Nitrógeno cavitación y centrifugación diferencial permite el monitoreo de la distribución periférica de proteínas de membrana en células cultivadas

Biochemistry

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Summary

Aquí presentamos los protocolos para la homogeneización de detergente libre de células de mamíferos cultivadas basado en nitrógeno cavitación y posterior separación de las proteínas citosólicas y membrana-limitan por ultracentrifugación. Este método es ideal para el monitoreo de la partición de proteínas periféricas de membrana entre soluble y fracciones de la membrana.

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Zhou, M., Philips, M. R. Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (126), e56037, doi:10.3791/56037 (2017).

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Abstract

Las células cultivadas son útiles para estudiar la distribución subcelular de proteínas, incluyendo proteínas de membrana periférica. Codificada genéticamente fluorescente etiquetadas proteínas han revolucionado el estudio de la distribución subcelular de la proteína. Sin embargo, es difícil cuantificar la distribución con microscopia fluorescente, especialmente cuando las proteínas son parcialmente citosólicas. Por otra parte, a menudo es importante para el estudio de proteínas endógenas. Bioquímicos de ensayos como immunoblots siguen siendo el estándar de oro para la cuantificación de la distribución de la proteína después de fraccionamiento subcelular. Aunque existen kits comerciales que tienen como objetivo aislar citosólica o ciertas fracciones de la membrana, la mayoría de estos kits se basa en la extracción con detergentes, que puede ser inadecuado para el estudio de proteínas de membrana periférica que se extraen fácilmente las membranas. Aquí presentamos un protocolo libre de detergente para celular homogeneización por nitrógeno cavitación y posterior separación de las proteínas citosólicas y membrana-limitan por ultracentrifugación. Confirman la separación de orgánulos subcelulares en soluble y fracciones de pellets a través de diferentes tipos de células y comparar la extracción de proteínas entre varios métodos de homogeneización mecánica no-base de detergente común. Entre varias ventajas de nitrógeno la cavitación es la superior eficacia de disrupción celular con daño mínimo de físico y químico delicada organelos. Combinado con ultracentrifugación, nitrógeno la cavitación es un método excelente para examinar el cambio de las proteínas periféricas de membrana entre citosólica y fracciones de la membrana.

Introduction

Proteínas celulares se pueden dividir en dos clases: los que están asociados a membranas y aquellos que no son. No-membrana las proteínas asociadas se encuentran en el citosol, nucleoplasia y lumina de orgánulos como el retículo endoplásmico (ER). Hay dos clases de proteínas asociadas a membrana, integrales y periféricas. Proteínas integrales de membrana también son conocidas como proteínas transmembranales porque uno o más segmentos de la cadena polipeptídica atraviesa la membrana, por lo general como una α-hélice compuesta de aminoácidos hidrofóbicos. Proteínas transmembranales co-translationally se insertan en las membranas en el curso de su biosíntesis y permanecerán así configuradas hasta que catabolizan. Proteínas de la membrana periférica secundario son conducidas a las membranas, generalmente como consecuencia de la modificación poste-de translación con moléculas hidrofóbicas como los lípidos. En contraste con las proteínas de membrana integral, la Asociación de las proteínas periféricas de membrana con las membranas celulares es reversible y puede ser regulada. Muchos periférica de membrana proteínas función en vías de señalización y asociación regulada con membranas es uno de los mecanismos de activación o inhibición de una vía. Un ejemplo de una molécula de señalización que es una proteína periférica de membrana es la pequeña GTPasa, RAS. Después de una serie de modificaciones post-traduccionales que incluyen modificación con un lípido farnesil, el c-término modificado de una proteína madura de RAS inserta en el folleto de citoplásmico de la membrana celular. En concreto, la membrana plasmática es donde el RAS se dedica a su efector downstream RAF1. Para evitar la activación constitutiva de vía de mitógeno-activada proteína quinasa (MAPK), varios niveles de control de RAS están en lugar. Además de renderización RAS inactivo por hidrolizando GTP en PIB, RAS activa también se puede lanzar desde la membrana plasmática por modificaciones o interacciones con factores para inhibir la señalización de solubilización. Aunque la proyección de imagen vivo fluorescente ofrece a biólogos de célula la oportunidad de observar la localización subcelular de fluorescente etiquetado proteína periférica de membrana proteínas1, existe una necesidad crítica para evaluar la Asociación de la membrana de proteínas endógenas semi-cuantitativamente con enfoques bioquímicos simples.

La evaluación bioquímica adecuada de proteína repartir entre fracciones solubles y de membrana es críticamente dependiente de dos factores: celular homogeneización y eficiente separación de fracciones solubles y de membrana. Aunque algunos de los protocolos, incluyendo los kits comercializados más utilizados, dependen de homogeneización de la célula base de detergente, estos métodos pueden confundir análisis mediante la extracción de proteínas de la membrana en la fase soluble2. Por consiguiente, no detergente mecánicos, basado en métodos de disrupción celular proporcionan resultados limpiador. Existen varios métodos de interrupción mecánica de células cultivadas en cultivo o cosecha de sangre o de órganos. Estos incluyen Dounce homogeneización, interrupción de fina de la aguja, rodamientos de bolas homogeneización, sonicación y cavitación de nitrógeno. Aquí evaluamos cavitación de nitrógeno y se compara con otros métodos. Cavitación de nitrógeno depende del nitrógeno que está disuelto en el citoplasma de las células bajo alta presión. Después de equilibrar, la suspensión de células se expone bruscamente a la presión atmosférica que burbujas de nitrógeno se forman en el citoplasma que rasgar abierto la célula como consecuencia de su efervescencia. Si la presión es suficientemente alta, efervescencia de nitrógeno puede perturbar el núcleo3 y membrana destino organelos como lisosomas4. Sin embargo, si la presión se mantiene lo suficientemente baja, la descompresión alteran la membrana plasmática y ER pero no otros organelos, derramando así citosol y orgánulos citoplásmicos intactos en el homogeneizado que se señala el cavitate5. Por esta razón, la cavitación de nitrógeno es el método de elección para aislar organelos como lisosomas y mitocondrias.

Sin embargo, también es una excelente manera de preparar un homogeneizado que puede ser fácilmente separado en fracciones solubles y de membrana. El recipiente del reactor (de aquí en adelante llamado "la bomba") usado durante la cavitación consiste en una carcasa de acero inoxidable grueso que soporta alta presión, con una entrada para la entrega del gas nitrógeno desde un tanque y un puerto de salida con una válvula de descarga ajustable.

Cavitación de nitrógeno se ha utilizado para la homogeneización de la célula desde la década de 19606. En 1961, cazador y Commerfold7 estableció cavitación de nitrógeno como una opción viable para la interrupción de tejidos de mamíferos. Desde entonces, los investigadores han adaptado la técnica a diferentes células y tejidos con éxito y cavitación de nitrógeno se ha convertido en una grapa en múltiples aplicaciones, incluyendo membrana preparación8,9, núcleos y organelas preparación10,11y extracción bioquímica lábil. En la actualidad, biólogos de la célula más a menudo emplean otros métodos de homogeneización de la célula porque las ventajas de la homogeneización de nitrógeno no han sido ampliamente anunciadas, bombas de nitrógeno son caras y hay una idea errónea de que un número relativamente grande de células es Obligatorio. No se han publicado protocolos para la cavitación de nitrógeno alcanzar homogenados sin células con núcleos intactos, y en evaluaciones más publicadas se utilizaron volúmenes de 20 mL de la suspensión celular. Para adaptar esta técnica clásica para los requerimientos actuales de trabajar con muestras pequeñas, presentamos un protocolo modificado de cavitación de nitrógeno diseñado específicamente para las células cultivadas. Después de la cavitación del nitrógeno, el homogenado se separa en fracciones de membrana (P) y soluble (S) por centrifugación diferencial, primero con un exprimido a velocidad baja para extraer los núcleos y células intactas y luego con un exprimido a alta velocidad (> 100.000 x g) para separar membranas de la fracción soluble. Analizar la eficiencia de la separación con los immunoblots y comparar cavitación de nitrógeno con otras técnicas de interrupción mecánica. También investigamos el efecto osmótico de buffer de homogenización durante la cavitación de nitrógeno.

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Protocol

1. buffer y preparaciones de equipo

  1. enfriar 45 mL celular interrupción bombas, tubos de 15 mL y tubos de ultracentrifugación a 4 ° C.
  2. Preparación y 25 mL de buffer de homogenización por 2 x 10 7 células a 4 ° C. agregar una proteasa inhibidor tableta antes de uso.
    Nota: Reservas de homogeneización normalmente contienen KCl en vez de NaCl para mejor reflejar la composición sal intracelular. Buffer de homogeneización utilizado en este protocolo se compone de 10 mM HEPES, pH 7.4, 10 mM KCl y 1,5 mM de MgCl 2 (en lo sucesivo como buffer de homogeneización hipotónica). Almacenadores intermediarios la mayoría pueden ser adaptados para la cavitación del nitrógeno (ver discusión).
  3. Preparación y 6 mL de 1 x de buffer de Phosphate-Buffered salina (PBS) por muestra a 4 ° C. agregar proteasa inhibidor tabletas frescas antes de su uso.
    Nota: Tampón PBS utilizado en este protocolo consiste en Na 2 HPO 4 de 10 mm a pH 7.4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl y KCl de 2.7 mM.
  4. Preparación y 4 mL de tampón de solubilización por muestra a 4 ° C. agregar una proteasa inhibidor de la tableta antes de uso.
    Nota: Tampón de solubilización utilizado en este protocolo es 1 Tampón de ensayo (RIPA) x Radioimmunoprecipitation, que consiste en 25 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, desoxicolato de sodio 0.5% y 1% NP-40. Véase la nota 4.6.

2. La cosecha de la célula

medios de cultivo
  1. crece 2 x 10 7 -10 x 10 9 células de cultivo de tejidos con la recomendada para el tipo de célula. Por lo general, un plato de 15 cm rinde 2 x 10 7 células HEK-293 cultivadas en DMEM en confluencia de 90% ( figura 1).
  2. Quitar el medio de crecimiento por el vacío de.
  3. Para las células adherentes, coloque los platos de la cultura en hielo, lavar las células directamente en los platos de la cultura con buffer de homogeneización fría dos veces (10 mL de tampón por plato 15 cm por lavado) y cosechar las células con una espátula grande de la célula en un volumen adecuado de buffer de homogeneización; Para las células de suspensión, recolectar y lavar el precipitado de células en frío homogeneización buffer dos veces (10 mL de tampón por cultura de 50 mL por lavado) con giro de 500 x g a 4 ° C por 5 min y resuspender el precipitado de células lavadas en un volumen adecuado del buffer de homogeneización en el hielo.
    Nota: el volumen debe basarse en los requisitos para la concentración de proteína en los experimentos previstos, así como el mínimo/máximo volumen permitido en la bomba de disrupción celular. Una pauta general es 2-10 x 10 7 células/mL, o unos 10 volúmenes de la celda de pellets. Este protocolo está optimizado para tres platos de 15 cm de las células HEK-293 en 2 mL de buffer de homogenización.

3. Cavitación de nitrógeno

  1. traslado de la suspensión celular a una bomba limpia y enfriada en un baño de hielo en un revuelo placa.
    Atención: La bomba tiene alta presión, baja temperatura, nitrógeno – Utilice protección personal adecuada .
  2. Colocar una barra de agitación magnética micro dentro de la bomba y encienda la placa de agitación para mantener la homogeneidad de la suspensión.
  3. Añadir una tableta de inhibidor de proteasa a la suspensión y cierre de la bomba por el fabricante ' instrucción s.
  4. Gradualmente presurice la bomba con un tanque de gas nitrógeno por fabricante ' instrucción de s hasta el medidor de presión de bomba Lee 300 a 600 psi. Todas las válvulas de cierre y desconecte el tanque de nitrógeno.
    Nota: La presión requerida puede variar con el tipo de célula. Aquí realizamos cavitación a 350 a 400 psi para las células HEK-293, NIH-3T3 y Jurkat.
  5. Espere 20 minutos permitir que el nitrógeno a disolver y a alcanzar equilibrio dentro de las células.
  6. Eliminar exceso de agua alrededor de la válvula de descarga con una toalla. Abra la válvula de descarga suavemente para lograr una liberación gota a gota de homogeneizado y recoger en un tubo previamente enfriado 15 mL.
    Nota: Cerca del final de la colección habrá un chorro de homogeneizado y gas saldrá con un silbido. Asegúrese de que el gas no causa recogieron cavitará para tirar del tubo (por lo tanto, la utilización de 15 mL tubos en lugar de tubos de 1,5 mL). Una vez que el chorro se inicia, cierre la válvula de descarga y abra la válvula de entrada de nitrógeno abruptamente para despresurizar la bomba y lograr la cavitación de las celdas restantes de la bomba. Abrir la bomba para cavitará recuperación y limpieza.
    Nota: Cavitate final debe tener un aspecto lechoso con espuma en la parte superior. Revuelva suavemente con una pipeta para permitir que la espuma antes de centrifugación a.
    Nota: Examine el cavitate por microscopia de contraste de fase para determinar la eficacia de la homogeneización. Añadir una gota de 15 μl de cavitará a la superficie de un portaobjetos de microscopía y cubrir con un cubreobjetos. Repita el paso 3.4-3.6 sólo si demasiadas células intactas se detectan con objetivo 20 X.
    Nota: Si el buffer de homogeneización no contiene EDTA o EGTA, añadir a la recogida cavitará a una concentración final de 1 mM dentro de 5 minutos después de la descarga.

4. Separación de Cytosolic y fracciones de la membrana

  1. centrífuga cavitate a 500 x g por 10 min a 4 ° C para eliminar las células intactas y núcleos.
    Nota: Repita el paso de centrifugación hasta no pellet visible se produce y recoge el Post Nuclear flotante (PNS) evitando la espuma flotante en la parte superior. Volver a centrifugar la espuma para recoger y combinar PNS, si es necesario ( figura 1).
  2. Proceso de PNS como desee para obtener fracciones de interés. Con el fin de separar citosólica y fracciones de la membrana, el PNS la transferencia a un tubo de ultracentrífuga y realizar ultracentrifugación como desee. Este protocolo está optimizado para una < 3,5 mL de muestra en un tubo de ultracentrífuga de policarbonato y de ultracentrifugación a 350.000 x g durante 1 h a 4 ° C.
  3. Recoger el sobrenadante (fracción S) usando una pipeta de 1 mL.
  4. Cuidadosamente Lave el precipitado con 3 mL de PBS frío sin perturbarla. Retirar el PBS por el vacío de.
    Nota: Si la contaminación de la fracción de membrana por las proteínas citosólicas es una preocupación mayor que la pérdida de muestra, Resuspender el precipitado en 3 mL de PBS y re-ultracentrífuga como en el paso 4.2. Retirar el PBS por el vacío de.
  5. Resuspender el precipitado totalmente en un volumen adecuado de tampón de solubilización que contiene detergente de preferencia. Para lograr la equivalencia de celda, usar el mismo volumen de tampón de solubilización como la fracción citosólica.
    Nota: Se sugiere utilizar 1 x RIPA buffer como tampón de solubilización para la extracción de proteínas de membrana eficiente. Si no análisis aguas abajo es necesario para la fracción de membrana, usar 1 x laemmli solución tampón de muestra para la extracción de proteínas de membrana máxima.
    Nota: Le sugerimos desalojando y transferir el precipitado en tampón de solubilización a un tubo limpio en un rotador de tubo a 4 ° C para la extracción de proteínas de membrana máxima.
    Nota: Si el pellet es demasiado pegajosos (demasiados lípidos) ser eliminado eficientemente de thtubo de ultracentrífuga e en tampón de solubilización, se aconseja ajustar la pelotilla de la congelación en nitrógeno líquido y rápidamente removiendo el sedimento del tubo de ultracentrífuga con una espátula de metal mini antes de la pelotilla deshiela.
    Nota: Alternativamente, pelotillas de la membrana pueden ser sólo serán suspendidas y no solubilizados en un búfer que contiene detergente no para producir una fracción P de la suspensión de la vesícula de membrana, en cuyo caso la centrifugación paso 4.6 no es necesario. Esas fracciones de P son útiles al investigar funciones tales como actividades enzimáticas dependientes de la Asociación de la membrana.
  6. Centrifugar la suspensión de pellets completamente solubilizado de paso 4.5 a 20.000 x g en una centrífuga de mesa durante 10 min a 4 º C. recoger el sobrenadante con una pipeta de 1 mL (la fracción de P) y descartar el precipitado (lípidos insolubles).
  7. Realizar ensayos deseados como el borrar occidental con las fracciones citosólicas o membrana, o salvar a-80 ° C para su uso futuro.

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Representative Results

La figura 2 muestra la partición de proteínas celulares del PNS en la fracción citosólica soluble (S) o fracción de la pelotilla de membrana (P). Examinamos tres líneas de células representativas de diferentes tipos de células: HEK-293 (epiteliales), NIH-3T3 (fibroblastos) y Jurkat (linfocito). Inhibidores de disociación de guanina de Rho (RhoGDI) y receptor de manosa-6-fosfato catión independiente (CIMPR) fueron utilizados como controles positivos para citosólica y fracciones de la membrana, respectivamente. Confirmamos la separación eficiente del citosol y membrana después de la cavitación de nitrógeno en ~ 350 psi en tampón hipotónico seguido por ultracentrifugación a 350.000 x g durante 1 hora. La proteína total se recuperó de las fracciones de S y P se analizaron luego con marcadores para ER, endosomas y lisosomas, mitocondrias, Golgi y otros orgánulos. Todas las proteínas transmembranales son presentes en la fracción de membrana exclusivamente, como Na++ ATPasa de k y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) de la membrana plasmática, calnexin de ER, proteína de la membrana lisosomal asociada 1 (LAMP1) de lisosomas, F0-ATPasa de las mitocondrias y 97 Golgin del trans red de Golgi. Como era de esperar, muchas proteínas de membrana periférica que se asocian libremente a la membrana, están presentes tanto en la fracción citosólica y la membrana en diferentes grados. Los ejemplos notables incluyen temprano endosome antígeno 1 (EEA1), Rab7/9 (endosomas finales) y hexoquinasa 1 (membrana externa de las mitocondrias). Esto demuestra la utilidad de esta técnica en evaluación de la fuerza de Asociación de la membrana de proteínas periféricas. Nuestro laboratorio ha tomado ventaja de esta técnica de cavitación para examinar la situación de la Asociación de la membrana de varios señalización moléculas5,12,13,14. Curiosamente, encontramos calregulin casi exclusivamente en la fracción soluble, sugiriendo que los microsomas generados a partir de membranas ER también han sido interrumpidos durante la cavitación de nitrógeno y las proteínas en el lumen del re se lanzan a la fracción soluble. En cambio, la integridad de las mitocondrias después de la cavitación depende del tipo celular. Observamos que F1-ATPasa, una proteína periférica interna de la mitocondria, parcialmente en la fracción citosólica que van desde 2% en las células NIH-3T3 a ~ 35% de las células HEK-293 y Jurkat. Esto indica que nitrógeno cavitación a 350 psi con tampón hipotónico no garantiza la integridad mitocondrial. A pesar de tres ciclos de 500 x g vueltas para generar el PNS de cavitate, no todos los núcleos fueron quitados. Histona deacetilasa 1 (HDAC1) nucleoplasia y fibrillarin el nucleolo, se encontraron en el PNS y el sedimento. La presencia de HDAC1 en la pastilla y no en el sobrenadante sugiere que el PNS está contaminado con los núcleos, en lugar de interrupción nuclear durante la cavitación. Esto es consistente con informes que presurizar la bomba a 350 psi deja intactos los núcleos10, aunque el uso de tampón hipotónico puede dejar los núcleos frágil, como se explica en la sección más adelante.

Se comparó la eficacia de la homogeneización de la cavitación de nitrógeno con la de otros métodos comunes de interrupción físicas. Cantidades iguales de células Jurkat fueron suspendidas en buffer de homogeneización hipotónica idénticos y sometidas a métodos de interrupción diferentes. Hubo pérdida perceptible de muestras en Dounce cavitación homogeneización y nitrógeno (en ambos casos de 5-10% menos volumen se recoge). Sin embargo, la cavitación nitrógeno dio la más alta eficiencia de extracción de proteína; conducto de la aguja y Dounce rindieron sólo el 60% como mucha proteína (figura 3). Curiosamente, la recuperación de algunas proteínas como determinado por el immunoblot no presentaron una diferencia significativa entre los métodos de interrupción mecánica diferentes. Sin embargo, la producción de ciertas proteínas de membrana periférica como la hexoquinasa 1 y RAS fue mayor en muestras preparadas con la cavitación de nitrógeno. Este soporta esa cavitación de nitrógeno puede ser óptima para la homogeneización al investigar proteínas periféricas de membrana. Recuperación de proteínas de HDAC1 por cavitación de nitrógeno es comparable a otros métodos, lo que sugiere que los núcleos permanezcan intactos en todas las condiciones. Así, los datos en la figura 3 demuestra que cavitación de nitrógeno ofrece resultados superiores de la homogeneización.

A continuación, comparó la eficacia de la homogeneización entre el mismo tampón y tampón hipotónico pero a isotónicas con sacarosa o cloruro de sodio (figura 4). Cantidades similares de proteína fueron recuperadas de las células de Jurkat homogeneizadas en tampón hipotónica versus tampón isotónica de NaCl después de cavitación a 350 psi. En contraste, menos proteína se recuperó en el PNS de células en búfer hace isotónica con sacarosa. Proteínas más individuales examinadas por inmunoblot encajan en este patrón. Una excepción fue fibrillarin que relativamente se enriqueció en el PNS en buffer isotónico.

Para determinar si nuestro protocolo puede ser empleado para investigar la partición de proteínas periféricas de membrana entre soluble y fracciones de la membrana, en comparación con patrones entre ANR tagged bandera tipo de salvaje y su mutante deficiente Prenilación, C186S (de la partición Figura 5). En estado estacionario, el tipo salvaje ANR estuvo presente en el citosol y membranas similares a las proteínas de membrana más periféricas, aunque la parte recuperada en la fracción soluble es mayor que el de otras proteínas RAS del14. Cuando ANR es desprovista de su modificación de Lucas, se pierde la capacidad de asociar con membranas y se convierte exclusivamente citosólica. Los patrones esperados de particionado de ANR confirman que nuestro protocolo es una opción confiable para el estudio de la dinámica de la partición de proteínas periféricas de membrana entre el citosol y las membranas.

Figure 1
Figura 1: Diagrama de flujo resumiendo paso 2 (azul), paso 3 (rojo) y paso 4 (amarillo) del Protocolo de. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: partición de proteína entre las fracciones de membrana y citosólicas. HEK-293, células NIH-3T3 y Jurkat fueron sometidas a cavitación de nitrógeno (~ 350 psi por 20 min, suspendida en buffer de homogeneización hipotónica) y ultracentrifugación (~ 350.000 x g durante 1 h) como se describe en el protocolo. Niveles de proteína endógena en diferentes fracciones se analizaron por el immunoblot. PNS: Atascamiento del Receptor antígeno del cáncer expresado en SiSo células (RCA), nuclear sobrenadante, sobrenadante S:, P: pelotilla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: comparación de técnicas de interrupción mecánica diferentes. Equivalente de células Jurkat fueron suspendidas en tampón hipotónico y sometidas a congelación y descongelación (3 ciclos), homogeneización de Dounce pasaje (5 pasos, a través de aguja de 28G½), (15 pases, Kontes 2 mL Dounce tubo con un mortero de tejido molido, separación de la aguja 0.01-0.06 mm) o cavitación de nitrógeno (~ 350 psi por 20 min). Niveles relativos de proteínas endógenas en el PNS fueron analizados por el immunoblot para cada método. Las concentraciones de proteínas totales de PNS se cuantificaron por assa BCAy y normalizado al valor del PNS elaborado por cavitación de nitrógeno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: comparación de búferes hipotónicas y bebidas isotónicas durante la cavitación nitrógeno. Cantidades equivalentes de Jurkat células fueron suspendidas en tampón hipotónico o tampón hipotónico suplementado con sacarosa al 8.5% o 150 mM NaCl y sometidos a cavitación de nitrógeno (~ 350 psi por 20 min). Niveles relativos de proteínas endógenas en el PNS fueron analizados por el immunoblot para cada búfer. Las concentraciones de proteínas totales de PNS fueron cuantificadas por análisis de la BCA y normalizadas al valor del PNS preparado en tampón hipotónico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Farnesylated NRAS divide en fracciones de P y S. Las células HEK-293 fueron transfectadas transitoriamente con plásmidos dirigiendo la expresión de tipo salvaje de ANR tagged bandera o C186S mutante. Partición de proteína se realizó como se describe en la figura 2 y se analizaron los niveles de proteína indicado por el immunoblot. Reproducido con permiso (Zhou, M et al., 2016. Publicado originalmente en Journal of Cell Biology. https://Doi.org/10.1083/JCB.201604061). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Son múltiples las ventajas de la cavitación de nitrógeno sobre otros métodos de alteración mecánica. Quizás el beneficio más significativo es su capacidad para suavemente y eficientemente homogeneizar a muestras. Los principios físicos de descompresión enfría muestras en lugar de generar daño de calentamiento local como ultrasonidos y fricción/cizallamiento basado en técnicas. La cavitación también es extremadamente eficaz en alterar la membrana plasmática. Porque el nitrógeno de las burbujas se generan dentro de cada célula individual con descompresión, el proceso de cavitación es limitado tanto por el tamaño de celda, tamaño de la muestra o concentración de la muestra. Por lo tanto, ofrece ventajas adicionales sobre Dounce basado en la separación o aguja paso homogeneización. Cavitación de nitrógeno también ofrece resultados más consistentes como la misma fuerza disruptiva que se aplica uniformemente a lo largo de la muestra puede ser reproducida con presiones idénticas. Además, cada célula experimenta solamente el proceso de interrupción por una sola vez y componentes subcelulares, por lo tanto, no constantemente exponen a fuerzas disruptivas variable. Esto limita la fragmentación artefactual de organelos. Preocupación para la oxidación de componentes celulares lábiles causado por la interrupción también se mitiga, como el nitrógeno se utiliza para saturar la suspensión de células y sin oxígeno suplementario. Las tensiones físicas y químicas restringidas impuestas por cavitación de nitrógeno hace que sea una técnica ideal para estudiar las enzimas lábiles y organelos frágil y la reproducibilidad de la técnica de homogeneización está bien adaptada para la cuantificación.

Cavitación de nitrógeno también ofrece gran flexibilidad en cuanto a tamaño de la muestra, la composición de buffers de homogeneización y el grado de integridad de organelas. Para escalar hasta la homogeneización, simplemente hay que desplegar los recipientes a presión de mayor capacidad, sin sacrificar la velocidad, conveniencia o eficacia de la descompresión. Puede utilizarse cualquier buffer de homogeneización para la cavitación de nitrógeno; opción de tampón puede ser adaptado para la compatibilidad con los requisitos de cada experimento. Uno puede diseñar un buffer de homogeneización que coincide con el líquido intracelular (p. ej., alto potasio y bajo contenido de sodio) para minimizar alteraciones en organelos. Por ejemplo, hemos desarrollado un búfer de "relajación" que minimiza el ex vivo polimerización de la actina y lo ayuda en la recolección de vesículas citoplasmáticas intactas de granulocitos5. Las características del buffer osmóticas e iónicas pueden modificarse también para controlar el grado de homogeneización de la célula. Además, la agresividad de la disrupción celular puede controlarse ajustando la presión de nitrógeno. Presión moderada reduce la fuerza disruptiva para preservar núcleos, mitocondrias y otros organelos en un estado intacto, mientras que la alta presión interrumpe estos organelos. Brock et al. reportó el éxito con la interrupción de células de la leucemia Basophilic rata manteniendo núcleos más intacto a 350 psi con tampón hipotónico10, que forma la base de la presión de nitrógeno utilizada en nuestro protocolo actual.

Limitaciones de la cavitación de nitrógeno incluyen el hecho de que la homogeneización es uniforme a lo largo de las muestras y las estructuras diferentes de la membrana pueden producir vesículas de tamaño similar; Esto puede complicar más separación de la membrana plasmática, microsomas lisos, endosomas y las membranas de Golgi por centrifugación de gradiente de densidad de tasa zonal. Otra preocupación es que los orgánulos relativamente frágiles después de la homogeneización debido a la ruptura desde el interior. Por lo tanto, este método requiere optimización cuidadosa para evitar la rotura de organelas en las manipulaciones posteriores. Se intentó abordar algunos de estos temas en este estudio.

Separación de citosólica y fracciones de la membrana por centrifugación se ha explorado en limitado informes detallando el repartir de las fracciones de proteína con un puñado de proteínas marcadores15,16. Nuestro método genera una separación cruda de proteínas solubles y de membrana-limita y no implica aislamiento de organelos particular. Sin embargo, sigue siendo una preocupación válida que las vesículas homogéneas de diferentes membranas producidas por la cavitación pueden afectar la eficiencia de separación por ultracentrifugación. Se presenta un estudio exhaustivo por immunoblots del aislamiento y la partición de organelos subcelulares común después de fraccionamiento con nuestro protocolo. Como era de esperar, proteínas citosólicas puramente como RhoGDI son exclusivamente en la fracción soluble y proteínas transmembranales de la membrana plasmática (PM) como EGFR y Na+/+ ATPasa, k fueron recuperados sólo en el sedimento. Proteínas transmembranales en organelos como lisosomas, mitocondrias, Golgi y ER también fueron recuperadas en el sedimento, confirmando que proteínas de membrana integral de diferentes membranas y organelos pueden ser exitosamente separadas de proteínas solubles con nuestro método. Esta validación fundamental es crucial para el análisis posterior de las proteínas de la membrana periférica, que es el objetivo principal de este protocolo.

La mayoría de las proteínas periféricas de membrana existe en las fracciones de membrana y citosólicas. Aunque a menudo se trata de una verdadera representación de su localización, puede en algunos casos representar artefactual redistribución de estas proteínas de la superficie citoplasmática de las membranas a la fracción soluble durante el proceso de homogeneización, puesto que la fuerza de su asociación con las membranas no es tan fuerte como la de proteínas de membrana integral. Aunque la cavitación nitrógeno minimiza potencial redistribución exponiendo las células a una interrupción de una sola vez, suave, uno debe ser consciente de tales artefactos de fraccionamiento bioquímico y enfoque en los cambios en la partición de proteínas entre citosólica y fracciones de la membrana en condiciones experimentales. Sin embargo, el examen de las proteínas periféricas de membrana en diferentes fases de maduración endosomal es posible con este método. EEA1, un efector Rab5 que media el acoplamiento de las vesículas recubiertas de clatrina a los endosomas tempranos, se localiza en la superficie citoplásmica de endosomas tempranos y fue recuperado sobre todo en la fracción de sedimento. Último endosome-proteínas relacionadas con Rab7 y Rab9 están también en la fracción de sedimento. Sin embargo, sigue siendo una cantidad apreciable de Rab7/9 en el citosol. Porque RabGDI es capaz de interactuar con prenylated RAB y hacer estas proteínas de otra manera insolubles citosólica, las proteínas Rab tienden a ser más citosólica que otras proteínas de membrana periférica relacionadas con endosome.

Para caracterizar la integridad nuclear y organelas con homogeneización por cavitación de nitrógeno, se immunoblotted las fracciones aisladas en compartimientos del luminales y citoplasmáticas. En este análisis, calregulin es completamente liberado en la fracción soluble, demostrando que ER es interrumpido a microsomas de forma y así fugas de contenido luminal. Teniendo en cuenta que una mitad del área total de membrana en una célula eucariota incluye los espacios laberínticos de la sala de emergencia, no es de extrañar que su vasta red de estructura de forma de saco o tubular no permanecen intactos durante la expansión de burbujas de nitrógeno. Por otro lado, nuestro análisis de la integridad mitocondrial después de cavitación muestran clara dependencia del tipo de célula, como hemos observado F1-ATPasa, una proteína periférica asociado a la membrana interna de la mitocondria, en la fracción citosólica en diversos grados (~ 35% HEK-293 y Jurkat, 2% para NIH-3T3). Esto indica que nitrógeno cavitación a 350 psi con tampón hipotónico no garantiza la integridad mitocondrial. De hecho, otros han informado de que para preservar las mitocondrias, la cavitación se debe realizar a presiones inferiores a 150 psi17. Por el contrario, encontramos que la catalasa permanece en el lumen de los peroxisomas. Curiosamente, las proteínas nucleares se observan en las fracciones PNS y pellets. Específicamente, HDAC1, una histona deacetilasa presente en el nucleoplasia, está ausente en la fracción soluble, lo que indica que no se comprometa la integridad nuclear. Esto sugiere que la envoltura nuclear no se rompe por la cavitación, como era de esperar la liberación de HDAC1 en la solubfracción de le en ese escenario. Es probable que los núcleos no se quitan completamente durante el proceso de elaboración del PNS, y la proteína queda en el sedimento después de la ultracentrifugación. Esta probabilidad es más apoyado por el hecho de que ninguna salida de DNA es detectada en la fracción soluble. Por lo tanto, concluimos que utilizando buffer de homogeneización hipotónica durante la cavitación a ~ 350 psi con la adición de Mg2 + es capaz de preservar la integridad nuclear en múltiples líneas celulares.

Nuestros resultados también demuestran que los ribosomas recogen en la fracción de membrana pellet, sugiriendo que incluso gratis ribosomas en el citoplasma que son no Unidos a las membranas ER pueden ser totalmente sedimentados en un colchón de sacarosa no búfer después de centrifugación a 350.000 x g para 1 h. Asimismo, identificación de la proteína relacionada con la autofagia 12 (Atg12)-Atg5 conjugado como marcador de autophagosomes, revela estricta segregación a las fracciones de la pelotilla. Su presencia en el citosol puede ser causada por el hecho de que el covalente-accesorio de Atg12 y Atg5 precede autophagosomes formación. Proteínas citoesqueléticas son difíciles de evaluar debido a la polimerización de ex vivo . Este fenómeno puede minimizarse con un tampón de relajación pero en el protocolo descrito aquí, tubulina es probable polimerizado ex vivo sobre quelación de calcio 18. En nuestros preparativos tubulina se encuentra en el sedimento sugiere polimerización, mientras que la actina se encuentra en la P y la S fracciones.

Para caracterizar posibles ventajas de la cavitación de nitrógeno en la eficiencia de la homogeneización, se revisaron algunas técnicas comunes de interrupción mecánica. No se evaluaron los métodos optimizados para las muestras de tejido como licuadora o mortero/Maja. Sonicación también fue excluido ya que es difícil alterar la membrana superficial, manteniendo intactos los orgánulos internos. Nuestro análisis se centró en los siguientes métodos: congelación y descongelación, la aguja paso y Dounce homogeneización, ya que son fáciles de realizar y no requieren equipo especial como un homogeneizador de rodamiento de bolas. Las células Jurkat fueron utilizadas en este análisis debido a su pequeño tamaño, que los hace difíciles de homogeneizar eficientemente con técnicas corte líquidas tradicionales que dependen de la separación, como conducto de la aguja y Dounce. Juzgado por la concentración de la proteína total que se recuperó, se encontró que métodos de interrupción independiente del tamaño de la célula tales como cavitación de nitrógeno y de congelación y descongelación de hecho muestran mayor eficiencia de extracción de proteínas. Análisis similar con células de mayor tamaño reveló diferencias más pequeñas en eficiencias de homogeneización, aunque nitrógeno cavitación es todavía superior a métodos físicos alternativos probados (datos no mostrados).

Muchos endosomal y citoesqueleto proteínas citosólicas, eficientemente recuperadas con todos los métodos de prueba. En contraste, las proteínas en el ER y Golgi se recuperaron óptimamente con cavitación de nitrógeno. El rendimiento ligeramente inferior de F1-ATPasa en cavitación de nitrógeno en relación con los otros métodos puede reflejar el hecho de que las mitocondrias son más propensos a permanecer intactos durante la cavitación y por lo tanto más eficientemente removido en el centrifugado de baja velocidad utilizada para generar el PNS. La observación eso hexoquinasa 1, una proteína periférica de membrana encontrada tanto en el citosol y asociada a la membrana mitocondrial externa, se comportó de la manera opuesta en relación con la F1-ATPasa probablemente refleja la labilidad de la Asociación de hexoquinasa 1 en relación a F1-ATPasa, que es secuestrada dentro de las mitocondrias. Lo importante es que, aunque capaz de alterar las células con eficiencias comparables, métodos alternativos de interrupción mecánica dieron relativamente pobre recuperación de ciertas proteínas de membrana periférica (hexoquinasa 1 y RAS). Por lo tanto, la cavitación es nuestra técnica de homogenización de elección con el fin de investigar la partición de proteínas periféricas de membrana. Porque Dounce homogeneización es ampliamente utilizado preparar núcleos intactos, utilizamos Dounce como punto de referencia para evaluar integridad nuclear a través de otros métodos de interrupción mecánica. En nuestro análisis, niveles similares de recuperación de proteínas de HDAC1 confirman que los núcleos permanezcan intactos en Jurkat homogenados preparados por cavitación de nitrógeno a ~ 350 psi con tampón hipotónico.

Era evidente que el buffer de homogeneización utilizado durante la cavitación de nitrógeno puede afectar significativamente la integridad de la eficiencia y organelas de interrupción. Mientras que la composición del buffer de homogeneización debe ser optimizada a los requerimientos de la aplicación, es de destacar que los investigadores realizar descompresión de nitrógeno de los tejidos animales utilizan buffer con una baja presión osmótica para extracto nuclear contenido. Cazador y Commerford demostraron núcleos hinchazón y ruptura cuando las soluciones fueron diluidas y preservación de núcleos al utilizar soluciones isotónicas7 (que se puede lograr agregando o sales inorgánicas tales como cloruro de sodio o solutos orgánicos tales como sacarosa o glicerol). El buffer isotónico estándar utilizado para aislar organelos subcelulares que no sean de núcleos de células de mamíferos es sacarosa de 0,25 M que contiene 1 mM EDTA y tamponada con Tris, HEPES y Tricina en pH 7.0-7.6. Pero no todas las células de cultura pueden ser eficientemente homogeneizadas en un buffer isotónico. Tampón hipotónico (generalmente de 10 mM Tris, HEPES, etc.) se utiliza a menudo para proporcionar estrés osmótico necesario para ciertos tipos de células para lograr la completa homogeneización. Sin embargo, como se mencionó antes, buffers hipotónicas tienden a representar los núcleos frágiles y propensos a la fuga de ADN cuando se incluye EDTA. Para promover la integridad nuclear, substituimos el EDTA con KCl y bajas concentraciones de los cationes divalentes como MgSO4MgCl2 . Mg2 + se prefiere normalmente sobre Ca2 + porque este último puede activar ciertas fosfolipasas y proteasas e inhiben la polimerasa del RNA. Una vez terminada la cavitación, EDTA o EGTA puede añadirse a los homogenados quelatar los cationes, si es necesario para inhibir las metaloproteasas.

Células Jurkat mostrar una relación núcleo-citoplasma relativamente grande, lo que una línea celular ideal para el estudio de integridad nuclear. El aumento de la eficiencia de homogeneización mediante el uso de tampón hipotónico es mínimo cuando se compara a isotónica buffer suplementado con NaCl. Sin embargo, la cavitación en una isotónica buffer suplementado con sacarosa recupera aproximadamente la mitad las proteínas extraídas mediante el uso de una contraparte de tampón hipotónico. Esto es poco probable ser un resultado directo de isotonicity, y la discrepancia entre utilizando NaCl y sacarosa para lograr isotonicity requiere más investigación. Una posible explicación es que sal altera las interacciones electrostáticas entre las proteínas mientras que la sacarosa no. Así, incluso en la misma tonicidad, NaCl tiene una actividad relevante a la extracción de la proteína carente de sacarosa. Won respecto a la preservación de integridad nuclear, encontramos mayor fibrillarin proteínas con isotónicos almacenadores intermediarios, a pesar de isotónicos almacenadores intermediarios teóricamente ser más protectora de los núcleos. Curiosamente, la fracción mitocondrial más eficientemente se extrajo con isotónica buffer suplementado con NaCl, sugiriendo que bajo condiciones de sal pueden ser subóptimas para la extracción de las mitocondrias. Teniendo en cuenta la cavitación con tampón hipotónica logra el mejor equilibrio entre la eficiencia de la homogeneización e integridad nuclear, el tampón hipotónico se convierte en el búfer de elección en nuestro protocolo de la cavitación. Sin embargo, advertimos a los lectores que ningún búfer es garantía de una óptima homogeneización de resultados. Nuestro protocolo debe servir como una plantilla para la optimización, y piloto de pruebas con tampones deseadas, líneas celulares de interés y otras variables (presión, composición del tampón, etc.) deben establecerse para obtener mejores resultados.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por GM055279, CA116034 y CA163489.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Disruption Vessel (45 mL) Parr Instrument 4639 Nitrogen cavitation Bomb
Dounce homogenizer (2 mL) Kontes 885300-0002 Dounce pestle and tube
U-100 Insulin Syringe 28G½ Becton Dickinson 329461 Needle
Atg12 antibody Santa Cruz 271688 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-actin antibody Santa Cruz 47778 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-tubulin antibody DSHB E7-s Mouse antibody, use at 1:5000 dilution
Calnexin antibody Santa Cruz 23954 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Calregulin antibody Santa Cruz 373863 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Catalase antibody Santa Cruz 271803 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
CIMPR antibody Abcam 124767 Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
EEA1 antibody Santa Cruz 137130 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
EGFR antibody Santa Cruz 373746 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F0-ATPase antibody Santa Cruz 514419 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F1-ATPase antibody Santa Cruz 55597 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Fibrillarin antibody Santa Cruz 374022 Mouse antibody, use at 1:200 dilution
Golgin 97 antibody Santa Cruz 59820 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
HDAC1 antibody Santa Cruz 81598 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Hexokinase 1 antibody Cell Signaling Technology 2024S Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Lamin A/C antibody Santa Cruz 376248 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
LAMP1 antibody DSHB H4A3-c Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Na+/K+ ATPase antibody Santa Cruz 48345 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Rab7 antibody Abcam 137029 Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Rab9 antibody Thermo MA3-067 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RCAS1 antibody Santa Cruz 398052 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RhoGDI antibody Santa Cruz 360 Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution
Ribosomal protein S6 antibody Santa Cruz 74459 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Sec61a antibody Santa Cruz 12322 Goat antibody, use at 1:1000 dilution
Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube Beckman Coulter 349622 Sample tube for ultracentrifugation
TLK-100.3 rotor Beckman Coulter 349481 rotor for ultracentrifugation
Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge Beckman Coulter 364300 ultracentrifuge
cOmplete protease inhibitor cocktail tablets Roche 11697498001 protease inhibitors
Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade Corning 353089 large cell scraper
Magnetic Stir Bar Fisher Scientific 14-513-57SIX micro stir bar
Ceramic-Top Magnetic Stirrer Fisher Scientific S504501AS magnetic stirrer

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