Stickstoff-Kavitation und differentielle Zentrifugation ermöglicht eine Überwachung der Verteilung von peripheren Membranproteinen in kultivierten Zellen

Biochemistry

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Summary

Hier präsentieren wir Protokolle für Waschmittel-freie Homogenisierung der kultivierten Säugerzellen basierend auf Stickstoff Kavitation und nachträgliche Trennung der cytosolischen und Membrane-springen Proteine durch Ultrazentrifugation. Diese Methode ist ideal für die Überwachung der Partitionierung von peripheren Membranproteinen zwischen löslich und Membran-Fraktionen.

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Zhou, M., Philips, M. R. Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (126), e56037, doi:10.3791/56037 (2017).

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Abstract

Kultivierte Zellen eignen sich für das Studium der subzellulären Verteilung von Proteinen, einschließlich der peripheren Membranproteine. Genetisch codierte Eindringmittel haben tagged Proteine das Studium der subzellulären Proteinverteilung revolutioniert. Es ist jedoch schwierig zu quantifizieren die Verteilung mit Fluoreszenz-Mikroskopie, vor allem, wenn Proteine teilweise cytosolischen sind. Darüber hinaus ist es oft wichtig, körpereigene Proteine zu studieren. Biochemische Tests wie Immunoblots der Goldstandard für die Quantifizierung der Proteinverteilung nach subzellulären Fraktionierung bleiben. Zwar kommerzielle Kits, die cytosolischen oder bestimmte Fraktionen Membran isolieren wollen, basieren die meisten dieser Kits auf Extraktion mit Reinigungsmitteln, die möglicherweise ungeeignet für das Studium periphere Membranproteine, die leicht aus Membranen extrahiert werden. Hier präsentieren wir ein Waschmittel-freie Protokoll für zelluläre Homogenisierung von Stickstoff Kavitation und nachträgliche Trennung der cytosolischen und Membrane-springen Proteine durch Ultrazentrifugation. Wir bestätigen die Trennung der subzellularen Organellen in lösliche und Pellet Brüche in verschiedenen Zelltypen und Proteingewinnung unter mehrere gemeinsame mechanische Homogenisierung nicht-Reinigungsmittel-basierte Methoden zu vergleichen. Einige Vorteile von Stickstoff ist Kavitation die überlegene Effizienz der zellulären Störungen mit minimalen physikalischen und chemischen Schäden an empfindlichen Organellen. In Kombination mit Ultrazentrifugation Stickstoff Kavitation ist eine hervorragende Methode, die Verschiebung von peripheren Membranproteinen zwischen cytosolischen zu untersuchen und Membran-Fraktionen.

Introduction

Zelluläre Proteine können in zwei Klassen einteilen: diejenigen, die Membranen und diejenigen, die nicht zugeordnet sind. Nicht zugeordneten Membranproteine sind im Zytosol, Nukleoplasma und Lumina von Organellen wie das endoplasmatische Retikulum (ER) gefunden. Es gibt zwei Klassen von Membran-assoziierte Proteine, integralen und peripheren. Integrale Membranproteine sind auch bekannt als transmembrane Proteine, weil ein oder mehrere Segmente der Polypeptid-Kette erstreckt sich über die Membran in der Regel als eine α-Helix bestehend aus hydrophoben Aminosäuren. Transmembrane Proteine sind co-translationally Membranen im Laufe des Jahres ihre Biosynthese eingeschoben und so konfigurierten bleiben, bis sie catabolized sind. Periphere Membranproteine sind sekundär, Membranen, meist als Folge von Post-translationale Modifikation mit hydrophoben Moleküle wie Lipide angetrieben. Im Gegensatz zur integralen Membranproteine die Vereinigung von peripheren Membranproteinen mit Zellmembranen ist reversibel und kann reguliert werden. Viele periphere Membran Proteine funktionieren im Signalwege und geregelte Zusammenarbeit mit Membranen ist ein Mechanismus zum Aktivieren oder hemmen einen Weg. Ein Beispiel für ein Signalmolekül, das eine periphere Membranprotein ist die kleine GTPase, RAS. Nach einer Reihe von post-translationalen Modifikationen, die Änderung mit einem Farnesyl-Lipid enthalten, fügt modifizierte C-Terminus eines ausgereiften RAS-Proteins in der zytoplasmatischen Broschüre von der Zellmembran. Insbesondere ist der Plasmamembran, wo die RAS die nachgeschaltete Effektor RAF1 eingreift. Um konstitutive Aktivierung von Mitogen-activated Protein Kinase (MAPK) Weg zu verhindern, sind mehrere Ebenen von Kontrolle über RAS. Neben Rendern RAS durch hydrolysieren GTP in BIP inaktiv, können aktive RAS auch von der Plasmamembran durch Modifikationen oder Interaktionen mit Gefäss-Faktoren zur Signalisierung hemmen freigegeben werden. Obwohl fluoreszierende live Imaging Zellbiologen die Möglichkeit bietet, die subzelluläre Lokalisation der fluoreszierende Protein-Tags peripheren Membran Proteine1beobachten, bleibt eine kritische Notwendigkeit auszuwertende Membran Verband der körpereigene Proteine semi-quantitativ mit einfachen biochemischen Ansätzen.

Die richtige biochemische Auswertung der Protein Aufteilung zwischen Membran und löslichen Brüche hängt entscheidend von zwei Faktoren ab: zelluläre Homogenisierung und effiziente Trennung von Membran und löslichen Brüche. Obwohl einige Protokolle, darunter die am weitesten verbreitete kommerzialisierten Kits von Waschmittel-basierte Zelle Homogenisierung abhängen, können diese Methoden Analyse durch die Gewinnung von Membranproteinen in die lösliche Phase2zu verschleiern. Dementsprechend liefern nicht Reinigungsmittel basierte, mechanische Methoden der Zellaufschluss sauberere Ergebnisse. Es gibt mehrere Methoden der mechanischen Störungen der Zellen in Kultur angebaut oder geerntet aus Blut oder Organe. Dazu gehören Dounce Homogenisierung, feinen Nadel Störung, kugelgelagerte Homogenisierung, Beschallung und Stickstoff Kavitation. Wir bewerten hier Stickstoff Kavitation und vergleichen es mit anderen Methoden. Stickstoff-Kavitation stützt sich auf Stickstoff, die in das Zytoplasma der Zellen unter hohem Druck aufgelöst wird. Nach Gleichgewichtherstellung wird die Zellsuspension abrupt auf den atmosphärischen Druck ausgesetzt, so dass Stickstoffluftblasen entstehen im Zytoplasma, die die Zelle als Folge ihrer Aufbrausen aufreißen. Wenn der Druck hoch genug ist, Stickstoff Aufbrausen stören kann der Kern3 und Membran gebunden Organellen wie Lysosomen4. Jedoch wenn der Druck gering genug gehalten wird, unterbrechen die Dekompression die Plasmamembran und ER aber nicht andere Organellen, dabei verschütten Zytosol und intakte zytoplasmatischen Organellen in der Homogenat, der die Cavitate5festgelegt ist. Aus diesem Grund ist Stickstoff Kavitation die Methode der Wahl für die Isolierung von Organellen wie Lysosomen und Mitochondrien.

Es ist jedoch auch eine hervorragende Möglichkeit der Vorbereitung eine homogenisierte, die leicht in Membran und löslichen Brüche unterteilt werden kann. Der Druckbehälter ("the Bomb" bezeichnet) verwendet, während Kavitation besteht aus einem dicken Edelstahl-Gehäuse, die hohen Druck mit einem Einlass für die Lieferung des Gases Stickstoff aus einem Tank und einem Auslass mit einem einstellbaren Auslassventil widersteht.

Stickstoff-Kavitation wurde für Zelle Homogenisierung seit den 1960er Jahren6verwendet. Im Jahr 1961 Jäger und Commerfold7 Stickstoff Kavitation als eine praktikable Option für Säugetier-Gewebe Störung etabliert. Seitdem Forscher haben die Technik, um verschiedene Zellen und Gewebe mit Erfolg angepasst, und Stickstoff Kavitation ist ein Grundnahrungsmittel in mehreren Anwendungen, einschließlich der Membran Vorbereitung8,9, Kerne und Organelle geworden Vorbereitung10,11, und labile biochemischen Abbau. Derzeit beschäftigen Zellbiologen häufiger andere Methoden der Zelle Homogenisierung, weil die Vorteile von Stickstoff Homogenisierung nicht weit ausgeschrieben, Stickstoff-Bomben teuer sind und es ist ein Irrglaube, das ist eine relativ große Anzahl von Zellen Erforderlich. Protokolle für Stickstoff Kavitation, zellfreie Homogenates mit intakten Zellkernen zu erreichen sind nicht veröffentlicht worden, und in die meisten veröffentlichten Bewertungen Volumen von 20 mL Zellsuspension dienten. Um diese klassische Technik aktuelle Anforderungen der Arbeit mit kleinen Proben entsprechend anzupassen, stellen wir einen geänderten Protokoll der Stickstoff Kavitation speziell für kultivierten Zellen. Nach Stickstoff Kavitation, das Homogenat ist getrennt in lösliche (S) und Membran (P) Brüche durch differentielle Zentrifugation, zuerst mit einem Lowspeed Spin, Kerne und ungebrochene Zellen zu entfernen, und dann mit einem High-Speed-Spin (> 100.000 x g) trennen Membranen aus der löslichen Fraktion. Wir analysieren die Effizienz der Trennung mit Immunoblots und Stickstoff Kavitation mit anderen Techniken, mechanische Störungen zu vergleichen. Wir untersuchen auch die osmotische Wirkung der Homogenisierung Puffer während Stickstoff Kavitation.

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Protocol

1. Puffer und Ausrüstung Vorbereitungen

  1. Chill 45 mL Zelle Störung Bomben, 15 mL-Tuben und Ultrazentrifugation Rohre bei 4 ° c
  2. Vorbereiten und chill Homogenisierung Puffer pro 2 x 10 7 Zellen bei 4 ° c hinzufügen eine Protease Inhibitor Tablette kurz vor dem Einsatz 25 mL.
    Hinweis: Homogenisierung Puffer enthalten in der Regel KCl, anstatt NaCl besser reflektieren intrazellulären Salzzusammensetzung. Homogenisierung Puffer verwendet, die in diesem Protokoll besteht aus 10 mM HEPES bei pH 7,4, 10 mM KCl und 1,5 mM MgCl 2 (nachfolgend hypotone Homogenisierung Puffer). Die meisten Puffer können für Stickstoff Kavitation angepasst werden (siehe Diskussion).
  3. Vorbereiten und chill-6 mL 1 x Phosphate-Buffered Kochsalzlösung (PBS) Puffer pro Probe bei 4 ° c hinzufügen Protease Inhibitor Tabletten vor Gebrauch frisch.
    Hinweis: In diesem Protokoll verwendeten PBS-Puffer besteht aus 10 mM Na 2 HPO 4 bei pH 7,4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl und 2,7 mM KCl.
  4. Vorbereiten und chill 4 mL Solubilisierung Puffer pro Probe bei 4 ° c Hinzufügen einer Protease Inhibitor Tablet kurz vor Gebrauch.
    Hinweis: Solubilisierung Puffer verwendet, die in diesem Protokoll ist 1 X Radioimmunoprecipitation (RIPA) Testpuffer, bestehend aus 25 mM Tris bei pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5 % Natrium Deoxycholate, 0,1 % SDS und 1 % NP-40. Erläuterung Nr. 4.6.

2. Handy-Ernte

  1. wachsen 2 x 10 7-10 x 10 9 Gewebekultur Zellen mit der empfohlenen Nährmedien für den Zelltyp. In der Regel liefert ein 15-cm-Schüssel 2 x 10 7 HEK-293-Zellen kultiviert in DMEM bei 90 % Konfluenz ( Abbildung 1).
  2. Entfernen das Wachstumsmedium durch Vakuum.
  3. Platz für adhärente Zellen, die Kultur-Gerichte auf dem Eis, waschen Sie die Zellen direkt auf die Kultur Gerichte sanft mit gekühlten Homogenisierung Puffer zweimal (10 mL Puffer pro 15 cm Schüssel pro Waschgang) und ernten die Zellen mit einem großzellige Schaber in einem entsprechenden Volumen von Homogenisierung Puffer; Für Aussetzung Zellen die Zelle Pellet in gekühlten Homogenisierung Puffer zweimal (10 mL Puffer pro 50 mL Kultur pro Waschgang) mit 500 X g Spin bei 4 ° C für 5 min waschen sammeln und Aufschwemmen der gewaschenen Zelle Pellet in einem entsprechenden Volumen der Homogenisierung Puffer auf Eis.
    Hinweis: die Lautstärke sollte anhand der Anforderungen für die Proteinkonzentration in den geplanten Experimenten sowie die minimalen/maximalen Lautstärke in die Zelle Störung Bombe erlaubt. Eine allgemeine Richtlinie ist 2-10 x 10 7 Zellen/mL oder pellet-ca. 10 Bände der Zelle. Dieses Protokoll ist für drei 15-cm-Gerichte der HEK-293-Zellen in 2 mL Homogenisierung Puffer optimiert.

3. Stickstoff-Kavitation

  1. Übertragung der Zellsuspension auf eine saubere und gekühlte Bombe im Eisbad auf Aufsehen Platte.
    Achtung: Die Bombe hat, hohen Druck, niedrige Temperatur, Stickstoffgas – tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung .
  2. Mikro magnetische Stir Bar im Inneren der Bombe und Einschalten der rühren Platte weiterhin Aussetzung Homogenität.
  3. Die Aussetzung einer Protease-Inhibitor-Tablette hinzu und schließen Sie die Bombe pro Hersteller ' Anweisung s.
  4. Druck allmählich die Bombe mit einem Stickstoff-Gas-Tank pro Hersteller ' s Anweisung bis die Bombe Manometer liest 300 bis 600 Psi. Alle Ventile schließen und trennen der Stickstofftank.
    Hinweis: Der erforderlichen Druck variieren mit der Art der Zelle. Hier führten wir Kavitation bei 350 bis 400 Psi für HEK-293, NIH-3 t 3 und Jurkat Zellen.
  5. Warten Sie 20 Minuten erlauben den Stickstoff zu lösen und das Gleichgewicht innerhalb der Zellen zu erreichen.
  6. Entfernen Sie überschüssiges Wasser rund um das Auslassventil mit einem Tuch Handtuch. Öffnen Sie das Ablassventil vorsichtig, um eine tropfenweise Freisetzung von Homogenat erreichen und sammeln in einer vorgekühlt 15 mL Tube.
    Hinweis: Am Ende der Sammlung werden ein Spurt von Homogenat und Gas entstehen mit einem Zischen. Stellen Sie sicher, dass das Gas nicht Ursache zuvor erfassten kavitieren aus dem Rohr schießen (daher die Verwendung von 15 mL Röhrchen statt 1,5 mL Röhrchen). Sobald die Spurt beginnt, schließen Sie das Ablassventil und öffnen Sie des Einlassventils Stickstoff abrupt um drucklos machen die Bombe und Kavitation der verbleibenden Zellen in die Bombe. Offen die Bombe für ordnungsgemäße Wiederherstellung und gründliche Reinigung.
    Hinweis: Die endgültige Cavitate sollte ein milchiges Aussehen mit Schaum an der Spitze haben. Rühren Sie leicht mit einer Pipettenspitze, den Schaum vor Zentrifugation abklingen zu lassen.
    Hinweis: Untersuchen Sie die Cavitate Phasenkontrast-Mikroskopie die Homogenisierung Effizienz bestimmen. Geben Sie einen Tropfen 15 µL Kavitation an der Oberfläche der Mikroskopie Rutsche und mit einem Deckglas abdecken. Wiederholen Sie Schritt 3.4-3.6 nur dann, wenn zu viele ungebrochene Zellen werden mit einem 20 X Ziel erkannt.
    Hinweis: Wenn Homogenisierung Puffer keine EDTA oder EGTA enthält, fügen Sie es, die gesammelten auf eine Endkonzentration von 1 mM innerhalb von 5 min nach der Entlassung kavitieren.

4. Trennung von Cytosolic und Membrane Brüche

  1. Zentrifuge Cavitate bei 500 X g für 10 min bei 4 ° C, ungebrochene Zellen und Kerne entfernen.
    Hinweis: Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt zu, bis keine sichtbaren Pellet entsteht und sammeln Sie die Post Nuclear überstand (PNS) unter Vermeidung des Schaums oben schweben. Erneut Zentrifugieren den Schaum um weitere Sammle und kombiniere PNS, falls erforderlich ( Abbildung 1).
  2. Verarbeiten die PNS wie gewünscht um Bruchteile von Interesse zu erhalten. Zum Zwecke der cytosolischen trennen und Membran-Fraktionen übertragen Sie die PNS an einer Ultrazentrifuge Rohr und führen Sie Ultrazentrifugation wie gewünscht. Dieses Protokoll ist optimiert für eine < 3,5 mL Probe in einem Polycarbonat Ultrazentrifugen Rohr und Ultrazentrifugation 350.000 x g für 1 h bei 4 ° c
  3. Sammeln mit einer 1 mL-Pipette überstand (S-Bruch).
  4. Sorgfältig abspülen das Pellet mit 3 mL kaltem PBS ohne es zu stören. Entfernen Sie die PBS durch Vakuum.
    Hinweis: Wenn die Kontamination von der Membran Bruch durch cytosolische Proteine ein größerer Bedeutung als der Verlust der Probe ist, Aufschwemmen der Pellets in 3 mL kaltem PBS und Re-Ultrazentrifugen wie in Schritt 4.2. Entfernen Sie die PBS durch Vakuum.
  5. Aufschwemmen der Pellet vollständig in einem entsprechenden Volumen der Waschmittel-haltigen Solubilisierung Puffer der Wahl. Um Zelle Gleichwertigkeit zu erreichen, verwenden Sie die gleiche Menge an Solubilisierung Puffer als die cytosolische Fraktion.
    Hinweis: Wir empfehlen 1 X RIPA Puffer als Solubilisierung Puffer für effiziente Membran-Protein-Extraktion. Wenn keine nachgeschalteten Assay für Membran Bruchteil erforderlich ist, verwenden Sie 1 X laemmli Probenpuffer für maximale Membran Proteingewinnung.
    Hinweis: Wir empfehlen verdrängen und das Pellet in Solubilisierung Puffer in ein sauberes Röhrchen auf ein Rohr Rotator bei 4 ° C für maximal Membran Proteingewinnung.
    Hinweis: Wenn die Kugel ist zu klebrig (zu viele Lipide) th effizient entfernt werdene Ultrazentrifugen Rohr in Solubilisierung Puffer, wir empfehlen Snap Einfrieren das Pellet in flüssigem Stickstoff und schnell verdrängen die Pellets aus der Ultrazentrifuge Tube mit einem Mini Metallspatel, bevor das Pellet taut.
    Hinweis: Alternativ Membran Pellets können nur Nukleinsäuretablette und nicht solubilisiert in einem nicht-Reinigungsmittel-haltigen Puffer, ein P-Anteil der Membran Vesikel Aussetzung zu produzieren, in diesem Fall die Zentrifugation Schritt 4.6 nicht erforderlich ist. Solche Brüche P eignen sich bei der Untersuchung von Funktionen wie Enzym-Aktivitäten, die Membran Vereinigung abhängig sind.
  6. Zentrifuge voll solubilisiert Pellet-Suspension aus Schritt 4.5 bei 20.000 x g in einer Tischplatte Zentrifuge für 10 min bei 4 ° c den Überstand mit einer 1-mL-Pipette (P-Anteil) zu sammeln und entsorgen das Pellet (unlöslichen Lipide).
  7. Gewünschte Assays wie westliche Beflecken mit der cytosolischen bzw. Membran Brüchen führen, oder bei-80 ° C für eine spätere Verwendung zu speichern.

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Representative Results

Abbildung 2 zeigt die Aufteilung des zellulären Proteinen aus PNS in der löslichen cytosolische Fraktion (S) oder Membran Pellet Bruchteil (P). Wir untersuchten drei repräsentativen Zelllinien aus verschiedenen Zelltypen: HEK-293 (epitheliale), NIH-3 t 3 (Fibroblasten) und Jurkat (Lymphozyten). Rho Guanin Dissoziation Inhibitor (RhoGDI) und kationen-unabhängige Mannose-6-Phosphat-Rezeptor (CIMPR) dienten als Positivkontrollen für cytosolischen und Membran Brüche, beziehungsweise. Wir bestätigten die effiziente Trennung der Zellflüssigkeit und Membran nach Stickstoff Kavitation bei ~ 350 Psi in hypotone Puffer gefolgt von Ultrazentrifugation 350.000 x g für 1 h. Die gesamte-Protein erholte sich von S und P-Fraktionen wurden dann mit Marker analysiert, für die ER Endosomen und Lysosomen, Mitochondrien, Golgi und anderen Organellen. Alle transmembranen Proteine befinden sich in der Membran-Fraktion ausschließlich, einschließlich Na+/k+ ATPase und epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) von der Plasmamembran, Calnexin aus ER, lysosomale verbundenen Membranprotein 1 (LAMP1) aus Lysosomen, F0-ATPase aus Mitochondrien und Golgin 97 von Trans Golgi-Netzwerk. Wie erwartet, viele periphere Membranproteine, die locker mit der Membran verbunden sind, sowohl in der cytosolischen und Membran-Fraktionen in unterschiedlichem Maße vorhanden sind. Bemerkenswerte Beispiele sind frühen Endosom Antigen 1 (EEA1), Rab7/9 (späte Endosomen) und Hexokinase 1 (äußere Mitochondrien-Membran). Dies zeigt das Dienstprogramm dieser Technik in Auswertung der Membran Verein Stärke der peripheren Proteine. Unser Labor hat diese Kavitation Technik zu prüfen, die Membran-Vereinsstatus von mehreren Signalisierung Moleküle5,12,13,14genutzt. Interessanterweise fanden wir Calregulin fast ausschließlich in der löslichen Fraktion darauf hindeutet, dass die Microsomen generiert von ER-Membranen auch worden, während Stickstoff Kavitation gestört haben und der Proteine im ER-Lumen für die löslichen Fraktion freigegeben. Im Gegensatz dazu ist die Integrität der Mitochondrien nach Kavitation Zelltyp abhängig. Wir beobachteten F1-ATPase, eine innere Mitochondrien peripheren Protein, teilweise in der cytosolischen Anteil von 2 % für NIH-3 t 3 Zellen bis hin zu ~ 35 % für HEK-293 und Jurkat Zellen. Dies deutet darauf hin, dass Stickstoff Kavitation bei 350 Psi mit hypotone Puffer mitochondriale Integrität nicht gewährleistet. Trotz drei Zyklen von 500 x g Drehungen um die PNS von Cavitate zu generieren wurden nicht alle Kerne entfernt. Histon-Deacetylase 1 (HDAC1) von Nukleoplasma und Fibrillarin aus der Nukleolus, fanden sich sowohl in der PNS und das Pellet. Das Vorhandensein von HDAC1 im Pellet und nicht im Überstand legt nahe, dass die PNS mit Kernen, anstatt nukleare Störungen während der Kavitation verunreinigt ist. Dies ist konsistent mit Berichten, die die Bombe bis 350 Psi Druck Kerne intakt10, verlässt, obwohl unsere Nutzung der hypotone Puffer die Kerne zerbrechlich, Rendern kann wie im späteren Abschnitt besprochen.

Wir verglichen die Homogenisierung Effizienz der Stickstoff Kavitation mit anderen gängigen Methoden der körperlichen Störungen. Gleiche Mengen von Jurkat-Zellen wurden in identischen hypotone Homogenisierung Puffer suspendiert und verschiedene Störungen Methoden. Gab es nachweisbare Verlust von Proben im Dounce Homogenisierung und Stickstoff Kavitation (in beiden Fällen etwa 5-10 % weniger Volumen gesammelt werden). Stickstoff-Kavitation hat jedoch die höchste Protein Extraktionseffizienz; Nadel-Passage und Dounce ergab nur 60 % so viel Eiweiß (Abbildung 3). Interessanterweise zeigte Wiederherstellung einiger Proteine durch Immunoblot bestimmt keinen signifikanten Unterschied zwischen den verschiedenen mechanischen Störungen Methoden. Allerdings lag der Ertrag von bestimmten peripheren Membranproteinen wie Hexokinase 1 und RAS in Proben mit Stickstoff Kavitation. Dieses unterstützt möglicherweise, dass Stickstoff Kavitation optimal für Homogenisierung bei peripheren Membranproteine untersucht. Wiederherstellung von HDAC1 Proteine durch Stickstoff Kavitation ist vergleichbar mit anderen Methoden, was darauf hindeutet, dass die Kerne unter allen Umständen erhalten bleiben. Damit beweist die Daten in Abbildung 3 , dass Stickstoff Kavitation bietet überlegene Homogenisierung Ergebnisse.

Als nächstes wir verglichen die Homogenisierung Effizienz zwischen hypotone Puffer und den gleichen Puffer aber isotonische mit Saccharose oder Natrium-Chlorid (Abbildung 4). Ähnliche Mengen an Protein wurden von Jurkat Zellen im hypotone Puffer gegen isotonische NaCl Puffer nach Kavitation bei 350 Psi homogenisiert erholt. Im Gegensatz dazu weniger Protein im PNS Zellen gestört im Puffer gemacht mit Saccharose isotonische wiedergefunden. Individuellste Proteine untersucht durch Immunoblot passen dieses Muster. Eine Ausnahme bildete die Fibrillarin, die in der PNS in isotonischen Puffer erzeugt relativ angereichert wurde.

Um festzustellen, ob unser Protokoll eingesetzt werden kann, zu untersuchen, Partitionierung von peripheren Membranproteinen zwischen löslich und Membran Brüche, verglichen wir Partitionierung Muster zwischen Flagge markiert NRB Wildtyp und seine Prenylation-Deficient Mutant, C186S () ( Abbildung 5). Im Steady-State war dem Wildtyp NRB im Zytosol und Membranen, ähnlich wie die periphere Membranproteine, obwohl der Teil erholt in der löslichen Anteil größer als bei anderen RAS-Proteine-14ist vorhanden. Wenn seine Prenyl-Modifikation NRB entzogen wird, verliert die Fähigkeit, die Membranen zugeordnet und wird völlig cytosolischen. Die erwarteten Partitionierung Muster der nationalen Regulierungsbehörden bestätigt, dass unser Protokoll eine zuverlässige Möglichkeit, die Dynamik der Partitionierung von peripheren Membranproteinen zwischen Zytosol und Membranen zu studieren.

Figure 1
Abbildung 1: Flussdiagramm zusammenfassen von Schritt 2 (blau), Schritte 3 (rot) und 4 (gelb) des Protokolls. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Protein Aufteilung zwischen der cytosolischen und Membran-Fraktionen. HEK-293, wurden Stickstoff Kavitation (~ 350 Psi für 20 min, suspendiert in hypotone Homogenisierung Puffer) und Ultrazentrifugation (~ 350.000 x g 1 h) in das Protokoll beschriebenen NIH-3 t 3 und Jurkat Zellen ausgesetzt. Endogene Proteingehalte in verschiedene Fraktionen wurden von Immunoblot analysiert. PNS: Rezeptorbindung Krebs Antigen auf SiSo Zellen (RCAS), nukleare überstand, S: überstand, P: Pellet ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Vergleich der verschiedenen mechanischen Störung Techniken. Gegenwert von Jurkat-Zellen wurden in hypotone Puffer suspendiert und Frost-Tau-wechseln (3 Zyklen), Nadel-Passage (5 Pässe, durch 28G½ Nadel), Dounce Homogenisierung (15 Pässe, Kontes 2 mL Dounce-Tube mit einem Gewebe Grind Stößel, Clearance von 0,01-0,06 mm) oder Stickstoff Kavitation (~ 350 Psi für 20 min). Relativen Pegel der endogenen Proteinen in der PNS wurden von Immunoblot für jede Methode analysiert. Gesamt-Protein-Konzentrationen von PNS wurden von BCA Assa quantifiziert.y und normalisierte auf den Wert der PNS von Stickstoff Kavitation vorbereitet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Vergleich der hypotone und isotonische Puffer verwendet, während Stickstoff Kavitation. Äquivalenzbeträge Jurkat Zellen hypotone Puffer oder hypotone Puffer suspendiert wurden ergänzt mit 8,5 % Saccharose oder 150 mM NaCl und Stickstoff Kavitation (~ 350 Psi für 20 min) unterzogen. Relativen Pegel der endogenen Proteinen in der PNS wurden von Immunoblot für jeden Puffer analysiert. Gesamt-Protein-Konzentrationen von PNS wurden durch BCA Assay quantifiziert und normiert auf den Wert der PNS in hypotone Puffer vorbereitet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Farnesylated NRAS Partitionen in P und S Fraktionen. HEK-293-Zellen wurden vorübergehend mit Plasmide, die Leitung des Ausdrucks der Flagge markiert NRB Wildtyp oder C186S Mutant transfiziert. Protein Partitionierung durchgeführt wurde, wie in Abbildung 2 beschrieben und analysiert die angegebenen Proteingehalte wurden durch Immunoblot. Reproduziert mit Erlaubnis (Zhou, M Et Al., 2016. Ursprünglich veröffentlicht im Journal of Cell Biology. https://DOI.org/10.1083/JCB.201604061). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Die Vorteile von Stickstoff Kavitation gegenüber anderen Methoden der mechanischen Störungen sind vielfältig. Vielleicht ist der wichtigste Vorteil seine Fähigkeit, sanft aber effizient Proben zu homogenisieren. Die physikalischen Grundlagen der Dekompression kühlt Proben statt erzeugen lokale Erwärmung Schaden wie Ultraschall und Reibung/Scheren Techniken basiert. Kavitation ist auch äußerst effizient in der Plasmamembran zu stören. Da Stickstoff werden Luftblasen innerhalb jeder einzelnen Zelle bei der Dekompression, die Kavitation Prozess erzeugt begrenzt ist weniger durch die Zellengröße Stichprobengröße oder probieren Sie Konzentration. Es bietet somit zusätzliche Vorteile gegenüber Clearance-basierte Dounce oder Nadel Durchgang Homogenisierung. Stickstoff-Kavitation bietet auch mehr konsistente Ergebnisse wie die gleiche zerstörerische Kraft, die einheitlich im gesamten Beispiel angewendet wird mit identischen Druck reproduziert werden kann. Darüber hinaus jede Zelle erfährt nur die Unterbrechung-Prozess für ein einziges Mal und subzelluläre Komponenten sind, daher nicht ständig Variable auseinandertreibenden Kräften ausgesetzt. Dies schränkt die artifizielle Fragmentierung der Organellen. Sorge für die Oxidation labile zellulärer Komponenten durch Störungen verursacht wird auch gemildert, wie Stickstoff verwendet wird, um die Zellsuspension sättigen und ist frei von zusätzlichem Sauerstoff. Die eingeschränkt physikalischen und chemischen Belastungen auferlegt durch Stickstoff Kavitation ist es eine ideale Technik, labile Enzyme und fragile Organellen und die Reproduzierbarkeit dieser Homogenisierung-Technik zu studieren ist gut geeignet für die Quantifizierung.

Stickstoff-Kavitation bietet auch erhebliche Flexibilität in Bezug auf die Stichprobengröße, die Zusammensetzung der Homogenisierung Puffer und der Grad der Organelle Integrität. Um die Homogenisierung zu skalieren, muss man einfach Druckbehälter größere Kapazitäten bereitstellen, ohne Einbußen bei Geschwindigkeit, Komfort und Effizienz der Dekompression. Für Stickstoff Kavitation kann Homogenisierung Puffer verwendet werden; Puffer-Wahl kann für die Kompatibilität mit den Anforderungen der einzelnen Experimente angepasst werden. Eine kann einen Homogenisierung Puffer entwerfen, der die intrazelluläre Flüssigkeit (z.B., hohen Kalium- und niedrigen Natriumgehalt) Veränderungen zu minimieren in Organellen entspricht. Zum Beispiel haben wir einen "Entspannung" Puffer, der ex Vivo Aktin-Polymerisation minimiert und dadurch hilft bei der Erhebung von intakter zytoplasmatischen Vesikeln von Granulozyten5entwickelt. Die osmotischen und ionischen Eigenschaften des Puffers können auch geändert werden, um den Grad der Homogenisierung der Zelle zu steuern. Darüber hinaus kann die Aggressivität der zellulären Störungen durch Anpassung der Stickstoffdruck gesteuert werden. Mäßiger Druck reduziert die zerstörerische Kraft, Kerne, Mitochondrien und anderen Organellen in einem intakten Zustand zu bewahren, während Hochdruck diese Organellen stört. Brock Et Al. berichtet, Erfolg mit Störung der Ratte Basophile Leukämie-Zellen und gleichzeitig die meisten Kerne intakt bei 350 Psi mit hypotone Puffer10, bildet die Basis der Stickstoffdruck in unserem aktuellen Protokoll verwendet.

Einschränkungen der Stickstoff Kavitation gehört, dass Homogenisierung einheitlich die Proben ist und verschiedenen Membranstrukturen Vesikel ähnlicher Größe produzieren können; Dies kann weitere Trennung der Plasmamembran, glatte Microsomen, Endosomen und Golgi-Membranen durch Rate-zonale Dichte Gradienten Zentrifugation erschweren. Ein weiteres Problem ist, dass die Organellen nach Homogenisierung durch den Bruch von innen relativ brüchig. Diese Methode erfordert sorgfältige Optimierung Organelle Bruch in nachfolgenden Manipulationen zu verhindern. Wir wollten einige dieser Fragen in dieser Studie zu beheben.

Trennung der cytosolischen und Membran Brüche durch Zentrifugation in begrenzten Berichte über die Partitionierung der Proteinfraktionen mit einer Handvoll von Protein-Marker15,16erforscht. Unsere Methode erzeugt eine grobe Trennung von löslichen und Membrane-springen Proteine und beinhaltet keine Isolierung der besonderen Organellen. Dennoch bleibt es eine berechtigte Sorge, dass homogene Vesikel von verschiedenen Membranen durch Kavitation erzeugt die Effizienz der Trennung durch Ultrazentrifugation auswirken können. Wir präsentiert einen umfassenden Überblick von Immunoblots der Isolation und Aufteilung des gemeinsamen subzellularen Organellen nach der Fraktionierung mit unserem Protokoll. Wie erwartet, rein cytosolischen Proteine wie RhoGDI sind ausschließlich in der löslichen Fraktion und transmembranen Proteine auf der Plasmamembran (PM) wie EGFR und Na+/k+ ATPase, wurden nur im Pellet geborgen. Transmembrane Proteine auf Organellen wie ER, Mitochondrien, Golgi und Lysosomen wurden auch geborgen im Pellet, bestätigt, dass integraler Membranproteine aus verschiedenen Membranen und Organellen von löslichen Proteinen mit erfolgreich isoliert werden können Unsere Methode. Diese grundlegende Validierung ist entscheidend für die weitere Analyse der peripheren Membranproteine, das ist der Hauptzweck dieses Protokolls.

Die meisten der peripheren Membranproteinen gibt es in der cytosolischen und Membran-Fraktionen. Obwohl dies oft ein getreues Abbild von ihrer Lokalisation, es kann in einigen Fällen darstellen artifizielle Umverteilung dieser Proteine von der zytoplasmatischen Oberfläche der Membranen, die lösliche Fraktion bei der Homogenisierung, da die Stärke von ihrer Verbindung mit Membranen ist nicht so stark wie die von integralen Membranproteinen. Obwohl Stickstoff Kavitation mögliche Umverteilung minimiert, indem die Zellen zu einer einmaligen, sanften Störung auszusetzen, sollte man achten, diese Artefakte der biochemischen Fraktionierung und konzentrieren sich auf die Veränderungen in der Abschottung der Proteine zwischen cytosolischen und Membrane Brüche in experimentellen Bedingungen. Dennoch ist die Untersuchung des peripheren Membranproteinen in verschiedenen Stadien der Reifung Endosomal mit dieser Methode möglich. EEA1, ein Rab5 Effektor, der vermittelt Andocken des Clathrin-coated Vesikel an den frühen Endosomen, lokalisiert an der zytoplasmatischen Oberfläche der frühen Endosomen und wurde in erster Linie in der Pellet-Fraktion zurückgewonnen. Späten Endosom-im Zusammenhang mit Rab7 und Rab9 Proteine sind auch in der Pellet-Fraktion. Es bleibt jedoch eine nennenswerte Menge an Rab7/9 in der Zellflüssigkeit. Da RabGDI mit prenylierten Rabs interagieren und diese sonst unlösliche Proteine cytosolischen Rendern ist, tendenziell Rab-Proteine mehr cytosolischen als andere Endosom-bezogene periphere Membranproteine.

Die Kern- und Organelle Integrität mit Homogenisierung durch Stickstoff Kavitation zu charakterisieren wir Immunoblotted der isolierten Fraktionen für luminalen und zytoplasmatischen Kompartimente. In dieser Analyse ist Calregulin voll in die lösliche Fraktion, zeigen, dass ER zu Form Microsomen gestört ist und dadurch luminalen Inhalt Lecks freigesetzt. Gegeben, dass man die Hälfte der gesamten Fläche der Membran in einer eukaryotischen Zelle umschließt die verwinkelten Räumen des ER, ist es nicht verwunderlich, dass seine riesige Netz von Sac-Like oder röhrenförmigen Struktur schlägt fehl, während der Ausbau der Stickstoffluftblasen intakt bleiben. Auf der anderen Seite zeigt unsere Analyse der mitochondrialen Integrität nach Kavitation klare Abhängigkeit von Zellentyp, wie wir F1 beobachten-ATPase, ein Protein, das am Rande der inneren Membran der Mitochondrien in die cytosolische Fraktion zugeordnet ist in unterschiedlichem Maße (~ 35 % für HEK-293 und Jurkat, 2 % für die NIH-3 t 3). Dies deutet darauf hin, dass Stickstoff Kavitation bei 350 Psi mit hypotone Puffer übernimmt keine Garantie für mitochondriale Integrität. In der Tat haben andere berichtet, dass um Mitochondrien zu bewahren, Kavitation mit Druck niedriger als 150 Psi17durchgeführt werden sollte. Im Gegensatz dazu fanden wir, dass Katalase in das Lumen der Peroxisomen bleibt. Faszinierenderweise sind nukleare Proteine in den PNS und Pellet Fraktionen beobachtet. Insbesondere HDAC1, ein Histon-Deacetylase in das Nukleoplasma fehlt in der löslichen Fraktion darauf hinweist, dass die nukleare Integrität nicht beeinträchtigt wird. Dies deutet darauf hin, dass die Kernhülle nicht durch Kavitation zerrissen ist, wie man, die Freisetzung von HDAC1 in der Solub erwarten würdeLe Bruchteil in diesem Szenario. Es bleibt wahrscheinlich, dass Kerne werden während des Prozesses der PNS Vorbereitung nicht vollständig entfernt, und das Protein im Pellet nach Ultrazentrifugation bleibt. Diese Wahrscheinlichkeit wird weiter durch die Tatsache unterstützt, dass keine DNA-Leckage in der löslichen Fraktion erkannt wird. Wir schließen daher, dass mit hypotone Homogenisierung Puffer während Kavitation bei ~ 350 Psi mit dem Zusatz von Mg2 + in der Lage ist, nukleare Integrität in mehreren Zelllinien zu bewahren.

Unsere Ergebnisse zeigen auch, dass Ribosomen zu sammeln, ganz in der Membran Pellet Bruch, darauf hindeutet, dass auch freie Ribosomen im Zytoplasma, die ungebunden zu ER-Membranen sind vollständig sedimentiert in einem nicht-Saccharose-Kissen-Puffer nach sein kann Zentrifugation bei 350.000 x g für 1 h. Desgleichen, Identifizierung der Autophagie-related Protein 12 (Atg12)-Atg5-Konjugat als Marker für Autophagosom, verrät strikte Trennung der Pellet-Fraktionen. Seine Präsenz in der Zellflüssigkeit kann durch die Tatsache verursacht werden, dass die kovalente-Anlage von Atg12 und Atg5 Autophagosom Bildung vorausgeht. Zellskelett Proteine sind schwierig, wegen der ex Vivo Polymerisation zu beurteilen. Dieses Phänomen mit einer Entspannung Puffer minimiert werden kann, aber in dem hier beschriebenen Protokoll Tubulin ist wahrscheinlich polymerisierten ex Vivo auf Chelat von Kalzium 18. Bei unseren Vorbereitungen findet sich Tubulin in das Pellet Polymerisation darauf hindeutet, während Actin in der P und S-Fraktionen zu finden ist.

Um potenziellen Vorteile von Stickstoff Kavitation Homogenisierung Effizienz zu charakterisieren, haben wir einige gemeinsame mechanische Störung Techniken überprüft. Methoden für Gewebeproben wie Mixer oder Mörser/Stößel optimiert wurden nicht bewertet. Ultraschall wurde auch ausgeschlossen, da es schwierig ist, die Oberfläche Membran zu stören, während die inneren Organellen intakt zu halten. Unsere Analyse konzentriert sich auf die folgenden Methoden: Frost-Tau-wechseln, Passage und Dounce Homogenisierung, Nadel, sind leicht zu führen und benötigen keine spezielle Ausrüstung wie ein Kugellager Homogenisator. Jurkat Zellen dienten in dieser Analyse aufgrund ihrer geringen Größe, die macht sie schwierig ist, effizient mit traditionellen flüssigen Scheren Techniken zu homogenisieren, die Zollabfertigung, wie Nadel-Passage und Dounce abhängig sind. Durch die Konzentration des gesamten Proteins wiederhergestellt beurteilt, fanden wir, dass Zellengröße unabhängige Störungen Methoden wie Stickstoff Kavitation und Frost-Tausalz-zeigen in der Tat die überlegene Effizienz der Proteingewinnung. Ähnliche Analyse mit Zellen des größeren Größen enthüllt kleinere Unterschiede in der Homogenisierung der Effizienz, obwohl Stickstoff Kavitation immer noch besser als alternative physische Methoden getestet (Daten nicht gezeigt ist).

Viele cytosolischen, Endosomal und Cytoskelett-Proteinen effizient mit allen getesteten Methoden wiederhergestellt wurden. Im Gegensatz dazu wurden Proteine auf der ER und Golgi optimal erholt mit Stickstoff Kavitation. Die etwas geringere Ausbeute der F1-ATPase in Stickstoff Kavitation im Vergleich zu anderen Methoden spiegeln die Tatsache, dass Mitochondrien wahrscheinlicher sind, während Kavitation intakt bleiben und daher mehr effizient entfernt in der langsamen Drehung, um verwendet die PNS zu generieren. Die Beobachtung, dass Hexokinase 1, eine periphere Membranprotein fand sowohl in der Zellflüssigkeit und im Zusammenhang mit der mitochondrialen Außenmembran, verhielt sich in der gegenüberliegenden Weise im Vergleich zu den F-1-ATPase wahrscheinlich spiegelt die Labilität des Verbandes der Hexokinase 1 im Vergleich zu F-1-ATPase, die im Inneren der Mitochondrien abgesondert wird. Wichtig ist, obwohl in der Lage, Zellen mit vergleichbaren Wirkungsgraden zu stören, gab alternative mechanische Störung Methoden relativ schlechte Verwertung von bestimmten peripheren Membranproteine (Hexokinase 1 und RAS). Somit ist Kavitation unsere Homogenisierung Technik der Wahl zum Zwecke der Untersuchung der Partition von peripheren Membranproteinen. Da Dounce Homogenisierung weit verbreitet ist, intakt Kerne vorzubereiten, haben wir Dounce als Benchmark um nuklearen Integrität über andere mechanische Störung Methoden zu bewerten. In unserer Analyse bestätigen ähnliches Niveau der Verwertung von HDAC1 Proteine, dass Kerne in Jurkat Homogenates vorbereitet durch Stickstoff Kavitation bei ~ 350 Psi mit hypotone Puffer intakt bleiben.

Es war offensichtlich, dass die Homogenisierung-Puffer verwendet, während Stickstoff Kavitation die Störung Effizienz und Organelle Integrität erheblich beeinträchtigen kann. Während die Zusammensetzung der Homogenisierung Puffer auf die Anforderungen von dem Einsatzzweck optimiert werden soll, ist es erwähnenswert, dass Forscher, die Durchführung von Stickstoff-Dekompression des tierischen Geweben Puffer mit einem niedrigen osmotischen Druck verwenden, um nuklearen extrahieren Inhalt. Jäger und Commerford zeigte Schwellung Kerne und Bruch als die Lösungen verdünnte waren und Kerne Erhalt bei Verwendung von isotonischen Lösungen7 (die erreicht werden kann, indem Sie entweder hinzufügen, dass anorganische Salze wie Natriumchlorid oder gelöste organische Stoffe wie Saccharose oder Glycerin). Der standard isotonische Puffer verwendet, für die Isolierung von subzellularen Organellen als Kerne von Säugetierzellen ist 0,25 M Saccharose mit 1 mM EDTA und gepuffert mit Tris, HEPES oder Tricine bei pH 7,0-7,6. Aber nicht alle Kultur-Zellen können effizient in einem isotonischen Puffer homogenisiert werden. Hypotone Puffer (in der Regel 10 mM Tris, HEPES, etc.) wird oft verwendet, um notwendige osmotischen Stress bestimmte Zelltypen, vollständige Homogenisierung zu erreichen bieten. Aber wie bereits erwähnt, tendenziell hypotone Puffer die Kerne zerbrechlich und anfällig für Undichtigkeiten der DNA zu rendern, wenn EDTA enthalten ist. Zur Förderung der nuklearen Integrität ersetzen wir EDTA mit KCl und niedrige Konzentrationen von zweiwertigen kationen wie MgCl2 oder MgSO4. Mg2 + ist in der Regel bevorzugt über Ca2 + weil Letztere können bestimmte Phospholipases und Proteasen aktivieren und RNA-Polymerase hemmen. Abschluss Kavitation kann EDTA oder EGTA wieder Homogenates um das kation Chelatkomplex zugerechnet werden bei Bedarf Metalloproteasen zu hemmen.

Jurkat Zellen zeigen ein relativ großes Zellkern, Zytoplasma Verhältnis, so dass sie eine ideale Zelllinie, nukleare Integrität zu studieren. Die Erhöhung der Homogenisierung Effizienz mithilfe hypotone Puffer ist minimal im Vergleich zu isotonischen Puffer mit NaCl ergänzt. Kavitation in einem isotonischen Puffer ergänzt mit Saccharose erholt jedoch ungefähr eine halbe Proteine mithilfe ein hypotone Puffer Gegenstück extrahiert. Dies ist unwahrscheinlich, dass ein direktes Resultat des Isotonicity, und die Diskrepanz zwischen NaCl und Saccharose, um Isotonicity zu erreichen bedarf weiterer Untersuchungen. Eine mögliche Erklärung ist, dass Salz elektrostatische Wechselwirkungen zwischen Proteinen stört während Saccharose nicht der Fall ist. So auch bei die gleiche Spannkraft hat NaCl eine Tätigkeit relevant für Protein-Extraktion, die Saccharose fehlt. WITH-Hinweis zum Erhalt der nuklearen Integrität, wir fanden erhöhte Fibrillarin Proteine mit isotonischen Puffer, trotz isotonische Puffer als theoretisch mehr Schutz der Atomkerne wiederhergestellt. Interessanterweise wurde die mitochondriale Fraktion effizienter extrahiert mit isotonischen Puffer mit NaCl, darauf hindeutet, dass niedrige Salz Bedingungen suboptimal für die Mitochondrien Extraktion möglicherweise ergänzt. Betrachtet man Kavitation mit hypotone Puffer die beste Balance zwischen Homogenisierung und nukleare Integrität erreicht, wird die hypotone Puffer Puffer Wahl in unserem Protokoll der Kavitation. Allerdings warnen wir die Leser, dass keine Puffer eine Garantie für optimale Homogenisierung Ergebnisse ist. Unser Protokoll dient als Vorlage für die Optimierung und pilot Tests mit gewünschten Puffer, Zelllinien von Interesse und anderen Variablen (Druck, Puffer Zusammensetzung usw.)müssen festgelegt werden, um beste Ergebnisse zu erzielen.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von GM055279, CA116034 und CA163489 finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Disruption Vessel (45 mL) Parr Instrument 4639 Nitrogen cavitation Bomb
Dounce homogenizer (2 mL) Kontes 885300-0002 Dounce pestle and tube
U-100 Insulin Syringe 28G½ Becton Dickinson 329461 Needle
Atg12 antibody Santa Cruz 271688 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-actin antibody Santa Cruz 47778 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-tubulin antibody DSHB E7-s Mouse antibody, use at 1:5000 dilution
Calnexin antibody Santa Cruz 23954 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Calregulin antibody Santa Cruz 373863 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Catalase antibody Santa Cruz 271803 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
CIMPR antibody Abcam 124767 Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
EEA1 antibody Santa Cruz 137130 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
EGFR antibody Santa Cruz 373746 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F0-ATPase antibody Santa Cruz 514419 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F1-ATPase antibody Santa Cruz 55597 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Fibrillarin antibody Santa Cruz 374022 Mouse antibody, use at 1:200 dilution
Golgin 97 antibody Santa Cruz 59820 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
HDAC1 antibody Santa Cruz 81598 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Hexokinase 1 antibody Cell Signaling Technology 2024S Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Lamin A/C antibody Santa Cruz 376248 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
LAMP1 antibody DSHB H4A3-c Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Na+/K+ ATPase antibody Santa Cruz 48345 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Rab7 antibody Abcam 137029 Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Rab9 antibody Thermo MA3-067 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RCAS1 antibody Santa Cruz 398052 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RhoGDI antibody Santa Cruz 360 Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution
Ribosomal protein S6 antibody Santa Cruz 74459 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Sec61a antibody Santa Cruz 12322 Goat antibody, use at 1:1000 dilution
Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube Beckman Coulter 349622 Sample tube for ultracentrifugation
TLK-100.3 rotor Beckman Coulter 349481 rotor for ultracentrifugation
Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge Beckman Coulter 364300 ultracentrifuge
cOmplete protease inhibitor cocktail tablets Roche 11697498001 protease inhibitors
Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade Corning 353089 large cell scraper
Magnetic Stir Bar Fisher Scientific 14-513-57SIX micro stir bar
Ceramic-Top Magnetic Stirrer Fisher Scientific S504501AS magnetic stirrer

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