بيب على رقاقة: دراسة خالية من التسمية من التفاعلات البروتين فسفوانوسيتيد

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هنا نقدم طبقة ثنائية الدهون المدعومة في سياق منصة ميكروفلويديك لدراسة التفاعلات البروتين فسفوانوسيتيد باستخدام طريقة خالية من التسمية على أساس التشكيل الرقم الهيدروجيني.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Shengjuler, D., Sun, S., Cremer, P. S., Cameron, C. E. PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions. J. Vis. Exp. (125), e55869, doi:10.3791/55869 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

العديد من البروتينات الخلوية تتفاعل مع أسطح الغشاء للتأثير على العمليات الخلوية الأساسية. ويمكن توجيه هذه التفاعلات نحو مكون معين من الدهون داخل غشاء، كما هو الحال في فوسفهوانوسيتيدس (بيبس)، لضمان توطين خلوية محددة و / أو تفعيل. وقد تم دراسة بيبس والنطاقات الخلوية ملزمة بيب على نطاق واسع لفهم أفضل لدورها في علم وظائف الأعضاء الخلوية. طبقنا فحص التشكيل الرقم الهيدروجيني على الطبقات ثنائية الداعم (سلبس) كأداة لدراسة التفاعلات البروتين بيب. في هذه الدراسات، يتم استخدام الرقم الهيدروجيني الحساسة أورثو -Sulforhodamine B مترافق فوسفهاتيديليثانولامين للكشف عن التفاعلات البروتين بيب. عند ربط البروتين إلى سطح غشاء يحتوي على بيب، يتم تشكيل إمكانات بينية ( أي تغيير في درجة الحموضة المحلية)، وتحويل حالة البروتونات من التحقيق. يتم تقديم دراسة حالة من الاستخدام الناجح لفحص التشكيل الرقم الهيدروجيني باستخدام فوسفهوليباس C delta1 بليكسترفي مجال التماثل (بلك-δ1 ف) و فوسفهاتديلينوسيتول 4،5-بيسفوسفهات (بي (4،5) P 2 ) التفاعل كمثال. كان ثابت التفكك الظاهري ( K د، التطبيق ) لهذا التفاعل 0.39 ± 0.05 ميكرومتر، على غرار K د، والقيم التطبيق التي تم الحصول عليها من قبل الآخرين. كما لوحظ سابقا، المجال بلك-δ1 ف هو بي (4،5) P 2 محددة، ويظهر أضعف ملزم نحو فوسفهاتديلينوسيتول 4-فوسفات، وليس ملزمة ل سسبس نقية فوسفاتيديلكولين. المقايسة بيب على رقاقة هو مفيد على المقايسات التقليدية بيب ملزمة، بما في ذلك ولكن لا تقتصر على انخفاض حجم العينة ولا يجند / مستقبلات وضع العلامات المتطلبات، والقدرة على اختبار التفاعلات غشاء عالية والمنخفضة تقارب مع كل من الصغيرة و جزيئات كبيرة، وتحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء. وبناء على ذلك، فإن استخدام نهج بيب على رقاقة أن يسهل توضيح آليات مجموعة واسعة من التفاعلات الغشاء. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون هذا الأسلوب شسيد في تحديد العلاجات التي تعدل قدرة البروتين على التفاعل مع الأغشية.

Introduction

عدد لا يحصى من التفاعلات والعمليات البيوكيميائية تجري على سطوح غشاء السائل ثنائي الأبعاد. العضيات المغلقة الغشاء في خلايا حقيقيات النواة هي فريدة من نوعها ليس فقط في العمليات البيوكيميائية والبروتيوم المرتبطة بها ولكن أيضا في تكوين الدهون. فئة استثنائية واحدة من الفوسفورية هي فوسفهوانوسيتيدس (بيبس). على الرغم من أنها تشكل 1٪ فقط من الدهون الدهنية الخلوية، فإنها تلعب دورا حاسما في التنبيه إشارة، أوتوفاجي، والغشاء الاتجار، من بين أمور أخرى 1 ، 2 ، 3 ، 4 . يؤدي الفسفرة الديناميكية لمجموعة رأس الإينوسيتول بواسطة كينازات بيب الخلوية إلى ظهور سبعة مجموعات رأسية بيب هي أحادية أو ثنائية أو تريس فوسفهوريلاتد 5 . بالإضافة إلى ذلك، بيبس تحديد الهوية تحت الخلوية من الأغشية وتكون بمثابة مواقع لرسو السفن المتخصصة لالبروتينات / الإنزيمات التي تحتوي على واحد أو أكثر من فوسفهوانوسعلى سبيل المثال، بليكسترين هومولوغي (ف)، فوكس هومولوغي (بس)، و إبسين N- محطة التماثل (إنث) 6 ، 7 . واحدة من أفضل المجالات درس الملزمة بيب هو فوسفهوليباز C (بلك) -δ1 ف المجال الذي يتفاعل على وجه التحديد مع فوسفاتيديلينوسيتول 4،5-بيسفوسفهات (بي (4،5) P 2 ) ضمن نانومولار منخفضة منخفضة تقارب مجموعة ميكرومولار 8 ، 9 ، 10 ، 11 .

وقد تم تطوير مجموعة متنوعة من الطرق الكمية والكمية في المختبر واستخدامها لدراسة آلية، الديناميكا الحرارية، وخصوصية هذه التفاعلات. ومن بين المقايسات الأكثر شيوعا بين بيب الملزمة هي رنين بلاسمون السطحي (سبر)، و كالوريمتري متساوي الحرارة (إيتس)، و التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (نمر)، و فحص الطفو الليبوسومي / الترسيب، و شحم الدهون (شرائط الدهون / شرائط بيب)12 ، 13 . على الرغم من أن هذه تستخدم على نطاق واسع، لديهم جميعا العديد من العيوب. على سبيل المثال، سير، مركز التجارة الدولية، و نمر تتطلب كميات كبيرة من العينة، وأجهزة مكلفة، و / أو الموظفين المدربين 12 ، 13 . بعض أشكال فحص مثل الأجسام المضادة على أساس الدهون-بلوتس الاستفادة من أشكال قابلة للذوبان في الماء من بيبس وتقديمها بطريقة نفيسيولوجيكال 12 ، 14 ، 15 ، 16 . وبالإضافة إلى ذلك، لا يمكن أن تكون الكميات الدهنية كوانتيتاتد موثوق وأنها كثيرا ما أدت إلى ملاحظات إيجابية / سلبية كاذبة 12 ، 17 ، 18 . للتغلب على هذه التحديات وتحسين مجموعة الأدوات الحالية، تم إنشاء طريقة جديدة خالية من التسمية على أساس طبقة ثنائية الدهن المدعومة (سلب) في سياق آم منصة إيكروفليديك، التي تم تطبيقها بنجاح لدراسة التفاعلات البروتين بيب ( الشكل 1 ) 19 .

وتستند الاستراتيجية المستخدمة للكشف عن التفاعلات البروتين بيب على استشعار الرقم الهيدروجيني التشكيل. وهذا ينطوي على صبغ حساسية الرقم الهيدروجيني التي لديها أورثو -Sulfourhodamine B ( س سرب) مترافق مباشرة إلى فوسفاتيديليثانولامين رئيس مجموعة الدهون 20 . س سرب-بوب التحقيق ( الشكل 2A ) هو الفلورسنت للغاية في درجة الحموضة منخفضة ومطفأ في درجة الحموضة عالية مع يكا حوالي 6.7 ضمن 7.5 مول٪ بي (4،5) P 2 - تحتوي على سلبس ( الشكل 5B ). وقد تم استخدام بلك-δ1 نطاق ف على نطاق واسع للتحقق من صحة البروتين-بيب ملزم المنهجيات نظرا لخصوصيتها العالية بي (4،5) P 2 ( الشكل 5A ) 21 ، 22 ،"> 23 ، 24 ، 25 .Hence، نحن السبب في أن المجال بلك-δ1 ف يمكن أن تستخدم لاختبار ملزم ل بي (4،5) P 2 من خلال فحص بيب على رقاقة.و بناء المجال ف (P4.4)، وبالتالي يجذب أوه - أيونات ( الشكل 5C ) عند ربط بي (4،5) P 2 - تحتوي على سلبس، مجال ف يجلب أوه - أيونات إلى سطح الغشاء، والذي بدوره ينظم إمكانية بينية والتحولات الدولة بروتوناتيون من س SRB-البابا (الشكل 5C) 26. ووظيفة من تركيز نطاق PH، تطفأ مضان (الشكل 6A). وأخيرا، فإن البيانات تطبيع هو يصلح ل إيسوثرم ملزمة لتحديد تقارب من ف المجال بي (4،5) P 2 التفاعل ( الشكل 6B ، 6C ). </ P>

في هذه الدراسة، يتم توفير بروتوكول مفصل لأداء البروتين ملزم ل سلب التي تحتوي على بيب داخل منصة ميكروفلويديك. هذا البروتوكول يأخذ القارئ من تجميع جهاز ميكروفلويديك وإعداد حويصلة لتشكيل سلب والبروتين ملزمة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم توفير الاتجاهات لتحليل البيانات لاستخراج المعلومات تقارب ل بلك-δ1 ف المجال بي (4،5) التفاعل P 2 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تنظيف كوفرسليبس الزجاج

  1. تمييع الحل 7x تنظيف (انظر الجدول المواد ) 7 أضعاف مع الماء منزوع الأيونات في طبق زجاج البورسليكات العميقة 100 ملم مع أسفل مسطحة وتسخينه حتى 95 درجة مئوية على لوحة الساخنة مستوى لمدة 20 دقيقة أو حتى يصبح حل غائم واضح .
    ملاحظة: الحل سيكون ساخنا، توخي الحذر لتجنب الإصابات الجسدية. الحل 7x تنظيف هو مزيج الملكية من هيكساسوديوم [أوكسيدو- [أوكسيدو (فوسفوناتوكسي) فوسفهوريل] أوكسيفوسفهوريل] الفوسفات، 2- (2-بوتوكسيثوكسي) الإيثانول، الصوديوم 1،4-مكرر (2-إيثيلهيكسوكسي) -1،4-ديوكسوبوتان -2-سلفونات وإضافات غير خطرة.
  2. باستخدام ملاقط، وترتيب كوفرسليبس (40 مم طول × 22 مم العرض × 0.16-0.19 مم الارتفاع) على رف تلطيخ الألومنيوم في الاتجاهات بالتناوب. إبقاء بقعة فارغة بين كل ساترة لمنعهم من لمس بعضها البعض.
  3. تغمر تماما رف تلطيخ مع كوفرسليبس في محلول التنظيف. الحفاظ على كوفرسليبس فيالحل لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: كما يتبخر الماء، والحفاظ على إضافة الماء منزوع الأيونات جديدة للحفاظ على تركيز الحل دون تغيير.
  4. اتخاذ رفوف تلطيخ من محلول التنظيف وغسل كوفرسليبس مع كميات وفيرة من الماء منزوع الأيونات لإزالة المنظفات.
  5. تجفيف كوفرسليبس مع غاز النيتروجين (حوالي 5 دقائق لكل رف تلطيخ)، ومن ثم وضع كوفرسليبس في فرن لمدة 6 ساعات عند 550 درجة مئوية للصلب.
    ملاحظة: هذه خطوة حاسمة التي سموثنس ميزات الخام على سطح الزجاج.
  6. وضع كوفرسليبس في حاوية بلاستيكية والاحتفاظ بها بعيدا عن الغبار.

2. تصنيع ميكروباترنيد بدمس كتل

  1. خلط بوليديميثيلزيلوكسان (بدمس) بريبوليمر وكيل علاج بنسبة 10: 1 (ث / ث) في البلاستيك كبير وزن القارب و ديغاس في فراغ لمدة 1 ساعة مع قوة فراغ في 500 تور أو أقل.
    ملاحظة: بدمس هو البوليمر سيليكون شفاف وخامل. للحصول على بدمس المطلوب كتلة رهيكنيس (0.5 سم)، مزيج 55 غرام من بريبوليمر مع 5.5 غرام من وكيل المعالجة.
  2. وضع سيد السيليكون الذي يحتوي على مكررات متعددة من نفس سو-8 ميكروباترن في كبير (قطرها 10 سم) البلاستيك وزن القارب وتصب في بدمس ديغاسد. ثم، وعلاجه في فرن جاف عند 60 درجة مئوية خلال الليل.
    ملاحظة: ميكروباترنس كبيرة بما فيه الكفاية ليتم رؤيتها بالعين المجردة. كل نمط يحتوي على 8 ميكروشانلز (100 ميكرون العرض × 40 ميكرون الطول × 1 سم طول) مع 40 ميكرون تباعد بين ( الشكل 1A ، 1B ). سيليكون ملف رقاقة تتألف من الصعب خبز سو-8 مقاومة للضوء ملفقة في منشأة التصنيع النانوي 27 . وتشمل الأساليب الأخرى لإعداد الماجستير النقش حامض الهيدروفلوريك (هف)، ونقش المياه عالية الحرارة، وروغرافي، والطباعة 3D 28 ، 29 ، 30 ، 31 . المبادلات التجارويمكن أيضا استخدام مصادر إال لإعداد السليكون الرئيسي. تم تصميم أنماط الجهاز ميكروفلويديك مع برنامج الصياغة (انظر جدول المواد). يتم توفير الملف الأصلي الذي يحتوي على تصميم نمط كملف تكميلي "نمط Design.dwg"، والتي يمكن توفيرها مباشرة إلى الشركة المصنعة.
  3. بلطف، تقشر بدمس من سيد السيليكون مع اليدين. وضع علامة على حدود كل ميكروباترن في المستطيلات باستخدام مشرط جراحي وحاكم. ثم، وقطع بدمس في كتل.
  4. لكمة 16 ثقوب (8 مداخل و 8 منافذ لكل كتلة) على طرفي كل متناهية مع لكمة الخزعة (1.0 ملم حفرة قطرها) كما هو مبين في الشكل 3B .
  5. تطبيق الشريط على كل بدمس كتلة لحماية ميكروباترنس من الضرر والغبار. تخزينها في حاوية بلاستيكية.

3. إعداد الحويصلات ونيلاميلار صغيرة (سيارات الدفع الرباعي)

ملاحظة: تكوين طبقة ثنائية السيطرة السلبيةهو 99.5 مول٪ 1-بالميتويل-2-oleoyl- التعطيل -glycero-3-phosphocholine (POPC) و 0.5٪ مول مستقيم بادئة Sulforhodamine B-1-بالميتويل-2-oleoyl- التعطيل -glycero-3-phosphoethanolamine SRB- بابا الفاتيكان). تكوين اختبار طبقة ثنائية هو 92.0 مول٪ POPC، و 0.5٪ مول س SRB-البابا، و 7.5٪ من مول إما L-α-فوسفتيدلينوستول-4-الفوسفات (PI4P) أو L-α-فوسفتيدلينوستول-4،5-bisphosphate (PI ( 4،5) P 2 ). وفيما يلي إجراءات إعداد 92.0 مول٪ POPC، و 0.5٪ مول س SRB-البابا، و 7.5٪ مول PI (4،5) P 2 المحتوية على سيارات الدفع الرباعي. تركيب س SRB-البابا المستخدمة في هذه الدراسة وقد وصفت سابقا 20.

  1. احسب حجم ال بوب و بي (4،5) P 2 و o سرب-بوب التي تحتاج إلى مختلطة، والتي تمثل مجموع المبالغ التالية: 2.22 ملغ من بوب، 0.26 ملغ من بي (4،5) P 2 ، و 2.1 × 10 -5 ملغ من س SRB-البابا.
  2. ماصة الحجم المحسوب من بوب، بي (4،5) P 2 ، <إم> o سرب-بوب في قارورة تلألؤ زجاجية 20 مل.
    ملاحظة: POPC وس الحلول الأسهم SRB-البابا تأتي في حل الكلوروفورم، في حين يأتي الأسهم PI (4،5) P 2 (وphosphoinositides البعض) في الكلوروفورم: الميثانول: الماء (20: 9: 1) خليط المذيبات. للدقة، الرطب طرف ماصة مع الكلوروفورم قبل استخدامه. من أجل السلامة، يجب أن تحدث هذه الخطوة داخل غطاء الدخان الكيميائية.
  3. تجفيف الخليط في تيار من غاز النيتروجين داخل غطاء الدخان الكيميائي لمدة 10 دقيقة أو حتى يتبخر المذيب وتشكل طبقة رقيقة من الدهون في الجزء السفلي من القارورة.
  4. تجفيف الخليط تحت فراغ ل ≥3 ح في قوة فراغ من 10 متور لإزالة أي المذيبات العضوية المتبقية.
    ملاحظة: الوقت ج 3 ساعة كافية لمقياس إعداد سيارات الدفع الرباعي وصفها في هذا البروتوكول، وهو ما يكفي ل 50 التجارب. إذا كان هناك حاجة إلى نطاق أوسع من إعداد سيارات الدفع الرباعي، ويمكن إجراء الجفاف بين عشية وضحاها.
  5. ترطيب الدكتور(20 ملي هيبيس، 100 ملي كلوريد الصوديوم، في درجة الحموضة 7.0) ووضعه في حمام بالموجات فوق الصوتية في تردد التشغيل من 35 كيلو هرتز لمدة 30 دقيقة في رت.
    ملاحظة: خلط كميات من الدهون المحددة في الخطوة 3.1 وإضافة 5 مل من العازلة تشغيل في الخطوة 3.5 يعطي تعليق الحويصلة في 0.5 ملغ / مل. في هذه المرحلة، تعليق الحويصلة هو مزيج من الحويصلات ونيلاميلار و مولتيلاميلار ( الشكل 2B ). الحل سوف تظهر الوردي / الأرجواني في اللون وعكر نسبيا.
  6. تجميد ذوبان الجليد تعليق الحويصلة مع النيتروجين السائل وحمام الماء في 40 درجة مئوية للحصول على الحويصلات ونيلاميلار. كرر تجميد ذوبان الجليد 10 مرات.
    ملاحظة: (اختياري) لضمان عدم وجود الحويصلات غير ونيلاميلار في تعليق، خطوة الطرد المركزي يمكن تطبيقها 32 ، 33 .
  7. قذف تعليق الحويصلة من خلال 0.10 ميكرون غشاء البولي محفور المسار باستخدام الطارد الدهون (انظرجدول المواد) لإثراء سيارات الدفع الرباعي. كرر قذف 10 مرات.
    ملاحظة: أنبوب مخروطي 15 مل يمكن استخدامها لجمع الحويصلات مقذوف. يجب أن يكون الحل باطلا من التعكر في هذه المرحلة. يمكن تأكيد قطر سيارات الدفع الرباعي عبر ديناميكية ضوء تشتت (دلس) ( الشكل 2C ). سيارات الدفع الرباعي هي الأنسب لتشكيل سلبس 34 .
  8. تغطية أنبوب مخروطي مع رقائق الألومنيوم وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام.

4. تجميع جهاز ميكروفلويديك

  1. اختبار مداخل ومنافذ كتلة بدمس للانسداد عن طريق تدفق الماء منزوع الأيونات من خلال الثقوب باستخدام زجاجة غسل المياه. ثم، وتجفيف كتلة بدمس مع غاز النيتروجين.
    ملاحظة: هذه الخطوة أيضا إزالة أي جزيئات الغبار التي قد تم المحاصرين داخل و / أو بين القنوات. إذا لزم الأمر، إزالة الغبار كوفرسليبس قبل تنظيفها مع غاز النيتروجين لإزالة أي جزيئات الغبار.
  2. وضع كتلة بدمس وقبل تنظيفها(انظر القسم 1) داخل نظام البلازما الأكسجين (انظر الجدول من المواد) غرفة العينة لفضح مع البلازما الأكسجين لمدة 45 ثانية مع وضع السلطة في 75 واط، وسرعة تدفق الأكسجين في 10 سم 3 / دقيقة، وقوة فراغ في 200 متور .
  3. وضع سطح منقوشة من كتلة بدمس في اتصال مع ساترة مباشرة بعد العلاج البلازما الأكسجين. اضغط بلطف لإزالة أي فقاعات الهواء في مواقع الاتصال.
  4. وضع الجهاز على لوحة الساخنة مستوى في 100 درجة مئوية لمدة 3 دقائق لتعزيز الترابط.
  5. استخدام مسح الرطب خالية من الوبر (على سبيل المثال كيمويب) مع الايثانول 100٪ لإزالة أي جزيئات الغبار من أعلى (بدمس) والجزء السفلي (الزجاج) من الجهاز. ثم، الشريط الجهاز على رأس شريحة المجهر الزجاج.
    ملاحظة: لا تستخدم كمية مفرطة من الإيثانول وتجنب الإيثانول الدخول في قنوات مدخل ومخرج. أداء هذه الخطوة في حين أن الجهاز لا يزال ساخنا ينصح لضمان أن يتبخر الإيثانول على الفور. مكر الزجاجيمكن تخزين الشرائح أوسكوبي في 100٪ من محلول الإيثانول لإزالة الغبار والملوثات الأخرى.

5. تشكيل الدعامات الداعمة المدعومة (سلبس)

  1. نقل 100 ميكرولتر من بي (4،5) P 2 - تحتوي على سيارات الدفع الرباعي من الخطوة 3.8 إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 0.65 مل. ضبط درجة الحموضة من الحل إلى ~ 3.2 عن طريق إضافة 6.4 ميكرولتر من 0.2 N حمض الهيدروكلوريك.
    ملاحظة: تأكيد الرقم الهيدروجيني للحل مع جهاز قياس الرقم الهيدروجيني مجهزة التحقيق الرقم الهيدروجيني الجزئي (انظر الجدول من المواد).
  2. ماصة 10 ميكرولتر من حل سوف المعدلة الهيدروجينية تعديلها في كل قناة من خلال مدخل وتطبيق الضغط من خلال ماصة حتى يصل الحل منفذ. فصل غيض من ماصة وتركها تعلق على الجهاز.
  3. كرر الخطوة أعلاه لكل قناة ومن ثم احتضان الجهاز لمدة 10 دقيقة في رت.
    ملاحظة: حقن الحويصلات في ميكروشانلز يجب أن يتم مباشرة بعد تجميع الجهاز.
  4. قطع مجموعات من مدخل ومخرج أنابيب إيتش 60 سم (أنابيب مدخل) و 8 سم (أنابيب منفذ) طويلة، على التوالي.
    ملاحظة: قطع الأنابيب قطريا وخلق حافة حادة، يجعل من السهل لإدراج الأنابيب في مداخل ومنافذ البيع. يجب أن يكون أنبوب المخرج شكل قوس. طول أنبوب مدخل قد تختلف بناء على إعداد المجهر. القطر الداخلي للأنبوب 0.05 سم.
  5. باستخدام ملاقط، وربط مجموعة أنابيب منفذ إلى الجهاز، ومن ثم الشريط الجهاز على مرحلة المجهر.
  6. غمر نهاية واحدة من أنابيب مدخل مجموعة في 25 مل من العازلة تشغيل الواردة في أنبوب مخروطي وشريط للتأكد من أن يتم تأمين الأنابيب.
  7. وضع أنبوب مخروطي على أرض مرتفعة (~ 20 سم) من الجهاز من أجل دفع الحل من خلال ميكروشانلز عبر تدفق الجاذبية. يمكن استخدام جاك مختبر لتحقيق ذلك.
  8. لكل أنبوب مدخل، استخدم حقنة لرسم 1 مل من العازلة تشغيل من نهاية حرة من الأنابيب. إزالة طرف ماصة من مدخل وإدراجنهاية الحرة من أنابيب مدخل في الجهاز.
    ملاحظة: إدخال قطرة من المخزن المؤقت تشغيل على مدخل للحد من احتمال فقاعة الهواء التي أدخلت في القناة خلال هذه الخطوة. بعد أن تعلق أنابيب مدخل إلى الجهاز، استخدم مسح خالية من الوبر لإزالة المخزن المؤقت الزائدة.
  9. كرر الخطوة أعلاه لتوصيل جميع قطع أنابيب مدخل إلى الجهاز.
    ملاحظة: تدفق العازلة تشغيل من خلال قنوات يساعد على إزالة الحويصلات الزائدة وتتوازن طبقة ثنائية إلى الظروف التجريبية.
  10. افتح برنامج التحكم المجهر (انظر جدول المواد). على اللوحة اليمنى، انقر على علامة التبويب "المجهر" واختيار الهدف "10X".
  11. انقر على "لايف" ثم الرموز "أليكسا 568" صورة على شريط الأدوات. باستخدام غرامة والمقررات تعديل بالطبع، والتركيز على ميكروشانلز.
  12. مسح من خلال الجهاز للتحقق من جودة سلبس والقنوات ( الشكل 8 ). ثم،انقر فوق "فل مصراع مغلق" رمز الصورة على شريط الأدوات.
  13. انقر على علامة التبويب "اكتساب"، وتحت "التعديلات الأساسية" حدد "وقت التعرض". اضبط وقت التعرض على "200 مللي ثانية".
  14. في اللوحة اليمنى، انقر على "اكتساب متعدد الأبعاد" وتحت قائمة المرشحات حدد القناة الحمراء (التي تحمل علامة "أليكسا 568"). ثم انقر على القائمة "انقضاء الوقت"، تعيين الفاصل الزمني إلى 5 دقائق، ومدة إلى 30 دقيقة، وانقر فوق "ابدأ".
    ملاحظة: استنادا إلى مدة (30 دقيقة) ومعدل التدفق (~ 1.0 ميكرولتر / دقيقة)، ويستخدم 30 ميكرولتر من العازلة تشغيل لتوازن سلب داخل قناة، أي 240 ميكرولتر من تشغيل العازلة يستخدم لجميع القنوات 8.
  15. حدد أداة "الدائرة" ضمن علامة التبويب "قياس" ورسم دائرة في أي قناة. انقر بزر الماوس الأيمن أثناء تحديد الدائرة واختر "خصائص". ضمن علامة التبويب "الملف الشخصي"، تحقق من "كل T" لعرضكثافة مضان باعتبارها وظيفة من الزمن.
    1. تأكد من وصول هذا المنحنى إلى هضبة، مما يشير إلى التوازن، قبل الشروع في الخطوة التالية.
  16. اخفض حل المخزن المؤقت إلى أرضية متساوية مثل الجهاز لإيقاف التدفق.
  17. حفظ ملف الفاصل الزمني.

6. اختبار بلك-δ1 ف مجال التفاعل مع بي (4،5) P 2- سلبس التي تحتوي على

  1. إعداد التخفيفات من المجال ف باستخدام المخزن المؤقت تشغيل كمخفف.
    ملاحظة: نظرا لوجود ثماني قنوات داخل الجهاز، استخدم اثنين على الأقل من عناصر التحكم الفارغة. اختيار نهايات بعيدة على كل جانب واستخدام القنوات المتبقية لتخفيفات البروتين. تم اختبار تركيزات المجال ف التالية: 0.10، 0.25، 0.50، 1.00، 2.50 ميكرومتر. كان ما يقرب من 200 ميكرولتر من كل التخفيف كافية للوصول إلى التوازن في غضون 30 دقيقة.
  2. واحد في وقت واحد، فصل كل أنابيب منفذ وتطبيق 200 ميكرولتر من كل تخفيف البروتين فيقناة منفذ باستخدام ماصة. لا تنطبق أي ضغط، والسماح الجاذبية القيام بهذا العمل. فصل غيض من ماصة وتركها تعلق على الجهاز ميكروفلويديك.
  3. كرر الخطوة أعلاه لكل قناة والتأكد من أن فقاعات الهواء لم يتم إدخالها في القنوات أثناء هذه العملية.
  4. خفض أنابيب مدخل إلى الأرض تحت جهاز ميكروفلويديك لبدء تدفق البروتين من خلال ميكروشانلز. شريط نهاية خالية من الأنابيب إلى حاوية النفايات. تدفق التخفيفات البروتين لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: هذا سوف عكس تدفق والسماح للبروتين ليتم إدخالها في القنوات. الوقت إلى موازنة وحجم التخفيفات البروتين اللازمة سوف تعتمد على تقارب التفاعل.
  5. على اللوحة اليسرى من البرنامج، ضمن علامة التبويب "الفاصل الزمني"، انقر على "ابدأ" لبدء التصوير مرة أخرى.
  6. كرر الخطوة 5.15 للتأكد من التوصل إلى التوازن. عند اكتمال التجربة، احفظ الفاصل الزمنيملف.

7. تقييم سيولة الغشاء

ملاحظة: مضان استعادة بعد التجارب فوتوبلاشينغ (فراب) ينبغي أن يؤديها مع كل دفعة جديدة من سيارات الدفع الرباعي ونظافة كوفرسليبس الزجاج للتأكد من أن سلبس هي السوائل.

  1. اتبع الإجراء لتنظيف كوفرسليبس الزجاج (1.1-1.6)، افتعال كتل بدمس ميكروباترنيد (2.1-2.5)، وإعداد سيارات الدفع الرباعي (3.1-3.8)، وتجميع جهاز ميكروفلويديك (4،1-4،5) وتشكيل سلبس (5.1-5.17) كما كان من قبل وصفه.
  2. التركيز المجهر على طبقة ثنائية، تعيين وقت التعرض إلى 200 مللي ثانية، و بينينغ إلى 1.
  3. الصورة التبييض بقعة دائرية باستخدام 532 نانومتر، شعاع الليزر 2 ميغاواط (13 ميكرومتر دائرة نصف قطرها). مباشرة بعد فوتوبلاشينغ، بدء التقاط سلسلة من الصور كل 3 ثوان ل 45 الأولى s، تليها فترة 30 ثانية للفترة المتبقية من الوقت (15 دقيقة المدة الإجمالية). مرة واحدة اكتساب البيانات كاملة، احفظ ملف الفاصل الزمني.
  4. حدد المبيض aريا باستخدام أداة الرسم الدائرة لاستخراج القيم كثافة مضان كدالة من الوقت. بالإضافة إلى ذلك، حدد منطقتين أخريين قريبتين، أحدهما يقابل منطقة غير مقفلة وواحدة تقابل منطقة دون أي سلبس.
  5. حساب الانتعاش مضان ( ذ ) باستخدام المعادلة التالية:
    معادلة
    ملاحظة: هنا F ر يمثل شدة المنطقة المبيضة كدالة من الوقت، F ط يمثل كثافة مضان قبل التبييض (استخدام "1" كقيمة تطبيع في هذه الحالة). F 0 هو شدة الخلفية.
  6. مؤامرة الانتعاش مضان (المحور ص) كدالة من الوقت (محور س) لتوليد منحنى فراب. ثم، تناسب البيانات إلى وظيفة أسي واحدة على النحو التالي،
    معادلة
    ملاحظة: هنا يمثل A جزء المحمول و ر 1/2 ):
    معادلة
  7. استخدم t 1/2 لحساب ثابت الانتشار ( D ):
    معادلة
    ملاحظة: هنا R يمثل شعاع الليزر شعاع (13 ميكرون). يجب أن يكون ثابت الانتشار لطبقة ثنائية السوائل ≥1.0 ميكرون 2 / ثانية.

8. معالجة البيانات

ملاحظة: سوف روتين تحليل البيانات تعتمد على المجهر، برامج معالجة الصور، والبرمجيات منحنى المناسب المستخدمة.

  1. فتح ملفات مرور الوقت من قبل (من الخطوة 5.17) وبعد (من الخطوة 6.6) معايرة المجال ف. انتقل إلى الإطار الأخير من كل ملف الفاصل الزمني والقيام مسح خط عبر جميع ميكروشانلز للحصول على فلوريسكالبيانات كثافة شدة بوصفها وظيفة من المسافة في بكسل ( الشكل 6A ). نقل البيانات إلى برنامج جدول بيانات.
  2. لكل قناة (قبل وبعد إضافة المجال ف)، عينة بعض البيانات داخل القناة وأي من جانبي القناة تمثل خط الأساس ( الشكل 7A ).
    ملاحظة: يجب أن تبقى فارغة مضان قناة كثافة دون تغيير. يتم تطبيع جميع القنوات الأخرى إلى قناة فارغة، لذلك فمن الأهمية بمكان أن يكون اثنين من القنوات فارغة وتأكد من أن كثافة مضان تبقى متسقة مع بعضها البعض.
  3. تطبيق الصيغة أدناه لتطبيع البيانات إلى القناة الفارغة؛ ويرد حساب عينة في الشكل 7B .
    معادلة
    ملاحظة: هنا ΔF البروتين يمثل الخلفية تطرح شدة مضان من قناة البروتين، Δ، F فارغة يمثل خلفية طرح كثافة مضان القناة فارغة، قبل وبعد الرجوع إلى ما قبل وبعد خطوات البروتين المعايرة، ويمثل α عامل التصحيح الذي هو نسبة كثافة مضان من قناة البروتين والقناة فارغة ([ F بروتين / F فارغة ] قبل ) في خطوة المعايرة قبل البروتين. وبما أن كثافة مضان تنخفض كدالة لتركيز المجال ف، فإن البيانات تطبيع تكون سلبية في القيمة.
  4. باستخدام برنامج منحنى المناسب (انظر الجدول المواد )، مؤامرة مضان تطبيع كدالة من تركيز المجال ف وتناسب إيسوثرم لانغموير ( الشكل 6C ):
    معادلة
    ملاحظة: هنا ΔF يمثل التغيير في كثافة مضان بالنسبة إلى أقصى تغيير في فلو( ΔF ماكس )، في حين أن K د، التطبيق يمثل ثابت التفكك الظاهري، وهو ما يعادل تركيز البروتين السائبة ( [بلك-δ1 ف] ) التي 50٪ تغطية (عند تركيز التشبع من البروتين موجود ( ΔF ماكس ) غشاء مجمع معقدة). هذا هو قياس ملزمة على أساس التوازن حتى البيانات تطبيع يصلح ل إيسوثرم لانجموير بسيط لاستخراج المعلمة التجريبية واضح K د، التطبيق . استنادا إلى البرامج المناسب K د، التطبيق ل بلك-δ1 ف-بي (4،5) P 2 التفاعل هو 0.39 ± 0.05 ميكرومتر ( الشكل 6B ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استخدمنا فحص ف التحوير لدراسة بلك-δ1 ف المجال بي (4،5) P 2 التفاعل داخل ميكروديفيس بيب على رقاقة ( الشكل 1 ). من خلال بروتوكول مفصل، أثبتنا كيفية إعداد وتجميع مكونات جهاز ميكروفلويديك، وجعل الحويصلات ونيلاميلار صغيرة (سيارات الدفع الرباعي) ( الشكل 2 )، شكل سلبس داخل جهاز ( الشكل 3 )، واختبار البروتين ملزمة ل سلب التي تحتوي على بيب. ويرد مخطط انسيابي لتجربة ملزمة سلب نموذجي في الشكل 4 . ويوضح الشكل 5 مقايسة التشكيل الرقم الهيدروجيني في الشكل 5 باستخدام ف المجال بي (4،5) P 2 ملزمة كمثال. النتائج التي تم الحصول عليها من هذه الدراسة تشير إلى أن مجال ف يرتبط بي (4،5) P 2 - تحتوي على سلبس. وبشكل أكثر تحديدا، لاحظنا أنه عند الربط، أصبح الرقم الهيدروجيني المحلي أكثر أساسية. هذه تغيرت درجة الحموضة المحلية تغير من قبل س سرب-بوب التحقيق الفلورسنت موجودة داخل سلبس، الذي تم إخماد وفقا لذلك ( الشكل 6A ، 6C ). وكان التبريد تعتمد تعتمد و مشبعة، وبالتالي تركيب البيانات إلى إيسوثرم لانجموير K د، التطبيق من 0.39 ± 0.05 ميكرومتر ( الشكل 6B ، 6D ). وأظهر المجال ف الانتقائية نحو بي (4،5) P 2 لأنه لم يلاحظ أي ملزمة نحو الملوثات العضوية الثابتة (زويتريونيك الدهون)، وأضعف ملزم نحو سلبس PI4P ( K د، التطبيق = 1.02 ± 0.20 ميكرومتر) ( الشكل 6B ). يتم تضمين حساب عينة لإظهار كيفية معالجة البيانات مضان ( الشكل 7 ). في الشكل 8 ، يتم عرض سلسلة من الصور متناهية الصغر لتوفير أدلة مرئية في تحديد نوعية سلبس و ميكروشانلز.

_content "فو: كيب-together.within-بادج =" 1 "> شكل 1
الشكل 1: بيب على رقاقة جهاز ميكروفلويديك لدراسة التفاعلات البروتين بيب. ( A ) جهاز ميكروفلويديك ديه 8 ميكروشانلز مع 8 مداخل و 8 منافذ. تم تدفق حلول ملونة من خلال جعل القنوات مرئية في هذه الصورة. الجهاز هو 2.0 سم في العرض (س)، 0.5 سم في الارتفاع (ذ)، و 3.0 سم في الطول (ض). ( ب ) الكلمة من ميكروشانلز هو الزجاج، في حين أن الجدران والسقوف تتكون من بوليديميثيلزيلوكسان (بدمس). كل ميكروشانل هو 100 ميكرون في العرض، 40 ميكرون في الطول، و 1 سم في الطول. التباعد بين ميكروشانلز اثنين المتاخمة هو 40 ميكرون. يتم تشكيل طبقات ثنائية الداعم (سلبس) على سطح الزجاج. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. الحويصلة ونيلاميلار الصغيرة (سيارات الدفع الرباعي) إعداد ودراسات مراقبة الجودة. (A) مكونات الدهون المستخدمة في صنع حويصلات: أورثو -Sulforhodamine B-البابا SRB-البابا)، L-α-فوسفتيدلينوستول-4-الفوسفات (PI4P)، L-α-فوسفتيدلينوستول-4،5-bisphosphate ( بي (4،5) P 2 )، و 1-بالميتويل-2-oleuell- سن -glycero-3-فسفوشولين (بوب). ( B ) أنواع الحويصلات الدهنية: سوف، حويصلة ونيلاميلار كبيرة (لوف)، حويصلة ونيلاميلار العملاقة (غوف)، وحويصلة متعددة الصفائح (ملف). سيارات الدفع الرباعي هي الأنسب لإعداد سلبس 34 . ( C ) تشتت الضوء الديناميكي (دلس) تأكيد مقرها على حجم الحويصلات بعد الدهون البثق (من خلال 0.1 ميكرون فلتر). نصف قطر الهيدروديناميكية (ر) من 53.9 نانومتر يؤكد أن م إين من توزيع حجم حويصلة هو ~ 100 نانومتر. وتمثل النتائج القياس من بي (4،5) P 2 - التي تحتوي على سيارات الدفع الرباعي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل 3: تشكيل سلب على دعم الزجاج. ( A ) يتم إعداد حويصلات تكوين الدهون المطلوب ومن ثم تتدفق من خلال ميكروشانلز. يتم كثف الحويصلات على سطح الزجاج وتشوه. مرة واحدة يتم تحقيق تغطية سطحية حرجة، الحويصلات تمزق بشكل عفوي لتشكيل سلبس. مقتبس من المراجع 35 ، 36 . ( B ) سلبس داخل جهاز تحت هدف 10X هو مبين. يتم استخدام اليكسا 568 مجموعة فلتر (الإثارة / الانبعاثات في 576/603 نانومتر).ource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig3large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4
الشكل 4: مخطط انسيابي لتجربة ملزمة سلب نموذجية. مكونات الجهاز ميكروفلويديك أي منقوشة بدمس كتلة وتنظيف كوفرسليبس، يتم التعامل مع البلازما الأكسجين لجعل كلا الأسطح ماء ثم تجميعها. وتتدفق سيارات الدفع الرباعي من خلال ميكروشانلز لتشكيل سلبس. تتم إزالة الحويصلات الزائدة ويتم معايرة سلبس إلى الظروف التجريبية عن طريق تدفق حل العازلة تشغيل. ثم، وتتدفق التخفيفات البروتين من خلال ميكروشانلز. وأخيرا، يتم تحليل البيانات شدة مضان، تطبيع، وتآمر كدالة من تركيز البروتين. البيانات تطبيع يصلح لوظيفة لاستخراج ثابت التفكك واضح ( K د، التطبيق ) فاLUE. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5
الشكل 5: مبادئ الاستشعار القائم على التشكيل الرقم الهيدروجيني. ( A ) هيكل الكريستال بالأشعة السينية للمجال بلك-δ1 ف في مجمع مع بي (4،5) P 2 رئيس مجموعة إينوسيتول 1،4،5-تريسفوسفهات (إنز (1،4،5) P 3 ) (بدب إد: 1MAI) 37 . (ب) س SRB-البابا التحقيق هو فلوري غاية في انخفاض الرقم الهيدروجيني وتطفأ في درجة الحموضة العالية مع الباكاف الحمضية من 6.7 في 7.5 مول٪ PI (4،5) P 2 التي تحتوي SLBs كما هو مبين في منحنى درجة الحموضة المعايرة. ( C ) المجال ف المستخدمة في هذه الدراسة لديها نقطة إسويلكتريك (بي) من 8.4، وذلك في درجة الحموضة التجريبية (7.0) البروتين مشحونة إيجابيا. تحمل صافي إيجابي جهارج، البروتين يجذب أوه - أيونات. عندما يتحد المجال PH إلى PI (4،5) P 2 التي تحتوي SLBs، فإنه يجلب OH - الأيونات على سطح الغشاء، والتضمين إمكانية بينية والذي بدوره يحول الدولة بروتوناتيون من س SRB-البابا، ومضان لها يتم إخمادها في ف تعتمد على التركيز على نطاق المجال. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6
الشكل 6: بلك-δ1 ف غشاء ملزمة رصدها عن طريق تعديل الرقم الهيدروجيني. ( A ) وجهة نظر ميكروشانلز قبل وبعد إضافة مجال ف في تركيزات المشار إليها. ( ب ) مقارنة الارتباطات نحو الملوثات العضوية الثابتة، PI4P، و بي (4،5) P 2 - تحتوي على سلبس. نطاق نطاق ف إلى 7.5 مول٪ بي (4،5) P 2 - تحتوي على سلبس K د، التطبيق من 0.39 ± 0.05 ميكرومتر. لوحظ ضعف ملزم نحو 7.5 مول٪ PI4P المحتوية على سلبس ( K د، التطبيق من 1.02 ± 0.20 ميكرومتر) ولم يلاحظ أي ملزمة ل سوبس نقية بوبك. أشرطة الخطأ تشير سيم (ن = 3). ر -test كان يستخدم لمقارنة الانتماءات بين PI4P وPI (4،5) P 2 ملزمة (* ع = 0.0396) اثنين الذيل. ( C ) يتم تكثيف شدة الإسفار من مسح خط عبر ميكروشانلز بوصفها وظيفة المسافة بالبكسل ل بوب، PI4P، و بي (4،5) P 2 التجارب ملزمة. ( D ) يتم رسمها المعياري ومتوسطا بوب، PI4P، و بي (4،5) P 2 البيانات ملزمة كدالة ل بلك-δ1 تركيز المجال ف ومن ثم يصلح ل إيسوثرم لانغموير لاستخراج K د، التطبيق . انظر المعادلة في الخطوة 8.4 للحصول على التفاصيل."تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7
الشكل 7: حساب العينة لمعالجة البيانات. ( A ) قبل (أسود) وبعد (الأحمر) البروتين المعايرة خط مسح البيانات فارغة (لا البروتين) وقناة البروتين، حيث يتم عرض البيانات كثافة مضان بوصفها وظيفة من المسافة في بكسل. وتمثل المناطق المظللة المناطق التي استخدمت لاستخراج البيانات للحسابات. يتم استخراج البيانات شدة خط الأساس مضان الحق قبل وبعد كل قناة. ( ب ) يتم استخراج البيانات لقنوات فارغة والبروتين، سواء قبل وبعد معايرة البروتين. يتم أخذ المتوسطات لخط الأساس وضمن بيانات مضان القناة. بعد الطرح الأساسي، يتم تطبيع البيانات مضان لقناة فارغة. راجع المعادلة في الخطوة 8.3 للحصول على التفاصيل. هريف = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig7large.jpg" تارجيت = "_ بلانك"> الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8
الشكل 8: تقييم سلامة سلبس و ميكروشانلز. ( A ) صورة توضح سلبس ذات جودة عالية و ميكروشانلز. ( ب ) الانصهار غير مكتملة. ( C ) تنصهر ميكروشانلز. ( D ) جسيمات الغبار المحاصرين داخل متناهية. ( E ) فقاعات الهواء المحاصرين داخل ميكروشانلز. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملف تكميلي 1: Pattern_Design.dwgفارغة "> الرجاء انقر هنا لتحميل الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

كل البديل بيب، وإن كان في تركيزات منخفضة، موجود على سطح عصاري خلوي من عضيات محددة حيث أنها تسهم في إنشاء تكوين البدني الفريد والخصوصية الوظيفية للغشاء العضوي 1 . واحدة من أهم استخدامات بيبس هو بمثابة منصة لرسو السفن محددة للعديد من البروتينات التي تتطلب توطين خلوية محددة و / أو تفعيل 6 ، 7 . نظرا لدورهم في علم وظائف الأعضاء الخلوية والمرض، والقدرة على دراسة التفاعلات البروتين بيب في المختبر ، في سياق ذات الصلة فسيولوجيا مهم. صيغة فحص الموصوفة هنا يسمح واحد للنظر التفاعلات البروتين بيب في سياق طبقة ثنائية الدهون السائل، في وجود خليط من الفوسفورية، مع العرض الطبيعي للمجموعة الرأسية القطبية، وسلاسل أسيل الدهنية طول الطبيعي.

هذا الفحص، في كومبيناتيعلى مع التشكيل الرقم الهيدروجيني كما نظام الكشف، و سلبس كنظام غشاء نموذج مجموعة في منصة ميكروفلويديك، ويوفر مزايا فريدة من نوعها بالمقارنة مع غيرها من تقنيات ملزمة الغشاء. أولا وقبل كل شيء، منصة ميكروفلويديك يحفظ على المواد بسبب متطلبات انخفاض حجم كل من البروتين والدهون المستخدمة (40 نل حجم القناة بشكل عام، 1.0 مم 2 سلب مساحة السطح). وبالإضافة إلى ذلك، تركيبات الدهون ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية يمكن استخدامها، في حين لا يزال الحفاظ على سيولة غشاء ثنائي الأبعاد (≥1.0 ميكرون 2 / ثانية) 28 ، 38 . يوفر نظام الكشف تحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء مقارنة إيتس، سير، والكوارتز الكريستال الجزئي مع تبديد (قم-D) الرصد، والذي يسمح لاختبار ليس فقط التفاعلات غشاء البروتين ولكن أيون، جزيء صغير، والتفاعلات غشاء الببتيد كما جيد 19 ، 20 ، 39 ، 40 . أيضا، ودرجة الحموضة التحقيق الفلورسنت حساسة للغاية ولا فوتوبلاش تحت ظروف تجريبية اختبار 19 ، 20 ، 41 . ميزة أخرى من هذا المنبر هو القدرة على مراقبة السطوح الغشاء بصريا. بعض التفاعلات قد تحفز تشكيل ميكرودومين الدهون و / أو تؤثر على سيولة الغشاء، والتي يمكن تصور مباشرة و / أو اختبارها عن طريق الانتعاش مضان بعد فوتوبلاشينغ (فراب)، على التوالي 42 . الفحص الموصوف هنا لا يتطلب أي أجهزة مكلفة وراء المجهر مضان. وأخيرا، والأهم من ذلك، وتقييم التفاعلات الغشاء في غياب التوسيم / مستقبلات وضع العلامات يجعل بيب على رقاقة فحص الطريقة المفضلة على تلك التقليدية.

على الرغم من أن بيب على رقاقة فحص هو تقنية قوية، يمكن أن البروتينات الغشاء الطرفية ديفإيه في التركيب العام للمخلفات الموجبة والأنيونية وتوزيعها داخل / حول الموقع الملزم، مما يخلق بعض التحديات. بعض البروتينات لديها مواقع ملزمة بيب تتكون من العديد من المخلفات الأساسية، في حين أن البعض الآخر لديها سوى عدد قليل. ولذلك، فإن نسبة H + / أوه - في موقع الربط ستكون مختلفة، وذلك هو حجم التغيير في درجة الحموضة المحلية عند ملزمة. إن الكيمياء المتفاعلة للتفاعل وعما إذا كان ملزم بيب قد استقر من خلال التفاعلات مع الدهون الأخرى يزيد من تعقيد الحالة. وبالتالي، فإن بي من البروتين، وخاصة بالنسبة للبروتين كبير، قد لا يكون المؤشر الوحيد للتغير مضان المتوقع. في حين أن بعض التفاعلات البروتين-بيب يؤدي إلى تغييرات مضان كبيرة، والباقي قد يؤدي إلى تغييرات مضان صغيرة. في الحالة الأخيرة، يمكن اتخاذ اثنين على الأقل من الإجراءات لتعزيز نسبة الإشارة إلى الضوضاء: 1) باستخدام مستويات بيب أكبر على طبقة ثنائية لزيادة عدد البروتينات صecruited إلى السطح، أي زيادة عدد المعينين OH - الأيونات وعدد س جزيئات SRB-البابا مروي. 2) زيادة س المستويات SRB-البابا لتعزيز إشارة إلى نسبة الضوضاء.

على الرغم من أن النظام الأساسي الحالي يوفر العديد من المزايا لدراسة البروتينات الغشاء الطرفية، لديه بعض التحديات لدراسة البروتينات الغشائية. بسبب القرب دعم سلب الزجاج (طبقة المياه حوالي 1-2 نانومتر اعتمادا على تكوين الدهون)، الغشاء البروتيني دعم دعم الزجاج يمكن أن تعزز تمسخ البروتين، يؤدي إلى فقدان وظيفة، وتجميد 34 ، 43 ، 44 ، 45 . على الرغم من أن أكثر انخراطا، وقد وضعت مجموعة متنوعة من النهج للتغلب على هذه التحديات، مثل تعديل سطح الدعم الزجاجي لتوفير وسادة البوليمر أو بما في ذلك ليبوبوليم(على سبيل المثال الدهون المفرغة) داخل طبقة ثنائية لزيادة المسافة دعم الزجاج سلب 34 ، 46 ، 47 ، 48 .

تشكيل عالية الجودة سلبس هو الجانب الأكثر أهمية من بيب على اساس رقاقة فحص ( الشكل 8A ). ينصح باستخدام كوفرسليبس نظيفة وسيارات الدفع الرباعي جديدة لضمان استنساخه. بسبب وجود الدهون الأيونية، مثل بي (4،5) P 2 ، سيارات الدفع الرباعي مشحونة سلبا، مما يقلل من كفاءة سيارات الدفع الرباعي تمزق وتؤثر على سيولة الغشاء ( الشكل 8B ). لذلك، تعديل درجة الحموضة من حل سوف أمر حاسم لبروتونات بي (4،5) P 2 فوسفات مجموعة الرأس وتقليل التنافر الكهربائي مع الزجاج لزيادة كفاءة تمزق 49 ، 50 . سيارات الدفع الرباعي التي لا تحتوي على أنيوني لإيبيدس، لا تتطلب أي تعديل الرقم الهيدروجيني. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي حقن سيارات الدفع الرباعي في قنوات الحق بعد العلاج البلازما الأكسجين والترابط، في حين أن سطح ساترة الزجاج لا يزال ماء، وهو مطلوب لتشكيل سلب. بالإضافة إلى جودة سلب، جزيئات الغبار تمثل قضية أخرى. أثناء عملية تصنيع الجهاز، يمكن أن يسبب جسيم الغبار المحاصر بين القنوات انصهار القناة، في حين أن جسيم الغبار المحاصر داخل قناة يمكن أن يضر سلب و / أو يقلل من سرعة تدفق الحل ( الشكل 8C، 8D ). يجب تنظيف منطقة العمل بشكل دوري لإزالة الغبار. وبالمثل، ينبغي تجنب التعرض فقاعة الهواء في قناة في أي خطوة، والتي من شأنها أن تلحق الضرر سلب لا رجعة فيه ( الشكل 8E ).

معلمة أخرى للنظر عند التخطيط ل بيب على رقاقة الفحص هو المخزن المؤقت تخزين البروتين. إذا استخدمت في تركيزات عالية، والمكونات الفردية (عوامل استقرارية، عوامل اختزال، أملاح، عوامل مضادة للميكروبات، الكواشف المخلبية، الخ ) قد تؤثر على مضان و / أو سلامة سلب. لذلك، يجب أن يتم معايرة مخزن التخزين المؤقت لاختبار تأثيره. إذا لوحظ تأثير، وينبغي أيضا أن تكون معادلة سلبس إلى ظروف التخزين المؤقت قبل معايرة البروتين لمنع الانجراف في مضان. وبالنظر إلى أن هذا هو فحص الرقم الهيدروجيني على أساس التشكيل، إذا كان ذلك ممكنا، يجب أن تحتوي على البروتين المنقى أيضا نفس عنصر التخزين المؤقت كما العازلة تشغيل (في هذه الحالة 20 ملي هيبيس في درجة الحموضة 7.0) للحد من الانجراف في مضان الناجمة عن عدم تطابق العازلة.

في الختام، لقد أثبتنا أن فحص الرقم الهيدروجيني التشكيل يمكن استخدامها بنجاح للتحقيق التفاعلات البروتين بيب. على الرغم من أن التركيز على بيبس، ويمكن استخدام هذه المنصة لاختبار التفاعلات مع أنظمة الغشاء أكثر تعقيدا التي تشمل الدهون الأخرى ذات الصلة فسيولوجيا مثل فوسفاتيديليسيرين، فوسفهاتيديليثانولامين، حمض فوسفهاتيديك، والكوليسترول، من بين أمور أخرى 28 ، 39 ، 42 ، 51 . أبعد من البروتينات الخلوية، يمكن لهذه المنصة فحص أيضا أن تكون مفيدة لأولئك الذين يدرسون مسببات الأمراض البشرية. على سبيل المثال، أظهرت البروتينات المشفرة بواسطة الفيروسات والبكتيريا أن تتفاعل مع الأغشية الخلوية وبعض على وجه التحديد مع بيبس 52 ، 53 ، 54 ، 55 ، 56 . وفقا لذلك، بيب على اساس رقاقة الفحص يمكن أن توفر وسيلة لاكتشاف وتوصيف مثبطات جزيء صغير من التفاعلات البروتين بيب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

دس و سيس، جزئيا، بمنحة AI053531 (نييد، نيه)؛ تم دعم سس و بسك بالمنحة N00014-14-1-0792 (أونر).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslip
Glass Coverslips: Rectangles Fisher Scientific 12-544B 22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass
7X Cleaning Solution MP Biomedicals 976670 Detergent
PYREX Crystallizing Dish Corning 3140-190 Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0 Paragon Industries SC-2 Kiln
Name Company Catalog Number Comments
PDMS
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 4019862 Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives
PYREX Desiccator VWR 89134-402 Vacuum Rated
Biopsy punch Harris 15110-10 Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative
Name Company Catalog Number Comments
Device
Plasma Cleaning System PlasmaEtch PE25-JW 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged)
Digital Hot Plate Benchmark H3760-H Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640)
Frosted Micro Slides VWR 48312-003 Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144
Name Company Catalog Number Comments
Mold
AutoCAD Autodesk v.2016 Drafting software for the photomask design
Photomask CAD/Art Services N/A Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services
Silicone Wafers University Wafer 1575 Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness
SU-8 50 MicroChem Corp. N/A Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property
SU-8 Developer MicroChem Corp. N/A Penn State Nanofabrication Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
SUV
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate Avanti Polar Lipids 840045X PI4P
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate Avanti Polar Lipids 840046X PI(4,5)P2
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757C POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) ThermoFisher Scientific L-20 Required for the synthesis of oSRB-POPE
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) In-house N/A In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013)
Glass Scintillation Vial VWR 66022-065 20 mL volume capacity
Aquasonic 250D VWR N/A Ultrasonic Water Bath
Nuclepore Track-Etched Membranes Whatman 110605 Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich
Chloroform VWR CX1054-6 HPLC grade
LIPEX Extruder Transferra Nanosciences T.001 LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder
Viscotek 802 DLS Malvern Instruments N/A Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
Data Analysis
GraphPad Prism GraphPad Software v.6 Curve-fitting software for data analysis
Name Company Catalog Number Comments
Microscope
Axiovert 200M Epifluorescence Microscope Carl Zeiss Microscopy N/A Microscope
AxioCam MRm Camera Carl Zeiss Microscopy N/A Camera
X-Cite 120 Excelitas Technologies N/A Light Source
Alexa 568 Filter Set Carl Zeiss Microscopy N/A Ex/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software Carl Zeiss Microscopy N/A Image Processing Software
Name Company Catalog Number Comments
Other
Tips VWR 10034-132 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel
Tips VWR 53509-070 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel
Orion Star A321 pH meter Thermo Scientific STARA3210 pH meter
Orion micro pH probe Thermo Scientific 8220BNWP micro pH probe
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) VWR VWRB30487 HEPES, Free Acid
Sodium Chloride VWR BDH8014-2.5KGR NaCl
Tubing Allied Wire & Cable TFT-200-24 N Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color
Nitrogen Gas - Industrial Praxair N/A Local Provider
Oxygen Gas - Industrial Praxair N/A Local Provider
Liquid Nitrogen Praxair N/A Local Provider

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443, (7112), 651-657 (2006).
  2. Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K. Phosphoinositides in cell architecture. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (8), a004796 (2011).
  3. Picas, L., Gaits-Iacovoni, F., Goud, B. The emerging role of phosphoinositide clustering in intracellular trafficking and signal transduction. F1000Res. 5, (2016).
  4. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Lett. 590, (15), 2454-2468 (2016).
  5. Balla, T. Phosphoinositides: Tiny lipids with giant impact on cell regulation. Physiol Rev. 93, 1019-1137 (2013).
  6. Lemmon, M. A. Membrane recognition by phospholipid-binding domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, (2), 99-111 (2008).
  7. Kutateladze, T. G. Translation of the phosphoinositide code by PI effectors. Nat Chem Biol. 6, (7), 507-513 (2010).
  8. Harlan, J. E., Hajduk, P. J., Yoon, H. S., Fesik, S. W. Pleckstrin homology domains bind to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Nature. 371, (6493), 168-170 (1994).
  9. Garcia, P., et al. The pleckstrin homology domain of phospholipase C-delta 1 binds with high affinity to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in bilayer membranes. Biochemistry. 34, (49), 16228-16234 (1995).
  10. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (23), 10472-10476 (1995).
  11. Flesch, F. M., Yu, J. W., Lemmon, M. A., Burger, K. N. Membrane activity of the phospholipase C-delta1 pleckstrin homology (PH) domain. Biochem J. 389, 435-441 (2005).
  12. Narayan, K., Lemmon, M. A. Determining selectivity of phosphoinositide-binding domains. Methods. 39, (2), 122-133 (2006).
  13. Scott, J. L., Musselman, C. A., Adu-Gyamfi, E., Kutateladze, T. G., Stahelin, R. V. Emerging methodologies to investigate lipid-protein interactions. Integr Biol (Camb). 4, (3), 247-258 (2012).
  14. Dowler, S., Currie, R. A., Downes, C. P., Alessi, D. R. DAPP1: A dual adaptor for phosphotyrosine and 3-phosphoinositides. Biochem J. 342, 7-12 (1999).
  15. He, J., et al. Molecular basis of phosphatidylinositol 4-phosphate and ARF1 GTPase recognition by the FAPP1 pleckstrin homology (PH) domain. J Biol Chem. 286, (21), 18650-18657 (2011).
  16. Ceccarelli, D. F., et al. Non-canonical interaction of phosphoinositides with pleckstrin homology domains of Tiam1 and ArhGAP9. J Biol Chem. 282, (18), 13864-13874 (2007).
  17. Huang, S., Gao, L., Blanchoin, L., Staiger, C. J. Heterodimeric capping protein from Arabidopsis is regulated by phosphatidic acid. Mol Biol Cell. 17, (4), 1946-1958 (2006).
  18. Yu, J. W., et al. Genome-eide analysis of membrane targeting by S. cerevisiae pleckstrin homology domains. Mol Cell. 13, (5), 677-688 (2004).
  19. Jung, H., Robison, A. D., Cremer, P. S. Detecting protein-ligand binding on supported bilayers by local pH modulation. J Am Chem Soc. 131, (3), 1006-1014 (2009).
  20. Huang, D., Zhao, T., Xu, W., Yang, T., Cremer, P. S. Sensing small molecule interactions with lipid membranes by local pH modulation. Anal Chem. 85, (21), 10240-10248 (2013).
  21. Saxena, A., et al. Phosphoinositide binding by the pleckstrin homology domains of Ipl and Tih1. J Biol Chem. 277, (51), 49935-49944 (2002).
  22. Knödler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. Biotechniques. 38, (6), 858-862 (2005).
  23. Baumann, M. K., Swann, M. J., Textor, M., Reimhult, E. Pleckstrin homology-phospholipase C-delta1 interaction with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate containing supported lipid bilayers monitored in situ with dual polarization interferometry. Anal Chem. 83, (16), 6267-6274 (2011).
  24. Saliba, A. E., et al. A quantitative liposome microarray to systematically characterize protein-lipid interactions. Nat Methods. 11, (1), 47-50 (2014).
  25. Arauz, E., Aggarwal, V., Jain, A., Ha, T., Chen, J. Single-molecule analysis of lipid-protein interactions in crude cell lysates. Anal Chem. 88, (8), 4269-4276 (2016).
  26. Best, Q. A., Xu, R., McCarroll, M. E., Wang, L., Dyer, D. J. Design and investigation of a series of rhodamine-based fluorescent probes for optical measurements of pH. Org Lett. 12, (14), 3219-3221 (2010).
  27. Lee, J., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6, (1), 1-18 (2014).
  28. Poyton, M. F., Sendecki, A. M., Cong, X., Cremer, P. S. Cu(2+) binds to phosphatidylethanolamine and increases oxidation in lipid membranes. J Am Chem Soc. 138, (5), 1584-1590 (2016).
  29. Karasek, P., Grym, J., Roth, M., Planeta, J., Foret, F. Etching of glass microchips with supercritical water. Lab Chip. 15, (1), 311-318 (2015).
  30. Thomas, M. S., et al. Print-and-peel fabrication for microfluidics: what's in it for biomedical applications? Ann Biomed Eng. 38, (1), 21-32 (2010).
  31. Waheed, S., et al. 3D printed microfluidic devices: enablers and barriers. Lab Chip. 16, (11), 1993-2013 (2016).
  32. Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers. J Vis Exp. (105), e53158 (2015).
  33. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16, (12), 2806-2810 (1977).
  34. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61, (10), 429-444 (2006).
  35. Hamai, C., Yang, T., Kataoka, S., Cremer, P. S., Musser, S. M. Effect of average phospholipid curvature on supported bilayer formation on glass by vesicle fusion. Biophys J. 90, (4), 1241-1248 (2006).
  36. Tero, R. Substrate effects on the formation process, structure and physicochemical properties of supported lipid bilayers. Materials. 5, (12), 2658-2680 (2012).
  37. Ferguson, K. M., Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Sigler, P. B. Structure of the high affinity complex of inositol trisphosphate with a phospholipase C pleckstrin homology domain. Cell. 83, (6), 1037-1046 (1995).
  38. Simonsson, L., Hook, F. Formation and diffusivity characterization of supported lipid bilayers with complex lipid compositions. Langmuir. 28, (28), 10528-10533 (2012).
  39. Cong, X., Poyton, M. F., Baxter, A. J., Pullanchery, S., Cremer, P. S. Unquenchable surface potential dramatically enhances Cu(2+) binding to phosphatidylserine lipids. J Am Chem Soc. 137, (24), 7785-7792 (2015).
  40. Robison, A. D., et al. Polyarginine interacts more strongly and cooperatively than polylysine with phospholipid bilayers. J Phys Chem B. 120, (35), 9287-9296 (2016).
  41. Robison, A. D., Huang, D., Jung, H., Cremer, P. S. Fluorescence modulation sensing of positively and negatively charged proteins on lipid bilayers. Biointerphases. 8, (1), 1 (2013).
  42. Tabaei, S. R., et al. Formation of cholesterol-rich supported membranes using solvent-assisted lipid self-assembly. Langmuir. 30, (44), 13345-13352 (2014).
  43. Johnson, S. J., et al. Structure of an adsorbed dimyristoylphosphatidylcholine bilayer measured with specular reflection of neutrons. Biophys J. 59, (2), 289-294 (1991).
  44. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12, (5), 1343-1350 (1996).
  45. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437, (7059), 656-663 (2005).
  46. Renner, L., et al. Supported lipid bilayers on spacious and pH-responsive polymer cushions with varied hydrophilicity. J Phys Chem B. 112, (20), 6373-6378 (2008).
  47. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: Silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys J. 79, (3), 1400-1414 (2000).
  48. Pace, H., et al. Preserved transmembrane protein mobility in polymer-supported lipid bilayers derived from cell membranes. Anal Chem. 87, (18), 9194-9203 (2015).
  49. Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: Influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29, (46), 14204-14213 (2013).
  50. Paridon, P. A., de Kruijff, B., Ouwerkerk, R., Wirtz, K. W. Polyphosphoinositides undergo charge neutralization in the physiological pH range: A 31P-NMR study. Biochim Biophys Acta. 877, (1), 216-219 (1986).
  51. Liu, C., Huang, D., Yang, T., Cremer, P. S. Monitoring phosphatidic acid formation in intact phosphatidylcholine bilayers upon phospholipase D catalysis. Anal Chem. 86, (3), 1753-1759 (2014).
  52. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (30), 11364-11369 (2006).
  53. Hsu, N. Y., et al. Viral reorganization of the secretory pathway generates distinct organelles for RNA replication. Cell. 141, (5), 799-811 (2010).
  54. Del Campo, C. M., et al. Structural basis for PI(4)P-specific membrane recruitment of the Legionella pneumophila effector DrrA/SidM. Structure. 22, (3), 397-408 (2014).
  55. Kolli, S., et al. Structure-function analysis of vaccinia virus H7 protein reveals a novel phosphoinositide binding fold essential for poxvirus replication. J Virol. 89, (4), 2209-2219 (2015).
  56. Cho, N. J., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate is an HCV NS5A ligand and mediates replication of the viral genome. Gastroenterology. 148, (3), 616-625 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics