التجويف النيتروجين والطرد المركزي التفاضلي يسمح بمراقبة توزيع البروتينات الغشاء المحيطي في الخلايا المستزرعة

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

نقدم هنا البروتوكولات لتجانس خلايا الثدييات مثقف استناداً إلى التجويف النيتروجين وفصل اللاحقة للبروتينات سيتوسوليك والغشاء زمنياً تنبيذ فائق خالية من المنظفات. هذا الأسلوب مثالي لرصد تقسيم البروتينات الغشاء المحيطي بين الذوبان والغشاء الكسور.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zhou, M., Philips, M. R. Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (126), e56037, doi:10.3791/56037 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الخلايا المستزرعة مفيدة لدراسة توزيع سوبسيلولار من البروتينات، بما في ذلك البروتينات الغشاء المحيطية. وراثيا ترميز فلوريسسينتلي البروتينات المعلمة قد أحدثت ثورة في دراسة توزيع البروتين سوبسيلولار. ومع ذلك، من الصعب قياس التوزيع مع مجهر فلوري، خاصة عندما تكون البروتينات جزئيا سيتوسوليك. وعلاوة على ذلك، من المهم كثيرا ما لدراسة البروتينات الذاتية. فحوصات الكيمياء مثل إيمونوبلوتس يظل المعيار الذهبي للتحديد الكمي لتوزيع البروتين بعد تجزئة سوبسيلولار. على الرغم من أن هناك مجموعات تجارية تهدف إلى عزل سيتوسوليك أو بعض الكسور غشاء، أن معظم هذه مجموعات تستند إلى استخراج مع المنظفات والتي قد تكون غير ملائمة لدراسة البروتينات الغشاء الطرفية التي يتم استخراجها بسهولة من الأغشية. هنا نقدم بروتوكول خالية من المنظفات لتجانس الخلوية التجويف النيتروجين وفصل اللاحقة للبروتينات سيتوسوليك والغشاء زمنياً حسب تنبيذ فائق. علينا تأكيد الفصل بين العضيات سوبسيلولار في الذوبان والكسور بيليه عبر أنواع مختلفة من الخلايا، ومقارنة استخراج البروتين بين عدة أساليب غير المستندة إلى المنظفات الميكانيكية التجانس المشترك. من بين العديد من المزايا للنيتروجين هو التجويف كفاءة متفوقة من انقطاع الهاتف الخلوي مع الحد الأدنى من الأضرار المادية والكيميائية إلى العضيات الدقيقة. جنبا إلى جنب مع تنبيذ فائق، التجويف النيتروجين وسيلة ممتازة لدراسة تحول البروتينات الغشاء المحيطي بين سيتوسوليك والغشاء الكسور.

Introduction

البروتينات الخلوية يمكن أن تقسم إلى فئتين: تلك التي ترتبط بالأغشية وتلك التي لا. تم العثور على عدم غشاء البروتينات المرتبطة بها في سيتوسول ونوكليوبلاسم ولومينا من العضيات مثل هيولى (ER). وهناك فئتان من البروتينات المرتبطة بالغشاء، لا يتجزأ، والأجهزة الطرفية. بروتينات الغشاء لا يتجزأ من المعروف أيضا البروتينات transmembrane لأن الأجزاء واحد أو أكثر في سلسلة ببتيد يمتد الغشاء، عادة α-الحلزون تتألف من الأحماض الأمينية مسعور. يتم إدراج كوترانسلاتيونالي في الأغشية أثناء التركيب الحيوي البروتينات transmembrane وتبقى حتى تم تكوينه حتى أنها هي كاتابوليزيد. بروتينات الغشاء المحيطي ثانوياً مدفوعة للأغشية، وعادة ما تكون نتيجة للتعديل بوستترانسلاشونال مع جزيئات مسعور مثل الدهون. وعلى النقيض من البروتينات الغشاء لا يتجزأ، ورابطة بروتينات الغشاء المحيطي مع الأغشية الخلوية يتم عكسها ويمكن أن تنظم. العديد من وظيفة البروتينات الغشاء المحيطي في مسارات الإشارات، وتنظم رابطة مع الأغشية إليه واحدة لتنشيط أو تثبيط طريقا. مثال واحد من جزيء مما يشير إلى أنه بروتين غشاء المحيطي هو GTPase الصغيرة، RAS. بعد سلسلة من التعديلات بوستترانسلاشونال التي تشمل التعديل مع دهن farnesyl، إدراج تعديل ج-المحطة من البروتين RAS ناضجة في النشرة هيولى من الغشاء الخلوي. على وجه التحديد، غشاء البلازما حيث يشرك RAS به المستجيب المتلقين للمعلومات RAF1. لمنع التنشيط التأسيسي لمسار mitogen تنشيط بروتين كيناز (MAPK)، توجد عدة مستويات للسيطرة على رأس. إلى جانب تقديم رأس نشط بالترشيح أنشئ في الناتج المحلي الإجمالي، RAS نشطة أيضا يمكن أن يفرج عن من غشاء البلازما بالتعديلات أو التفاعلات مع سولوبيليزينج عوامل تحول دون إشارة. على الرغم من أن يتيح تصوير لايف الفلورسنت علماء الأحياء الخلية فرصة مراقبة التعريب سوبسيلولار من البروتينات الفلورية غشاء الطرفية معلم البروتين1، لا تزال هناك حاجة ماسة إلى تقييم رابطة الغشاء البروتينات الذاتية شبه كمي مع النهج البيوكيميائية بسيطة.

التقييم البيوكيميائية السليم للبروتين التقسيم بين الغشاء والكسور القابلة للذوبان يتوقف بصورة حاسمة على عاملين اثنين هما: التجانس الخلوية وكفاءة فصل الغشاء وكسور قابلة للذوبان. على الرغم من أن بعض البروتوكولات، بما في ذلك مجموعات الأكثر استخداماً تجارياً، يعتمد على تجانس الخلية المستندة المنظفات، يمكن أن تعتم هذه الأساليب التحليل باستخراج البروتينات الغشاء في المرحلة القابلة للذوبان2. وبناء على ذلك، غير المنظفات الميكانيكية، واستنادا إلى أساليب تعطيل الخلية توفر نتائج أنظف. هناك عدة طرق لتعطل الخلايا نمت في الثقافة أو حصادها من الدم أو الأجهزة الميكانيكية. هذه تشمل دونس التجانس وتعطل غرامة إبرة وتجانس الحاملة للكرة، sonication والتجويف النيتروجين. هنا نقوم بتقييم التجويف النيتروجين وذلك مقارنة بالأساليب الأخرى. التجويف النيتروجين تعتمد على النيتروجين الذي يذوب في السيتوبلازم للخلايا تحت ضغط عال. تعليق خلية بعد الموازنة، فجأة تتعرض للضغط الجوي أن تتشكل فقاعات النيتروجين في السيتوبلازم التي تمزق فتح الخلية نتيجة على مقوماته. إذا كان الضغط مرتفع بما فيه الكفاية، مقوماته النيتروجين يمكن أن تعطل نواة3 والغشاء ملزمة العضيات مثل ليسوسوميس4. ومع ذلك، إذا كان يتم الاحتفاظ الضغوط منخفضة بما يكفي، سوف تعطيل تخفيف الضغط غشاء البلازما و ER ولكن لا العضيات الأخرى، وبالتالي إراقة سيتوسول والعضيات هيولى سليمة في هوموجيناتي الذي تم تعيينه كافيتاتي5. ولهذا السبب، التجويف النيتروجين هو الأسلوب المفضل لعزل العضيات مثل lysosomes والميتوكوندريا.

ومع ذلك، كما أنها وسيلة ممتازة لإعداد هوموجيناتي التي يمكن فصلها بسهولة في الغشاء وكسور قابلة للذوبان. وعاء الضغط (من الآن فصاعدا باسم "قنبلة") المستخدمة خلال التجويف تتكون من غلاف سميك من الفولاذ المقاوم للصدأ الذي يقاوم الضغط العالي، مع مدخل لتسليم غاز النيتروجين من دبابة ومنفذ مخرج مع صمام تفريغ قابل لتعديل.

وقد استخدمت التجويف النيتروجين لتجانس الخلية منذ الستينات6. في عام 1961، أنشأ صياد وكوميرفولد7 التجويف النيتروجين كبديل ناجع لاضطراب أنسجة الثدييات. ومنذ ذلك الحين، الباحثين قد تكيفت هذه التقنية لمختلف الخلايا والأنسجة بنجاح، والتجويف النيتروجين قد أصبح عنصرا أساسيا في العديد من التطبيقات، بما في ذلك الغشاء إعداد8،9ونوي وعضيه إعداد10،11، واستخراج البيوكيميائية مجا. حاليا، علماء الأحياء الخلية أكثر في كثير من الأحيان يستخدمون أساليب أخرى لتجانس خلية لفوائد النيتروجين التجانس لا يعلن عنها على نطاق واسع، والقنابل النيتروجين غالية الثمن وهناك الاعتقاد خاطئ بأن عدد كبير نسبيا من الخلايا مطلوب. لم يتم نشر بروتوكولات التجويف النيتروجين لتحقيق هوموجيناتيس الخلية خالية مع نويات سليمة، وفي التقييمات الأكثر المنشورة كانت تستخدم وحدات تخزين 20 مل من تعليق خلية. للتكيف مع هذا الأسلوب الكلاسيكي لتتناسب مع الاحتياجات الحالية للعمل مع عينات صغيرة الحجم، نقدم على بروتوكول تعديل التجويف النيتروجين مصممة خصيصا للخلايا المستزرعة. بعد التجويف النيتروجين، هوموجيناتي تنقسم القابلة للذوبان (S) والكسور غشاء (P) بالطرد المركزي التفاضلي، أولاً مع تدور السرعة المنخفضة لإزالة الأنوية والخلايا غير منقطعة، ثم مع تدور عالية السرعة (> 100,000 x ز) لفصل أغشية من الكسر القابلة للذوبان. نقوم بتحليل كفاءة الفصل مع إيمونوبلوتس وقارن التجويف النيتروجين مع تقنيات التعطيل الميكانيكية الأخرى. ونحن أيضا التحقيق ناضح تأثير تجانس المخزن المؤقت خلال التجويف النيتروجين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-المخزن المؤقت ومعدات الأعمال التحضيرية

  1. البرد 45 مل خلية تعطيل القنابل وأنابيب 15 مل وأنابيب تنبيذ فائق في 4 درجة مئوية.
  2. تحضير والبرد 25 مل من المخزن المؤقت لتجانس كل 2 × 10 7 خلايا في 4 ° C. إضافة حوزتي المانع قرص واحد فقط قبل الاستخدام.
    ملاحظة: مخازن التجانس تحتوي عادة على بوكل بدلاً من كلوريد الصوديوم بشكل أفضل وتعكس تركيبة الملح داخل الخلايا. تجانس المخزن المؤقت المستخدم في هذا البروتوكول يتكون من 10 ملم حبيس في درجة الحموضة 7.4، بوكل 10 و 1.5 ملم مجكل 2 (يشار إليه فيما يلي تجانس ناقص التوتر المخزن المؤقت). معظم المخازن المؤقتة يمكن تكييفها التجويف النيتروجين (انظر المناقشة)-
  3. تحضير والبرد 6 مل 1 × فوسفاتيبوفيريد المالحة (PBS) المخزن المؤقت كل عينة في 4 ° C. إضافة حوزتي المانع أقراص جديدة قبل الاستخدام.
    ملاحظة: برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت المستخدم في هذا البروتوكول يتكون من 10 مم نا 2 هبو 4 على درجة الحموضة 7.4، 1.8 مم خ 2 ص 4، كلوريد الصوديوم 137 و 2.7 مم بوكل.
  4. تحضير والبرد 4 مل من المخزن المؤقت solubilization كل عينة في حوزتي واحدة إضافة درجة مئوية. 4 المانع لوحي فقط قبل الاستخدام.
    ملاحظة: سولوبيليزيشن المخزن المؤقت المستخدم في هذا البروتوكول هو x Radioimmunoprecipitation 1 المقايسة (ريبا) العازلة، التي تتألف من 25 مم تريس في الأس الهيدروجيني 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم والحزب الديمقراطي الصربي 0.1% ديوكسيتشولاتي الصوديوم 0.5% 1% NP-40. انظر الحاشية 4.6.

2. خلية حصاد

  1. ينمو 2 × 10 7-10 × 10 9 زراعة أنسجة خلايا مع الموصى الثقافة الإعلامية لنوع الخلية. عادة، تؤدي صحن واحد 15 سم 2 × 10 7 HEK-293 الخلايا المستزرعة في دميم في كونفلوينسي 90% ( الشكل 1).
  2. إزالة المتوسطة النمو بالفراغ.
  3. للخلايا ملتصقة، ضع الأطباق الثقافة على الجليد وغسل الخلايا مباشرة على أطباق الثقافة بلطف مع المخزن المؤقت التجانس المثلجة مرتين (العازلة 10 مل كل طبق 15 سم في المياه والصرف الصحي) وحصاد الخلايا مع مكشطة خلية كبيرة في زيادة في حجم مناسب المخزن المؤقت للتجانس؛ لتعليق الخلايا، جمع وتغسل بيليه الخلية في تجانس مبردة المخزن المؤقت مرتين (10 مل المخزن الواحد 50 مل الثقافة الواحدة والمياه والصرف الصحي) مع 500 x ز تدور عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وريسوسبيند بيليه خلية غسلها في زيادة حجم المخزن المؤقت التجانس على الجليد مناسبة.
    ملاحظة: الحجم ينبغي أن يستند إلى الاحتياجات اللازمة لتركيز البروتين في التجارب المقصود، فضلا عن حجم الحد الأدنى/الأعلى المسموح بها في خلية تعطيل القنبلة. إرشادات عامة 2-10 × 10 7 خلايا/مل أو بيليه حوالي 10 مجلدات من الخلية. هذا البروتوكول هو الأمثل لثلاثة أطباق 15 سم الخلايا HEK-293 في 2 مل من المخزن المؤقت للتجانس.

3. التجويف النتروجين

لوحة
  1. نقل تعليق خلية لقنبلة مبردة ونظيفة في حمام الثلج في ضجة.
    تنبيه: أن القنبلة قد ضغط عالية، ودرجة حرارة منخفضة، غاز النيتروجين – ملابس الحماية الشخصية المناسبة .
  2. وضع شريط إثارة مغناطيسية دقيقة داخل القنبلة وقم بتشغيل لوحة إثارة للحفاظ على التجانس تعليق.
  3. إضافة حبة واحدة من مثبطات البروتياز للوقف وإغلاق القنبلة الواحدة الشركة المصنعة ' تعليمة s-
  4. الضغط تدريجيا القنبلة مع خزان غاز نيتروجين في الشركة المصنعة ' يقرأ التعليمات s حتى قياس الضغط قنبلة 300 إلى 600 رطل/بوصة مربعة. إغلاق جميع الصمامات وقطع خزان النتروجين.
    ملاحظة: قد تختلف الضغط اللازم مع نوع الخلية. هنا أجرينا التجويف في 350 إلى 400 psi للخلايا HEK-293، والمعاهد الوطنية للصحة-3T3 وجوركات-
  5. الانتظار لمدة 20 دقيقة للسماح للنيتروجين بحل والتوصل إلى التوازن داخل الخلايا.
  6. إزالة المياه الزائدة حول صمام التصريف باستخدام منشفة من قماش. فتح صمام التصريف برفق تحقيق الإفراج عن دروبويسي هوموجيناتي، وجمع في أنبوب مبردة قبل 15 مل.
    ملاحظة: قرب نهاية مجموعة سيكون هناك طفرة هوموجيناتي والغاز سوف تظهر مع صوت الهسهسة. تأكد من أن الغاز لا قضية سبق تجميعها تكهفا لإطلاق النار خارج الأنبوب (ومن ثم استخدام 15 مل أنابيب بدلاً من أنابيب 1.5 مل). بمجرد بدء طفرة، إغلاق صمام التصريف وفتح صمام مدخل النيتروجين فجأة ديبريسوريزي القنبلة وتحقيق التجويف الخلايا المتبقية في القنبلة. فتح تكهفا القنبلة للانتعاش وتنظيف شامل.
    ملاحظة: كافيتاتي النهائي ينبغي أن يكون مظهر حليبي مع الرغوة في الأعلى. يحرك برفق مع تلميح ماصة للسماح بالرغوة لتهدأ قبل الطرد المركزي-
    ملاحظة: دراسة في كافيتاتي بالتباين مرحلة الفحص المجهري لتحديد كفاءة التجانس. إضافة قطره 15 ميليلتر من تكهفا على سطح شريحة مجهرية والغطاء مع ساترة. كرر الخطوة يتم الكشف عن 3.4-3.6 فقط إذا كان عدد كبير جداً من الخلايا دون انقطاع مع هدف X 20-
    ملاحظة: إذا كان لا يحتوي على المخزن المؤقت لتجانس يدتا أو عطا، إضافة إلى جمع تكهفا بتركيز 1 مم داخل 5 دقيقة نهائي بعد التفريغ.

4. الفصل بين سيتوسوليك والكسور غشاء

ز
  1. الطرد المركزي كافيتاتي في 500 x لمدة 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية لإزالة الخلايا غير منقطعة ونوى-
    ملاحظة: كرر الخطوة الطرد المركزي حتى يتم إنتاج لا بيليه مرئية وجمع وظيفة النووية طافية (السندات الإذنية) مع تجنب الرغوة الطافية على أعلى. إعادة الطرد المركزي الرغوة لمواصلة جمع والجمع بين السندات الإذنية، إذا لزم الأمر ( الشكل 1).
  2. عملية السندات الإذنية كما هو مطلوب للحصول على كسور للفائدة. لغرض فصل سيتوسوليك والغشاء الكسور، نقل السندات الإذنية لأنبوب ultracentrifuge وأداء تنبيذ فائق كما هو مطلوب. هذا البروتوكول هو الأمثل < 3.5 مل العينة في أنبوب أولتراسينتريفوجي البولي وتنبيذ فائق في 350,000 س ز ح 1 في 4 ° C.
  3. جمع المادة طافية (الكسر S) باستخدام ماصة 1 مل.
  4. بعناية شطف بيليه مع 3 مل من برنامج تلفزيوني الباردة دون تحريكه. إزالة برنامج تلفزيوني بالفراغ.
    ملاحظة: إذا كان تلوث كسر غشاء من البروتينات سيتوسوليك أكثر أهمية من فقدان عينة، ريسوسبيند بيليه في 3 مل الباردة برنامج تلفزيوني وإعادة-أولتراسينتريفوجي كما في الخطوة 4، 2. إزالة برنامج تلفزيوني بالفراغ.
  5. ريسوسبيند بيليه تماما في وحدة تخزين مناسبة المحتوية على مواد تنظيف المخزن المؤقت سولوبيليزيشن الاختيار. لتحقيق التعادل الخلية، استخدم نفس حجم المخزن المؤقت سولوبيليزيشن ككسر سيتوسوليك.
    ملاحظة: نحن نقترح استخدام المخزن المؤقت x RIPA 1 ك solubilization المخزن المؤقت لاستخراج البروتين كفاءة الغشاء. إذا كان لا مقايسة المتلقين للمعلومات غير مطلوب لكسر الغشاء، استخدام x laemmli 1 عينة المخزن المؤقت لاستخراج البروتين غشاء القصوى.
    ملاحظة: نحن نقترح إزاحة ونقل بيليه في المخزن المؤقت سولوبيليزيشن إلى أنبوب نظيفة على المدورة أنبوب عند 4 درجة مئوية لاستخراج البروتين غشاء القصوى.
    ملاحظة: إذا كان بيليه هو لزجة جداً (الدهون كثيرة جداً) كفاءة إزالتها من الأنبوب أولتراسينتريفوجي ه في المخزن المؤقت سولوبيليزيشن، فإننا نقترح المفاجئة تجميد بيليه في النتروجين السائل، وإزاحة بيليه من أنبوب أولتراسينتريفوجي بسرعة مع ملعقة معدنية صغيرة قبل أن يذوب بيليه.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، غشاء الكريات يمكن حراكه فقط ولا سولوبيليزيد في المخزن مؤقت غير المحتوية على مواد التنظيف لإنتاج ف جزء بسيط من الغشاء حويصلة تعليق، فيه حالة الطرد المركزي الخطوة في 4.6 غير مطلوب. هذه الكسور ف مفيدة عند التحقيق في وظائف مثل إنزيم الأنشطة التي تعتمد على رابطة الغشاء.
  6. الطرد المركزي تعليق بيليه solubilized تماما من الخطوة 4، 5 في غ س 20,000 في أجهزة الطرد مركزي منضدية لمدة 10 دقائق في 4 ° C. جمع المادة طافية باستخدام ماصة 1 مل (الكسر ف) وتجاهل بيليه (غير قابلة للذوبان الدهون)-
  7. إجراء فحوصات المطلوب مثل النشاف الغربية مع كسور سيتوسوليك و/أو الغشاء، أو حفظها في-80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 2 تقسيم البروتينات الخلوية من السندات الإذنية في كسر سيتوسوليك القابلة للذوبان (S) أو غشاء بيليه الكسر (P). قمنا بفحص ثلاثة خطوط الخلايا الممثل من أنواع مختلفة من الخلايا: HEK-293 (طلائي)، والمعاهد الوطنية للصحة-3T3 (تنتجها الخلايا الليفية) وجوركات (اللمفاويات). رو جوانين تفارق المانع (رهوجدي)، ومستقلة عن الأيونات الموجبة يطلق – 6-فوسفات مستقبلات (سيمبر) استخدمت كعناصر إيجابية سيتوسوليك والغشاء الكسور، على التوالي. نحن أكدت فصل كفاءة سيتوسول والغشاء بعد التجويف النيتروجين في ~ 350 رطل/بوصة مربعة في المخزن المؤقت ناقص التوتر تليها تنبيذ فائق في 350,000 س ز ح 1. مجموع البروتين المستردة من الكسور S و P ثم حللت مع علامات للائحة، واندوسوميس وليسوسوميس، الميتوكوندريا، غولجي والعضيات الأخرى. جميع البروتينات transmembrane موجودة في الكسر غشاء حصرا، بما في ذلك نا+/K+ ATPase ومستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) من غشاء البلازما، كالنيكسين من ER، غشاء الليزوزومية المرتبطة بالبروتين 1 (LAMP1) من lysosomes، و0-ATPase من الميتوكوندريا، و 97 جولجين من عبر شبكة غولجي. كما هو متوقع، العديد من البروتينات الغشاء المحيطية التي تقترن فضفاضة الغشاء، ويقدم كل من الكسور سيتوسوليك والغشاء بدرجات متفاوتة. من الأمثلة البارزة مستضد دخلول المبكر 1 (EEA1)، Rab7/9 (أواخر اندوسوميس) وهيكسوكيناسي 1 (غشاء الميتوكوندريا الخارجي). وهذا يدل على فائدة هذا الأسلوب في تقييم قوة رابطة غشاء من البروتينات الطرفية. لدينا مختبر قد استغلت هذا الأسلوب التجويف لدراسة حالة الأغشية الرابطة عدة إشارات الجزيئات5،12،،من1314. من المثير للاهتمام، وجدنا كالريجولين بصورة شبه حصرية من الكسر للذوبان، مما يوحي بأن ميكروسوميس المتولدة من الأغشية ER تعطلت أيضا خلال التجويف النيتروجين والبروتينات في التجويف ER تم إصدارها للكسر القابلة للذوبان. وفي المقابل، سلامة الميتوكوندريا بعد التجويف يعتمد على نوع الخلية. لاحظنا إف1-ATPase، البروتينات طرفية الميتوكوندريا داخلية، جزئيا في الكسر سيتوسوليك تتراوح بين 2% للمعاهد الوطنية للصحة-3T3 الخلايا ~ 35% للخلايا HEK-293 وجوركات. وهذا يدل على أن النيتروجين التجويف في 350 رطل/بوصة مربعة مع المخزن المؤقت ناقص التوتر لا يضمن سلامة المتقدرية. على الرغم من ثلاث دورات من 500 × يدور ز لإنشاء السندات الإذنية من كافيتاتي، أزيلت الأنوية ليست كلها. هيستون deacetylase 1 (HDAC1) من نوكليوبلاسم وفيبريلارين من نوية، وعثر في السندات الإذنية وبيليه على حد سواء. وجود HDAC1 في بيليه وليس في المادة طافية تشير إلى أن السندات الإذنية ملوثة بنوي، بدلاً من تعطيل النووية خلال التجويف. وهذا يتسق مع تقارير تفيد بأن الضغط على القنبلة لهذه المبادرة 350 يترك نواة سليمة10، رغم أن استخدامنا للمخزن المؤقت ناقص التوتر قد تجعل الأنوية هشة، كما تمت مناقشتها في المقطع التالي.

نحن مقارنة كفاءة تجانس التجويف النيتروجين بأساليب أخرى تعطل المادية المشتركة. كميات متساوية من الخلايا جوركات علقت في المخزن المؤقت لتجانس ناقص التوتر متطابقة وتعرض لاضطراب مختلف الأساليب. وكان هناك خسارة يمكن كشفها من العينات في التجويف دونس التجانس والنيتروجين (في كلتا الحالتين حوالي 5-10% يتم جمع أقل حجم). ومع ذلك، أعطى التجويف النيتروجين أعلى كفاءة استخراج البروتين؛ مرور الإبرة ودونس أسفرت عن 60 في المائة فقط قدر البروتين (الشكل 3). الغريب، لم تظهر استرداد بعض البروتينات كما يحدده إيمونوبلوت فرق كبير بين أساليب التعطيل الميكانيكية المختلفة. ومع ذلك، العائد من بعض البروتينات الغشاء الطرفية مثل هيكسوكيناسي 1 ورأس كان أعلى في عينات أعد مع التجويف النيتروجين. هذا يدعم ذلك التجويف النيتروجين قد يكون الأمثل لتحقيق التجانس عند التحقيق بروتينات الغشاء المحيطي. استرداد بروتينات HDAC1 التجويف النيتروجين قابل للمقارنة إلى أساليب أخرى، مما يوحي بأن النواة تظل على حالها في جميع الظروف. وهكذا، يثبت البيانات في الشكل 3 التجويف النيتروجين أن يقدم نتائج متفوقة من التجانس.

المقبل، ونحن مقارنة كفاءة التجانس بين المخزن المؤقت ناقص التوتر والمخزن المؤقت نفس لكن متساوي التوتر مع السكروز أو كلوريد الصوديوم (الشكل 4). تم انتشال كميات مماثلة من البروتين من الخلايا جوركات تجانس في المخزن المؤقت ناقص التوتر مقابل كلوريد الصوديوم العازلة متساوي التوتر بعد التجويف في 350 رطل/بوصة مربعة. وفي المقابل، تم انتشال أقل البروتين في السندات الإذنية للخلايا التي تعطلت في المخزن المؤقت أدلى متساوي التوتر مع السكروز. البروتينات الأكثر حدة نظر immunoblot تتناسب مع هذا النمط. استثناء واحد هو فيبريلارين التي اثريت نسبيا في السندات الإذنية التي تم إنشاؤها في المخزن المؤقت متساوي التوتر.

لتحديد إذا كان لدينا بروتوكول يمكن أن تستخدم للتحقيق في تقسيم البروتينات الغشاء المحيطي بين الذوبان والغشاء الكسور، قارنا تقسيم أنماط بين نوع البرية تخطيطية معلم العلم وبه المسخ تفتقر إلى برينيليشن، C186S ( الشكل 5). في حالة مستقرة، نوع البرية تجاوزها كان حاضرا في سيتوسول والأغشية، مماثلة لبروتينات الغشاء الأكثر هامشية، على الرغم من أن الجزء المستردة في جزء صغير قابل للذوبان أكبر من البروتينات RAS الأخرى14. عندما يحرم تجاوزها لتعديلها برينيل، فإنه يفقد القدرة على ربط مع الأغشية ويصبح سيتوسوليك تماما. وأكدت أنماط التقسيم المتوقع تجاوزها أن لدينا بروتوكول خيار يمكن الاعتماد عليها لدراسة ديناميات تقسيم البروتينات الغشاء المحيطي بين سيتوسول والأغشية.

Figure 1
رقم 1: مخطط انسيابي تلخص الخطوة 2 (الأزرق) والخطوة 3 (أحمر) والخطوة 4 (أصفر) من البروتوكول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: البروتين التقسيم بين الكسور سيتوسوليك والغشاء. HEK-293، خلايا 3T3 المعاهد الوطنية للصحة وجوركات تعرضوا التجويف النيتروجين (psi ~ 350 مدة 20 دقيقة، علقت في المخزن المؤقت لتجانس ناقص التوتر) وتنبيذ فائق (~ 350,000 ز ح 1 x) كما هو موضح في البروتوكول. تم تحليل مستويات البروتين الذاتية في أجزاء مختلفة من إيمونوبلوت. السندات الإذنية: ملزم مستقبلات السرطان مستضد أعرب عن SiSo الخلايا (تقييمات النتائج والكفاءات)، المادة النووية طافية, s: المادة طافية, p: بيليه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
رقم 3: مقارنة بين تقنيات التعطيل الميكانيكية المختلفة. المبلغ المعادل للخلايا جوركات كانت قد علقت في المخزن المؤقت ناقص التوتر ويتعرضون لتجميد أذاب (3 دورات)، إبرة مرور (5 يمر، من خلال إبرة 28G½)، دونسي التجانس (يمر 15، Kontes 2 مل دونسي الأنبوبة مع مدقة تطحن أنسجة، إزالة الألغام من 0.01-0.06 مم) أو التجويف النيتروجين (psi ~ 350 لمدة 20 دقيقة). وجرى تحليل المستويات النسبية للبروتينات الذاتية في السندات الإذنية التي إيمونوبلوت لكل أسلوب. تم قياس كمية تركيزات البروتين الكلي من السندات الإذنية التي assa اتفاق التعاون الأساسيy وتطبيع لقيمة السندات الإذنية أعدتها التجويف النيتروجين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: مقارنة بين المخازن المؤقتة ناقص التوتر ومتساوي التوتر المستخدمة خلال التجويف النيتروجين. المبالغ المعادلة من جوركات الخلايا وقد توقفت في المخزن المؤقت ناقص التوتر، أو المخزن المؤقت ناقص التوتر وتستكمل مع السكروز 8.5% أو 150 مم كلوريد الصوديوم، وتعرض التجويف النيتروجين (psi ~ 350 لمدة 20 دقيقة). تم تحليل المستويات النسبية للبروتينات الذاتية في السندات الإذنية التي إيمونوبلوت كل من المخزن المؤقت. تركيزات البروتين الكلي للسندات الإذنية كمياً بمقايسة اتفاق التعاون الأساسي وتطبيع لقيمة السندات الإذنية أعدت في المخزن المؤقت ناقص التوتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: فارنيسيلاتيد تخطيطية للأقسام إلى كسور ف وق- تم transfected الخلايا HEK-293 عابر مع البلازميدات توجيه التعبير عن نوع البرية معلم العلم تجاوزها أو المسخ C186S. أجرى تقسيم البروتين كما هو موضح في الشكل 2 ، ومستويات البروتين المشار إليه تم تحليلها بواسطة immunoblot. تتكرر مع الإذن (تشو، M et al.، عام 2016. نشرت أصلاً في مجلة بيولوجيا الخلية. https://doi.org/10.1083/jcb.201604061). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وتتعدد مزايا التجويف النيتروجين عبر طرق أخرى لتعطيل الميكانيكية. ربما الفائدة الأكثر أهمية هو قدرته على تجانسه بلطف ولكن كفاءة العينات. المبادئ الفيزيائية للعينات يبرد الضغط بدلاً من توليد التدفئة المحلية الأضرار مثل الموجات فوق الصوتية والقص/الاحتكاك على أساس تقنيات. التجويف أيضا فعالة للغاية في تعطيل غشاء البلازما. لأن النيتروجين فقاعات تتولد داخل كل خلية فردية عند الضغط، عملية التجويف محدودة أقل من حجم الخلية، حجم العينة أو عينة تركيز. ولذلك يقدم مزايا إضافية أكثر من دونس المستندة إلى إزالة أو التجانس مرور الإبرة. ويقدم التجويف النتروجين أيضا نتائج أكثر اتساقا وكما يمكن أن يكون تتكرر نفس القوة التخريبية التي يتم تطبيقها تطبيقاً موحدا في جميع أنحاء العينة مع ضغوط مماثلة. وعلاوة على ذلك، كل خلية فقط تجارب عملية تعطيل لمرة واحدة واحدة ومكونات سوبسيلولار، ولذلك، باستمرار لا يتعرضون للقوات الهدامة متغير. وهذا يحد من تجزئة أرتيفاكتوال العضيات. كما يخفف، كما يستخدم النيتروجين تشبع تعليق خلية القلق لأكسدة مجا المكونات الخلوية الناتجة عن الاضطراب وخالية من الأكسجين الإضافي. وتؤكد الفيزيائية والكيميائية المقيدة تفرضها التجويف النيتروجين يجعل أسلوباً مثاليا لدراسة الإنزيمات مجا والعضيات الهشة، وإمكانية تكرار نتائج هذا الأسلوب التجانس هو مناسبة تماما للقياس الكمي.

التجويف النيتروجين كما يوفر مرونة كبيرة فيما يتعلق بحجم العينة وتكوين مخازن التجانس، والدرجة من النزاهة عضية. للارتقاء التجانس، يحتاج المرء ببساطة لنشر أوعية الضغط من قدرات أكبر، دون التضحية بالسرعة أو راحة أو كفاءة لتخفيف الضغط. يمكن استخدام أي تجانس المخزن المؤقت التجويف النيتروجين؛ اختيار المخزن المؤقت يمكن أن تكون مصممة للتوافق مع متطلبات كل تجربة. يمكن تصميم واحد مخزن مؤقت تجانس الذي يطابق السائل داخل الخلايا (مثلالبوتاسيوم عالية ومنخفضة الصوديوم) للتقليل من التعديلات في العضيات. على سبيل المثال، قمنا بتطوير المخزن مؤقت "استرخاء" مما يقلل السابقين فيفو بلمرة الأكتين، ومما يساعد في جمع الحويصلات هيولى سليمة من المحببة5. يمكن أيضا تعديل ميزات ناضح والأيونية من المخزن المؤقت للتحكم في درجة التجانس الخلية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن التحكم بعدوانية انقطاع الهاتف الخلوي بضبط ضغط النيتروجين. يخفض ضغط معتدل القوة التخريبية للحفاظ على نواة، الميتوكوندريا والعضيات الأخرى في حالة سليمة، بينما الضغط العالي يعطل هذه العضيات. بروك وآخرون. وأفادت النجاح مع اضطراب خلايا "اللوكيميا Basophilic الفئران" مع الحفاظ على معظم الأنوية سليمة في هذه المبادرة 350 مع المخزن المؤقت ناقص التوتر10، التي تشكل الأساس لضغط النيتروجين المستخدمة في البروتوكول الحالي لدينا.

وتشمل قيود التجويف النيتروجين أن التجانس موحد في جميع أنحاء العينات وهياكل الأغشية المختلفة قد تنتج حويصلات أحجام مماثلة؛ وهذا تعقيد فصل المزيد من غشاء البلازما، microsomes السلس، اندوسوميس، والأغشية غولجي بكثافة معدل طائفتين التدرج الطرد المركزي. مصدر قلق آخر أن العضيات تصبح هشة نسبيا بعد التجانس بسبب التمزق من داخل. وبذلك، يتطلب هذا الأسلوب الأمثل حذراً منع الكسر عضية في المعالجات اللاحقة. نحن تهدف إلى معالجة بعض هذه القضايا في هذه الدراسة.

الفصل بين سيتوسوليك وتم استكشاف الكسور الغشاء بالطرد المركزي في تقارير محدودة تفصيل تقسيم الكسور البروتين مع حفنة من علامات البروتين15،16. لدينا أسلوب يولد فصل النفط خام للبروتينات القابلة للذوبان والغشاء زمنياً، ولا تنطوي على عزل العضيات خاصة. حتى الآن، لا يزال مصدر قلق صالحة أن الحويصلات متجانسة للأغشية المختلفة التي ينتجها التجويف قد تؤثر على كفاءة الفصل قبل تنبيذ فائق. قدمنا دراسة استقصائية شاملة إيمونوبلوتس العزلة والتقسيم من العضيات سوبسيلولار المشتركة بعد تجزئة مع بروتوكول لدينا. كما هو متوقع، البروتينات سيتوسوليك بحتة مثل رهوجدي حصرا في جزء قابل للذوبان، والبروتينات ترانسميمبراني في غشاء البلازما (م) مثل EGFR و Na+تم انتشال/K+ ATPase، فقط في بيليه. البروتينات ترانسميمبراني على العضيات مثل ER، الميتوكوندريا، وغولجي و lysosomes عثر عليها أيضا في بيليه، مما يؤكد أن بروتينات الغشاء لا يتجزأ من العضيات والأغشية المختلفة يمكن أن تكون معزولة بنجاح من البروتينات القابلة للذوبان مع لدينا أسلوب. هذا التحقق من الصحة الأساسية أمر حاسم لمزيد من التحليل لبروتينات الغشاء المحيطي، وهو الغرض الرئيسي من هذا البروتوكول.

توجد معظم البروتينات الغشاء المحيطي في كلا من الكسور سيتوسوليك والغشاء. على الرغم من أن هذا غالباً تمثيل صحيح لهذه الترجمة، قد في بعض الحالات تمثل إعادة توزيع أرتيفاكتوال من هذه البروتينات من هيولى سطح الأغشية للكسر القابلة للذوبان خلال عملية التذويب، منذ ذلك الحين قوة لارتباطها بالأغشية ليست قوية كما أن البروتينات الغشاء لا يتجزأ. على الرغم من التجويف النتروجين يقلل من احتمال إعادة توزيع بتعريض الخلايا لتعطيل لطيف، مرة واحدة، ينبغي أن يكون أحد إدراكا منها لهذه المصنوعات اليدوية من تجزئة البيوكيميائية، والتركيز على التغيرات التي طرأت على تقسيم البروتينات بين سيتوسوليك والكسور غشاء عبر الظروف التجريبية. ومع ذلك، دراسة البروتينات الغشاء المحيطي في مراحل مختلفة من النضج اندوسومال من الممكن مع هذا الأسلوب. يموضع على السطح هيولى من أوائل اندوسوميس EEA1، المستجيب Rab5 الذي يتوسط التحام حويصلات المغلفة كلاثرين إلى اندوسوميس المبكر، واسترد أساسا في الكسر بيليه. أواخر ذات الصلة دخلول Rab7 و Rab9 البروتينات أيضا في الكسر بيليه. ومع ذلك، لا يزال هناك مبلغ ملموس من Rab7/9 في سيتوسول. نظراً لأن رابجدي قادرة على التفاعل مع برينيلاتيد رابس، وتجعل هذه البروتينات غير قابلة للذوبان وإلا سيتوسوليك، البروتينات Rab تميل إلى أن تكون سيتوسوليك أكثر من غيرها من البروتينات الغشاء الطرفية المتصلة دخلول.

لتحديد خصائص السلامة النووية وعضيه مع التجانس قبل التجويف النيتروجين، نحن إيمونوبلوتيد الكسور معزولة للمقصورات لومينال وحشوية على حد سواء. في هذا التحليل، يتم تحرير كالريجولين تماما إلى الكسر للذوبان، مما يدل على أن لائحة معطلة بشكل ميكروسوميس ومما تسرب محتوى لومينال. نظراً لأن أحد نصف المساحة الإجمالية لغشاء في خلية حقيقية النواة إحاطة المسافات متاهي لائحة، فمن الدهشة أن يفشل شبكة واسعة من هيكل مثل الكيس أو أنبوبي لتبقى سليمة من خلال التوسع في فقاعات النيتروجين. من ناحية أخرى، يظهر تحليلنا لسلامة المتقدرية بعد التجويف الاعتماد الواضح على نوع الخلية، كما لاحظنا إف1-ATPase، بروتين الذي يرتبط محيطيا مع الغشاء الداخلي من الميتوكوندريا، في كسر سيتوسوليك بدرجات متفاوتة (~ 35% ل HEK-293 وجوركات، 2% للمعاهد الوطنية للصحة-3T3). وهذا يدل على أن النيتروجين التجويف في 350 رطل/بوصة مربعة مع المخزن المؤقت ناقص التوتر لا تضمن سلامة المتقدرية. في الواقع، أفادت أخرى أن الحفاظ على الميتوكوندريا، ينبغي أن تجري في ضغوط أقل من 150 رطل/بوصة مربعة17التجويف. على النقيض من ذلك، وجدنا أن الكاتلاز يبقى في التجويف بيروكسيسوميس. الفضول، والبروتينات النووية لوحظت في كسور السندات الإذنية وبيليه. على وجه التحديد، HDAC1، deacetylase هيستون الحالية في جميع أنحاء nucleoplasm، غير موجودة في جزء قابل للذوبان، مما يشير إلى أن عدم المساس بالسلامة النووية. وهذا يوحي بأن المغلف النووية هو تمزق لا قبل التجويف، كما يتوقع المرء أن الإفراج عن HDAC1 في سولوبلو جزء بسيط في هذا السيناريو. ويظل احتمال أن لا تتم إزالة الأنوية تماما أثناء عملية إعداد السندات الإذنية، والبروتين يبقى في بيليه بعد تنبيذ فائق. هذا احتمال يدعمه كذلك حقيقة أن يتم الكشف عن لا تسرب الحمض النووي في الأجزاء القابلة للذوبان. ولذلك، نستنتج أن استخدام المخزن المؤقت لتجانس ناقص التوتر خلال التجويف في هذه المبادرة ~ 350 بالإضافة إلى Mg2 + غير قادرة على الحفاظ على السلامة النووية في العديد من خطوط الخلايا.

نتائجنا تثبت أيضا أن جمع ريبوسوم تماما في الكسر بيليه الغشاء، مما يوحي بأن ريبوسوم حتى حرة في السيتوبلازم التي غير منضم للأغشية ER يمكن رسابة تماما في المخزن مؤقت وسادة السكروز غير بعد الطرد المركزي في 350,000 س ز 1 حاء المثل، تحديد البروتين المتصلة أوتوفاجي 12 (Atg12)-المتقارن Atg5 كعلامة أوتوفاجوسوميس، ويكشف الفصل الصارم للكسور بيليه. قد يكون سبب وجودها في سيتوسول حقيقة أن التساهمي مرفق Atg12 و Atg5 تسبق تشكيل أوتوفاجوسوميس. بروتينات cytoskeletal يصعب تقييم بسبب السابقين فيفو البلمرة. يمكن الحد من هذه الظاهرة مع عازلة استرخاء لكن في البروتوكول هو موضح هنا، tubulin المحتمل مبلمرة السابقين فيفو على عملية إزالة معدن ثقيل كالسيوم 18. في تحضيراتنا وجدت tubulin في بيليه يوحي البلمرة حين يتم العثور على الأكتين في كسور كل من ف وق.

وصف المزايا المحتملة التجويف النيتروجين في كفاءة التجانس، استعرضنا بعض التقنيات الشائعة تعطل الميكانيكية. وقيمت لا أساليب محسنة لعينات الأنسجة مثل خلاط أو قذائف الهاون/مدقة. كما تم استبعاد sonication كما أنه من الصعب على عرقلة الغشاء السطحي مع عدم المساس العضيات الداخلية. تحليلنا تركز على الأساليب التالية: تجميد أذاب، إبرة المرور وتجانس دونس، كما أنها سهلة لأداء ولا تتطلب معدات خاصة مثل الخالطون الحاملة للكرة. واستخدمت جوركات الخلايا في هذا التحليل بسبب صغر حجمها، مما يجعل من الصعب على تجانسه كفاءة مع تقنيات القص السائلة التقليدية التي تعتمد على إزالة الألغام، مثل مرور الإبرة ودونس. الحكم من خلال تركيز البروتين الكلي استردادها، وجدنا أن أساليب التعطيل مستقلة حجم الخلية مثل التجويف النيتروجين وتجميد أذاب تظهر في الواقع أعلى كفاءة استخراج البروتين. تحليل مماثل مع الخلايا ذات أحجام أكبر تكشف عن فروق أصغر في تجانس الكفاءة، على الرغم من أن النيتروجين التجويف لا تزال متفوقة على الطرق الفيزيائية البديلة اختبار (البيانات لا تظهر).

العديد من سيتوسوليك، البروتينات اندوسومال وسيتوسكيليتون كفاءة وعثر مع جميع الأساليب المختبرة. وفي المقابل، البروتينات غولجي ER وعثر على النحو الأمثل استخدام النتروجين التجويف. العائد أقل بشكل طفيف من إف1-ATPase في التجويف النيتروجين مقارنة بالأساليب الأخرى قد يعكس حقيقة أن الميتوكوندريا من المرجح أن تبقى على حالها خلال التجويف ولذلك أكثر كفاءة إزالة بسرعة بطيئة الدوران استخدامها ل إنشاء السندات الإذنية. الملاحظة أن هيكسوكيناسي 1, بروتين غشاء المحيطي وجدت في سيتوسول السواء والمرتبطة بالغشاء الخارجي المتقدرية، تصرفت بطريقة المعاكس بالنسبة إلى و1-ATPase المحتمل يعكس lability للرابطة هيكسوكيناسي 1 بالنسبة إلى إف1-ATPase، الذي هو المحتبس داخل الميتوكوندريا. الأهم من ذلك، على الرغم من أن قادر على تعطيل الخلايا ذات الكفاءة قابلة للمقارنة، أعطت أساليب البديل اضطراب ميكانيكي الانتعاش الضعيف نسبيا لبعض البروتينات الغشاء المحيطية (هيكسوكيناسي 1 و RAS). وهكذا، هو التجويف لدينا تقنية التجانس الاختيار غرض التحقيق في قسم بروتينات الغشاء المحيطية. نظراً لتجانس دونس يستخدم على نطاق واسع لإعداد نواة سليمة، استخدمنا دونس كمعيار لتقييم السلامة النووية عبر الطرق تعطل الميكانيكية الأخرى. في تحليلنا، تأكيد مستويات مماثلة من انتعاش بروتينات HDAC1 أن نويات تظل على حالها في هوموجيناتيس جوركات التي أعدها التجويف النيتروجين في هذه المبادرة ~ 350 مع المخزن المؤقت ناقص التوتر.

كان من الواضح أن التجانس المخزن المؤقت المستخدمة خلال التجويف النيتروجين يمكن أن تؤثر تأثيراً كبيرا على سلامة اختلال الكفاءة وعضيه. في حين ينبغي أن يكون الأمثل تكوين التجانس المخزن المؤقت إلى متطلبات التطبيق المقصود، تجدر الإشارة إلى أن الباحثين إجراء الضغط النيتروجين من الأنسجة الحيوانية استخدام المخزن المؤقت مع ضغط الاسموزي منخفضة لاستخراج النووية المحتويات. صياد وكومرفورد أظهرت أنوية تورم وتمزق عند الحلول التي تم تمييع، والحفاظ على نواة عند استخدام الحلول متساوي التوتر7 (التي يمكن أن يتحقق عن طريق إضافة أما الأملاح غير العضوية مثل كلوريد الصوديوم أو الذوائب العضوية مثل السكروز أو الجلسرين). المخزن المؤقت متساوي التوتر القياسية المستخدمة لعزل العضيات سوبسيلولار خلاف الأنوية من خلايا الثدييات السكروز 0.25 متر يحتوي على 1 مم يدتا ومخزنة مع تريس، حبيس أو تريسيني على درجة الحموضة 7.0 7.6. ولكن ليس كل ثقافة الخلايا يمكن أن يكون تجانس كفاءة في أحد المخازن المؤقتة متساوي التوتر. ناقص التوتر المخزن المؤقت (عادة 10 ملم تريس، حبيس، إلخ) غالباً ما يستخدم لتوفير الضغط التناضحي اللازمة لبعض أنواع الخلايا لتحقيق التجانس الكامل. ومع ذلك، كما ذكر من قبل، المخازن المؤقتة ناقص التوتر تميل إلى تجعل الأنوية هشة وعرضه للتسرب من الحمض النووي عند تضمين يدتا. لتعزيز السلامة النووية، نستبدل يدتا مع بوكل وتركيزات منخفضة من الكاتيونات divalent مثل مجكل2 أو مجسو4. Mg2 + يفضل عادة أكثر من Ca2 + لأن هذه الأخيرة يمكن تنشيط بعض فوسفوليباسيس والبروتياز وتمنع بوليميريز الحمض النووي الريبي. بمجرد الانتهاء من التجويف يدتا اجتا يمكن إضافة أو العودة إلى هوموجيناتيس يخلب الأيونات الموجبة، إذا لزم الأمر لمنع ميتالوبروتيسيس.

تعرض الخلايا جوركات نسبة النواة إلى السيتوبلازم كبيرة نسبيا، يجعلها خط خلية مثالية لدراسة السلامة النووية. زيادة كفاءة التجانس باستخدام المخزن المؤقت ناقص التوتر الحد الأدنى عند مقارنة إلى المخزن المؤقت متساوي التوتر وتستكمل مع كلوريد الصوديوم. ومع ذلك، يسترد التجويف في مخزن مؤقت متساوي التوتر وتستكمل مع السكروز حوالي نصف البروتينات المستخرجة باستخدام نظير المخزن مؤقت ناقص التوتر. من غير المرجح أن يكون نتيجة مباشرة ل isotonicity، والتناقض بين استخدام كلوريد الصوديوم واستخدام السكروز لتحقيق isotonicity يتطلب مزيدا من التحقيق. أحد التفسيرات المحتملة أن الملح يعطل الالكتروستاتيكي التفاعلات بين البروتينات في حين لا السكروز. وهكذا، حتى في نفس tonicity، قد كلوريد الصوديوم نشاط ذات صلة باستخراج البروتين التي تفتقر إلى السكروز. Wالصدد ايث للمحافظة على السلامة النووية، وجدنا فيبريلارين زيادة البروتينات استردادها مع المخازن المؤقتة متساوي التوتر، على الرغم من المخازن المؤقتة متساوي التوتر نظرياً يجري مزيد من الحماية من الأنوية. ومن الغريب أن الكسر المتقدرية تم استخراج أكثر كفاءة مع المخزن المؤقت متساوي التوتر وتستكمل مع كلوريد الصوديوم، مما يوحي بأن تدني الظروف الملح قد تكون دون المستوى الأمثل لاستخراج الميتوكوندريا. النظر في التجويف مع المخزن المؤقت ناقص التوتر يحقق أفضل توازن بين كفاءة التجانس والسلامة النووية، يصبح ناقص التوتر المخزن المؤقت المخزن مؤقت خيار لدينا بروتوكول التجويف. ومع ذلك، أننا نحذر القراء أن المخزن المؤقت لا يعد ضمانا للنتائج التجانس الأمثل. ينبغي أن يكون لدينا البروتوكول كقالب للتحسين، والتجريبية اختبار مع المخازن المؤقتة المطلوبة، يجب إنشاء خطوط الخلايا من الفائدة، وغيرها من المتغيرات (الضغط، وتكوين المخزن المؤقت، إلخ) للحصول على أفضل النتائج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من GM055279 و CA116034 و CA163489.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Disruption Vessel (45 mL) Parr Instrument 4639 Nitrogen cavitation Bomb
Dounce homogenizer (2 mL) Kontes 885300-0002 Dounce pestle and tube
U-100 Insulin Syringe 28G½ Becton Dickinson 329461 Needle
Atg12 antibody Santa Cruz 271688 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-actin antibody Santa Cruz 47778 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-tubulin antibody DSHB E7-s Mouse antibody, use at 1:5000 dilution
Calnexin antibody Santa Cruz 23954 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Calregulin antibody Santa Cruz 373863 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Catalase antibody Santa Cruz 271803 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
CIMPR antibody Abcam 124767 Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
EEA1 antibody Santa Cruz 137130 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
EGFR antibody Santa Cruz 373746 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F0-ATPase antibody Santa Cruz 514419 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F1-ATPase antibody Santa Cruz 55597 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Fibrillarin antibody Santa Cruz 374022 Mouse antibody, use at 1:200 dilution
Golgin 97 antibody Santa Cruz 59820 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
HDAC1 antibody Santa Cruz 81598 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Hexokinase 1 antibody Cell Signaling Technology 2024S Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Lamin A/C antibody Santa Cruz 376248 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
LAMP1 antibody DSHB H4A3-c Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Na+/K+ ATPase antibody Santa Cruz 48345 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Rab7 antibody Abcam 137029 Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Rab9 antibody Thermo MA3-067 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RCAS1 antibody Santa Cruz 398052 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RhoGDI antibody Santa Cruz 360 Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution
Ribosomal protein S6 antibody Santa Cruz 74459 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Sec61a antibody Santa Cruz 12322 Goat antibody, use at 1:1000 dilution
Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube Beckman Coulter 349622 Sample tube for ultracentrifugation
TLK-100.3 rotor Beckman Coulter 349481 rotor for ultracentrifugation
Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge Beckman Coulter 364300 ultracentrifuge
cOmplete protease inhibitor cocktail tablets Roche 11697498001 protease inhibitors
Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade Corning 353089 large cell scraper
Magnetic Stir Bar Fisher Scientific 14-513-57SIX micro stir bar
Ceramic-Top Magnetic Stirrer Fisher Scientific S504501AS magnetic stirrer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, (10), 656-668 (2011).
  2. Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling. Cytotechnology. 61, (3), 153-159 (2009).
  3. Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).
  4. Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation. J Cell Biol. 86, (1), 21-28 (1980).
  5. Philips, M. R., et al. Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes. Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).
  6. Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution. Cancer Res. 20, 397-402 (1960).
  7. Hunter, M. J., Commerford, S. L. Pressure homogenization of mammalian tissues. Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).
  8. Wallach, D. F., Kamat, V. B. Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).
  9. Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3, (3), 653-654 (1977).
  10. Brock, T. G., Paine, R. 3rd, Peters-Golden, M. Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells. J Biol Chem. 269, (35), 22059-22066 (1994).
  11. Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation. FEBS Letters. 2, (1), (1968).
  12. Dai, Q., et al. Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 273, (24), 15030-15034 (1998).
  13. Wynne, J. P., et al. Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector. J Cell Biol. (2012).
  14. Zhou, M., et al. VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking. J Cell Biol. 214, (4), 445-458 (2016).
  15. Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27, (6), 1478-1485 (2007).
  16. Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46. Biochem J. 453, (3), 475-485 (2013).
  17. Annis, M. G., et al. Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event. Oncogene. 20, (16), 1939-1952 (2001).
  18. Berkowitz, S. A., Wolff, J. Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins. J Biol Chem. 256, (21), 11216-11223 (1981).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics