קוויטציה חנקן, צנטריפוגה דיפרנציאלית מאפשר ניטור ההתפלגות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בתאים בתרבית

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור ללא דטרגנט המגון בתרבית תאים בתרבית של מבוסס על חנקן קוויטציה עוקבות הפרדת חלבונים cytosolic ואת קרום מאוגד על-ידי ultracentrifugation. שיטה זו היא אידיאלית עבור ניטור חלוקה למחיצות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בין מסיסים ושברים ממברנה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zhou, M., Philips, M. R. Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (126), e56037, doi:10.3791/56037 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

תאים בתרבית שימושיים ללימוד ההתפלגות subcellular של חלבונים, כולל ממברנה פריפריאלי חלבונים. גנטית מקודד fluorescently חלבונים מתויג מהפכה בחקר התפלגות חלבון subcellular. עם זאת, קשה לכמת את ההתפלגות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, במיוחד כאשר חלבונים הם cytosolic חלקית. יתר על כן, חשוב תדירות ללמוד חלבונים אנדוגני. מבחני ביוכימיים כגון immunoblots נשארים תקן הזהב על כימות של חלבון הפצה אחרי subcellular fractionation. למרות שיש קיטים מסחריים שואפים לבודד cytosolic או שברים קרום מסוימים, רוב ערכות אלה מבוססים על חילוץ עם דטרגנטים, אשר עשויים להיות מתאימים ללמוד חלבוני ממברנה פריפריאלי בקלות שחולצו מן ממברנות. כאן אנו מציגים עבור הסלולר המגון פרוטוקול ללא חומרי ניקוי על-ידי חנקן קוויטציה עוקבות הפרדת חלבונים cytosolic ואת קרום מכורך מאת ultracentrifugation. אנחנו לאשר את ההפרדה של organelles subcellular ב מסיסים ושברים גלולה בכל סוגי התאים, והשווה חלבון החילוץ בין מספר שיטות מקובלות שאינן מבוססות על חומרי ניקוי המגון מכני. בין מספר יתרונות של חנקן קוויטציה הוא יעילות מעולה של שיבוש הסלולר עם מינימום נזק פיזי וכימי organelles עדין. בשילוב עם ultracentrifugation, חנקן קוויטציה זו שיטה מצוינת לבחון את השינוי של חלבוני ממברנה פריפריאלי בין cytosolic ושברים ממברנה.

Introduction

החלבונים ניתן לחלק לשתי קבוצות: אלה המשויכות ממברנות ואלה שאינם. Non-הממברנה חלבונים הקשורים נמצאים ציטוזול, נוקלאופלזמה, לומינה של organelles כגון תוך-פלזמית (ER). ישנם שני סוגים של חלבונים הקשורים ממברנה, נפרד ואת היקפי. חלבוני ממברנלי אינטגרלי מכונים גם חלבונים transmembrane כי אחד או יותר חלקי פוליפפטיד משתרע על הקרום, בדרך כלל בתור מורכב של חומצות אמינו הידרופוביות סליל α. חלבונים transmembrane co-translationally מוכנסים לתוך ממברנות במהלך ביוסינטזה שלהם ולהישאר שתצורתו נקבעה כל כך עד שהם אינם catabolized. חלבוני ממברנה פריפריאלי מונעים בגיחות לממברנות, בדרך כלל בעקבות השינוי post-translational עם מולקולות הידרופוביות כגון שומנים. בניגוד ממברנלי אינטגרלי חלבונים, השיוך של חלבוני ממברנה פריפריאלי ממברנות הסלולר הוא הפיך, יכול להיות מוסדר. פונקציית חלבוני ממברנה פריפריאלי רבים איתות המסלולים וחופש ההתאגדות מוסדר עם ממברנות הוא אחד למנגנון הפעלה או מעכבים שביל. דוגמה אחת של מולקולה איתות הוא חלבון ממברנה פריפריאלי היא GTPase קטן, ראס. לאחר סדרה של שינויים post-translational הכוללות שינוי עם ליפופרוטאין farnesyl, מוסיף ששונה קרבוקסילי של חלבון RAS בוגרת העלעל cytoplasmic של הממברנה התאית. באופן ספציפי, קרום פלזמה היא איפה RAS עוסקת שלה אפקטור במורד הזרם RAF1. כדי למנוע הפעלה המכונן של חלבון מופעל mitogen קינאז (MAPK) מסלול, מספר רמות של שליטה של ראס נמצאים במקום. חוץ עיבוד ראס לא פעיל על-ידי hydrolyzing GTP ל- GDP, ראס הפעיל גם יכול להשתחרר מן קרום פלזמה על-ידי שינויים או אינטראקציות עם solubilizing גורמים כדי לעכב איתות. למרות פלורסנט הדמיה חיה מעניקה תא ביולוגים את ההזדמנות כדי לבחון את ההתאמה subcellular של חלבוני ממברנה פריפריאלי מתויג החלבון הניאון1, נותר צורך קריטי כדי להעריך את קרום התאחדות חלבונים אנדוגני באופן כמותי למחצה עם גישות ביוכימיים פשוטים.

הערכת הביוכימי נאות חלבון מחיצות בין קרום ושברים מסיס הוא ביקורתי תלויה בשני גורמים: המגון הסלולר והפרדה יעיל של קרום ושברים מסיסים. למרות פרוטוקולים מסוימים, כולל ערכות ממוסחר הנפוצה ביותר, תלוי המגון תא מבוססי דטרגנט, שיטות אלה ניתן לערפל ניתוח על-ידי חילוץ קרום חלבונים לתוך מסיסים שלב2. בהתאם לכך, שיטות המבוסס, מכני ללא חומרי לשבירת תאים לספק תוצאות הניקוי. ישנן מספר שיטות של שיבוש מכני של תאים גדלו בתרבות או שנקטפו דם או איברים. אלה כוללים דאונס המגון, הפרעה מחט בסדר, המגון תנודה, sonication קוויטציה חנקן. כאן נוכל להעריך חנקן קוויטציה להשוות אותו בשיטות אחרות. חנקן קוויטציה מסתמך על חנקן אשר התפרקה בציטופלסמה של התאים בלחצים גבוהים. לאחר equilibration, התליה תא חשוף בפתאומיות הלחץ האטמוספרי כך נוצרות בועות חנקן בציטופלסמה זה כשהבנו את התא כתוצאה בתסיסת שלהם. אם הלחץ הוא מספיק גבוה, חנקן בתסיסת יכול לשבש את גרעין3 , ממברנה מאוגדים organelles כמו lysosomes4. עם זאת, אם הלחץ נשמרת נמוכה מספיק, הלחץ ישבש קרום פלזמה ו אר אבל לא organelles אחרים, ובכך לשפוך ציטוזול והן organelles cytoplasmic בשלמותם לתוך homogenate המיועד cavitate5. מסיבה זו, חנקן קוויטציה היא השיטה של בחירה עבור בידוד organelles כמו lysosomes והמיטוכונדריה.

עם זאת, זה גם דרך מצוינת של הכנת homogenate כי ניתן להפריד בקלות לתוך קרום ושברים מסיסים. הספינה לחץ (נקרא מעתה ואילך "הפצצה") ששימש קוויטציה מורכב מעטפת פלדה אל חלד עבה זה עומד בלחץ גבוה, עם מעין שקע בחופו עבור משלוח של הגז חנקן טנק ויציאת שקע עם שסתום פריקה מתכוונן.

חנקן קוויטציה שימש עבור תא המגון מאז שנות ה-606. בשנת 1961, צייד ו Commerfold7 נוסדה קוויטציה חנקן כמו אפשרות מעשית עבור רקמות יונקים השיבוש. מאז, חוקרים יש להתאים את הטכניקה כדי תאים ורקמות שונים עם הצלחה, חנקן קוויטציה הפך למרכיב ביישומים מרובים, כולל ממברנה הכנה8,9, גרעין, אברון הכנה10,11, חילוץ הביוכימי יציב. כעת, ביולוגים תא לעתים קרובות יותר להעסיק בשיטות אחרות של התא המגון כי היתרונות של חנקן המגון יש לא היה נרחב מפורסם, פצצות חנקן יקרים יש תפיסה מוטעית זו מספר גדול יחסית של תאים נדרש. פורסמו הפרוטוקולים עבור חנקן קוויטציה להשגת homogenates נטול תאים עם גרעינים שלמים, הערכות שפורסמו ביותר שימשו כרכים של 20 מ"ל של התא השעיה. להסתגל טכניקה קלאסית זו כדי להתאים לדרישות הנוכחי של עבודה עם דוגמאות בקנה מידה קטן, אנו מציגים פרוטוקול שונה של חנקן קוויטציה שתוכננה במיוחד עבור תאים בתרבית. לאחר קוויטציה חנקן, homogenate מחולק מסיסים (S) ושברים ממברנה (P) על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית, תחילה עם ספין במהירות נמוכה כדי להסיר גרעינים ותאים רצופה, ולאחר מכן עם ספין במהירות גבוהה (> g 100,000 x) כדי להפריד בין ממברנות של השבר מסיסים. לנו לנתח את יעילותו של ההפרדה עם immunoblots ולהשוות קוויטציה חנקן עם טכניקות טיפול נוספות שיבושים מכניים. אנחנו גם osmotic חיקרו את השפעת העלאת מאגר המגון במהלך קוויטציה חנקן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-מאגר וההכנות ציוד

  1. להירגע 45 מ ל תא הפרעה פצצות 15 מ"ל צינורות, צינורות ultracentrifugation ב-4 מעלות צלזיוס
  2. הכן ולהירגע 25 מיליליטר המגון מאגר לכל התאים 7 2 x 10-4 מעלות צלזיוס. הוסף פרוטאז מעכב טבליה אחת רק לפני השימוש.
    הערה: מאגרי המגון מכילים אשלגן כלורי בדרך כלל יותר מאשר NaCl טוב יותר לשקף את הרכב מלח תאיים. מאגר המגון בשימוש פרוטוקול זה מורכב מ 10 מ מ HEPES ב- pH 7.4, 10 מ"מ אשלגן כלורי ו 1.5 מ"מ MgCl 2 (המכונים להלן מאגר המגון היפוטוניק). רוב מאגרי יכול להיות מותאם קוויטציה חנקן (ראה דיון).
  3. הכן ולהירגע 6 מ של 1 x Phosphate-Buffered מלוחים (PBS) מאגר עבור דגימה-4 מעלות צלזיוס. הוסף פרוטאז מעכב טבליות טריים לפני השימוש.
    הערה: מאגר PBS בשימוש פרוטוקול זה מורכב מ 10 מ מ נה 2 HPO 4 ב- pH 7.4, מ מ 1.8 ח' 2 PO 4, 137 מ"מ NaCl ו 2.7 מ"מ אשלגן כלורי.
  4. הכן ולהירגע 4 מ"ל solubilization מאגר עבור דגימה על 4 מעלות צלזיוס. הוסף פרוטאז אחד מעכב לוח רק לפני השימוש.
    הערה: מאגר Solubilization בשימוש פרוטוקול זה הוא 1 מאגר assay (ריפה) x Radioimmunoprecipitation, אשר מורכב של 25 מ מ טריס ב pH 7.4, 150 מ מ NaCl, 0.1% מרחביות, 0.5% נתרן deoxycholate וב 1% NP-40. ראה הערה 4.6.

2. תא קציר

  1. לגדול 2 x 10 7-10 x 10 תרביות רקמה 9 תאים עם המומלץ תרבות המדיה עבור סוג התא. בדרך כלל, צלחת 15 ס מ אחת מניבה 2 x 10 7 תאים HEK-293 תרבותי ב- DMEM ב- 90% confluency ( איור 1).
  2. להסיר את מדיום הגידול על ידי ואקום.
  3. עבור תאים חסיד, למקם את הכלים תרבות על קרח, לשטוף את התאים ישירות על המנות תרבות בעדינות עם המגון צוננת מאגר פעמיים (10 מ ל מאגר לכל צלחת 15 ס מ לכל לשטוף), לקצור את התאים עם במגרדת תא גדול בתוך אמצעי אחסון המתאים של המגון המאגר; עבור תאים ההשעיה, לאסוף לשטוף בגדר תא במאגר המגון צוננת פעמיים (10 מ ל מאגר לכל 50-mL תרבות לכל לשטוף) עם ספין 500 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואתה resuspend בגדר תא שטף של אמצעי אחסון המתאים המגון מאגר על קרח.
    הערה: אמצעי האחסון צריך להיות מבוסס על הדרישות עבור ריכוז חלבון הניסויים המיועד, כמו גם את אמצעי האחסון מינימלי/מקסימלי מורשה להיכנס הפצצה הפרעה תא. קו מנחה כללי 2-10 x 10 7 תאים למ"ל, או גלולה בערך 10 כרכים של התא. פרוטוקול זה ממוטב עבור שלוש מנות 15 ס מ של תאים HEK-293 ב- 2 מ של מאגר המגון.

3. קוויטציה חנקן

  1. העברת התליה תא לפצצה צונן ונקי באמבט קרח למהומה צלחת-
    התראה: הפצצה יש בלחץ גבוה, טמפרטורה נמוכה, גז חנקן – לענוד הגנה אישית המתאימה .
  2. מקום בר מיקרו מערבבים מגנטי בתוך הפצצה והפעל את הצלחת מערבבים כדי לשמור על הומוגניות ההשעיה.
  3. להוסיף טבליה אחת של מעכבי פרוטאז ההשעיה ולסגור את הפצצה לכל יצרן ' הוראה s.
  4. בהדרגה לדחוס את הפצצה עם מיכל גז חנקן לכל יצרן ' s הוראה עד מד הלחץ פצצה קורא psi 300 עד 600. סגור שסתומים ונתק את מיכל החנקן.
    הערה: הלחץ הנדרש עשוי להשתנות עם סוג התא. כאן ביצענו קוויטציה בבית 350-400 psi עבור תאים HEK-293, NIH-3T3, Jurkat.
  5. לחכות 20 דקות לאפשר את החנקן להמיס ולהגיע שיווי משקל בתוך התאים.
  6. להסיר את עודף המים בסביבת שסתום פריקה באמצעות מגבת בד. פתח את שסתום פריקה בעדינות כדי להשיג פרסום dropwise של homogenate לאסוף צינור טרום מקורר 15 מ"ל.
    הערה: לקראת סוף אוסף יהיו כמה טיפות שם של homogenate, גז להגיח עם צליל השריקה. ודא כי הגז אינה סיבה שנאספו בעבר cavitate לירות מתוך הצינור (ומכאן השימוש 15 מ"ל צינורות במקום 1.5 mL צינורות). ברגע פרץ מתחיל, סגור את השסתום השחרור ופתח את שסתום כניסת חנקן בפתאומיות כדי להפחית לחץ הפצצה ולהשיג קוויטציה של התאים הנותרים הפצצה. פתח הפצצה על cavitate ניקוי יסודי ושחזור.
    הערה: cavitate הסופי צריך להיות מראה חלבי עם קצף על העליונה. מערבבים בעדינות עם טיפ פיפטה כדי לאפשר את הקצף תתארך לפני צנטריפוגה.
    הערה: לבחון את cavitate על ידי ניגודיות שלב מיקרוסקופ כדי לקבוע את היעילות המגון. להוסיף טיפה 15 µL של cavitate על פני השטח של שקופיות מיקרוסקופ וכן כיסוי עם coverslip. וחזור על שלב מספר תאים רצופה 3.4-3.6 רק אם רבים מדי מזוהים עם יעד X 20-
    הערה: אם מאגר המגון אינה מכילה EDTA או EGTA, להוסיף את שנאספו cavitate-ריכוז סופי של 1 מ מ בתוך 5 דקות אחרי השחרור.

4. הפרדת ממברנה שברים Cytosolic

  1. צנטריפוגה cavitate-500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר תאים רצופה ואת הגרעינים.
    הערה: חזור על השלב צנטריפוגה עד אין גלולה גלוי מופק ולאסוף את הפוסט גרעיני Supernatant (מערכת העצבים ההיקפית) תוך הימנעות הקצף שצף מעל. Centrifuge מחדש את הקצף נוספות לאסוף, לשלב מערכת העצבים ההיקפית, במידת הצורך ( איור 1).
  2. לעבד את מערכת העצבים ההיקפית לפי הצורך כדי לקבל שברים של עניין. לצורך הפרדת cytosolic ממברנה שברים, להעביר את מערכת העצבים ההיקפית צינור ultracentrifuge ולבצע ultracentrifugation לפי הצורך. פרוטוקול זה מיטבית < מ ל 3.5 מדגם צינור ultracentrifuge פוליקרבונט ועבור ultracentrifugation-350,000 g x עבור h 1-4 מעלות צלזיוס
  3. לאסוף את תגובת שיקוע (השבר S) באמצעות פיפטה של 1 מ"ל.
  4. לשטוף היטב את גלולה עם 3 מ"ל של PBS קר מבלי להפריע זה. הסר את PBS על ידי ואקום.
    הערה: אם זיהום של השבר הממברנה על ידי חלבונים cytosolic היא דאגה גדולה יותר מאשר אובדן הדגימה, resuspend בגדר ב- 3 מ"ל של PBS, re-ultracentrifuge כמו שלב 4.2 קר. הסר את PBS על ידי ואקום.
  5. Resuspend בגדר מלאה של אמצעי אחסון מתאים המכילים חומרי ניקוי solubilization מאגר של בחירה. כדי להשיג שקילות תא, להשתמש באותו אמצעי אחסון של מאגר solubilization השבר cytosolic.
    הערה: אנו מציעים באמצעות מאגר x RIPA 1 כמו מאגר solubilization להפקת חלבון ממברנה יעיל. אם אין assay במורד הזרם נדרשת עבור ממברנה שבר, השתמש מאגר מדגם x laemmli 1 לחילוץ חלבון ממברנה מקסימלי.
    הערה: אנו מציעים הם מוציאים והעברת בגדר במאגר solubilization על צינור נקי על שפופרת מסובב ב 4 ° C לחילוץ חלבון ממברנה מקסימלי.
    הערה: אם בגדר הוא דביק מדי (מדי שומנים) ביעילות יוסרו מ- thהרכבת התחתית במאגר solubilization e ultracentrifuge, אנו מציעים snap קפוא בגדר חנקן נוזלי, במהירות מוציאים בגדר מהצינור ultracentrifuge עם מרית מתכת מיני לפני בגדר מפשירה.
    הערה: לחלופין, ממברנה כדורי יכול להיות רק resuspended, לא solubilized במאגר המכילה אבקת לייצר חלקיק P קרום שלפוחית ההשעיה, שבו במקרה צנטריפוגה מקומו 4.6 אינה נדרשת. שברים כאלה P שימושיים בחקירת פונקציות כגון פעילות האנזים התלויות ממברנה האגודה-
  6. Centrifuge התליה גלולה באופן מלא solubilized מהשלב 4.5 ב g 20,000 x ומפרידה שולחן 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאסוף את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה של 1 מ"ל (השבר P) ולמחוק בגדר (ליפידים קשי תמס).
  7. לבצע מבחני הרצוי כגון סופג המערבי עם שברים cytosolic ו/או קרום, או לשמור אותם ב- 80 ° C לשימוש עתידי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 2 מציג את חלוקת החלבונים של מערכת העצבים ההיקפית לתוך שבר cytosolic מסיסים (S) או שבר צניפה ממברנה (P). בדקנו שלוש שורות תאים נציג מכל סוגי תאים שונים: HEK-293 (אפיתל) NIH-3T3 (פיברובלסט), Jurkat (לימפוציטים). רו גואנין דיסוציאציה מעכב (RhoGDI), ללא תלות הקטיון מנוז-6-פוספט קולטן (CIMPR) שימשו בקרים חיוביים ל cytosolic ושברים ממברנה, בהתאמה. אישרנו את ההפרדה יעיל של ציטוזול ואת קרום לאחר חנקן קוויטציה ב ~ 350 psi במאגר היפוטוניק ואחריו ultracentrifugation ב g x 350,000 לשעה. החלבון הכולל התאוששה S ו- P השברים נותחו ואז עם סמנים עבור המיון, endosomes, lysosomes, המיטוכונדריה, גולג'י ו organelles אחרים. כל החלבונים transmembrane הן נוכח השבר ממברנה באופן בלעדי, כולל Na+/K+ ATPase, קולטן גורם הגדילה באפידרמיס (EGFR) של קרום פלזמה, calnexin מן המיון, חלבון ממברנלי lysosomal-הקשורים 1 (LAMP1) מ lysosomes, F0-ATPase המיטוכונדריה, ואת Golgin 97 מ חוצה רשת גולג'י. כצפוי, חלבוני ממברנה פריפריאלי רבים קשורים באופן רופף עם הקרום, להציג את שניהם שברים cytosolic ואת קרום בדרגות. הדוגמאות כוללות אנדוזום מוקדם אנטיגן 1 (EEA1), Rab7/9 (לאחר endosomes) והקסוקינאז 1 (ממברנה המיטוכונדריה החיצוני). זה מדגים את התועלת של טכניקה זו בהערכה של עוצמת האגודה קרום חלבונים היקפיים. המעבדה שלנו ניצלה טכניקה קוויטציה זו לבחון את מצב שיוך ממברנה מספר איתות מולקולות5,12,13,14. מעניין, מצאנו calregulin באופן כמעט בלעדי השבר מסיסים, רומז כי microsomes שנוצר מתוך חדר המיון ממברנות גם שובשו במהלך קוויטציה חנקן, החלבונים ב- ER לומן משתחררים אל השבר מסיסים. לעומת זאת, השלמות של המיטוכונדריה לאחר קוויטציה תלויה בסוג התא. הבחנו F1-ATPase, המיטוכונדריה הפנימי היקפיים חלבון, באופן חלקי השבר cytosolic ועד 2% עבור תאים NIH-3T3 ~ 35% עבור תאים HEK-293 ו- Jurkat. אפשרות זו מציינת את החנקן קוויטציה בבית 350 psi עם מאגר היפוטוניק לא להבטיח את תקינות מיטוכונדריאלי. למרות בשלושה מחזורים של 500 x g ספינים כדי ליצור את מערכת העצבים ההיקפית מתוך cavitate, לא כל הגרעינים הוסרו. היסטון deacetylase 1 (HDAC1) לבין נוקלאופלזמה fibrillarin מ גרעינון, נמצאו הן את מערכת העצבים ההיקפית והן בגדר. הנוכחות של HDAC1 בגדר ולא את תגובת שיקוע עולה כי מערכת העצבים ההיקפית נגוע עם גרעינים, במקום גרעיני שיבושים במהלך קוויטציה. זה עקבי עם דוחות זה מתאים לחץ את הפצצה. כדי 350 psi משאיר גרעינים שלמים10, למרות השימוש היפוטוניק מאגר עלול להפוך הגרעינים שביר, כפי שפורט בסעיף מאוחר יותר.

השווינו את יעילות המגון קוויטציה חנקן עם זה של שיטות נפוצות אחרות הפרעה פיזית. כמויות שוות של תאים Jurkat מושעה במאגר המגון היפוטוניק זהה, חשופים לשיטות שיבושים שונים. היה אובדן לזיהוי של דוגמאות קוויטציה המגון וחנקן דאונס (בבשני המקרים כ 5-10% פחות נפח נאסף). עם זאת, חנקן קוויטציה נתן את היעילות החילוץ החלבון הגבוהה ביותר; מחט מעבר ו דאונס הניבו רק 60% מכמות הפרוטאין (איור 3). בסקרנות, שחזור של חלבונים מסוימים, כפי שנקבע על ידי immunoblot לא הראה הבדל משמעותי בין השיטות שיבושים מכניים שונים. לעומת זאת, התשואה של חלבונים מסוימים ממברנה פריפריאלי כגון הקסוקינאז 1 וראס היה גבוה בדגימות המוכנים קוויטציה חנקן. זה תומך קוויטציה חנקן הזה עשוי להיות אופטימלי המגון כאשר חוקרים חלבוני ממברנה פריפריאלי. שחזור של HDAC1 חלבונים על ידי חנקן קוויטציה משולה בשיטות אחרות, רומז כי הגרעינים נשארים בעינם בכל תנאי. לפיכך, הנתונים באיור 3 מוכיח שקוויטציה חנקן הזה מציע תוצאות המגון מעולה.

בשלב הבא, אנחנו לעומת היעילות המגון בין מאגר היפוטוניק המאגר אותו אבל מול עם סוכרוז או נתרן כלוריד (איור 4). כמויות דומות של חלבון נמצאו מתאי Jurkat הומוגני במאגר היפוטוניק מול מאגר מול NaCl לאחר קוויטציה בבית 350 psi. לעומת זאת, פחות חלבון התאוששה את מערכת העצבים ההיקפית של תאים במאגר גרם מול עם סוכרוז. חלבונים בודדים ביותר שבדק immunoblot להתאים תבנית זו. יוצא דופן היה fibrillarin זה היה יחסית מועשר בתמציות של מערכת העצבים ההיקפית המופקים מול מאגר.

כדי לקבוע אם הפרוטוקול שלנו יכול להיות מועסק לחקור חלוקה למחיצות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בין מסיסים, ממברנה שברים, השווינו חלוקה למחיצות של דפוסים בין מתויג דגל NRAS פראי סוג המוטציה שלה לקויה prenylation, C186S ( איור 5). מצב יציב, הסוג הפרוע NRAS היה נוכח ציטוזול והן ממברנות, הדומה ביותר היקפיים קרום חלבונים, אמנם החלק התאוששה השבר מסיס יותר מאשר עבור חלבונים אחרים ראס14. כאשר NRAS הוא משולל השינוי prenyl שלו, הוא מאבד את היכולת לקשר עם ממברנות, הופך לחלוטין cytosolic. דפוסי חלוקה למחיצות הצפוי NRAS אישר כי הפרוטוקול שלנו היא אופציה אמינה ללמוד את הדינמיקה של חלוקה למחיצות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בין ציטוזול ממברנות.

Figure 1
איור 1: תרשים זרימה סיכום שלב 2 (כחול), שלב 3 (אדום), שלב 4 (צהוב) של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: חלבון מחיצות בין שברים cytosolic ואת קרום. HEK-293, NIH-3T3 ותאי Jurkat היו נתונים קוויטציה חנקן (psi ~ 350 במשך 20 דקות, מושעה במאגר המגון היפוטוניק), ultracentrifugation (g x ~ 350,000 עבור 1 h) כמפורט בפרוטוקול. רמות החלבון אנדוגני בחלקים שונים נותחו על ידי immunoblot. מערכת העצבים ההיקפית: איגוד קולטן סרטן אנטיגן הביע על SiSo תאים (RCAS), תגובת שיקוע גרעינית, s: תגובת שיקוע, p: גלולה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: השוואה של טכניקות שונות שיבושים מכניים. כמות שוות ערך של תאים Jurkat היו מושעה במאגר היפוטוניק ונחשפו ההקפאה-הפשרה (3 מחזורים), המחט המגון (5 עובר, דרך המחט 28G½), מעבר של דאונס (עובר 15, Kontes 2 מ"ל דאונס שפופרת המרוסקים לטחון על רקמות, סיווג של 0.01-0.06 מ מ) או חנקן קוויטציה (psi ~ 350 במשך 20 דקות). רמות היחסי של חלבונים אנדוגני, מערכת העצבים ההיקפית נותחו על ידי immunoblot עבור כל אחת מהשיטות. ריכוז החלבון הכולל של מערכת העצבים ההיקפית היו לכמת על ידי BCA אסאy ו מנורמל לערך של מערכת העצבים ההיקפית שהוכנו על ידי חנקן קוויטציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: השוואה של היפוטוניק, מול מאגרי בשימוש במהלך חנקן קוויטציה. כמויות שוות ערך של Jurkat תאים הושעו מאגר היפוטוניק או מאגר היפוטוניק בתוספת 8.5% סוכרוז או 150 מ מ NaCl, ונחשפו קוויטציה חנקן (psi ~ 350 במשך 20 דקות). רמות היחסי של חלבונים אנדוגני, מערכת העצבים ההיקפית נותחו על ידי immunoblot עבור כל המאגר. ריכוז החלבון הכולל של מערכת העצבים ההיקפית לכמת על ידי BCA assay, מנורמל לערך של מערכת העצבים ההיקפית מוכנים במאגר היפוטוניק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: Farnesylated NRAS מחיצות לתוך שברים P ו- S. תאים HEK-293 היו transiently transfected עם פלסמידים מביים את הביטוי של NRAS מתויג דגל פראי סוג או מוטציה C186S. חלבון למחיצות בוצע כמתואר באיור 2, רמות חלבון המצוין נותחו על ידי immunoblot. לשכפל בעלי הרשאה (ג'ואו, ז. et al., 2016. פורסם במקור בהעת לביולוגיה התא. https://doi.org/10.1083/jcb.201604061). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

היתרונות של חנקן קוויטציה על פני שיטות אחרות של שיבוש מכני הן מגוונות. אולי היתרון המשמעותי ביותר הוא היכולת שלה בעדינות אך ביעילות homogenize דגימות. העקרונות הפיזי של דגימות מתקרר הלחץ במקום ביצירת הנזק חימום מקומי כמו אולטרה סאונד, חיכוך/הטיה המבוסס על טכניקות. קוויטציה הוא גם יעיל מאוד-שיבוש קרום פלזמה. מכיוון חנקן נוצרות בועות בתוך כל תא בודד על ביטול דחיסה, תהליך קוויטציה מוגבל פחות לפי גודל התא, לטעום גודל או לטעום ריכוז. לכן הוא מציע יתרונות נוספים על פני דאונס מבוסס-אישור או מחט מעבר המגון. חנקן קוויטציה מציע גם תוצאות עקביות יותר ככל שניתן להפיק אותו כוח הרסני המוחלת בצורה אחידה לאורך כל המדגם עם לחצים זהים. יתר על כן, כל תא רק חווה תהליך השיבוש עבור אפילו פעם אחת, רכיבי subcellular, לכן, לא כל הזמן נחשפים כוחות משובש משתנה. זה מגביל את פיצול artefactual של organelles. הדאגה חמצון של מרכיבי התא יציב נגרמת על ידי הפרעה היא גם התמודדות עימם, כמו חנקן משמש עיתוני התליה תא, ללא תשלום של תוספת חמצן. מוגבלת הפיסיקליות והכימיות הלחצים המוטלים על-ידי חנקן קוויטציה הופך את טכניקת אידיאלי ללמוד אנזימים יציב organelles שברירי, ואת את הפארמצבטית של טכניקה זו המגון מתאים היטב על כימות.

חנקן קוויטציה מציע גם גמישות משמעותית לגבי גודל המדגם, ההרכב של מאגרי המגון שיעור המוסריות אברון. לשנות את קנה המידה של המגון, פשוט צריך לפרוס מיכלי לחץ של קיבולת גדולה יותר, מבלי להקריב את מהירות, נוחות או יעילות של ביטול דחיסה. ניתן להשתמש בכל מאגר המגון קוויטציה חנקן; מאגר הבחירה ניתן להתאימו לתאימות עם הדרישות של כל ניסוי. אחד יכול לעצב מאגר המגון התואמת את הנוזלים תאיים (למשל, אשלגן גבוהה, נתרן נמוכה) למזעור שינויים ב- organelles. כך למשל, פיתחנו חיץ "רגיעה" ממזער שמחוץ פלמור אקטין, ובכך מסייע באיסוף שלפוחית cytoplasmic שלם של גרנולוציטים5. התכונות osmotic יוניים מאגר יכול גם להיות שונה כדי לקבוע את מידת המגון תא. בנוסף, התוקפנות של שיבוש הסלולר יכול להיות נשלט על ידי התאמת הלחץ חנקן. לחץ מתון מקטין את כוח הרסני כדי לשמר את הגרעינים, המיטוכונדריה, אחרים organelles במצב תקין, בעוד בלחץ גבוה משבש את organelles האלה. ברוק ואח. דיווחו על הצלחה עם הפרעה של תאים הלוקמיה Basophilic חולדה תוך שמירה על רוב הגרעינים שלמים בבית 350 psi עם מאגר היפוטוניק10, אשר מהווה את הבסיס לחץ חנקן בפרוטוקול הנוכחי שלנו.

מגבלות של חנקן קוויטציה כוללים את העובדה כי המגון הוא אחיד לאורך כל הדגימות, מבנים שונים ממברנה עשויה לייצר שלפוחית בגדלים דומים; זה יכול לסבך את ההפרדה נוספת של קרום פלזמה, חלק microsomes, endosomes גולג'י ממברנות על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות קצב-סונאל. חשש נוסף הוא כי organelles להיות שביר יחסית לאחר המגון עקב שבר מבפנים. לפיכך, שיטה זו דורשת אופטימיזציה זהירה כדי למנוע שבירה אברון תוך מניפולציות עוקבות. אנחנו נועדו להתמודד עם הבעיות הללו במחקר זה.

הפרדה בין cytosolic ו שברים הממברנה על ידי צנטריפוגה יש נחקרו בדוחות מוגבל המפרט את חלוקת שברים חלבון עם קומץ של חלבון סמני15,16. השיטה שלנו יוצרת הפרדה גסה של חלבונים מסיסים ולא מאוגד-ממברנה, אינו כרוך בידוד של organelles מסוים. ובכל זאת, זה עדיין עניין חוקי השלפוחיות המוגלתיות הומוגנית של ממברנות שונים המיוצרים על ידי קוויטציה עשוי להשפיע על היעילות של הפרדה על ידי ultracentrifugation. הצגנו סקר מקיף על ידי immunoblots בידוד חלוקת organelles subcellular נפוצות לאחר fractionation עם פרוטוקול שלנו. כצפוי, חלבונים גרידא cytosolic כמו RhoGDI הם אך ורק שבר מסיסים, וכן חלבונים transmembrane על קרום פלזמה (PM) כגון EGFR ו- Na+/K+ ATPase, התגלו רק ב בגדר. חלבונים transmembrane על organelles כגון ER, המיטוכונדריה, גולג'י, lysosomes התגלו גם ב בגדר, המאשר כי חלבוני ממברנלי אינטגרלי ממברנות שונות, organelles יכול להיות בהצלחה הפרדה בין חלבונים מסיסים עם השיטה שלנו. אימות בסיסי זה הוא קריטי עבור ניתוח נוסף של חלבוני ממברנה פריפריאלי, שהוא המטרה העיקרית של פרוטוקול זה.

רוב החלבונים ממברנה פריפריאלי קיימים שני שברים cytosolic של הממברנה. למרות זאת הוא לעיתים קרובות ייצוג אמיתי של לוקליזציה שלהם, זה עלול במקרים מסוימים מייצגים הפצה artefactual של חלבונים אלה מפני השטח cytoplasmic של ממברנות השבר מסיסים במהלך תהליך המגון, מאז כוחו של הקשר שלהם עם ממברנות אינו חזק כמו זה של חלבוני ממברנלי אינטגרלי. למרות חנקן קוויטציה ממזער את פוטנציאל הפצה באמצעות חשיפת תאים כדי הפרעה חד פעמית, עדין, אחד צריך להיות מודע שמירת חפצים של fractionation הביוכימי, להתמקד על שינויים חלוקת חלבונים בין cytosolic ושברים קרום על פני תנאי הניסוי. עם זאת, הבחינה של חלבוני ממברנה פריפריאלי בשלבים שונים של התבגרות endosomal אפשרי בשיטה זו. EEA1, אפקטור Rab5 המעביר עגינה של שלפוחית מצופים clathrin endosomes מוקדמת, רגישה השטח cytoplasmic של endosomes מוקדם, התאוששה בעיקר השבר גלולה. מאחר אנדוזום-Rab7 ו- Rab9 חלבונים הקשורים הינם גם השבר גלולה. עם זאת, נותר סכום ניכר Rab7/9 ב ציטוזול. בגלל RabGDI הוא מסוגל לקיים אינטראקציה עם prenylated Rabs ועיבוד חלבונים מסיסים אחרת אלה cytosolic, חלבונים ראב נוטים להיות יותר cytosolic מאשר חלבונים אחרים הקשורים אנדוזום ממברנה פריפריאלי.

כדי לאפיין את תקינות גרעין, אברון עם המגון על ידי חנקן קוויטציה, אנחנו immunoblotted שברים בודדים עבור תאים cytoplasmic והן luminal. ניתוח זה, calregulin משוחרר לחלוטין לתוך השבר מסיסים, הוכחת כי מיון מופרת על טופס microsomes, ובכך דליפות תוכן luminal. נתון זה מחצית מכלל השטח של קרום תא האיקריוטים יקיף את החללים מבוכיים של המיון, זה מפתיע, אפוא, כי שלה רשת נרחבת של המבנה דמוי שק או צינורי נכשל נשארים בעינם במהלך הרחבת בועות חנקן. מצד שני, הניתוח שלנו של שלמות מיטוכונדריאלי לאחר קוויטציה מראה ברור התלות סוג התא, כמו הבחנו F1-ATPase, חלבון זה משויך באופן עקיף הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה, בתוך השבר cytosolic בדרגות (~ 35% HEK-293, Jurkat, 2% עבור NIH-3T3). אפשרות זו מציינת את החנקן קוויטציה בבית 350 psi עם מאגר היפוטוניק אינה מבטיחה מיטוכונדריאלי שלמות. אכן, אחרים דיווחו כי כדי לשמר את המיטוכונדריה, קוויטציה צריכה להתבצע על לחצים נמוכים יותר 150 psi17. לעומת זאת, מצאנו שכי קטלאז נשאר לומן של peroxisomes. מסקרן, חלבונים גרעיניים הם נצפו שברים מערכת העצבים ההיקפית, גלולה. באופן ספציפי, HDAC1, deacetylase היסטון. מוצמד נוקלאופלזמה, נעדר ב השבר מסיסים, המציין כי שלמות הגרעין לא נפגעת. זה מרמז כי המעטפה גרעיני לא מופרת על ידי קוויטציה, כפי שניתן היה לצפות על שחרורו של HDAC1 לתוך solubשבר le בתרחיש זה. זה נשאר סביר כי הגרעינים לא יוסרו לחלוטין במהלך התהליך של הכנת מערכת העצבים ההיקפית, החלבון נשאר בגדר לאחר ultracentrifugation. הסבירות הזו נתמכת עוד יותר העובדה כי אין נזילה דנ א מתגלה השבר מסיסים. נוכל לסכם, לכן, כי באמצעות מאגר המגון היפוטוניק במהלך קוויטציה בבית ~ 350 psi עם התוספת של2 + Mg הוא מסוגל לשמור על שלמות הגרעין בשורות תאים מרובים.

התוצאות שלנו גם להוכיח כי הריבוזומים לאסוף לחלוטין השבר צניפה ממברנה, רומז כי אפילו חינם הריבוזומים בציטופלסמה, כי הם לא מאוגד לממברנות חדר המיון יכול להיות לגמרי sedimented במאגר שאינו-סוכרוז-כרית לאחר צנטריפוגה-350,000 g x עבור ה 1 בדומה לכך, זיהוי של החלבון הקשורות autophagy 12 (Atg12)-המספר המשלים Atg5 כסמן של autophagosomes, חושף סגרגציה נוקשה כדי שברים גלולה. נוכחותה ציטוזול עלולה להיגרם על ידי העובדה כי קוולנטיות-ההחזקה של Atg12 ו- Atg5 הסכם מקדים היווצרות autophagosomes. חלבונים cytoskeletal קשים להעריך בגלל שמחוץ הפילמור. ניתן למזער את התופעה עם מאגר הרפיה אך בפרוטוקול המתוארים כאן, טובולין הוא סביר polymerized ex-vivo על קלאציה של סידן 18. ההכנות שלנו טובולין נמצא בגדר רומז הפילמור ואילו אקטין נמצא בחלקים P ו- S.

כדי לאפיין את היתרונות הפוטנציאליים של חנקן קוויטציה המגון יעילות, שאנו שנסקרו כמה טכניקות הפרעות מכניות נפוצות. שיטות אופטימיזציה עבור דגימות רקמה כמו בלנדר או פצצות מרגמה/כמוה לא הוערכו. Sonication הורחק גם כפי שקשה לשבש את הקרום השטח תוך שמירה על organelles פנימי ללא פגע. הניתוח שלנו התמקדו בשיטות הבאות: הפשרת ההקפאה, מחט מעבר, המגון דאונס, כפי שהם קל לבצע, אינם דורשים ציוד מיוחד כמו מהמגן מיסב כדורי. תאים Jurkat שימשו ניתוח זה בשל גודלם הקטן, ההופכת אותם קשה homogenize ביעילות עם טכניקות מסורתיות ההטיה נוזלי התלויות סיווג, כגון מעבר המחט דאונס. שפטו את ריכוז החלבון הכולל התאושש, מצאנו כי הפרעה עצמאית גודל תא שיטות כמו חנקן קוויטציה הפשרת ההקפאה להראות אכן יעילות מעולה של חלבון החילוץ. ניתוח דומה עם תאים בגדלים גדולים יותר גילה הבדלים קטנים המגון היעילות, למרות חנקן קוויטציה עדיפה עדיין לשיטות חלופיות הפיזיים שנבדקו (נתונים לא מוצג).

רבים cytosolic, endosomal, שלד התא חלבונים ששוחזרו ביעילות עם כל שיטות בדוקות. לעומת זאת, חלבוני ER, גולג'י בצורה אופטימלית נמצאו באמצעות חנקן קוויטציה. התשואה מעט נמוך יותר של F1-ATPase, חנקן קוויטציה יחסית לשיטות אחרות עשוי לשקף את העובדה המיטוכונדריה הם נוטים יותר נותרו ללא פגע במהלך קוויטציה ולכן יותר להסיר ביעילות ספין במהירות איטית נהגה צור את מערכת העצבים ההיקפית. התצפית הזו הקסוקינאז 1, חלבון ממברנה פריפריאלי מצאו שניהם ציטוזול ומשויכים מיטוכונדריאלי הממברנה החיצונית, התנהגו בצורה הפוכה ביחס F1-ATPase סביר משקף את lability של איגוד הקסוקינאז 1 ביחס F1-ATPase, אשר הוא מבודד בתוך המיטוכונדריה. חשוב, למרות מסוגל לשבש את פעולת התאים בעזרת יעילות דומה, שיטות אלטרנטיביות שיבושים מכניים נתן ההחלמה הדלה יחסית של חלבונים מסוימים ממברנה פריפריאלי (הקסוקינאז 1 ו RAS). לכן, קוויטציה הוא הטכניקה המגון שלנו להתמקד במטרה לחקור את המחיצה של חלבוני ממברנה פריפריאלי. מאחר דאונס המגון משמשת באופן נרחב כדי להכין גרעינים שלמים, השתמשנו דאונס תקן ביצוע כדי להעריך את תקינות גרעינית על פני שיטות אחרות להפרעה מכנית. בניתוח שלנו, רמות דומות של שחזור של חלבונים HDAC1 לאשר כי הגרעינים נשארים ללא שינוי homogenates Jurkat שהוכנו על ידי חנקן קוויטציה בבית ~ 350 psi עם מאגר היפוטוניק.

זה היה ברור שהמאגר המגון במהלך חנקן קוויטציה יכול להשפיע משמעותית על שלמות אברון ויעילות של הפרעה. אמנם צריך ניתן למטב את ההרכב של מאגר המגון הדרישות של היישום המיועד, ראוי לציין כי חוקרים ביצוע חנקן דקומפרסיה של רקמות בעלי חיים משתמשים מאגר עם לחץ אוסמוטי נמוך כדי לחלץ גרעיני התכנים. האנטר, Commerford הראה גרעינים נפיחות קרע הפתרונות היו שתדללו, ואת שימור גרעינים בעת שימוש פתרונות מול7 (אשר יכולה להיות מושגת מלחי אורגניים כגון נתרן כלורי או מומסים בגבול אורגניים כגון הוספה סוכרוז או גליצרול). המאגר מול סטנדרט המשמש לבידוד organelles subcellular שאינו גרעיני תאים בתרבית של 0.25 M סוכרוז המכיל 1 מ מ EDTA, באגירה מלאה עם טריס, HEPES או Tricine ב- pH 7.0-7.6. אך לא כל התאים תרבות יכולה להיות הומוגני ביעילות באחד המאגרים מול... מאגר היפוטוניק (בדרך כלל 10 מ"מ. טריס, HEPES, וכו) משמש לעתים קרובות כדי לספק מתח osmotic הכרחי סוגי תאים מסוימים כדי להשיג המגון מלאה. עם זאת, כפי שהוזכר קודם לכן, מאגרי היפוטוניק נוטים לעיבוד הגרעינים שביר ונוטים דליפה של ה-DNA כאשר EDTA. כדי לקדם את שלמות הגרעין, נחליף EDTA עם אשלגן כלורי, ריכוזים נמוכים של קטיונים דו ערכיים כגון MgCl2 או MgSO4. Mg2 + עדיף בדרך כלל מעל Ca2 + מכיוון שהאחרון יכול להפעיל את phospholipases של פרוטאזות מסוימים ומעכבות RNA פולימראז. לאחר סיום קוויטציה, EDTA או EGTA ניתן להוסיף בחזרה homogenates כדי chelate את הקטיון, במקרה הצורך, כדי לעכב את metalloproteases.

Jurkat תאים מציגים יחס גדול יחסית הגרעין אל הציטופלסמה, הפיכתם קו תא אידיאלי ללמוד שלמות הגרעין. העלייה של יעילות המגון באמצעות מאגר היפוטוניק היא מזערית בהשוואת אל מול מאגר בתוספת NaCl. עם זאת, קוויטציה ב מאגר מול בתוספת סוכרוז משחזרת כ חצי החלבונים חילוץ באמצעות מאגר היפוטוניק מקבילה. . זה לא צפוי להיות תוצאה ישירה של isotonicity, הפער בין באמצעות NaCl ושימוש סוכרוז להשגת isotonicity דורש חקירה. הסבר אפשרי אחד הוא מלח משבש אלקטרוסטטית אינטראקציות בין חלבונים ואילו סוכרוז אינו. לפיכך, אפילו בזמן וגמישותו אותו, NaCl יש פעילות הרלוונטיים החילוץ חלבון חסר סוכרוז. With ביחס לשמירת תקינות גרעינית, מצאנו חלבונים מוגברת fibrillarin התאוששה עם מול אנשים רגילים, למרות מול מאגרי תיאורטית מגונן יותר של הגרעינים. למרבה הפלא, השבר מיטוכונדריאלי נעקר ביעילות רבה יותר עם מאגר מול בתוספת NaCl, טוען כי התנאים מלח נמוכה ייתכן שיוצרת לחילוץ המיטוכונדריה. בהתחשב קוויטציה עם מאגר היפוטוניק משיגה את האיזון הטוב ביותר בין יעילות המגון שלמות הגרעין, מאגר היפוטוניק הופך המאגר לפי בחירה, פרוטוקול שלנו של קוויטציה. עם זאת, אנחנו אזהרה לקוראים כי אין מאגר היא ערבות של האופטימלית המגון תוצאות. פרוטוקול שלנו צריך לשמש כתבנית עבור מיטוב, והקימו פיילוט בדיקות עם מאגרי הרצוי, שורות תאים של עניין ומשתנים אחרים (לחץ, מאגר הרכב, וכו ') חייב להיות לקבלת התוצאות הטובות ביותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו מומן על ידי GM055279, CA116034 ו- CA163489.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Disruption Vessel (45 mL) Parr Instrument 4639 Nitrogen cavitation Bomb
Dounce homogenizer (2 mL) Kontes 885300-0002 Dounce pestle and tube
U-100 Insulin Syringe 28G½ Becton Dickinson 329461 Needle
Atg12 antibody Santa Cruz 271688 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-actin antibody Santa Cruz 47778 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-tubulin antibody DSHB E7-s Mouse antibody, use at 1:5000 dilution
Calnexin antibody Santa Cruz 23954 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Calregulin antibody Santa Cruz 373863 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Catalase antibody Santa Cruz 271803 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
CIMPR antibody Abcam 124767 Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
EEA1 antibody Santa Cruz 137130 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
EGFR antibody Santa Cruz 373746 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F0-ATPase antibody Santa Cruz 514419 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F1-ATPase antibody Santa Cruz 55597 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Fibrillarin antibody Santa Cruz 374022 Mouse antibody, use at 1:200 dilution
Golgin 97 antibody Santa Cruz 59820 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
HDAC1 antibody Santa Cruz 81598 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Hexokinase 1 antibody Cell Signaling Technology 2024S Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Lamin A/C antibody Santa Cruz 376248 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
LAMP1 antibody DSHB H4A3-c Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Na+/K+ ATPase antibody Santa Cruz 48345 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Rab7 antibody Abcam 137029 Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Rab9 antibody Thermo MA3-067 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RCAS1 antibody Santa Cruz 398052 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RhoGDI antibody Santa Cruz 360 Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution
Ribosomal protein S6 antibody Santa Cruz 74459 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Sec61a antibody Santa Cruz 12322 Goat antibody, use at 1:1000 dilution
Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube Beckman Coulter 349622 Sample tube for ultracentrifugation
TLK-100.3 rotor Beckman Coulter 349481 rotor for ultracentrifugation
Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge Beckman Coulter 364300 ultracentrifuge
cOmplete protease inhibitor cocktail tablets Roche 11697498001 protease inhibitors
Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade Corning 353089 large cell scraper
Magnetic Stir Bar Fisher Scientific 14-513-57SIX micro stir bar
Ceramic-Top Magnetic Stirrer Fisher Scientific S504501AS magnetic stirrer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, (10), 656-668 (2011).
  2. Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling. Cytotechnology. 61, (3), 153-159 (2009).
  3. Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).
  4. Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation. J Cell Biol. 86, (1), 21-28 (1980).
  5. Philips, M. R., et al. Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes. Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).
  6. Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution. Cancer Res. 20, 397-402 (1960).
  7. Hunter, M. J., Commerford, S. L. Pressure homogenization of mammalian tissues. Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).
  8. Wallach, D. F., Kamat, V. B. Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).
  9. Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3, (3), 653-654 (1977).
  10. Brock, T. G., Paine, R. 3rd, Peters-Golden, M. Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells. J Biol Chem. 269, (35), 22059-22066 (1994).
  11. Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation. FEBS Letters. 2, (1), (1968).
  12. Dai, Q., et al. Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 273, (24), 15030-15034 (1998).
  13. Wynne, J. P., et al. Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector. J Cell Biol. (2012).
  14. Zhou, M., et al. VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking. J Cell Biol. 214, (4), 445-458 (2016).
  15. Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27, (6), 1478-1485 (2007).
  16. Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46. Biochem J. 453, (3), 475-485 (2013).
  17. Annis, M. G., et al. Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event. Oncogene. 20, (16), 1939-1952 (2001).
  18. Berkowitz, S. A., Wolff, J. Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins. J Biol Chem. 256, (21), 11216-11223 (1981).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics