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초음파에 쥐 실험 생식 조사에

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Summary

이 원고는 여성 쥐 생식 및 부인과 조사에 대 한 실험 모델을 설계 하에 수행 하는 초음파의 유틸리티를 설명 합니다. Ultrasonographic 평가 수행 하는 방법에 대 한 단계별 설명을 표시 됩니다.

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Wang, T., Oltra-Rodríguez, L., García-Carrillo, N., Nieto, A., Cao, Y., Sánchez-Ferrer, M. L. Ultrasonography in Experimental Reproductive Investigations on Rats. J. Vis. Exp. (130), e56038, doi:10.3791/56038 (2017).

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Abstract

보조 생식 기술 개발, 인 간에 대 한 연구의 윤리적 한계 쥐 동물 모델 생식 의학에서 널리 사용 되어 왔습니다. 과거에는, 설치류에 생식 개발의 연구 조직 삭제의 일회성 조직학 검사에 기반 되었습니다. 최근, 고해상도 transabdominal 초음파의 발달로, 높은-품질 초음파 이제 생식 시스템을 공부 하는 새로운 방법을 수 있도록, 쥐의 생식 기관 평가를 수행할 수 있습니다. 이미지는 고해상도 ultrasonographic 시스템을 사용 하 여 얻은 했다. 부인과 초음파 28 8 주 오래 된 비 임신 쥐와 5 임신 Sprague-Dawley 쥐에서 수행 되었다. 우리는 생식 기관을 인식 하는 방법을 설명 하 고 전형적인 보기는 발 정기의 여러 단계에서 관련된 구조 주기. 컬러 플로우 도플러는 자 궁 동맥 혈 류를 측정 하 고 임신의 다른 단계 동안 자 궁 혈액 흐름 패턴 변화를 평가 하는 데 사용 되었다. 우리는 초음파 탐사 내부 생식 기관에 변화를 평가 하기 위한 유용한 방법 임을 증명 하고있다. 그것의 사용 의료 또는 수술 절차를 포함 하 여 추가 실험의 가능성을 제기 하 고 동물을 희생 하지 않고 내부 장기의 sonographic 변경 내용을 모니터링 하는 기능을 제공 합니다.

Introduction

쥐 동물 모델 생식 의학, 태아 난소 이식1,2등에서 널리 사용 되었습니다. 그러나, 과거에는, 설치류에 생식 개발의 연구 삭제 조직의 일회성 조직학 검사에 기반 하고있다 그리고 일상적인 생식 기관 변경의 종 적 연구 쥐3가능한 되지 않았습니다. 초음파 널리 이용 되는 인간의 보조 생식 기술에 30 년 동안, 하지만이 귀중 한 기술만 적용 된 쥐에 최근.

우리의 목표는 복제 및 산부인과 조사에 대 한 실험 모델을 디자인 하 고 있기 때문에 절차를 설명 Sprague-Dawley 쥐의 생식 기관 평가 위한 ultrasonographic 접근을 설정 했다 우리의 지식, 이 절차에 대 한 없음 현재 시각된 간행물을 확인 하 고 있습니다. 우리는 해부학과 고해상도 초음파를 사용 하 여 자 궁 동맥 혈액 흐름에 여성 쥐의 생식 시스템 및 현재 ultrasonographic 결과의 ultrasonographic 검사의 절차를 설명 합니다. 우리는 자궁내 막 두께, 난소의 형태와 자 궁 혈액 흐름에 중요 한 차이 평가 하기 위해 발 정기 주기의 여러 단계에서 endometrium, 난소 및 자 궁 동맥 혈 비 임신 동물에서의 특성을 모니터링 발 정기 주기, 여성에 게 유사한의 서로 다른 단계. 우리 70 MHz 주파수와 30 µ m. 의 해상도 수준 높은-품질 초음파 장비를 사용 우리의 다른 목표 임신 쥐의 자 궁 혈의 저항에 변화를 평가 했다. 이 기술은 동물을 희생 하지 않고 매일 변화 생식 기관에서의 연구에 대 한 수 있습니다.

쥐에 초음파를 이용 하 여에 몇 가지 기술적인 문제가 있다. 이러한 어려움을 포함: 쥐 endometrium 인간의 여성4보다 훨씬 얇은입니다. 쥐의 난소를 이미징에 어려움 두꺼운 피부와 가까운 완전 한 감쇄 초음파5의 결과, 쥐에 복 벽 근육에 기인 했다 및 자 궁 동맥은 훨씬 더 어려운 비 임신에서 찾을 수 쥐입니다. 절차, 많은 기술적인 문제를 해결 하는 우리 하 고 남아 있는 그 문제에 대 한 우리가 그들을 최소화 하는 방법을 보여줍니다.

Sonographic 변화 동물을 희생 하지 않고도 쥐의 생식 기관에서의 성공적인 모니터링 생식 의학의 미래 동물 모델 및 다른 수술 절차의 가능성을 열 것 이다.

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Protocol

이 연구는 권장 사항 가이드 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 건강의 국가 학회 그리고에 도착에 따라에서 실시 됐다 (동물 연구: Vivo 실험에서 보고) 지침. 프로토콜 준수 지침 2010/63/EU 승인 번호 A13170404 (네오 1) 동물 실험에 대 한 라이센스를 받았다. 모든 실험 (RD 53/2013, EU 지침 63/2010) 동물의 윤리 치료에 대 한 국가 지침에 따라 유럽 연합 인증 실험실에서 수행 했다. 프로토콜은 무르시아의 대학의 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 동물 준비

참고: 모든 실험 동물 실험 부 무르시아 대학교 및 산부인과 산부인과 부서 무르시아의 대학에 의해 지원 되었다.

  1. 8 주 오래 된, Sprague-Dawley 쥐 (28 여성 쥐) 모든 실험에 200-250 g를 무게를 사용 합니다.
    참고: 여기, 우리 또한 사용 5 임신 쥐.
  2. 임신 쥐를, 8 주 오래 된 여성 및 비옥한 남성 쥐 케이지 및 17:00에서 친구-23: 00 h. 다음 아침에 질 플러그의 식별 짝짓기 성공. 로 해석 되었다 임신 후 성관계를 했다 그들은 다음 날의 1 일을 고려 하십시오.
  3. 임신의 9, 15, 18 일에는 실험을 실시 합니다.
  4. 집 쥐와 두 그룹에서 음식과 물에 대 한 액세스 및 일반 12 h 명암 주기를 유지 관리 합니다.
  5. 2 주간의 최소 시설 조건에 acclimating 후 매일 아침 질 세포학을 사용 하 여 발 정기 주파수 및 규칙에 대 한 평가.
    참고: 정기적으로 4 ~ 5 일 발 정기 단계 28 쥐 연구에 포함 선정 됐다.

2입니다. 영상에 대 한 쥐의 준비

참고: 이미지 고해상도 transabdominal 초음파를 사용 하 여 얻은 했다. Estrous 주기 단계 질 얼룩 세포학에 의해 결정 되었다.

  1. 이미징 연구에 앞서 2-3 %isoflurane 가스 유도 실에서 댐 anesthetize.
  2. 동물을 제거 즉시 마 취 시스템에 연결 된 코 콘 내 주 둥이 배치 하 고 ultrasonographic 시험 기간 동안 1.5-2 %isoflurane 동물 유지.
  3. 클리퍼 스와 depilatory 크림 꼬리 복 부 늑 골 여백에서 모피를 제거 합니다.
  4. 마 취 쥐 쥐를 보안 및 이미징 세션의 기간에 대 한 최적의 편안 함과 생리 적인 매개 변수의 유지 보수를 보장 하는 온수 테이블에 부정사 위치에 놓습니다. 모든 생리 적 매개 변수는 이미지와 함께 통합 한다 및 데이터 캡처에 초음파 응용 프로그램을 통해 실시간.
  5. 부드럽게 (37.5 ° C ± 0.5 ° C) 온도 모니터링 (윤 활) 후 직장 프로브를 삽입 합니다.
  6. 트랜스듀서 (30 Hz) 고정 홀더 놓고 수직 축과 수평 축 (앞으로-투-다시 및 사이드-투-사이드)를 따라 이동 수동으로 운영된 조이스틱을 사용 하 여 또는 손으로.
  7. 절차 동안에 건조 하지 않도록 하는 쥐의 눈에 석유 기반 안과 연 고를 적용 합니다.

3. 시험 절차

참고: rats´ 생식 기관의 해부학: 질 방광 등 거짓말과 신장 쪽으로 확장 하는 두 개의 자 궁 뿔을 나눕니다. 난소는 자 궁 뿔 oviducts (그림 1)를 통해에 연결 됩니다. 자 궁 후부 신장 지역에 위치 해 있습니다.

  1. 자 궁의 식별
    1. 를 사용 하 여 방광 랜드마크로 자 궁 경부를 찾을 왼쪽 및 오른쪽 자 궁 뿔의 분기를 찾을 수 자 궁 경부를 따릅니다.
    2. "B-모드"를 선택 하 여 2 차원 보기/비디오 전환 합니다. 화살 중간 이미지에 중반에 isthmic 지역에 각 자 궁 경적의 antero 후부 직경을 측정 합니다. Ultrasonographic 시스템 소프트웨어를 사용 하 여 측정을 감지 합니다.
    3. "B-모드"에서 화살 중간 이미지에 자궁내 강에 걸쳐 echogenic 국경에 echogenic 국경에서 자궁내 막 두께 측정 합니다.
    4. "컬러 도플러" 선택 하 여 컬러 도플러 모드를 변경 합니다. 색 도플러를 사용 하 여 식별 하는 endometrium의 혈액 공급 고 endometrium의 혈액의 흐름을 측정. 컬러 도플러 모드에서 다음 매개 변수를 선택: 4 Hz, 펄스 반복 주파수 세트 4 48 kHz, 그리고 펄스 도플러 게이트 사이 0.2 0.5 m m 사이 하이 패스 필터 설정.
  2. 자 궁 동맥 혈의 식별
    1. 각 측에 장 골 동맥에 가까운 utero 경부 접합의 측면-열 등 여백 근처 자 궁 동맥에서 파형 도플러를 얻을.
    2. 다음 매개 변수를 사용 하 여 도플러 모드에서: 6 Hz, 펄스 반복 주파수 세트 4 48 kHz, 그리고 펄스 도플러 게이트 0.2 0.5 m m 사이 사이 하이 패스 필터 설정.
    3. 혈액 흐름 및 도플러 각도 최소화 하기 위해 도플러 빔 정렬 하는 것을 주의. 도플러 빔과 배 사이의 각도 기록 합니다. 값 60 °의 각도 넘어 촬영 정확 하지 않으며 피할된6이어야 한다.
    4. 최대 수축 속도 (PSV)와 3 연속 사이클에서 끝 확장기 속도 (EDV)를 측정 합니다. 심장 수축 심장 확장 (S/D) 비율 (PSV/EDV) 및 저항 인덱스 (RI) 계산 ([PSV-EDV] / PSV) 각 자 궁 경적에 대 한 값.
    5. 9, 15, 임신의 18하루 동안 5 임신 쥐의 자 궁 동맥 혈 류를 측정 합니다.
  3. 난소와 난소 동맥 혈액 흐름의 식별
    참고: 여성 쥐 난소 있습니다 (그림 1) 자 궁 경적의 끝에 발견 하는 지방 패드에서 생활 하 고 동물의 양쪽에 신장에 측면.
    1. 난소, 이미지를 가로 평면에서 프로브와 함께 시작 하 고 갈비뼈 아래 약간 동물의 측면 측면에 배치 합니다. 신장 및 지방 패드 난소에 비해 hyperechoic 외관이 있다.
    2. 난소 낭의 외부 경계를 측정 합니다. 각 이미지에 규모에 번호 0.1 m m 단위로 밀리미터에 있습니다.
      참고: 컬러 도플러 모드와 파워 도플러 모드 영상 난소 강도와 방향 흐름의 식별 도움이 됩니다.

4입니다. 연구의 설계

  1. 질 얼룩 세포학에 의해 발 정기 주기를 확인 하십시오.
  2. 두 그룹에 있는 모든 쥐를 나눕니다. 그룹 1 또는 미리 비옥한 (또는 periovulatory), 주기 단계 proestrus와 발 정기에 있던 쥐를 포함 합니다. 그룹 2 또는 포스트 비옥한, 주기 단계 초기 diestrus 및 늦은 diestrus에 있던 쥐를 포함 합니다.
  3. 모니터링 하 고 중반에 isthmic 지역 그룹 1에서 각 자 궁 경적 및 2의 antero 후부 직경을 비교.
  4. 모니터링 및 자궁내 막 두께 그룹 1과 2에서 endometrium의 특성을 비교 합니다.
  5. 모니터링 및 크기 (최대 지름)와 난소의 특성을 비교 하 고 두 난소 그룹 1에서와 2에서 어떤 periovulatory 낭 지역화.
  6. 모니터링 및 그룹 1과 2에서 자 궁 동맥 혈을 비교 합니다.
  7. 모니터링 및 임신의 다른 단계에서 임신 쥐의 자 궁 동맥 혈을 비교 (9, 15 및 임신의 18 일).
  8. 수행 통계 분석 SPSS를 사용 하 여. Interquartile 범위와 평균 ± 표준 편차 (SD) 또는 중간 데이터를 제시. 다른 그룹 사이의 스튜던트 t-검정을 사용 하 여 결과 분석 합니다. P-값이 0.05 보다 통계적으로 유의 한 차이 고려 되었다.

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Representative Results

아니 큰 차이가 antero 후부 자 궁 경적 직경 또는 두께 endometrium의 자 궁 경적 (표 1)의 두 측면을 확인 하 고 있었다. 그룹 2와 비교, 그룹 1에에서 평균 자궁내 막 두께 두꺼운, 하지만 더 중요 한 차이 (P > 0.05) (그림 3)의 두 그룹 사이 발견 했다. 그럼에도 불구 하 고, 우리 관련 endometrium 형태 (그림 2)에서 변경 된 발 정기 주기 근처 (8 중 28 쥐)에서 자 궁 안에 액체 발견.

도플러 연구 또한 보였다 아니 중요 한 변화 흐름에 속도 파형 패턴 또는 비 임신 쥐 (표 1 2, 그림 4A)에서 발 정기 주기의 다른 단계에서 자 궁 경적의 각 측에. 그러나, 임신 쥐에 고급, 임신으로 피크 수축 및 끝 확장기 속도 크게 증가 하 고 계산 된 저항 인덱스 크게 감소 (표 3, 그림 4B).

난소의 평균 직경 크게 다른 (표 1) 아니었다. 난소의 형태는 두 그룹 사이의 비교 되었다, periovulatories 낭과 난소 주위 액체 (표 2, 그림 2) 배 란 후 보였다.

Figure 1
그림 1 : 해부학 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 자궁내 막 두께 (B 형태)의 측정. Endometrium (파란 선)의 두께 (A). Antero 후부 자 궁 경적 직경 (큰 파란 선) 발 정기 동안 endometrium (짧은 파란 선)의 두께 (B)를 주기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 왼쪽된 난소;의 직경의 (A) 측정 (B) 난소 그리고 발 정기 단계 동안 낭.

Figure 4
그림 4 : 자 궁 동맥 혈 류 량의 측정. (A) 비 임신 쥐에 자 궁 동맥 혈액 흐름. (B) 자 궁 동맥 혈액 흐름 임신 쥐의 15 번째 날에.

(P > 0.05, 각 그룹에 큰 차이). SD: 표준 DesviationPSV: 최대 수축 기 velocityEDV: 끝 확장기 velocityS/d: 수축 기 확장기 ratioRI에: 저항 인덱스. ((RI)=[PSV–EDV]/PSV)

변수
(mm±SD)
왼쪽 오른쪽 피 값
경적 직경 (mm) 1.78±0.24 1.73±0.28 0.626
Endometrium 두께 (mm) 0.75±0.06 0.76±0.05 0.752
난소 직경 (mm) 3.69±0.52 3.62±0.32 0.107
여 포 크기 (mm) 1.68±0.31 1.74±0.29 0.859
PSV (mm/s) 91.52±17.91 93.07±22.87 0.055
EDV (mm/s) 34.18±9.36 36.67±11.14 0.178
S/D 2.78±0.59 2.62±0.50 0.294
RI 0.62±0.08 0.60±0.08 0.876
(P > 0.05, 각 그룹에 큰 차이).
SD: 표준 Desviation
PSV: 최대 수축 기 속도
EDV: 끝 확장기 속도
S/d: 심장 수축 심장 확장 비율
RI: 저항 인덱스입니다. ((RI)=[PSV–EDV]/PSV)

표 1: 왼쪽 및 오른쪽 자 궁 경적 난소에 차이.

변수
(mm±SD)
발 정기 단계
(그룹 1)
비 발 정기 단계
(그룹 2)
P.value
경적 직경 (mm) 1.71±0.18 1.83±0.23 0.433
Endometrium 두께 (mm) 0.78±0.04 0.72±0.05 0.168
난소 직경 (mm) 3.71±0.56 3.66±0.47 0.515
PSV (mm/s) 92.05±17.93 94.15±20.62 0.886
EDV (mm/s) 37.81±9.64 34.72±5.38 0.096
S/D 2.61±0.58 2.77±0.44 0.249
RI 0.60±0.08 0.63±0.06 0.232
(P > 0.05, 각 그룹에 큰 차이).
SD: 표준 Desviation
PSV: 최대 수축 기 속도
EDV: 끝 확장기 속도
S/d: 심장 수축 심장 확장 비율
RI: 저항 인덱스입니다. ((RI)=[PSV–EDV]/PSV)

표 2: 비 임신 쥐에 다른 estrous 주기 단계 사이의 차이점.

변수 D9 D15 D18 P 값
PSV(mm/s) 111.08±5.93a, b 122.64±7.49c 131.91±3.50 < 0.05
EDV(mm/s) 38.80±3.37d, e 56.43±3.10f 79.29±5.47 < 0.05
S/D 2.87±0.12g, h 2.17±0.16 1.67±0.14 < 0.05
RI 0.65±0.02 j, k 0.54±0.04L 0.39±0.05 < 0.05
PSV는 최대 수축 기 속도 =
EDV 끝 확장기 속도 =.
S/D = 수축 기 확장기 비율 (PSV/EDV).
RI = 저항 인덱스 ((RI) = ([PSV-EDV] / PSV).
D9 = 임신의 날 9
D15 = 임신의 일 15
D18 = 임신의 날 18
SD: 오류 나타내는 표준 편차 (±).
(P < 0.05, 각 그룹에 큰 차이)
P 값: D9 vs d 15는 0.03; = d = 0.001; g = 0.01; j = 0.01.
D9 vs D18 b = 0.003; e = 0.001; h = 0.01; k = 0.001.
D15 vs D18 c = 0.03; f = 0.001; 나 = 0.03; L = 0.04입니다.

표 3: 임신 쥐의 자 궁 동맥 혈에 차이.

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Discussion

프로시저 수정 및 쥐, 초음파를 사용 하 여 주기는 발 정기의 단계 모든 식별의 우리의 목표에도 불구 하 고 본이 연구에서는 데 필요한 문제 해결 우리는 어떤 중요 한 차이점을 찾을 수 없었습니다. 우리 가설 이러한 어려움 때문에 발 정기 주기 여성에서 주기 달리 쥐 몇 일 지속 될 수 있습니다. 우리는 어떤 차이 확인 하기 위해 정확 하 게 적절 한 시기에 모든 측정 한 했다입니다. 따라서, 우리가 어떤 차이 대 한 평가를 두 단계로 발 정기 주기 단계 재편성 하지만 아무도 관찰 했다. 예상 대로, 우리는 측정을 수행 미래에 어느 경적을 선택할 수 있도록 각 자 궁 경적의 측정 사이의 큰 차이 발견. 설치류에서 isoflurane 사용의 효과 대 한 연구는 모순. 않았음, 하지만 몇 시간 또는 몇 일에 대 한 마 취 농도에서 관리 하는 경우에 수 있습니다. 우리가 어떤 임신 쥐 또는 그들의 자손에 어떤 부작용을 찾지 못 했 그래서 우리의 실험 임신 쥐에 시험 시간 30 분 미만 했다.

우리는 소 낭 모양 단계, periovulatory 및 분 비 단계 차이 분명 echogenic에 있는 여성 생식 관의 초음파 평가에 더 많은 유사점 발견 하 고 싶습니다 하지만 이러한 변화는 쥐에서 보인 하지 모델입니다. 이 사실은 쥐 발 정기 주기 단계만 지난 4 ~ 5 일 때문에 설명 될 수 있다. 짧은 발 정기 주기 단계 및 임신 기간 만들 쥐 연구를 위한 이상적인 동물 복제5. 그럼에도 불구 하 고,이 사실이 있을 수 있습니다 이유는 왜 발 정기 및 비 발 정기 단계에서 자 궁 경적, 자궁내 막 두께 난소 직경의 직경에 상당한 차이가 있다. 어려운 차이 확인을 정확 하 게 적절 한 시기에는 측정 하 고 측정 매일에 불구 하 고 우리 중대 한 변화를 찾지 못했습니다.

위의 제한에도 불구 하 고 우리는 두께 생식 기관의 형태를 포함 하 여 생식 시스템에 변경 사항을 모니터링 하는 초음파의 사용을 제안 합니다. 우리는 8 주 된 Sprague-Dawley에 endometrium의 두께 측정 histopathologically 쥐 때문에 초음파의이 사용이 긍정 수 있습니다 (레이어 359.13 ± 49.70 m m) 선사 외.7 여기에 결과 비슷합니다. Histopathologically 및 초음파 자궁내 막 두께 측정 하기 위한 다양 한 기법에도 불구 하 고 우리는 비슷한 결과를 얻었다. 파워 도플러와 컬러 도플러 임신 쥐에 몇 년8,9에 대 한 사용 되었습니다, 비 임신 쥐의 자 궁 동맥 혈 류를 측정 하는 몇 가지 조사 되었습니다. 이제는 초음파의 발달로 우리 임신의 처음에도 각각 다른 단계는 생식 기관에 변화를 모니터링 하기 위한이 기법의 장점은 걸릴 수 있습니다.

초음파의 미래 응용 쥐 동물 모델에서 배아 이식의 메커니즘 및 얇은 endometrium의 치료의 탐사를 포함할 수 있습니다. 또한, 낭 개발의 특성을 모니터링 하 여 우리는 난소 이식 모델에서 그들의 기능에 대 한 보다 포괄적인 지식을 얻을 수 있습니다. 현재, 3D 이미징 및10, 쥐 생식 시스템의 분자 초음파 이미징 사용 하 여 몇 가지 조사 있으며 우리 미래에 얇은 endometrium 모델에이 기법을 적용 됩니다.

우리 쥐 transcutaneous 초음파 바이오-현미경 검사 법, 동물의 희생을 요구 하지 않는 사용 하 여 생식 기관 역학의 연구에 대 한 적합 한 모델은 결론을 그릴 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

이 연구는 동물 실험 섹션의 무르시아 대학 및 산부인과 산부인과 부서 무르시아의 대학에 의해 지원 되었다. 우리 감사 모든 기술자를 무르시아의 대학, 동물 실험의 섹션 CEIB (센트로 실험 en Investigaciones Biomédicas)에서 작업 들이 프로젝트에 협력 해야 합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vevo3100 high-resolution in vivo micro-imaging system* Visual Sonics, inc. www.visualsonics.com/products
Vevo integrated rail system including physiological monitoring unit. Visual Sonics, inc. www.visualsonics.com/products
MX400 Transducter Visual Sonics, inc. www.visualsonics.com/products
Vevo Lab Software Visual Sonics, inc. www.visualsonics.com/products
HSD: Sprague Dawley SD Envigo, inc. Rat strain
Lubricating Gel General Supply
CIBERTEC CA-EAC20 Anesthesia Trolley System Cibertec S.A  Anesthesia Machine
Ecogel 100 ultrasound gel Eco-Med Pharmaceuticals Inc.
Hair removal lotion (Nair)  General Supply
Isoflurane Esteve Veterinaria Inhalatory anesthesia
* Required software is Vevo software including B-Mode application, pulse wave Doppler application, and vascular strain analysis tools package.

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References

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