 하 고이 케이블 같은 구조를 사용 하 여 미 성숙한 신경 세포 이주 특히 손상 된 CNS의 불리 한 환경을 통해 axonal 재생 촉진의 대상된 지도 대 한 실제 기판으로 포유류 glial 흉터 (그림 1C). 이 문서는 astrocytic 마이크로-열에 대 한 자세한 제작 방법을 제시, 단계 예상된 cytoarchitecture의 현재 한계에 대 한 포괄적인 토론 명암과 면역 형광 이미지 및의 미래 방향에 기술입니다.

Figure 1
그림 1: 영감, 제조 프로토콜 및 정렬된 Astrocytic 네트워크에 대 한 제안 된 응용 프로그램. (A) Neurobiological 영감: neurogenic 帯 (SVZ)에서 발생 하는 (1) Neuroblasts 후 각 전구 (OB); 향해 감독 마이그레이션 rostral 철새 스트림 (RMS)에 경도 정렬된 glial 관 활용 (2) 비-포유류 양서류, 물고기 등 신경 조직의 병 변 (예: transected 척수)의 끝을 연결 하 고의 지도 위한 비 계 역할 glial 다리의 형성으로 인해 일부 손상 후 재생을 유지할 수 있는 축 삭 재생 (B) 제조 개요: ECM, 코팅 루멘과 미크론 크기, 빈 히드로 마이크로 열의 건설 (1) (2) 기본 외피 이다 출생 후 쥐 새끼, 경도 중심의 (3) 자기 조립에서 고립의 시드 문화와 미래 이식 연구 소재 넣음에서 번들의 (4) 추출에서의 번들 (C) vivo에서 응용 프로그램: (1) 이러한 생활 건설 기계 신경 결핍 지역; 다시 neurogenic 센터에서 감독된 신경 마이그레이션에 대 한 설계 glial 튜브 역할을 수 있습니다 (2) 축 삭 지도 개척의 발달 메커니즘 및 비 포유류에서 glial 교량의 재생 메커니즘의 재현 부 비 허가 걸쳐 축 삭 재생을 직접 수 용량을 가진이 astrocytic 건설 기계를 부여 수 있습니다. 포유류 glial 흉터의 환경입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Protocol

모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 펜실베니아 대학의 마이클 J. Crescenz 노 병 사변 의료 센터에 의해 승인 되었고 자비 롭에 NIH 공중 보건 서비스 정책에 명시 된 지침을 준수 관리 및 실험실 동물 (2015)의 사용 합니다.

1. 개발의 Agarose 히드로 마이크로-열

  1. Agarose의 3 g의 무게와 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (DPBS) 100 mL를 포함 하는 메 마른 비 커에 전송 agarose 3% 무게/볼륨 (w/v) 솔루션을 확인 합니다. 비이 커에 살 균 자석 막대를 추가 하 고 핫 플레이트/활동가의 표면에 놓습니다. 다음 단계에서 내용물의 증발을 방지 하기 위해 적용 하는 비 커를 유지.
  2. Agarose 및 DPBS 100 ° C의 온도에서 열 하 고 60-120 rpm에서 저 어 합니다. 필요에 따라 이러한 설정을 조정 하 고 솔루션은 agarose는 완전히 해산 되었습니다 의미 명확한 모양 불투명에서 처음 변경 끊임없이 해체 과정의 진행을 모니터링 합니다.
    주의: 뜨거운 비 커와 솔루션은!
  3. Agarose 솔루션 열 자극으로 4 개의 빈 10 cm 배양 접시를 검색 하 고 그들의 2 DPBS의 20 mL를 추가 합니다. 침술 바늘을 배치 (직경: 300 µ m, 길이: 40 m m), microliter 모 세관 튜브 유리 (직경: 701.04 µ m, 길이: 65 mm, 용량: 25.0 µ L), 그리고 biosafety 캐비닛 안에 전구 디스펜서. 때 액체 agarose 솔루션 지웁니다, 유지 관리 일정 약 50 ° C에서 난방는 agarose의 겔 화를 피하기 위해 교 반 합니다.
  4. 침술 바늘 전구 디스펜서의 하단 오프닝으로 소개 합니다. 외부에 노출 하는 바늘을 통해 모 세관 튜브를 삽입 합니다. 모 세관 튜브 전구 디스펜서 실린더의 고무 부분에 그것의 일부를 입력 하 여 보안.
  5. 빈 페 트리 접시의 표면에는 micropipette와 액체 agarose의 1 mL를 전송 하 고 전구 디스펜서의 고무 캡을 안쪽으로 슬쩍 되는 동안 agarose, 접촉 모 세관 튜브의 한쪽 끝을 수직 (바늘 삽입)으로 장소. 천천히 압력을으로 그리는 agarose 모 세관 튜브 전구 디스펜서 모자에 놓습니다.
    참고: 모 세관 튜브로 액체 agarose의 양도 빠르게 수행 되어야 합니다. 액체 agarose 남아 있는 경우 충분 한 시간 동안 배양 접시 표면에 냉각 (약 60 s), 모 세관 튜브를 따라 agarose의 적당 한 suctioning 방지 젤, 시작.
  6. 장소 각 전구 튜브 바늘 조립 무료 페 트리 접시에 하자는 agarose 젤 모 세관 튜브 내부 강화 위한 5 분 신중 하 게 전구 디스펜서 실린더에서 고무 마 개에서 손으로 모 세관 튜브를 당겨 바늘을 떠나와 agarose 젤 튜브 내부.
  7. 모 세관 튜브; 천천히 당겨 침술 바늘을 수동으로 추출 새로 응고 agarose 실린더는 또한 아직도 바늘을 둘러싼이 절차에서는 튜브 슬라이드. 부드럽게 침술 바늘 끝에 이동 소독 집게의 끝에와 함께 따라 마이크로 열을 슬쩍 찌 르다. 오픈, 포함 하는 DPBS 페 트리 접시에 바늘을 놓고 집게는 DPBS에 마이크로 열 밀어.
    참고: agarose 마이크로 열 침술 바늘의 제거에 따라 유리 모 세관 튜브 내 경우, 천천히 agarose 마이크로 열 모 세관 튜브 25 mm 게이지 바늘으로 및 밀 DPBS 함께 그릇에.
  8. Microscalpels 또는 뜨거운 비드 소독 기를 사용 하 여 집게를 소독. Agarose의 4 g의 무게와 DPBS의 100 mL에 전송 하 여 4 %w / v agarose를 확인 합니다. 가 열 하 고 명확한 4% 액체 agarose 솔루션을 1.2 단계에 설명 된 대로 저 어. 가 열 하 고 다음 단계를 통해 솔루션의 감동 유지.
  9. 절 개 후드에 마이크로 열을 포함 하는 배양 접시를 전송 고 빈 페 트리 접시를 미세 집게와 마이크로 열을 이동 합니다. 시각적 안내 stereoscope 및 microscalpel 마이크로 열 원하는 길이로 잘라 이용 한다. ECM 및 셀 추가 동안 마이크로 열 처리를 용이 하 게 하는에 수평에서 45o 각도에서 입체 형태로 끝에 양쪽 끝을 잘라.
  10. 이전 같은 페 트리 접시에 더 많은 마이크로 열 3에 대 한 단계와의 분리와 동시에 4 개의 구문 줄 반복 < 실린더의 각각 사이 3 m m. 4 %agarose micropipette 솔루션의 50 µ L을 로드 하 고 액체의 행진/라인을 연결 하 고 4의 그룹으로 구문 번들 마이크로 열 배열 붓는 (약칭 이라고 "마이크로 열 배"). 4 %agarose 구문 사이의 거리를 최소화 하 고 얇은 라인에는 agarose를 신속 하 게 추가 하는 방법으로 인테리어를 방해할 수 있습니다 마이크로 열의 끝의 움직임을 피하십시오.
    참고: astrocytic 건설 기계를 조작 하 하지 필요 "배"로 4 개의 마이크로 열 그룹을 정렬 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 보트 제공 제조 과정을 촉진 하 고 이동 하 고 마이크로-나중 단계에서 열 처리 하는 안전한 방법을 제공 합니다.
  11. 1-2 분 추가 4 %agarose 겔 화를 허용에 대 한 마이크로 열 배 식 지. 연결 4 %agarose 좋은 집게와 마이크로 열 보트를 선택 하 고 다른 포함 하는 DPBS 페 트리 접시에 준비 단계 1.1.3에서에서 마이크로 열 이동. 원하는 대로 나머지 마이크로 열 더 보트를 조작.
  12. 마이크로 열 및/또는 보트 biosafety 내각을 포함 하는 배양 접시를 이동 하 고 30 분 동안 자외선 (UV)에 노출 된 소독.
    주의: 자외선에 노출을 방지 하기 위해 적절 한 보호를 착용 하십시오.
  13. ECM 추가 및 셀 도금 즉시 발생 하지 것입니다 경우 4 ° C에서 마이크로 열 보트와 요리 DPBS에 저장 후, 1 주까지. 이 기간 동안 구문을 사용 하지 않는 경우 마이크로 열 제조 단계를 반복 합니다.

2. 1 차 세포 배양 및 절연

  1. 쥐 새끼에서 대뇌 피 질의 사이토 격리
    1. 다음 단계에 대 한 준비, 행 크의의 20 mL 균형 소금물 (HBSS) 해 부 조직에 대 한 저수지 역할을 하는 4 개의 10 cm 배양 접시를 추가 합니다. 얼음에 모든 요리를 유지. 깨끗 한 수술가 위, 집게, 마이크로-주걱, 그리고 마이크로-scalpels 뜨거운 비드 소독 기에 소독.
    2. Prewarm 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)와 0.15 mg/mL deoxyribonuclease (DNase) 0.25% trypsin HBSS 37 ° c.에 있는 나 또한, prewarm의 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 햄의 F-12 영양소 혼합물을 구성 하는 37 ° C에서 사이토 문화 매체.
    3. 저체온증이 조건에 그들을 노출 하 여 출생 후 하루 0 또는 1 일 Sprague-Dawley 쥐 새끼를 anesthetize 하 고 잘린 여 안락사. 핀 19 m m를 사용 하 여 단계에 머리 눈 앞쪽 주 둥이 바늘 게이지.
    4. 눈 바로 뒤에 까지의 목의 기지에서 앞쪽에 후부 중간에서 내려 메스로 절 개를 확인 합니다. 옆에서 눈 아래쪽, T 자형을 형성 뒤에 직접가 하는 또 다른 절 개를 실시 합니다. 미세 집게를 사용 하 여 측면에 두개골 피부/해골 챌.
    5. 외부 표면에 다른 동물의 입에 (위로 향하도록)는 집게의 한 단자를 배치 하 여 주 둥이로 머리를 잡아. 살 균 마이크로-주걱으로 두뇌를 제거 하 고 냉장된 HBSS 가득 배양 접시 중 하나에 그것을 배치. 곳이 페 트리 접시 얼음에 즉시 이후에 그리고 모든 경우에서 제외 하 고 시간.
    6. 절 개 후드 내부 stereoscope-20 ° C에 이전 저장 된 화강암 블록을 놓으십시오. 해 부 절차 동안 그것의 낮은 온도 유지 하기 위해 화강암 블록의 표면에 뇌 조직으로 페 트리 접시를 놓습니다. 다음 단계에 걸쳐 시각적 지침으로는 stereoscope를 사용 합니다.
    7. 후 각 전구 그대로 남아 있으면 집게 또는 microscalpels 그들을 절단 하 여 추출. 또한, 소 뇌를 제거 하 고 두 개의 대뇌 반구를 분리 하는 중간 선 절 개는 microscalpel를 사용 합니다. 신선, 냉장 HBSS 포함 된 배양 접시에 집게를 가진 반구를 전송.
    8. 분리 된 외피가를 microscalpel으로 반구의 내부에서 midbrain 구조를 해 부. 고급 포 셉을 사용 하 여 대뇌 피 질의 조직에서 meninges, 시트와 같은 구조를 벗기다 절연된 외피가 찬 HBSS로 새로운 배양 접시에 전송. microscalpel를 사용 하 여 다음 단계에서 트립 신 행동에 대 한 표면적을 증가 하기 위하여 직물을 말하다.
    9. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 prewarmed 트립 신-EDTA (각 관에서 8 외피가)의 4 mL를 포함 하는 15 mL 원심 분리기 튜브에는 외피가 전송. 트립 신-EDTA 37 ° c.에 5-7 분 동안에 대뇌 피 질의 조직 노출
    10. 파스퇴르 피 펫, 신중 하 게 제거 하는 트립 신-EDTA와 0.15 mg/mL DNAse의 400 µ l을 추가 내가 원심 분리기 튜브에 솔루션. 모든 조직의 해리는 액체에 있는 아무 나머지 조직 조각 때까지 튜브 또는 소용돌이 교 반 하십시오. 완전히 조직 분해 불가능, 파스퇴르 피 펫의 끝을 가진 나머지 조각을 제거 합니다.
    11. 원심 분리기 튜브 200 x g 3 분에 해리 셀 솔루션을 포함 하는 셀을 방해 하지 않고 파스퇴르 피 펫과 상쾌한을 제거 합니다. (2.1.2 단계에서 정의 된) 사이토 문화 매체의 1 mL는 micropipette와 튜브를 추가 하 고 resuspend 균질 솔루션을 선동.
    12. T-75 플라스 크에 10 mL 혈 청 학적인 피 펫과 사이토 문화 매체의 전송. 플라스 크 당 셀의 가치가 한 강아지 뇌 접시를 플라스 크에는 micropipette 1 mL 셀 솔루션 (단계 2.1.11에서에서 준비)의 250 µ l를 추가 합니다. 문화 매체를 통해 방전된 셀 솔루션을 균등 하 게 배포 하 고 부드럽게 더 동등한 배급을 홍보 하기 위해 플라스 크를 선동.
    13. 37 ° C, 5% CO2습도 인큐베이터에서 도금된 플라스 크 문화. 도달 후 24, 72 h 문화에, 기계적으로 교 반 하십시오 신경 및 oligodendrocytes와 같은 비 부착 세포 유형 분리를 플라스 크.
    14. 나중에, 각각이 timepoints의, 미디어 변화를 수행 합니다. 그래서 문화 미디어 준수 셀 취재 플라스 크의 하단에 거짓말 플라스 크를 수직으로 잡으십시오. 배양 세포를 추출 하는 피하기 위해 플라스 크의 하단 모서리에 대 한 피 펫의 끝을 누르면 파스퇴르 피 펫과 발음 원래 수평 위치에 플라스 크를 놓고 부드럽게 셀 혈 청 학적인 피 펫을 통해 사이토 매체의 10 mL를 추가 합니다.
    15. 각 미디어 변경 후 인큐베이터에 있는 플라스 크를 반환 합니다. 90 %confluency 달성 후 기계적으로 어떤 나머지 비 준수 세포를 제거 하는 한 번 더 플라스 크를 교 반 하십시오.
    16. 진공 청소기와 파스퇴르 피 펫 문화 매체를 취 함으로써 통행에 이다. 준수 셀에 0.25 %trypsin-EDTA와 혈 청 학적인 피 펫의 5 mL를 추가 합니다. 부드럽게 모든 셀을 처리 하는 트립 신을 보장 하기 위해 플라스 크를 선동 하 고 37 ° C, 5% CO2에 5-7 분 동안 플라스 크를 품 어.
    17. 사이토 매체의 1 mL 혈 청 학적인 피 펫과 셀을 추가 하 여 트립 신을 끄다. 혈 청 학적인 피 펫과 플라스 크에서 셀 솔루션을 추출 하 고 살 균 15ml 원심 관에 그것을 전송. 3 분 x 200g에 튜브 원심
    18. 혈 청 학적인 피 펫과 상쾌한을 제거 하 고 사이토 문화 매체의 1 mL에 resuspend. 셀 솔루션은 균질 되도록 튜브를 교 반 하십시오. hemocytometer 또는 자동 셀 카운터 솔루션에서 셀의 개수를 계산 합니다.
      참고: 일반적으로 90% 합칠은 플라스 크 수율 약 3 백만 이다.
    19. T-75 플라스 크에 사이토 문화 매체의 10 mL를 추가 합니다. 1:4 희석 이미 문화 매체를 포함 하는 T-75 플라스 크에는 micropipette와 셀 솔루션 (단계 2.1.18)의 250 µ l를 전송 하 여 수행 합니다. 부드럽게 플라스 크의 표면에 걸쳐 균일 셀 분배 되도록 교 반 하십시오.
    20. 90 %confluency 셀 통로를 얻을 때마다 2.1.16-2.1.19 단계를 반복 합니다.
  2. 쥐 태아에서 대뇌 피 질의 신경 절연
    1. 유사한 준비 단계로 2.1.1, 2.1.2, prewarmed 미디어 공동 문화 미디어, Neurobasal 매체 (신경)에 대 한 2 %B-27 보충 + (이다)에 대 한 1 %G-5 혈 청 무료 보충 + 0.25%의 구성 된 예외와 함께 따라 L-글루타민.
    2. 이산화탄소 질 식과 타임-임신 배아 하루 18 Sprague-Dawley 쥐를 안락사 고 죽음 잘린 합니다.
    3. 쥐 태아를 추출 하 고 페 트리 요리 HBSS 집게53 , microscalpel, 및 소독된가 위, 영상 지도 stereoscope를 사용 하 여 냉장된 화강암 블록의 표면에 대뇌 조직의 나머지에서 외피가 해 부 . 머리, 두뇌, 대뇌 반구, 외피가의 연속 해 부, 후 각 조직 새로운 HBSS 가득 페 트리 접시에 전송 합니다.
    4. 트립 신에 대 한 표면 영역을 증가 하는 더 작은 조각으로 대뇌 피 질의 조직을 말하다. 양도 파스퇴르와 함께 4-6 외피가 prewarmed 트립 신-EDTA의 5 mL 튜브에 플라스틱 및 조직 분리를 37 ° C에서 유지. 5-7 분 수동으로 교 반 하십시오 혼합 하 고 조직의 응집 방지 튜브.
    5. 10 분 후 37 ° C에서 튜브를 제거 합니다. 앞에서 설명한 단계 2.1, 트립 신-EDTA를 추출 하 고 0.15 mg/mL DNAse 솔루션의 1.8 mL로 대체. 나중에, 소용돌이 솔루션까지 조직이 나타납니다 균질, 액체에 떠 있는 아무 조직 파편.
    6. 200 x g 3 분에 해리 조직 솔루션 원심 제거한 후에 상쾌한, 공동 문화 매체의 2 mL에 resuspend. hemocytometer 또는 자동 셀 카운터와 함께이 솔루션에는 셀의 수를 계산 합니다.
      참고: 일반적인 수익률은 3.0-5.0 x 106 셀/대뇌 반구.
    7. 위에 정의 된 공동 문화 미디어에서 105 셀/mL x 2.0-4.0의 밀도와 새로운 셀 솔루션을 준비 합니다.

3. 마이크로 열 내부 Astrocytic 케이블의 개발

  1. ECM 코어 제조
    참고: ECM 히드로 마이크로 열 내부에 있는 셀 시드 수행 됩니다 같은 날에 추가할 수 있다.
    1. Biosafety 내각, 내부 준비 1 mg/mL 쥐 꼬리의 솔루션 유형 I 교원 질 살 균 microcentrifuge 관에서 공동 문화 매체에. 사용 때 제외 하 고 모든 시간에 얼음에 ECM 솔루션 microcentrifuge 튜브를 유지 합니다.
    2. 1-2 µ L의 pH를 추정 하는 리트머스 종이의 스트립에 micropipette와 ECM 솔루션의 전송. 1 N 수산화 나트륨 (NaOH) 또는 염 산 (HCl)를 ECM 솔루션의 pH를 각각 늘리거나 micropipette와 1 µ L을 추가 하 고 균질을 위쪽 및 아래쪽 플라스틱. 새로운 pH 리트머스 종이 스트립을 확인 하 고 pH 7.2-7.4 범위에서 안정 될 때까지 필요에 따라 더 많은 산 성 또는 자료, 추가.
    3. 절 개 후드를 페 트리 접시 1.2 단계에서 이동 하 고 멸 균 미세 집게는 빈, 살 균 35 또는 60 mm 페 트리 접시에 4-5 마이크로-열 또는 보트 전송. 지도 stereoscope를 사용 하 여, 각 마이크로 열 및 빈 DPBS 및 공기 거품의 루멘을 흡입의 한쪽 끝에서 micropipette의 10 µ L 팁을 놓으십시오. 다음 단계에서 추가 된 ECM 루멘에서 자유롭게 흐를 수 있도록 stereoscope와 공기 방울의 부재를 확인 합니다.
    4. P10 micropipette ECM 솔루션, 장소 10 µ L 히드로 마이크로-열의 한쪽 끝에 대 한 팁과 루멘 (약 3-5 µ L), 관찰은 stereoscope와 ECM의 항목을 채우기 위해 충분 한 솔루션을 제공 충전. 마이크로 열의 양쪽 끝에 ECM 솔루션의 작은 저수지 (2-4 µ L) 플라스틱.
      참고: 항상 4-5 마이크로-열을 관리 하거나이 마이크로 열 구조의 crumpling 발생할 수 있으므로 방지 하기 위해 한 번에 하나의 보트 구문, 건조를 연장 합니다. 완전히 말린된 마이크로-열 셀 시드를 위한 그들의 사용을 방지 하는 접시의 표면에 단단히 연결 합니다. 이 아래에 설명 된 잠복기 동안 흐름 ECM을 일으킬 수 있기 때문에 (수 분 측정)으로 공동 문화 미디어의 과도 한 양의 마이크로 열에 추가할 수 없습니다.
    5. 열 부 화 하는 동안 밖으로 건조 하지 않도록 습도 싱크를 제공 하기 위해 페 트리 접시 주위에 반지에서 피 펫 공동 문화 미디어. 포함 하는 포함 하는 ECM 마이크로-열 신경 또는 이다 추가 하기 전에 콜라겐의 중 합을 촉진 1 h 37 ° C, 5% CO2 배양 접시를 품 어.
      참고: ECM 빈 루멘의 내부 표면에 코팅 층을 형성 한다 보다는 오히려 고체 ECM 코어 내부를 포괄, 둘 다 관찰 될 수 있다는 stereoscope를 사용 하 여. ECM는 코어를 형성, 층만 남아 때까지 잠복기를 계속 합니다. 이 층으로 형성, 사이토 셀 솔루션 도금 단계에서 마이크로 열 내부를 채울 수 있습니다.
    6. (아래와 같이) 인큐베이션 기간 동안 사이토 셀 솔루션을 준비 합니다.
  2. 사이토와 신경 마이크로 열에 뿌리기
    1. 통로 (사이 네 번째 및 12 번째 통로) 도금된 이다 단계 2.1.16-2.1.19에 설명 된 대로. 플라스 크에 세포의 수를 계산 후 셀 문화 미디어에 9.0 12.0 x 105 셀/mL 해결책의 조밀도에 셀 솔루션을 준비 합니다.
    2. stereoscope 사용 하 여, P10 micropipette의 팁 마이크로 열의 한쪽 끝에 놓고 완전히 그것을 채우기 위해 루멘으로 충분 한 셀 솔루션 (~ 5 µ L)를 전송 합니다. ECM와 위에 다, 각 마이크로 열의 양쪽에 셀 솔루션의 작은 저수지를 추가 합니다.
    3. 1 h는 ECM 이다 부착 홍보를 위한 37 ° C, 5% CO2 배양 접시에 도금된 마이크로 열 품 어. 신경 마이크로 열에 추가 되지 것입니다, 만약 3.2.5 단계를 진행 합니다.
    4. 초기 잠복기, 다음 1-2 µ L는 stereoscope 아래 관찰 하는 동안 단계 2.2.7 micropipette와 마이크로-열의 양쪽 끝에서에서 얻은 대뇌 피 질의 뉴런 솔루션의 추가. 충분 한 미디어, 건조 방지 하 고 신경 세포의 접착을 위한 수 있도록 37 ° C, 5% CO2 에서 40 분 다시 품 어를 요리에 존재 하는 확인 하십시오.
      참고: 대뇌 피 질의 뉴런 솔루션 또한 추가할 수 있습니다 신중 하 게 문화 미디어는 micropipette와 페 트리 접시에서 제거 후 단계 3.2.4 수행 번들 형성 후 1-2 일.
    5. 부 화 후 기간, 신중 하 게 작성 접시 각각 35 또는 60 mm 페 트리 접시를 위한 공동 문화 미디어의 3 또는 6 mL와 함께 도금된 마이크로 열을 포함 하는. 문화 홍보를 37 ° C, 5% CO2 도금된 마이크로 열 유지는 6-10 h 후 번들, 케이블 같은 구조를 형성 해야 정렬된 astrocytic 번들의 자기 조립.
  3. 사이토 케이블 아키텍처의 안정화
    참고: 번들의 형성, 후 구조, 경작의 대략 6-12 h astrocytic 장비의 정렬 구조의 붕괴를 방지 하기 위해 다음 단계를 수행 합니다.
    1. 살 균 microcentrifuge 관에서 3 mg/mL 쥐 꼬리 콜라겐 준비 나 공동 문화 미디어에서 솔루션. 7.2-7.4 단계 3.1.2에에서 설명 된 절차에 따라 솔루션의 pH를 조정 합니다. 때 사용에서 얼음에 콜라겐 재고 및 공동 문화 미디어를 유지 하 고 모든 시간에 얼음에 준비 된 콜라겐 솔루션을 배치.
    2. 접시는 micropipette, 마이크로 열의 수 분을 보장 하는 습도 싱크를 만들려고 접시의 측면에 몇 가지 미디어를 떠나와 astrocytic 건설 기계를 포함 하는에서 미디어를 제거 합니다. 시각화에 도움 stereoscope 아래 접시를 놓습니다.
    3. Micropipette, 시각적 지도 stereoscope를 사용 하 여 마이크로 열의 각 끝에 2-3 µ L 콜라겐 솔루션 및 방전의 소요. 접시는 접시의 가장자리 주위 습도 싱크 역할을 양쪽 주변 충분 한 미디어 다는 것을 확인 하십시오. 새로 추가 된 콜라겐의 겔 화를 촉진 하는 습도 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO2 시 30 분에 대 한 마이크로 열으로 페 트리 요리를 품 어.
    4. 천천히 3 또는 6 mL 공동 문화 미디어의 추가 (35 또는 60 mm 페 트리 접시, 각각)는 배양 하는 피 펫으로 요리 하 고 37 oC, 5% CO2에서 습도 인큐베이터에서 요리 문화.

4. 하이드로 겔 내부에서 Astrocytic 번들의 추출

  1. 유리 coverslips 오토 클레이 브에서 소독. 살 균 세포 문화 학년 물에 폴 리-L-리 신 (PLL)의 20 µ g/mL 솔루션을 준비 합니다.
  2. Biosafety 내각, 내부 수동으로 멸 균 10 cm 배양 접시를 멸 균된 유리 coverslips를 전송 하 고는 coverslips를 충당 하기 위해 충분 한 PLL 솔루션을 추가 합니다.
  3. PLL 솔루션 코트 표면에 37 ° C에서 30 분으로 덮여 coverslips를 품 어. 제거는 파스퇴르 피 펫과 PLL 솔루션 30 분 린스 후 세 번은 coverslip 셀 문화 학년 물 추가 파스퇴르 피 펫과 그것을 제거 하 여.
  4. 정렬 된 폐해 번들의 형성 후 멸 균 미세 집게와 멸 균 페 트리 접시에 섬세 하 게 마이크로 열을 전송 및 탈수를 방지 하기 위해 번들 건강 보장 micropipette 공동 문화 미디어의 10 µ L의 작은 수영장을 추가. 살짝 당겨 한쪽에서 시각적 지도 stereoscope를 사용 하 여 메 마른 외과 집게와 히드로 마이크로 열에서 astrocytic 번들을 추출 합니다.
  5. 집게와 astrocytic 번들을 들고, PLL 코팅 coverslip에 탑재 합니다. 수정 하 고 아래 프로토콜 얼룩.

5. 생체 외에서 연구 Immunocytochemistry

참고:이 연구를 위해 1 차 항 체 했다 토끼 안티 glial 산 성 fibrillary 단백질 (GFAP) (1: 500), 안티-β-tubulin III (1: 500) 마우스, 나 (1: 500), 마우스 안티 nestin (1: 200), 그리고 토끼 안티-vimentin (1: 100) 방지 콜라겐 토끼. 2 차 항 체 되었고 당나귀 반대로 마우스 568, 당나귀 안티 토끼 568, 당나귀 안티 토끼 488, 당나귀 반대로 마우스 568 (모두 1: 500). 모든 경우에, 충분 한 양의 각 솔루션 완전히 커버 마이크로 열을 추가 합니다.

  1. 화학 증기 두건 안쪽 1 x DPBS에서 4% 볼륨/볼륨 (v/v) 포름알데히드 솔루션을 준비 합니다.
    주의: 포름알데히드, 발암 성 것으로 알려져 독성 화합물 이며, 별도 용기에 폐기 해야 합니다. 항상 화학 증기 두건 안쪽이 화합물을 조작 하 고 실험실 외 투, 안전 안경, 장갑 등 개인 보호 장비 (PPE)를 활용 합니다.
  2. 마이크로 열 경우 실수로 히드로 실린더를 suctioning 없이 파스퇴르 피 펫과 구조를 포함 하는 배양 접시에서 배양을 삭제 합니다. 마이크로 열 또는 탑재 된 coverslips (둘 다는 접시에 남아)를 충당 하기 위해 충분 한 포름알데히드 솔루션 추가 18-24 ° c.에 35 분 동안 품 어
  3. 고정된 마이크로 열 또는 혈 청 학적인 피 펫과 coverslips에서 4.0% 포름알데히드 용액을 추출 합니다. 신속 하 게 추가 하 고 두 번 PBS를 제거 하 고 다음 10 분 3 시간 담가 내버려 하 여 고정 된 마이크로-열 세 번 PBS 씻어.
  4. 4 %v / 준비 용 매로 NHS 솔루션을 사용 하 여 0.3 %v / v의 농도에서 비 이온 세제로 솔루션에 대 한 농도 대 한 PBS에 정상적인 말 혈 청 (NHS)를 분해.
  5. 마이크로 열 이나는 피 펫과 coverslips를 포함 하는 배양 접시에서 PBS를 제거 합니다. 마이크로-열/coverslips 세포를 permeabilize를 18-24 ° C에서 60 분을 충당 하기 위해 충분 한 0.3% 세제 솔루션을 추가 합니다.
  6. 꺼내 세제 솔루션, 그리고 린스 신속 하 게 두 번 PBS와 3 시간 5 분 4 %NHS 필요한 볼륨 및 주 항 체의 각 계산에 몸을 담글 하 여 원하는 항 체 농도와 솔루션을 준비 하.
  7. 배양 접시에서 PBS를 제거 하 고 충분 한 1 차적인 항 체를 추가 (4%에 희석 NHS DPBS) 마이크로 열 또는 추출 된 astrocytic 번들 커버 솔루션. 품 어 4 ° c.에 하룻밤 (12-16 h)
  8. 1 차적인 항 체 솔루션을 꺼내와 PBS와 3 시간 5 분 동안 몸을 담글 하 여 신속 하 게 두 번을 씻어. 1: 500의 희석에 4.0% 보 건국 솔루션에 있는 각 항 체와 함께 어둠 속에서 이차 항 체 솔루션을 준비 합니다.
  9. 2 h 18-24 ° c.에 대 한 2 차 항 체 솔루션에 포함 된 셀을 품 어 외피의 전체 시간에 걸쳐 접시 알루미늄 호 일로 빛에 노출을 피하기 위해 마이크로 열을 포함 하는 커버.
  10. 이차 항 체 솔루션을 제거 하 고 핵 얼룩을 18-24 ° C에서 10 분 동안 Hoechst 솔루션 (1:10, 000)를 추가 합니다.
    주의: Hoechst 발암 물질로 처리 해야 하는 알려진된 등재 이다. 따라서, 그것은 별도 용기에 폐기 해야 하 고 보호구를 사용 해야 항상이 에이전트를 조작 하는 경우.
  11. 5 배, 각 시간 5-10 분 후 PBS로 헹 구 십시오, PBS와 알루미늄 호 일 덮개에 4 ° C에서 스테인드 마이크로 열을 저장 합니다. 탑재 된 astrocytic 번들의 경우 번들에 수성 장착 매체의 한 방울을 추가 하 고는 고정된 번들에 놓고 다른 유리 coverslip 인감 장기 보관 및 후속 이미징에 대 한 매니큐어와 두 coverslips.

6. 생존 분석 결과 라이브-죽은 (Calcein-오전/브로민 Homodimer) 얼룩

  1. 1 x DPBS의 10 mL를 5 μ calcein 오전 무수 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) (4 mM) 및 20 μ 브로민 homodimer-1 (EthD-1) (2 mM DMSO/H2O 1:4 v/v)을 추가 하 여 시 약 솔루션을 준비 합니다. 커버 알루미늄 호 일로 솔루션 또는 빛에서 그것을 보호 하기 위해 어둠 속에서 저장.
  2. 파스퇴르 피 펫과 도금된 마이크로 열을 포함 하는 배양 접시에서 미디어를 발음 하 고 충분 한 솔루션 (준비 위) 구문을 커버를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2, 유지 빛 으로부터 솔루션을 보호 하기 위해 적용 하는 페 트리 접시에서 30 분 동안 품 어.
  3. Micropipette 또는 파스퇴르 피 펫 솔루션을 제거 합니다. 단계 5.3에서에서 설명한 DPBS 2-3 회 린스 합니다. 접시의 크기에 따라 DPBS와 페 트리 접시를 홍수. 이미지 셀 즉시 이후에 사용 하 여 epifluorescence 또는 confocal 영상.
    참고: 변환 metabolically 활성 셀에 의해 calcein에 막 침투성 calcein 오전의 calcein의 녹색 형광을 생성합니다. 죽은 세포 막 손상 셀, 셀 및 빨간색 형광을 일으키는 핵 산 바인딩 EthD-1의 입국을 허용 하는 표시 됩니다.

Representative Results

처음에, 단계 대조 현미경 검사 법 사이토 접착 및 번들 형성의 진행과 시간의 함수로 cytoarchitecture의 전반적인 안정성을 모니터링 하는 데 사용 되었다. 도금 후 1 시간에서 이다 둥근 형태 (그림 2A)와 마이크로 열의 루멘을 통해 발견 되었다. 5 h 이다 시작 프로세스를 확장 하 고 8 h 여 계약 셀 완전 한 프로세스 베어링 형태를 전시 케이블 마이크로 열 (그림 2A)의 경도 축 중심 구조로 형성. 특히, 마이크로 열 셀의 처음 분산된 존재에 비해, 이다 나타나 인테리어 따라 밀도 번들의 네트워크를 형성 하는 계약을 체결 (그림 2B). 초기 셀 맞춤, 세로 축 따라 자주 뽑 사이토 네트워크 후 마이크로 열 (그림 2C)의 중심에서 빽빽한 번들 형태로 닫는 지퍼를 닮은. 이 번들 구조의 형성 일부 마이크로 열 ID와 셀 밀도의 선택에 의해 규정 자기 집합 프로세스 할 예정 이었습니다. 이다 정렬 및 바이 폴라 형태 (그림 3B, 상단과 중간, 그리고 3D-3 층) 350 µ m 보다 작은 ID와 마이크로 열에 시드 때 인수49. 그와 반대로, 이러한 셀 때 1 m m의 ID 이용 되었다 무작위 방향 시연 (그림 3B, 바닥), 모양에 비슷한 문화의 2D 사이토 혈 청-무료 노출, 공동 문화 매체 (그림 3A, 오른쪽). 또한, 비록 이다 아직도 표시 정렬 낮은 시드 밀도 (105 셀/mL x 2.0-3.0 또는 2.0-3.0 x 102 셀/m m3)에서 (그림 3C), 조밀한 네트워크 높은 밀도 (9.0-12.0에만 형성 된다 105 셀/mL 또는 9.0-12.0 x 102 셀/m m3) 비슷한 크기의 원통형 마이크로 열 내 ( 그림 3B에서 본 탑), 프로토콜49에 제안. Astrocytic 번들에 생존, 셀 그린 (calcein 오전) 셀 (calcein 오전) 녹색과 빨강 (EthD-1) fluorescing의 총 면적 기준으로 fluorescing의 면적의 비율로 서 라이브/죽은 분석 결과 사용 하 여 정량 했다. Astrocytic 번들의 생존 능력은 97.4% 비슷한 2D 사이토 문화 컨트롤 (그림 4A-4B)의 98.2% 생존, 마이크로 열 내 환경 사이토 활력 ( 적합 증명 4E 그림). Astrocytic 건설 기계에서 라이브 및 죽은 세포의 3D 개조는 또한 구조 (그림 4C-4 D) 내 전체 셀 맞춤을 보여 줍니다. 또한, 매우 긴 astrocytic 마이크로 열 상당한 길이 사이토 번들의 안정성을 조사 하기 위해 개발 되었다. 정렬, 밀도, 그리고 계약 astrocytic 번들의 cytoarchitecture의 확대/축소 영역에서 명확 하 게 볼 (그림 5A), 마이크로 열의 길이 걸쳐 일관 되 게 지속 되었다 3.5 c m의 특별 한 거리에는 마이크로 열 (그림 5B-5 C)

일단 형성, 번들 고정 되었고 중간 필 라 멘 트 단백질 GFAP, 같은 glial 세포의 특성에 대 한 immunocytochemistry 기술로 스테인드 nestin, 그리고 vimentin. 공초점 이미지 이다의 과정-베어링 형태학 및 프로세스 (그림 6그림 7)의 세로 맞춤을 확인합니다. 중간 필 라 멘 트 단백질의 표현 뿐만 아니라 마이크로 열 (그림 6, 그림 7B-7 D)에서 사이토 번들 모두 2D 사이토 문화 (그림 7A)에서 볼 수 있습니다. 또한, 마이크로 열에이 ECM 단백질의 존재를 뒷받침 콜라겐 얼룩. 이다 준수 수 있도록 마이크로 열에서 교양 때 루멘 내의 콜라겐을 리 모델링 하는 이다 등장 하는 반면 2D 환경 (그림 8A)에서 경작 하는 경우 콜라겐과 연속 구조를 형성 하지 않았다 대 한 세포 수축과 번들 형성 (그림 8B). GFAP와 콜라겐 채널 오버레이 사이토 케이블 경도 콜라겐 섬유 (그림 8B)와 밀접 하 게 관련 된 프로세스의 구성 되어 시연 했다. 따라서, 제공 하는 앵커리지, 떨어져 콜라겐 소 제공 수 있습니다 또한 있다 이다 수축 후 밀도 번들을 형성 하기 위한 추가 방향 신호. 경우에 따라 사이토 콜라겐 수축 유지, 형성 (그림 9A) 후 12-24 h 이상 정렬된 번들의 붕괴에서 결과. 하이드로 겔 마이크로 열 내 케이블 같은 사이토 아키텍처를 안정화 하기 위해 추가 콜라겐 매트릭스는 더 수축 억제와 축소를 완벽 하 게 구성 된 번들의 끝에 추가 되었습니다. 이 증강 기술은 허용 적어도 4 일 동안 원하는 케이블 아키텍처의 생존에 대 한 안정성의 긴 창으로 예상 (그림 9B). 또한, 대표 astrocytic 번들 했다 히드로 마이크로 열에서 추출, 탑재, 그리고 긴장 힘을 외부 환경에 노출 될 때 그들의 안정성을 평가 하기 위해 유리 coverslips에 4% 포름알데히드로 고정. 추출 및 다른 모양 (그림 10A, 10B)으로 실제 조작, astrocytic somata 및 프로세스 정렬, 유지 번들 마이크로 스케일 형태 (그림 10C), 후에 강조는 일단 형성, 히드로 마이크로 열 구조 지원은 결 석 하는 경우에 자동 정렬된 astrocytic 발판의의 탄력성

기본 대뇌 피 질의 뉴런 이다 탐험 사이토 번들 신경 접착 및 neurite 결과 찜질 가능 여부 마이크로 열 내부와 공동 경작도 했다. GFAP와 microtubule 단백질 β-tubulin III 했다 이다 및 신경, 각각 특정 표식으로 사용. 11A 그림 이다 공동 대뇌 피 질의 뉴런으로 시드 또한 프로세스를 전시 하 고 정렬 된 번들을 형성 했다. 뉴런은 준수 우선적으로 사이토 번들 모든 긍정적인 β-tubulin III 얼룩 GFAP ( 그림 11B-11 C에 오버레이)와 함께 공동 화 된 이후 등장. (그림 12B) 대뇌 피 질의 뉴런 히드로 마이크로 열 내에서 도금 했다 astrocytic 구문의 재생 속성을 보여 2 일 후에 이다 도금 (그림 12A). 신경은 사이토 번들에 연결 하 고 astrocytic 책자를 따라 직접 neurites 확장. 추가 검사 어디 사이토로 없는 지역에서 neurites 보인 비 조직적인 방식으로 (그림 12C) 성장 하는 반면 astrocytic 케이블의 방향에 neurite 결과를 보여주었다. 이러한 관측 프로토콜 정렬된, 가능한, 강력한 astrocytic 네트워크 촉진 신경 세포 접착 및 neurite 결과 이식 생활 경로 역할을 하는 결과 보여 줍니다.

Figure 2
그림 2: 명시 야 현미경 시간이 지남에 히드로 마이크로-열 내에서 사이토 번들의 형성을 보여준다. (A) 도금 후 시간의 기능으로 사이토 형태: (1 시간) 이다 모양에서 구형 이며 구문; 걸쳐 분산 (5h) 이다 시작 프로세스 확장과 수축; (8 h) 이다 정렬 하 고 계약. 바 규모 = 100 µ m. (B) 번들 형성 추가 대표적인 비 계에서 시간이 지남에: (1 시간) 처음에 이다 구형 이며 프로세스;을 전시 하지 않습니다 (24 시간) astrocytic 프로세스의 조밀한 뭉치 형성 됩니다. 스케일 바 = (왼쪽) 300 µ m, 500 µ m (오른쪽). (C) 완전히 형성 astrocytic 번들 24 h 후 도금, "zippering" 효과 보여주는 케이블의 끝 루멘 벽의 다른 끝에 첨부. 눈금 막대 = 1000 µ m.

Figure 3
그림 3: 마이크로 열 내경 및 셀 밀도 영향은 바이 폴라 이다의 정렬 된 번들의 자기 조립. 혈 청에 포함 된 미디어 (왼쪽)와 혈 청 무료 공동 문화 미디어 (오른쪽) (A) 2D 사이토 문화 표시 비 프로세스 및 다중 프로세스 베어링 형태학, 각각. 스케일 바 마이크로-180 및 이다 표시 여러, 1 mm 결과의 ID 동안 세로 축 기준으로 350 µ m 폼 정렬 번들의 ID 열에 100 µ m. (B) 이다 높은 밀도 (9.0-12.0 x 105 셀/mL)에서 시드를 = 루멘의 직경에 걸쳐 정렬된 프로세스입니다. 바 규모 = 100 µ m (위, 중간) 및 150 µ m (아래). 낮은 밀도 (2.0-4.0 x 105 셀/mL)에서 350 µ m ID 마이크로-열에 시드 (C) 이다, 하지만 하지 번들. 눈금 막대 = 100 µ m. (D)는 350 µ m ID 마이크로-열에서 낮은 또는 중간 세포 밀도에서 도금 때 이다 취득 바이 폴라 형태학. 스케일 바 = 300 µ m. (E) D 히드로 마이크로 열 내부 양식 양극 이다의 체인의 확대/축소에서 보여주는 상자. 눈금 막대 = 300 µ m. (F)는 개별 양극 사이토의 예. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 이다 후 번들 형성 하이드로 겔 마이크로-열 내에서 가능한 남아. (A-B), (C-D) 각각, calcein-오전/브로민 homodimer 얼룩 (그린 라이브와 함께 분석 평면 문화 및 정렬된 astrocytic 번들, 세포의 생존 능력을 보여주는 3D confocal 개조 셀; 레드 죽은 세포). 라이브 및 죽은 세포의 부 량 (E) 라이브/죽은 이다 2D 표면에 경작 하는 때의 유사한 백분율 및 마이크로 열 결과. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 대표 매우 긴 정렬된 Astrocytic 번들 히드로 마이크로-열 내에서 위상 대조 이미지. (A) 3.5 c m 마이크로 열의 전체 길이 걸쳐 형성 번들. 눈금 막대 = 1000 µ m. (B-C) 높은 확대 줌 기능 표시 사이토 정렬 전체 따라 다양 한 지역에서 A에 있는 상자에 해당 구성의. 스케일 바 = 500 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: Astrocytic 장비의 Immunolabeling Astrocytic 프로세스의 세로 맞춤을 보여 줍니다. (A) (오른쪽) GFAP (레드, 왼쪽)와 핵 (Hoechst, 중간)와 두 채널의 오버레이 대 한 얼룩 보여주는 astrocytic 번들의 Confocal 재건입니다. (B) 높은 배율 줌에서 A 에 박스형된 지역에서 astrocytic 번들의 마이크로 열 내 이다 cytoarchitecture의 시각화를 수 있습니다. 스케일 바 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: Immunocytochemistry 통해 대표 Astrocytic 번들의. (A-B) 이다 2 차원 표면에 경작 하 고 히드로에 시드 마이크로 열 표현할 비슷한 astrocytic 마커 GFAP (적색) 및 vimentin (녹색). (A)와 병합 된 별도 채널을 보여주는 2D 평면 사이토 문화의 Confocal 재건입니다. 눈금 막대 = 100 µ m. (B) 공초점 이미지는 astrocytic 번들, 표현의 마커를 확인 하 고 보여주는 사이토 정렬의. 눈금 막대 = 50 µ m. (C D) 이다 마이크로 열 내 경작된 또한 익스프레스 중간 필 라 멘 트 단백질 nestin (빨강) 및 vimentin (녹색). (C) astrocytic 번들의 공초점 이미지. 눈금 막대 100 µ m. (D) 높은 배율 줌-에서 c=. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8: 정렬 된 번들에서 이다 속속들이 2D 문화에 콜라겐의 불규칙 한 배열 반대로 계약, 경도 콜라겐 매트릭스와 상호 작용. 셀 immunolabeled 이다 (GFAP; 레드), 핵 (Hoechst, 블루), 콜라겐 (녹색)를 관찰 했다. (A) 2D 사이토 문화 1 mg/mL에서 콜라겐 표시 정렬된 이다 무작위로 분산된 콜라겐. 눈금 막대 = 250 µ m. (B) 콜라겐 마이크로 열 루멘 벽에서 뽑아 그리고 astrocytic 번들의 일부인 정렬 된 매트릭스를 형성 하는 계약을 체결. 눈금 막대 = 150 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 9
그림 9: 추가 콜라겐 Astrocytic 케이블의 구조를 안정화 하는 데 사용할 수 있습니다. 콜라겐 코팅 히드로 마이크로-열 내 이다 도금 후 대략 6 h를 형성 하는 (A) 번들. 일단 번들 형성 되었다, 더 높은 농도 (3 mg/mL) 콜라겐 마이크로-열 astrocytic 케이블의 수축 억제의 끝에 추가 되었습니다. 구문을 추가 콜라겐과 안정 하지, astrocytic 콜라겐 번들 18 h, 계약을 시작 했다 그리고 사이토 케이블 24 h에 의해 완전히 붕괴 했다. 이 수축 번들 3 mg/mL 콜라겐 강화 했다 때 관찰 하지 했다. 눈금 막대 = 1000 μ m. (B) 확대에서 축소 된 astrocytic 번들 하지 3 mg/mL 콜라겐 강화의. 눈금 막대 = 500 μ m. (C) 확대/축소에서 콜라겐 강화 마이크로 열에서 지역. 사이토 번들 형태로 마이크로-칼럼의 전체에 걸쳐 유지 되었다. 스케일 바 = 500 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 10
그림 10: 폴 리-L-리 신 코팅된 유리 Coverslips에 장착 하 고 마이크로 열에서 Astrocytic 번들의 추출 기술의 견고성 증거. (A) 위상 대조의 이미지 추출 astrocytic 번들, 맞춤법 단어 "펜"으로 조작. (B) 공초점 재건 같은 번들 astrocytic 마커 GFAP (빨간색)와 세포 핵 (Hoechst, 블루)에 대 한 스테인드 추출. 눈금 막대 = 100 µ m.의 박스형된 B 영역 (C) 확대, 불규칙 한 모양으로 조작 하는 경우에 astrocytic 건설 기계 유지 정렬, 바이 폴라 형태학 그리고 번들된 cytoarchitecture를 보여줍니다. 눈금 막대 = 200 µ m. 참고 단계와 공초점 이미지 사이의 구조적 차이 가능성이 구문 immunocytochemistry 절차 동안 rinsing 인해 이동의 유물 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 11
그림 11: 뉴런을 준수 하 고 신경-사이토 공동 경작된 건설 기계에 정렬 된 사이토 번들 따라 Neurites 확장. (A) 신경 시드 astrocytic 번들의 위상 대조 이미지. 눈금 막대 = 300 µ m. (B)-(C) 신경 하 astrocytic 번들을 준수 하 고 확장 케이블 (Hoechst-블루;의 방향 따라 neurites 관찰 되었다 GFAP-그린; Β-tubulin III-레드)입니다. 스케일 바 = 200 및 100 µ m, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 12
그림 12: 사이토 케이블 Neurite 결과 감독에 대 한 생활 발판으로 봉사. 신경 세포의 구성 된 마이크로 열 영역을 보여주는 confocal 개조 시드 번들 형성 후 약 2 일. (A) GFAP 긍정적인 사이토 번들, (B) β-tubulin III 양성 신경, HOECHST 얼룩 핵 (파란색)를 포함 하 여 모든 채널의 (C) 병합. 그 뉴런 전시 neurite 정렬 정렬된 사이토 프로세스 (화살표)와 영역을 때, 임의의 전시 이다 등장 하지 신경 준수를 정렬 하는 반면 (즉, 다중 방향) neurite 결과 (화살촉). (D) 줌-인 영역의 neurite 결과의 방향을 보여 줍니다. 바 규모 = 100 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

PNS 더 지원 환경에 비해, CNS neurotrauma 및 neurodegeneration의 해로운 결과 처리에 특히 제한 됩니다. 포유류 CNS에 심각한 모욕 후 glial 흉터 형성, 분열된 반응 이다 축 삭 발전이 억제 proteoglycans14분 비의 조밀한 meshwork에 둘러싸인 거리 및 염증 세포의 핵심 구성. 이 흉터는 축 삭 엔딩12의 재생에 대 한 물리적 및 생화학 방해 역할을 합니다. 또한, 성인 포유류 CNS 복원 손실된 셀 다음 외상 또는 neurodegeneration, neurogenic 센터는 SVZ, hippocampal가 뇌와 잠재적으로 다른 일반적으로 비활성 제한 때문에 새로운 신경 세포의 제한 된 소스를가지고 지역54 이상적인 전략 주소로 현재 접근 실패 CNS의 제한 된 회복 기능의 두 측면을 우회할 것 이다. 따라서, 우리의 연구 그룹 사이토 기반 건설 기계 생활 신경 결핍 및 축 삭 성장 콘 회생의 가이드 확장으로 신경 마이그레이션 경로 제시 하기 위한 개발 했다. Agarose 마이크로 열의 콜라겐 내부에 포함 된 정렬 된 astrocytic 번들이 astrocytic 생활 건설 기계를 구성 합니다. 상당한 구별에서 기존의 셀 및 소재 기반 CNS 수리 및 재생에 사용 되는 전략은 이러한 구문의 cytoarchitecture은 완전히 바이너리로 체 외 여러 vivo에서 시뮬레이션 명과 기반 지도 그리고 비 계 구조입니다. 예를 들어, 배아 개발 하는 동안 레이디얼 명과 경로 역할 새로운 신경 피 질, 그리고 glial 세포에 대 한 건설 기계 생활 중재 axons 패턴화 된 기판 및 도표 셀35로 개척의 대상된 확장 ,,3839. 배아 방사형 명과 帯에서도는 neuroblasts postnatally는 연결-형성에는 SVZ에서 산부인과41로 마이그레이션할 경도 정렬된 glial 튜브를 형성 하는 이다 생산. 또한, 그것은 증명 되었습니다 일부 비-포유류에서 그, 다음 CNS 손상, 중생의 큰 정도 조직, 정렬 astrocytic 배치44의 형성 때문에 가능. 예를 들어 성인 zebrafish의 척수 병 변 사이트, 바이 폴라 형태학 및 병 변, 경로 형성을 폐해 프로세스의 신장으로 차별화를 미 성숙한 glial 세포의 이동에 따라 회생 할 수 있다 그 재생 축 삭45를 지시합니다. 정렬된 astrocytic 번들의 설계 구조는 이러한 메커니즘을 업과 고 명과 중재 신경 마이그레이션 및 축 삭 재생35필요한 구조 및 수용 성 신호를 제시 할 수 있을 수 있습니다. 또한, 생활 이다의 포함으로 인해 이러한 구문을 제공할 수 있습니다 적극적으로 호스트 로부터 피드백에 따라 필요한 환경 단서.

우리의 기술에서 사이토 맞춤 자기 집합 프로세스는 물리적 단서와 셀 상호 마이크로 열 내경, 콜라겐 농도, 그리고 시드 밀도 의해 추진에 파견. 이 방법의 또 다른 매력적인 기능 CNS의 손상 된 영역에서 최소 침 습 이식에 대 한 수의 미크론 단위 크기입니다. 또한,이 원고에 제시 하는 결과 설명 프로토콜 얻은 구문을 높은 생존 능력을 소유 하 고 표현 하는 중간 필 라 멘 트 단백질 GFAP, nestin, vimentin 통로 수에 의해 정의 된 대로 사이토 나이에 . GFAP와 vimentin 미 숙 하 고 성숙한 이다 표현 하는 동안 nestin는 주로 성숙 명과 upregulating GFAP의 표현과 nestin45, 의 생산을 감소와 함께 undifferentiated 또는 미 성숙한 세포 그러나 55. 이전 연구는 사이토 나이, 행동 변화 중간 필 라 멘 트 단백질, 또한 번들의 일관 된 표현을 통과 번호 (4-12 구절)56의 범위에 걸쳐 보였다. Astrocytic 건설 기계는 또한 매우 긴 달성 하는 표시 했다 센티미터 규모 길이 체 외에,이 기술은 적응 별개 부상 길이 고 vivo에서발생 하는 형상 제안. 또한, 정렬된 astrocytic 번들 전시 놀라운 구조적 무결성 및 안정성로 그들의 케이블 같은 cytoarchitecture 마이크로 열에서 추출 대상이 되 고 후에 유지 됩니다. 사이토 기반 생활 투어 또한 지원 신경 접착 및 neurite 결과, CNS 수리에 대 한 감독된 신경 마이그레이션 및 축 삭 확장을 촉진이 기술의 잠재력을 강화.

정렬 된 astrocytic 번들 보호 관 히드로 넣음의 collagenous 내부에 포함 되어 있습니다. 모 세관 튜브로 침술 바늘을 삽입 하 고 그것에 액체 agarose를 suctioning 마이크로 열 어셈블리와 astrocytic 장비의 제조 개시. Agarose의 불활성, 생체 적합성, 속성과 쉽게 제어 기계, 육체, 및 생 화 확 적인 재산49때문에 선택 된 소재를 했다. Agarose 농도 히드로에서 그들의 기질 (예: 강성)에서 기계적 자극을 감각 셀부터 중요 한 변수를 수 하 고 세포내 변화57응답 수 있습니다. 이러한 마이크로-열에 대 한 설계 기준이 포함 적절 한 대량 전송, 하지만 작은 대 한 충분 한 기 공 크기 측면 프로세스 파생물; 금지를 수 있도록 충분히 높은 다공성 나노 스케일 오픈 다공성에 의해 이러한 기준을 충족이 프로토콜에서 사용 하는 농도에서 agarose에 존재. 이 프로토콜의 agarose 농도 안정성, 처리, 및 두뇌 환경58을 기계적 성질에서 유사성의 용이성 또한 선택 되었다. 주목할 만한 고려 모 세관 튜브 내에서 바늘의 중앙 위치입니다. 때때로, 바늘 튜브에서 agarose 겔 화 및 마이크로 열 제거를 다음 외부 벽에 위치한 센터에서 상대를 되도록 루멘을 일으키는 과정 약간 경사 또는 난민을 수 있습니다. 이 방지 하려면 바늘, 그리고 플런저 튜브 바늘 어셈블리 agarose 되 고 그려집니다 중앙 축 바늘을 유지 하는 동안 수직 위치에서 유지 되어야 합니다. 루멘의 정확한 집중 보호 agarose 벽; 사이 정렬된 이다 루멘은 파열 경우 실린더의 외부 가장자리에 인접 하는 경향이. 또한, 루멘 외부 벽 사이의 거리가 충분히 제공할 수 있습니다 보호 혜택 중 고 이식 후 (제공 astrocytic 구문 마이크로 열 전에 이식에서 제거 되지 않습니다). Astrocytic 비 계 제조의 초기 단계가 니 들 직경의 선택은 적절 한 사이토 소마/프로세스 정렬 및 케이블에 대 한 중요 한 자기 조립 기술의 성공에 대 한 최고 이다. 우리는 사이토 정렬 셀 정렬 및 강력한 사이토 번들 되 고 180 ~ 350 µ m (그림 3)의 형성에 대 한 최적의 ID 범위 마이크로 열 ID에 반비례 의존 했다 발견. 마찬가지로, 그것은 이전 뉴런 직접59,60, 벤딩 과정을 줄이기 위해 최소 기판 곡률의 방향 따라 그들의 파생물 및 유사한 메커니즘은 사이토에 영향을 미칠 직장에서 가능성이 입증 되었다 우리의 시스템49에 맞춤입니다. 곡률 사이토 정렬에 영향을, 뿐만 아니라 우리가 발견 한 180 ~ 350 µ m ID 범위 결과 취득 한 바이 폴라 형태학49, id 1 m m의 또는에 이다 경작 했다 관찰 방사상, 다 극 형태에 반대 이다 2D (그림 3)입니다. 그것은 변조 바이 폴라 사이토 형태학에 이러한 깊은 형태학 변화 그들의 생리 적 특성 뿐만 아니라; 예를 들어,이 이다 대체 secretable 요인 또는 세포 표면 마커를 재생, 유리할 수 있습니다 표현할 수 있지만이 특성 추가 영장. 전반적으로, 우리의 연구 결과 물리적 신호, 표면 곡률 등의 적당 한 선택 astrocytic 생활 건설 기계에서 네이티브 cytoarchitecture을 모방 하는 것이 필수적는 보여줍니다.

Astrocytic 장비의 건설 마이크로 열의 빈 내부에 콜라겐 ECM 솔루션 및 대뇌 피 질의 이다의 순차 포함과 함께 진행 한다. 마이크로 열의 내부 루멘 사이토 생존, 첨부 파일, 그리고 neurite 결과61를 독립적으로 지원 하는 agarose의 무 능력 때문에 정렬 된 번들 형성을 지원 하기 위해 콜라겐으로 코팅 되어 있습니다. 1 mg/mL의 콜라겐 농도 이전 연구 결정 낮은 및 높은 농도 접착의 부족 및 ECM, 각각49의 불안정성에서 결과 때문에 선택 되었다. 따라서, 예상 했던 대로, 콜라겐 농도이 기술의 효과에 극적인 효력이 있다. 또한, ECM 솔루션 이루어져 있다 종류만 난 콜라겐. Laminin 및 2D astrocytic 문화 Matrigel 코팅 된 기판에 비해, 이다 도금 형식에 나 콜라겐 시연 최적의 접착 및 네트워크 형성62. 보육 시간 셀 시드 전에 콜라겐 중 합에 사용 되는 프로토콜에서 필수적인 단계 이기도 합니다. 우리 이전 뉴런 수반 agarose 마이크로 열 unpolymerized ECM 전달 했다 때 감소 neurite 결과 및 axonal fasciculation 했다 본된47, 그리고 그것은 이러한 결과 이다를 확장할 것 이라고 수 발견 뿐만 아니라. 콜라겐 사이토 접착 및 번들 형성을 위한 필요 때문에, 기포 또는 빈 주머니의 부재와 구조를 통해 ECM의 존재 한다 시각화 되며 미세한 기술로 확인.

프로토콜은 사이토 도금, 콜라겐, 하 단기 문화 대상 cytoarchitecture의 형성을 위한 세포 접착 되도록 잠복기로 마칩니다. 그들은 강력한 astrocytic 번들과 콜라겐 개혁 전시 통로 4-12 번 사이 이다 사용 되었다. 이 이다 또한 구성 된 성숙한 표현 형을 제시 > 신경 오염 없이 거의 95% 순수 문화63,64 . 혈 청에 포함 된 매체 (왼쪽그림 3A, )을 채용, 일반 사이토 문화 달리 우리의 기술 과정-베어링 형태 (그림 3A, 권리를 채택 하는 것 이다 있도록 혈 청 자유로운 매체 활용 ) 정렬된 somata 및 마이크로 열62,,6566내 프로세스의 번들을 형성. 셀 농도 시드, 측면에서 350 µ m의 id의 9.0 12.0 x 105 셀/mL 범위에서 높은 농도 귀착되 었 다 이다 했다 더 분산 된 반면, 개장 하는 콜라겐을 동반와 단단히 포장된 번들의 형성 하지만 여전히 정렬, 낮은 농도 활용 했다 (그림 3C). 따라서, 세포 세포 상호 작용에 집중을 뿌리기의 효과 영향 사이토 정렬 및 관찰 케이블 같은 구조의 형성의 정도. 루멘으로 셀 솔루션의 주입은 일반적으로 지속적인 번들 형성을 위한 중요 한 마이크로 열 길이 걸쳐 균일 배달 되도록 한 stereoscope를 사용 하 여 시각화 됩니다. 시드, 후 문화 미디어 홍수 이전 예비 보육 시간은 ECM에 이다의 앵커리지를 확보 하기 위해 불가결 이다. 기간 하는 구문이 충분히 건조를 방해 하기 위해 습도 이다 구조에서 탈출 하는 경우 수정할 수 있습니다. 8 h, 정렬된 astrocytic 번들의 네트워크는 형성 되는 과정에서 보여준 시간의 기능으로 astrocytic 장비의 위상 대조 이미지. 또한, 루멘 벽, 그 뒤이어 수축과 세포 사이의 계약된 콜라겐 꽉 협회에서 ECM의 분리 구조 콜라겐 및 GFAP 그림 8과 같이 표시 했다 때 관찰 되었다. 이 현상을 가능 하 게 유연한 기판 및 매트릭스 리 모델링을 왜곡 하는 힘을 생성 하 glial 세포의 섬유 아 세포와 같은 능력의 이전 보고서에 따라 벽에서 콜라겐을 분리 astrocytic 수축 성 힘의 결과 이다 사이토 전용에 이다의 능력 및 신경-사이토 공동28,49,,6768문화. 특히, 사이토 운동 성 및 콜라겐 소와 integrin 중재 한 상호 작용의 결과 중 소17,69계약을 충분 한 힘의 발생 이다. 전반적으로, 설명된 프로토콜의 구현 생활 건설 기계 구조의 조밀 하 고, 정렬 된 astrocytic 케이블 같은 실제 기판 CNS 개발의 여러 단계에서 존재를 정리 하는 자기 조립된 네트워크 구성을 생산할 예정 이다.

프로토콜에 걸쳐 발생할 수 있는 문제에 대 한 개인, 이외에 astrocytic 비 계 기술 CNS를 복구 하는 능력에 영향을 미칠 수 있습니다 다른 hindrances를 소유한 다. 예를 들어,이 기술의 궁극적인 성공 신경이 소성 및 호스트 회로 astrocytic 발판의 기능 통합에 관 하 우발적 이다. 이러한 장비의 이식에 관련 된 astrocytic 번들의 프로 재생 특성을 카운터 수 있습니다 염증 반응의 가능성이입니다. 모든 이식 기반 기술을 혈액-뇌 장벽 파열 및 염증 세포, 신경 세포와 조직47모세 혈관 사이의 근접 때문에의 침투를 일으킬 수가 있다. 이 경우에, 히드로 마이크로 열 또는 astrocytic 건설 기계에 대 한 다른 넣음 체계 염증 반응을 줄이기 위해 항 염증 제 요인의 제어 방출 위한 수단으로 서 활용 될 수 있습니다. 처음에, 정렬된 astrocytic 번들은 셀 맞춤을 강요 하는 세력으로 마이크로 열 내부 안정 고 개장 하는 매트릭스 궁극적으로 문화에 1-2 일 후 원하는 cytoarchitecture의 붕괴. 그러나, 추가 수축과 번들 붕괴 장소에서 번들을 보전 되기 위하여 높은 농도 콜라겐을 추가 하 여 마이크로 열 끝에 번들에 대 한 추가 보강을 제공 하 여 장애가 되었다. 추가 전술 사용으로 그들은 마이크로 열에서 가져온 새로운 하이드로 겔 코팅 정렬된 astrocytic 번들에 적용 되 면 보조 캡슐화 될 수 있습니다. 이 미래의 연구에 직접 테스트할 필요가 있을 것 이다 비록 그것은 가능성이 뇌에 정렬 된 사이토 네트워크의 전달 때문에 전체 길이 따라 호스트 및 구성 셀 사이의 셀 셀 유착 구조 안정 또한 것 이다.

향후 개발 및 보호 astrocytic 번들의 동안 신경 마이그레이션에 대 한 허용 하기 위하여 vivo에서 배달 후 복구, 보장 하는 효과적인 이식 방법에 목적 하는 것입니다 따라서, 그리고 부상된 CNS에서의 재생 우리는 이전 설명의 corticothalamic 경로 astrocytic 구문 넣음 체계를 공유 하는 TENNs-신경/axonal 기반 마이크로의 성공적인 이식 호스트와 생존 및 구조적 통합의 결과로 조직에서 1 개월46,47까지 적어도. 따라서, 마이크로 열에서 추출 후 케이블의 견고성은 악용 될 수 있습니다. 이 경우에, agarose 히드로 초기 문화 침대 자기 조립을 유도 될 것 이다 그리고 astrocytic 케이블을 넣음에서 제거 될 것 고 얇은-벽으로 바늘을 사용 하 여 뇌에 직접 주입. 히드로 마이크로 열에서 추출 하는 동안 기계적인 힘으로 사이토 변형 하지 관찰 하 고 기대 하지 않습니다. 이전 작업 사이토 반응성에 기계적 변형 효과 공부 하 고 그 결과 변형 하지에 적용 될 충분히 급속 하 게 astrocytosis 또는 프로세스 신장62,70를 유도 나왔다. 뇌 조직 및 가능한 염증 반응을 피해를 최소화 하는 히드로 내 번들 마이크로-TENNs에 대 한 이전 개발 바늘 없는 기술을 사용 하 여 이식 수 있습니다. 이 방법론에는 하이드로 겔은 이식47의 파괴와 염증 발자국을 축소 수 있습니다 두뇌에 바늘 없는 항목에 대 한 허용 하는 carboxymethylcellulose의 얇은 층으로 입힌 다. 나중에, 이식 연구, 호스트 조직 통합을 이러한 장비의 능력을 평가 하기 위해 수행할 수 있습니다 그리고 신경 이동과 축 삭 지침을 홍보. 특히, 이러한 구문 한쪽 신경 줄기 세포 및 RMS, 및 다른 끝 부상 사이트에 연결 된 잠재적으로의 직접 흉내에 neuroblasts의 그것의 수영장에 액세스 하려면 SVZ 같은 neurogenic 지역에서 집중적으로 이식 될 수 있습니다. 신경 마이그레이션 metered 패션에서 영역을 다시 하 고.

후 이식 프로토콜 최적화 기술은 다른 지역에서 개선할 수 있습니다. 마이크로 열 미 숙 이다 (예: 방사형 명과, RMS 형 셀)로 조작 될 수 있습니다 또는 나중에 성숙한 고기 이러한 구문을49의 재생 유도 용량을 증가 시키기 위해 dedifferentiated. 생체 외에서 모델에서 glial 흉터의 성숙 이다 축 삭 파생물71에 대 한 경로 형성 하는 능력이 없 있다. 대조적으로, 미 성숙한 이다 neurite 결과 생체 외에서 및 axonal 재생에 vivo에서 chondroitinase glial 흉터71 CSPGs의 높은 레벨을 해결 하기 위해 ABC와 수반 이식 때 표시 되었습니다. , 72. 맞춤된 의학의 등장과 일치 하려면, 헌 astrocytic 마이크로 열 소스와 같은 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)와 인간의 신경 줄기 세포 (hNSCs)에서 줄기 세포를 뿌리기에 의해 개발 있을 수 있습니다. 이 수정이 건설 기계 개별 대 한 도관으로 작동 하 고 구체적인 통로 수리 및 재생 허용 됩니다. 또한, 이러한 세포 자원의 사용 가능한 우회 수 있습니다 면역성 응답을 사이토 이식 발생할 수 있습니다. 비록 immunogenicity iPSC 셀 라인 따라 다릅니다,이 세포는 이론적으로 averting 또는 iPSC 파생 기관 후 해로운 응답의 부재에 의해 제안 된로 이식 시 면역 반응 감소 쥐73,74에 이식. 또한, 헌 hNSCs 및 그들의 astrocytic 유도체 수용자 면역 응답75억 누르다. 따라서, 이러한 조작 자가 줄기 세포로 될 수 있음이 기술을 더 쉽게 임상 설정에서 적용 하는 중요 한 미래 단계 사이토 정렬.

CNS 수리 및 재생에 대 한 도관으로 응용 프로그램을 제외 하 고 astrocytic 생활 건설 기계 체 외에서 테스트-침대, 또는 특정 테스트 패러다임의 목표에 따라 하이드로 겔 넣음 없이 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 이러한 astrocytic 구문은 사용할 수 있습니다 신경 마이그레이션 및 neurite 확장 이다, 제어할 수 있는 속성 및 3D 환경 건설 기계 생활의 모델로 이용 하 여 중재 neurobiological 현상 조사 vivo에서 조건입니다. 이 원고에서 설명 하는 프로토콜 자세한 히드로 마이크로 열 내 collagenous 매트릭스에 자체 조립된 정렬된 astrocytic 번들의 제조. 업과 뇌 neuroanatomy, 발달/재생 메커니즘 및 neuroblast 마이그레이션 경로의 기능, 여 이러한 이식 astrocytic 건설 기계는 신경 마이그레이션 및 축 삭을 감독에 대 한 지원 경로 제공 가능성이 손상 된 CNS의 그렇지 않으면 금지 환경에 지도.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

재정 지원 건강의 국가 학회 [U01-NS094340 (컬) & F31-NS090746 (Katiyar)], 마이클 제이 폭스 재단 [치료 파이프라인 프로그램 #9998 (컬)], 펜 의학 신경 과학 센터 조종사 상 (컬 린)에 의해 제공 되었다 국립 과학 재단 [대학원 연구 장학 DGE-1321851 (Struzyna)], 재향 군인의 부서 담당 [RR & D 장점 검토 #B1097-난 (컬)], 미국 육군 의료 연구 및 물자 명령 [#W81XWH-13-207004 (컬) & W81XWH-15-1-0466 (컬)].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acupuncture needle (300 µm diameter) Lhasa Medical HS.30x40 The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish Fisher 08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Invitrogen 14200075
Polystyrene disposable serological pipet Fisher 13-678-11D
Agarose Sigma A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm) Fisher 21-170J The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser Fisher 21-170J Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate Fisher SP88857200
Magnetic bar Fisher 1451352
Micropipette Sigma Z683884-1EA
25 mm gauge needle Fisher 14-826-49
Microscalpel Roboz Surgical RS-6270
Scissors Fine Science Tools 14081-09
Forceps World Precision Instruments 501985
Hot bead sterilizer Sigma Z378550-1EA
Stereoscope Nikon SMZ800N
Micro-spatula Fisher S50821
Rat tail type I collagen Corning 354236 Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube Fisher 02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher SS2661
Hydrochloric acid (HCl) Fisher SA48-1
Litmus paper Fisher 09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS) Invitrogen 14170112 Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I Sigma 10104159001 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture Gibco 11330-032 Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11195 Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups Charles River Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium Invitrogen 21103049 Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement Invitrogen 12587010 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine Invitrogen 35050061 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement Invitrogen 17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats Charles River Strain 001
Pasteur pipette Fisher 22-042816
15 mL centrifuge tube EMESCO 1194-352099
Vortex Fisher 02-215-414
Centrifuge Fisher 05-413-115
Hemocytometer Fisher 02-671-6
Incubator Fisher 13 998 076
Formaldehyde 40% Fisher F77P-4 Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip Fisher 12-548-5M
Nail polish Electron Microscopy Sciences (EMS) 72180
Fluoromont mounting medium Southern Biotech 0100-01
Poly-L-lysine Sigma P4707
Phosphate buffered saline Fisher BP3994
Triton X-100 Sigma T8787
Normal horse serum Gibco 16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody Millipore AB5804 Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody Sigma T8578 Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody Abcam ab34710 Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin Millipore AB3400 Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin Millipore AB5326 Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody Invitrogen A10037 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody Invitrogen A10042 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody Invitrogen A21206 Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride Invitrogen H3570 Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM Sigma C1359 4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1 Life Technologies E1169 2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO) Sigma 276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope Nikon Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope Nikon Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).

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