Le c. elegans intestin comme un modèle intercellulaires Lumen morphogenèse et In Vivo polarisé la biogenèse membranaire au niveau unicellulaire : marquage par des anticorps, RNAi perte de fonction analyse et imagerie

Developmental Biology

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Summary

Le transparent c. elegans intestin peut servir comme une «en vivo tissu chambre » pour l’étude des apicobasal la biogenèse membranaire et lumen au niveau unicellulaire et subcellulaire pendant tubulogenèse multicellulaires. Ce protocole décrit comment combiner un étiquetage standard, perte de fonction génétique/ARNi et approches microscopiques de disséquer ces processus au niveau moléculaire.

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Zhang, N., Khan, L. A., Membreno, E., Jafari, G., Yan, S., Zhang, H., Gobel, V. The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56100, doi:10.3791/56100 (2017).

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Abstract

Multicellulaires tubes, unités fondamentales des organes internes, sont composées de cellules épithéliales ou endothéliales polarisées, avec membranes apicales tapissant les membranes lumen et basolatérale communiquant avec eux et avec la matrice extracellulaire. Comment cette asymétrie membranaire distinctif est créée et maintenue au cours de la morphogenèse de l’orgue est encore une question non résolue de la biologie cellulaire. Ce protocole décrit l’intestin de c. elegans comme un modèle pour l’analyse de la biogenèse membranaire polarisée au cours de la morphogenèse de tube, en mettant l’accent sur la biogenèse membranaire et lumen apicale. Le c. elegans vingt-cellule seule couche épithélium intestinal est organisé dans un simple tube bilatéralement symétrique, permettant l’analyse sur le plan de cellule unique. Polarisation de la membrane se produit simultanément avec la division cellulaire polarisée et migrations au cours de l’embryogenèse précoce, mais en reprenant polarisé biogenèse membranaire se poursuit tout au long de la croissance larvaire, lorsque les cellules ne prolifèrent et se déplacent. Le dernier paramètre permet de séparer subcellulaires changements qui interviennent simultanément ces différents processus polarisants, difficiles à distinguer dans la plupart des modèles de polarité. Apical-basolatérale membrane-jonctionnelle-, du cytosquelette- et endomembranaire composants peuvent être marqués et suivis tout au long de l’élaboration des protéines de fusion de GFP ou évaluées par in situ anticorps coloration. Avec polyvalence génétique de l’organisme, l’intestin de c. elegans fournit donc un modèle unique en vivo pour le visuel, le perfectionnement et analyse en génétique moléculaire de membrane polarisée et tube biogenèse. Les méthodes spécifiques (tout norme) décrits ici comprennent comment : étiqueter des composants subcellulaires intestinales par anticorps coloration ; analyser les gènes impliqués dans la biogenèse membranaire polarisée par perte de fonction des études adaptés aux gènes essentiels généralement tubulogenèse ; évaluer les défauts de polarité au cours des différentes étapes du développement ; interpréter les phénotypes par épifluorescence, contraste interférentiel différentiel (DIC) et microscopie confocale ; quantifier les défauts visuels. Ce protocole peut être adapté pour analyser des molécules souvent hautement conservées impliquées dans la polarité épithéliale, biogenèse membranaire, morphogenèse tube et lumen.

Introduction

La génération des asymétries cellulaires et subcellulaires, tels que la formation de domaines membranaires polarisée, est cruciale pour la morphogénèse et la fonction des cellules, tissus et organes1. Études sur la biogenèse membranaire polarisée dans l’épithélium restent un défi technique, étant donné que les changements de direction dans la répartition des composants subcellulaires dépendent consécutives et coïncidant extracellulaires et intracellulaires des signaux multiples qui sont difficiles à séparer dans la plupart des modèles et dépendent fortement du système de modèle. Le modèle présenté ici - la seule couche Caenorhabditis elegans intestin - est un tissu d’une simplicité exquise. Ensemble avec la cellule unique canal c. elegans excréteur (voir document d’accompagnement sur la biogenèse membranaire polarisée dans le canal excréteur de c. elegans )2, il offre plusieurs avantages uniques pour l’identification et caractérisation des molécules nécessaires à la biogenèse membranaire polarisée. La conservation des repères de polarité moléculaire de la levure à l’homme de faire cet simple organe d’invertébrés un excellent «en vivo tissu chambre » pour répondre aux questions sur la polarité épithéliale qui se rapportent directement au système humain, qui est encore beaucoup trop complexe pour permettre la dissection visuelle de ces événements à l’unique cellule niveau in vivo.

Bien que plusieurs repères de polarité conservée de (1) la matrice extracellulaire (2) la membrane plasmique et les jonctions et le trafic vésiculaire (3) intracellulaire ont été identifiés3, les principes qui sous-tendent leur intégration dans le processus de polarisée biogenèse membranaire et tissu épithéliale est mal compris4. Les modèles classiques unicellulaires en vivo (e.g.S. cerevisiae et le zygote de c. elegans ) ont joué un rôle important dans la définition des principes de la division cellulaire polarisée et de polarité antéro-postérieur et ont identifié critiques polarité associée à la membrane déterminants (les petites GTPases/CDC-42, les PARs présentant un défaut de partitionnement)5,6, mais ils dépendent de la symétrie unique cues (cicatrice de bourgeon, entrée de sperme) et n’ont pas sécurisé par jonction apicobasal membrane domaines et, vraisemblablement, le correspondant apicobasal intracellulaire, machines de tri. Nos connaissances actuelles sur l’organisation du trafic polarisée dans l’épithélium, cependant, repose essentiellement sur des monocultures 2D mammifères7, qui n’ont pas des indicateurs physiologiques extracellulaires et développement qui peuvent changer de position de la membrane domaines et les directions des trajectoires de trafic (passage de la 2D à la 3D en vitro systèmes de culture seuls suffit pour inverser la polarité de la membrane des cellules MDCK (Madin-Darby canine kidney))8. In vivo du développement sur la polarité épithéliale chez les organismes invertébrés modèle a été initialement étudié dans l’épithélium plat, par exemple dans l’épiderme de Drosophila melanogaster , où ils ont identifié la contribution critique de la dynamique de la jonction pour la migration cellulaire polarisée et cellule feuille mouvement9et d’endocytose traite à polarité entretien10. La 3D in vitro et in vivo l’analyse de la morphogénèse de la lumière dans l’épithélium tubulaire dans les cellules MDCK et dans l’intestin de c. elegans , respectivement, ont récemment identifié l’exigence du trafic intracellulaire pour de Novo domaine (apical) et biogenèse lumen et positionnement11,12,13. L’épaisseur de tubulaire (par opposition à plat) des cellules épithéliales est un avantage pour l’analyse 3D des asymétries subcellulaires puisqu’elle permet une distinction visuelle supérieure de la membrane apicale-lumière, jonctions apico-latéral, la membrane latérale et le position des organites intracellulaires. À ces avantages visuels, le modèle de c. elegans ajoute le paramètre in vivo , transparence, axe du développement, simplicité du plan du corps, lignée de cellules invariant et définies, analytique (génétique) et des avantages supplémentaires décrits ci-dessous.

C. elegans lui-même est un ver rond de structure tubulaire dont la transparence et architecture simple faire ses organes internes de même tubulaires directement accessible à l’analyse visuelle de la morphogénèse tube et lumen. Les vingt cellules de son intestin (21 ou 22 cellules parfois)14 sont issus d’une cellule unique ancêtre (E) et se développent à partir d’un double épaisseur de l’épithélium par une étape d’intercalation dans un tube à symétrie bilatérale de neuf anneaux INT (quatre cellules dans le premier anneau ; Figure 1 schéma)14,15,16. Analyse de lignage et tissus de l’intestin, initialement déterminé par optique Nomarski via des identités nucléaire17puis par microscopie de fluorescence par l’intermédiaire des membranes étiquetées, a fourni un aperçu critique de sa morphogénèse, dans particulier les exigences autonome-cellule et cellule-non autonome pour son directionnel des divisions cellulaires et les mouvements (par exemple, intercalation, asymétrie droite-gauche, rotation de tube antérieur et postérieur)14,18 . La spécification des cellules endodermiques précoce et le réseau de régulation de gène contrôlant le développement de cet organe clonale modèle sont bien caractérisés19,20. Ici, cependant, porte sur l’analyse de membrane polarisée et biogenèse lumen dans les cellules tubulaires et des asymétries intracellulaires d’endomembranes, les structures du cytosquelette et les organites qui accompagnent ce processus. L’analyse est facilitée par la simplicité de ce tube, où toutes les membranes apicales (sur ultrastructures distingué de microvillosités) face à la lumière et toutes les membranes basales face à la surface du tube extérieur, avec des membranes latérales communiquant avec l’autre, séparée de la membrane apicale de jonctions (schéma de laFigure 1 , voir les références (16,21) pour c. elegans-organisation spécifique de serré et éléments de jonction adherens). Biogénèse de la membrane apicale est donc coïncidant avec la morphogénèse de la lumière. En outre, la taille des cellules intestinales adultes - les plus grandes cellules de ce petit animal (à l’exception de la cellule excréteur) - la taille approximative d’une cellule de mammifère, permettant le suivi visuel in vivo des éléments subcellulaires, par exemple trajectoires de vésicules, qui est généralement tenté in vitro dans une boîte de Petri.

Dans le but de cette analyse cellulaire et subcellulaire, un étiquetage approprié est essentiel. Domaines d’intestinal endo - ou -membrane plasmique, jonctions, du cytosquelettestructures, les noyaux et les autres organites subcellulaires peuvent être visualisées par leurs composants moléculaires spécifiques d’étiquetage. Plusieurs de ces composants ont été caractérisés et continuer à découvrir (letableau 1 donne quelques exemples et fait référence aux ressources). Par exemple, diverses molécules qui distingue les compartiments tubulaires ou vésiculaires du système endomembranaire intestinale, l’ER à l’appareil de Golgi par l’intermédiaire de vésicules de Golgi-post à la membrane plasmique, ont été identifiés22. Les spécifiques protéines (ainsi que les lipides et les sucres) soit peuvent être étiquetés directement, ou indirectement via les protéines de liaison. Ce protocole met l’accent sur la souillure d’échantillons fixés, une des deux techniques de marquage standards in situ anticorps (voir le document ci-joint sur canal excréteur tubulogenèse pour obtenir une description des autres technique2 - en vivo étiquetage par l’intermédiaire de fusions de la protéine fluorescente - qui s’applique directement à l’intestin ; Tableau 2 donne des exemples des promoteurs d’intestin spécifique qui peuvent être utilisés pour piloter l’expression de ces protéines de fusion de l’intestin). Doubles ou multiples étiquetage avec deux approches, ou avec une combinaison de ces deux plus supplémentaires attaque chimique, permet une plus grande résolution visuelle approfondie et l’examen des changements spatiaux et temporels dans la co-localisation et recrutement particulier des molécules ou des composants subcellulaires (Figure 2). La fixation et coloration des procédures décrites dans cette préservation de soutien de protocole de la protéine fluorescente verte (GFP) étiquetage pendant les procédures d’immunohistochimie. Pour l’imagerie, principaux points de la détection et caractérisation des phénotypes via des procédures standards microscopiques (dissection et confocale microscopie en fluorescence) sont de tubulogenèse décrit ()Figure 3, 4). Il peuvent être étendus à une résolution plus élevée d’imagerie approches, pour l’instance superrésolution microscope microscopes et électronique (non décrit ici).

Des atouts majeurs de ce système sont la capacité d’analyser la polarité dans des cellules individuelles à différents stades de développement, de l’embryogenèse à la vie adulte. Par exemple, la membrane apicale domaine et lumen la biogenèse peut être suivie tout au long du développement à l’échelle de la cellule unique moyen de l’étiquetage avec MCE-1, un lieur de membrane-actine hautement conservée de la moésine-radixine-Ezrin famille23,24 . ERM-1 visualise la biogenèse (1) de la membrane apicale au cours de la morphogénèse du tube embryonnaires, lorsqu’elle se produit simultanément avec la division cellulaire polarisée et migration (déplacement de cellules apicalement autour de la lumière au cours de l’intercalation)15; (2) au cours de fin extension tube embryonnaire et larvaire qui se déroule en l’absence de division cellulaire ou de la migration ; et (3) dans l’intestin adulte, où les domaines membranaires polarisées sont entretenus (Figure 1). Dans l’épithélium larvaire post-mitotique en expansion, de novo polarisé membrane biogenèse se distingue ainsi de la morphogenèse tissu polarisée, qui n’est pas possible dans la plupart des modèles polarité épithéliale in vivo et in vitro , y compris ceux avec résolution monocellulaires (par exemple le 3D MDCK kyste modèle8). D’étiquetage pour les autres composants, ce paramètre fournit l’occasion (particulièrement dans le stade larvaire L1 lorsque les cellules ont un ratio plus élevé de cytoplasme/noyau) pour distinguer ces modifications intracellulaires spécifiques à polarisé (membrane) biogenèse par exemple la réorientation des trajectoires de trafic) de celles requises en même temps que la division cellulaire polarisée et la migration.

La polyvalence génétique de c. elegans est bien connu25et rend un système puissant de modèle pour l’analyse moléculaire de n’importe quelle question biologique. Une étude sur la morphogenèse, par exemple, peut commencer par une souche de type sauvage, une souche transgénique où la structure d’intérêt (par exemple une membrane) est marquée avec un marqueur fluorescent, ou avec un mutant perte ou gain de-fonction présentant un défaut dans ce structure. Une étude génétique inverse typique peut générer un mutant où le gène d’intérêt est supprimé dans la lignée germinale (p. ex. par une suppression ciblée), modifiée par mutagénèse (produisant généralement des mutations ponctuelles avec perte, réduction ou un gain en fonction du gène), ou si sa transcription est réduite d’Arni. La facilité de l’ARNi en se nourrissant dans c. elegans26 se prête également à la conception d’écrans ciblés qui examinent un plus grand groupe de gènes d’intérêt. Les sans doute plus grande force de l’organisme d’un modèle génétique sont la capacité à conduire en vivo avancer écrans (p. ex. mutagénèse, systématiques ou génome écrans RNAi) qui autorisent une enquête impartiale sur la cause moléculaire pour un phénotype de intérêt. Par exemple, un visual impartiale Arni c. elegans tubulogenèse écran, commençant par un animal transgénique avec membranes apicales MCE-1-étiqueté, découvert une conversion de polarité intestinal réversible intrigante et phénotype lumen ectopique, utilisé Voici un exemple pour ce type d’analyse. Cet écran identifié l’appauvrissement des glycosphingolipides (GSL ; lipides de la membrane obligatoires, identifiés par leurs enzymes biosynthétiques-GLS) et les composants de la clathrine coat de vésicule et son adaptateur AP-1 comme défauts moléculaires spécifiques causant cette polarité phénotype de la conversion, caractérisant ainsi ces molécules le trafic comme in vivo cues pour la polarité de la membrane apicale et lumen positionnement12,13. Lorsque vous démarrez avec un phénotype spécifique mutation génétique/morphogenèse, ces écrans (ou des expériences unique interaction génétique/ARNi) peuvent également examiner les interactions fonctionnelles entre deux ou plusieurs gènes d’intérêt (voir document d’accompagnement sur l’excrétion canal pour obtenir un exemple d’une telle analyse)2. Ce protocole met l’accent sur l’ARNi, qui, outre sa capacité d’identifier directement le gène dont la perte provoque le phénotype à avancer les écrans, offre des avantages spécifiques pour l’analyse de la morphogénèse. Étant donné que les produits des gènes dirigeant morphogenèse souvent travaillent d’une manière dose-dépendante, Arni est généralement couronnée de succès dans la production d’un éventail de phénotypes. La capacité de générer des phénotypes partielle-perte de fonction informatives permet également de régler le problème que la majorité des tubulogenèse importants gènes est essentielle et que leurs pertes causent la stérilité et la létalité embryonnaire précoce. Ce protocole comprend conditionnelle Arni stratégies pour surmonter cette difficulté et suggère des façons d’optimiser la production d’un plus large éventail de phénotypes, par exemple une série allélique produites par mutagénèse.

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Protocol

1. Étiquetage de l’intestin de c. elegans

Remarque : Voir le document d’accompagnement par les auteurs sur l’analyse du canal excréteur tubulogenèse 2 pour la construction de marqueurs fluorescents spécifiques de tissus plasmides et la production d’animaux transgéniques, notamment des discussions sur des protéines de fusion transcriptionnel et traductionnel (ce dernier requis pour la localisation subcellulaire d’une molécule d’intérêt). Ces procédures peuvent être adaptés à l’aide de promoteurs spécifiques pour piloter la molécule d’intérêt à l’intestin. Voir le tableau 1 pour des exemples de molécules sont avérées utiles pour la visualisation de c. elegans intestinale endo - et les membranes plasmiques et leurs jonctions, tableau 2 pour obtenir des exemples des promoteurs pour expression en route vers l’intestin, et le tableau 3 pour les ressources pour les collections plus complètes des marqueurs intestinales et promoteurs.

  1. Souillure d’anticorps de l’intestin de c. elegans 27 , 28
    1. Fixation
      1. prendre une lame de verre propre et utiliser la poly-L-lysine à générer une couche mince pour les vers à coller sur. Place 30 µL 0,1 à 0,2 % de poly-L-lysine sur la diapositive et place une deuxième diapositive sur la baisse de la poly-L-lysine pour faire un " sandwich ". Les diapositives puis frottez doucement plusieurs fois pour mouiller la surface entière des deux et laissez-les sécher pendant 30 min Label le côté givré des diapositives à l’air avec un crayon.
        Remarque : 0,2 % poly-L-lysine parties aliquotes de 200 µL ont été faites en dissolvant la poudre en dH 2 O ; Cela peut être conservé à-20 ° c utilisation haut poids moléculaire poly-L-lysine pour améliorer le collage vers. La concentration de la poly-L-lysine est également critique. Des concentrations trop faibles ne permettra pas les vers s’en tenir, mais des concentrations trop élevées peuvent générer le signal de fond de fluorescence. Une couche trop épaisse peut se détendre dans son intégralité.
      2. Placer un bloc plâtes fermement sur le bas d’un conteneur (par exemple un récipient en polystyrène) rempli d’azote liquide.
        Remarque : On peut utiliser la glace sèche au lieu de cela, mais l’azote liquide conserve un bloc de métal plus stable sur le fond du conteneur et frissons bien.
      3. Frais virés vers soit en les lavant hors leurs assiettes avec M9 29 ou pick vers différentes étapes (deux œufs, L1, L2, L3 ou L4 stade larvaire vers) sur chaque diapositive. En règle générale, choisissez ~ 100 larves et embryons ou ~ 20 adultes à chaque diapositive. Placer 10 µL lavé vers le milieu de la diapositive ou pick oeufs/worms dans 10 µL M9 ou 10 µL 1 x PBS 27 (tamponné phosphate salin).
        1. Utiliser une pipette d’étaler un grand nombre de vers pour éviter les grumeaux.
          Remarque : Mélange des populations de lavé les vers, en raison de l’encombrement et différentes épaisseur de stades, ne collent pas bien et sont moins efficacement gel fissuré (voir ci-dessous), donc prélèvement spécifique au stade vers (ou populations synchronisées) donne des résultats supérieurs. Les larves collent mieux que les adultes et plus d’animaux peuvent être placés par diapo.
        2. Avant la cueillette vers sur glissières, transférer sur une plaque de médium de croissance nématode (NGM) 29 sans bactéries OP50. Adepte de bactéries excédentaires à la worms peut également interférer avec collage. Veiller à ce que les vers ne s’assèchent pas.
      4. Doucement le lieu (goutte) une lamelle couvre-objet 22 × 22 mm croisements des chemins sur le dessus de la collecte worms telle que ses bords se pendent au moins un côté de la diapositive. Appuyer vers le bas doucement mais fermement avec un ou deux doigts sur la lamelle couvre-objet. Éviter le cisaillement qui nuira à l’intégrité des tissus.
      5. Immédiatement et délicatement transférer la diapositive dans le bloc de métal dans l’azote liquide et laisser reposer pendant environ 5 min de geler. Puis " flick off " la lamelle dans un swift déplacer en utilisant le bord surplombant.
        Remarque : Cette étape doit être faite avec fermeté et alors que la diapositive est gelée pour atteindre " craquage " de la cuticule. ATTENTION : Veuillez suivre les directives de l’EPI (Equipement de Protection individuelle) lorsque vous travaillez avec de l’azote liquide.
      6. Plonger les lames gel fissuré dans un méthanol-rempli de verre Coplin pendant 5 min à-20 ° C. Puis transfert à l' acétone-rempli de verre Coplin pendant 5 min à -20 ° C.
        Remarque : Méthanol et acétone devraient être stockés à-20 ° C pendant au moins 30 min avant utilisation. Après fixation, les diapositives peuvent être conservés à -20 ° C. attention : méthanol et acétone sont toxiques.
      7. Supprimer des diapositives de jar et laissez-les sécher à température ambiante (RT) avant de l’utiliser à l’air.
    2. Coloration
      1. entourent zone de worms fixes avec une fine couche de vaseline sur la diapositive. Tracer un cercle autour de cette zone sur le dessous de la diapositive pour marquer le point.
        Remarque : Il est essentiel que le cercle de gelée reste intact tout au long de la procédure de marquage pour éviter les fuites des solutions de coloration.
      2. Préparer un " chambre humide " dans un bac en plastique avec couvercle en plaçant mouiller les serviettes en papier dedans. Placer la lame sur une grille dans ce " chambre humide " pour empêcher le séchage des lames pendant la coloration.
        Remarque : Les diapositives ne doivent pas être en contact avec l’eau ou avec l’autre.
      3. Pipetez doucement environ 50 µL PBS 1 x dans le cercle de gelée, assez pour couvrir la zone. Fermer la " chambre humide " avec le couvercle. Incuber à RT pendant 5 min.
        Remarque : Pour éviter de perdre vers à cette étape, ne pas pipeter PBS directement sur les vers. Doucement, placer l’embout de la pipette sur le bord du cercle et permettre au liquide de se disperser en douceur sur les vers.
      4. Inclinaison de la lame et aspirer lentement le PBS avec une pipette. Placez le chariot arrière plat sur le support et ajouter 50 µL (ou le montant nécessaire pour couvrir la tache) bloquant la solution avec précaution. Ceci incuber dans la chambre humide à ta pendant 15 min. En attendant, diluer l’anticorps primaires en bloquant la solution (voir Table des matières pour obtenir des exemples de concentrations et d’anticorps primaires).
        Remarque : Fraîchement préparer la solution de blocage à l’aide de la solution de 1 PBS x (10 mL), 10 % tween (50 µL) et le lait en poudre (0,2 g). La quantité de détergent et de la concentration du lait peut varier en fonction des anticorps utilisés et devrez peut-être déterminer empiriquement. Aspiration du liquide de la diapositive est une autre étape pour perdre facilement vers. Vérifier les progrès en examinant la diapositive dans le cadre de dissection, mais veiller à ce que la lame de se dessécher.
      5. Inclinaison de la lame et aspirer à la solution de saturation, en utilisant les mêmes précautions comme décrit ci-dessus. Placez la lame arrière plat sur support et ajoutez lentement 50 µL dilué l’anticorps primaire, en utilisant les mêmes précautions. Proche la " chambre humide " et incuber à 4 ° C pendant la nuit ou pour des périodes plus courtes à RT.
        Remarque : La période d’Incubation peut nécessaire de déterminer empiriquement pour un anticorps spécifique.
      6. Aspirer au large de la solution d’anticorps primaire comme pour les autres solutions. Puis laver les lames avec solution de saturation pendant 10 min, 3 fois, ajout et suppression de la solution de la même façon comme décrit ci-dessus.
      7. Ajouter des anticorps secondaire (fluorescent marqué) dilué dans une solution de blocage, incuber à RT pendant 1 h. Voir Table des matières pour obtenir des exemples de concentrations et des anticorps secondaires.
      8. Enlever les anticorps secondaire et lavage, comme ci-dessus, avec la solution de blocage 2 fois et, pour débarrasser la solution de saturation, avec du PBS 1 x, pendant 10 min chaque.
      9. Aspirer loin autant PBS que possible sans permettre le spécimen à sécher et retirer délicatement la gelée autour de l’échantillon.
      10. Ajouter une goutte de milieu de montage sur l’échantillon, et poser une lamelle doucement dessus. Sceller les bords de la lamelle avec vernis à ongles. Placer les lames dans une boîte sombre lame pour préserver la coloration et stocker à 4 ° C.
        Note : Gardez les diapositives dans l’obscurité en raison de la sensibilité à la lumière (fluorescence peut s’estomper avec le temps) et de prévenir l’exposition à l’air en les gardant scellé, pour la même raison. Diapositives peuvent être conservés pendant une période prolongée à 4 ° C ou -20 ° C.

2. Interférence avec la fonction des gènes essentiels tubulogenèse dans l’intestin de c. elegans. Exemple : Arni.

Remarque : les souches de c. elegans sont cultivées sur OP50 bactéries ensemencées sur plaques NGM selon des protocoles standard 29. Pour RNAi, c. elegans se nourrissent HT115 RNAi bactéries sur des plaques de RNAi additionné de 25 carbénicilline µg/mL et 2 mM IPTG (isopropyl bêta-D-1-thiogalactopyranoside) pour l’induction du promoteur bactérien qui génère la double stranded RNA (dsRNA) depuis l’introduction gène c. elegans. Antibiotiques et la concentration de l’IPTG peuvent varier selon l’ARNi clone/Bibliothèque et force désirée de RNAi, resp. Arni spécifique clones peuvent être obtenus auprès RNAi de Génome-large disponible dans le commerce de l’alimentation des bibliothèques (voir ( 26 , 30 , 31) pour des informations sur l’alimentation Arni chez c. elegans et Table des matières pour les matières/réactifs et bibliothèques RNAi).

  1. Standard ARNi en se nourrissant 26 , 31
    1. sortir plaque bibliothèque RNAi de-80 ° C et le mettre sur la glace sèche. Retirer le ruban adhésif et de pipette stérile permet de transférer des bactéries adhérentes du clone d’intérêt pour les boîtes de gélose LB (bouillon Luria) 29 additionné de 100 µg/mL ampicilline et la tétracycline 15 µg/mL. Ensemencer les bactéries sur gélose. Sceller la plaque RNAi de bibliothèque avec une nouvelle bande d’étanchéité. Cultiver les bactéries pendant une nuit à 37 ° C.
      Remarque : Ces plaques de gélose peuvent être stockés à 4 ° C pendant plusieurs semaines. Nouvelles bactéries peuvent être cultivées directement auprès d’eux pour protéger la bibliothèque originale d’Arni.
    2. Lendemain, ensemencer Arni bactéries provenant de gélose LB dans 1 mL de milieu liquide LB 29 contenant chacun 50 ampicilline µg/mL et agiter pendant 14 h (8-18) ou toute la nuit à 37 ° C.
      Remarque : Pour un résultat optimal utilisez bactéries fraîches chaque fois. Voir référence ( 30) pour la comparaison des conditions de culture différente (par exemple le calendrier de la culture).
    3. Prochain jour, graine 200 µL par clone des bactéries cultivées Arni sur plaques de RNAi distinctes. Laissez les plaques sécher et laissent à la droite du jour au lendemain pour l’induction du promoteur bactérien.
    4. Transfert des larves de stade L4 4-6 sur chaque plaque d’Arni. Incuber les boîtes de RNAi ensemencés à RT ou 22 ° C pendant 3 à 5 jours.
      Remarque : Choisissez tout d’abord L4 larves sur un plat de NGM sans bactéries pour éliminer adherent OP50 qui interférerait avec Arni, ou en série, les transférer à une nouvelle plaque NGM sans OP50 trois fois. Assurez-vous que les souches ne sont pas contaminés, comme des bactéries contaminantes - OP50 préféré de nourriture pour les vers - interviendra également avec Arni. Ajustez la température selon vos besoins : par exemple le développement s’accélère avec une température plus élevée ; les souches peuvent être sensibles à la température.
    5. Pour les études sur le développement, vérifier les phénotypes de la progéniture F1 dès jour-là 2.
      Remarque : Il est essentiel de vérifier les animaux fréquemment pour éviter manque l’apparition ou la progression d’un phénotype (p. ex. remplacement d’un marqueur) quelle évaluation de biogenèse membranaire polarisée au cours du développement. Enrichissement de la population F2 pour les phénotypes fortes (par exemple en choisissant des hermaphrodites de parent d’une nouvelle plaque de RNAi jour 2 pour sélectionner pour les plus fortement touchés partie milieu de leur progéniture) est rarement nécessaire, car un spectre allant de doux à fort phénotypes est souhaitable.
  2. Conditionnelle Arni
    Remarque : Arni conditions peuvent être modifiées de réduction sévère, ou une augmentation des effets bénins, ou d’intervenir à l’étape spécifique ; modifications sont utiles pour l’évaluation complète des effets phénotypiques de la souvent gènes létaux tubulogenèse.
    1. Larvaire RNAi - évaluation de l’ARNi effets dans la même génération (doux, spécifique au stade RNAi)
      Remarque : pour vaincre la stérilité ou la létalité embryonnaire ou de perturber la fonction du gène à l’embryogenèse de post d’un stade spécifique, l’ARNi est induit dans les larves, post embryonnaire. Placer les oeufs non traitées (2.2.1.1), adultes gravides (2.2.1.2) ou synchronisé L1 (ou, si vous le souhaitez, stade ultérieur) larves (2.2.1.3) sur plaques d’Arni ; évaluer les effets de l’ARNi dans la même génération, par exemple deux jours plus tard et, dans les larves ou les adultes.
      1. Pick 30-50 adultes gravides en une seule goutte blanchiment solution (solution 1 : 4 de 10 M NaOH et ménage l’hypochlorite de sodium) placé sur le bord d’une plaque de l’ARNi. Laisser sécher et laisser L1s à éclore et se déplacer dans la pelouse bactérienne.
        Remarque : Blanchiment solution, généralement utilisée pour décontaminer, tuera tout sauf les embryons dans leur coquille de œuf. Par conséquent, ne pas placer la solution de blanchiment sur ou à proximité de la bactérie Arni.
      2. Pick ou graines environ 20 jeunes adultes gravides Arni plaque et attendre leur pondront pendant 2-3 h ou jusqu'à ce qu’il y a environ 300 oeufs sur le plat, puis Ramassez les adultes.
        Remarque : Cette méthode peut entraîner la contamination de la bactérie Arni par OP50. Pour réduire ce risque, d’abord transférer adultes sur une plaque de NGM sans bactéries pour éliminer OP50 adhérentes à la worms. Veiller à ce que les adultes ne restent pas trop longtemps sur des plaques de RNAi d’échapper à Arni sur embryons.
      3. Choisir ou placer vers stade L1 directement sur les plaques d’Arni (voir référence ( 29)-pour les protocoles de synchronisation).
        Remarque : On peut utiliser un protocole de synchronisation abrégée (par exemple pour un set-up moyennement grande échelle) en lavant les vers des plaques densément peuplées avec M9 pour plusieurs fois jusqu'à ce que les oeufs seulement restent. Après 2-3h d’incubation L1s peut alors être prélevé en M9 dans ces plaques, nettoyé de nouveaux lavages pour éliminer les bactéries (3 x en M9) et ensemencé sur des plaques d’Arni.
    2. Dilution de RNAi bactéries avec des bactéries de RNAi vecteur vide (doux RNAi)
      Remarque : réduction d’un montant de dsRNA par dilution de la quantité de bactéries Arni peuvent suffire pour induire des effets moins graves et peuvent également réduire la létalité embryonnaire sans abolir tous les effets embryonnaires. Dilution des bactéries de l’ARNi est également utilisée pour des expériences d’Arni doubles et pour titrer les conditions d’expériences d’interactions génétiques (par exemple pour générer des effets bénins pour l’évaluation de la mise en valeur et des effets importants pour l’évaluation de la répression).
      1. Grow up RNAi et emPty vector Arni HT115 bactéries dans un milieu avec de l’ampicilline 50 µg/mL, 1 mL LB comme fait aux conditions normales d’Arni.
      2. Diluer les bactéries de l’ARNi avec bactéries Arni vecteur vide pour réaliser une gamme de concentrations différentes, par exemple, de 5 %, 15 %, 30 %, 50 %, 70 %. Mélanger les bactéries bien par pipetage de haut en bas. Pipeter 200 µL mélangé de bactéries sur un plat d’Arni.
      3. Pick 4-6 L4 larves sur chaque plaque d’Arni. Vérifier le phénotype de partir du 31ième jour 2.
    3. Arni des souches sensibles (ARNi solide)
      1. utiliser les souches sensibles à Arni disponibles, par exemple, eri-1 (mg366), rrf-3 (pk1426) ou eri-1 (mg366) lin-15 b (n744) (la dernière hypersensible) et suivez procédures de RNAi standard décrits dans 2.1 31 , 32 , 33.
        Remarque : Arni des souches sensibles (p. ex. rrf-3 et eri-1) peuvent avoir la taille des couvées plus bas que les animaux sauvage et être stérile à 25 ° C. Ils peuvent également avoir un faible bruit de fond des phénotypes propres, par exemple faible létalité embryonnaire par ressuage, qui doit être pris en compte lors de l’évaluation des effets spécifiques d’Arni.

3. L’imagerie in vivo de l’intestin de c. elegans par dissection microscopie à fluorescence

  1. avant la visualisation des animaux sous la lumière de fluorescence, vérifier l’ARNi plaques sous une lumière vive sur n’importe quel microscope à dissection. Évaluer (et potentiellement enregistrer) phénotypes visibles sous une lumière brillante qui peut-être influer sur l’analyse, comme la détermination de la létalité, stérilité (nombre inférieur de la progéniture), développement (p. ex. larves arrestation) et autres phénotypes visibles qui peuvent aider caractériser la fonction d’un gène impliqué dans la morphogenèse de la biogenèse et lumière polarisée membrane.
    Remarque : Seule plaques de score qui ont suffisamment progeny pour évaluation (au moins 50), sinon essayez conditions alternatives d’Arni. Pour l’évaluation quantitative Assurez-vous que les plaques ne sont pas contaminés ou grandir OP50 (qui interfèrent avec RNAi).
  2. Pour visualiser les animaux sous lumière fluorescente, enlever le couvercle et placer la plaque de RNAi directement sous le microscope de fluorescence dissection.
    Remarque : Pour détecter les phénotypes intestinales subtiles, il faudra un microscope à dissection avec un attachement de fluorescence stéréo puissance supérieur qui permet une gamme suffisante de grossissement. Ce protocole décrit l’utilisation d’une portée avec un 1,5 et 10 x objectif et une plage de zoom de 3.5 à 45.
  3. Tout d’abord trouver des animaux sous une lumière vive pour se concentrer. Ensuite, examiner les animaux sous une lumière fluorescente à faible grossissement (par exemple au titre de l’objectif 1. 5 x), en utilisant le filtre approprié. Examiner la plaque systématiquement du coin supérieur gauche au coin inférieur droit pour numériser une plaque entière pour les phénotypes.
  4. Sélectionnez animal d’intérêt et changer d’objectif 10 x. Mettre l’accent sur l’intestin et zoom permet d’évaluer le phénotype de la morphogenèse tubulogenèse/lumen. Voir la section 5 pour la notation des phénotypes. Tout d’abord, prendre des photos à faible grossissement. Puis passer à fort grossissement.
    Remarque : Étant donné que des animaux sains aller vite, travailler rapidement, avec une main sur la souris d’ordinateur pour l’acquisition d’images tout en se concentrant au microscope avec l’autre main. Ralentissement des animaux (p. ex. par transitoire mise en place des plaques à 4 ° C) peut-être pas nécessaire quand travailler avec tubulogenèse phénotypes dans surtout arrêté des embryons et des larves au début. Les images peuvent être capturées par une caméra CCD microscope monté et logiciel de capture d’image.

4. Imagerie de l’intestin de c. elegans à résolution plus élevée par laser à balayage microscopie confocale 34 , 35

  1. montage et immobilisation
    1. utilisation doigt de diffuser finement une petite quantité de graisse ou de la vaseline dans un cercle sur une lame de verre (~ 6-8 mm de diamètre).
      Remarque : Épaisseur du cercle de graisse est essentiel pour le montage. Pour de meilleurs résultats d’imagerie, un seul ou plusieurs larves d’image à la fois et utiliser un cercle de graisse ultra-mince avec comme peu de liquide que possible tel que l’animal est directement coincé entre la lame et lamelle couvre-objet (si fait parfaitement, animal va être immobilisé sans anesthésique). Montage des oeufs et des animaux plus âgés nécessitent un cercle un peu plus épais pour éviter la destruction de l’échantillon lors de l’ajout de lamelle couvre-objet.
    2. Ajouter une goutte de de 10 mM en général 3,5 µL solution d’azoture de sodium au milieu du cercle et choisissez vers dedans sous le microscope à dissection.
      Remarque : Préparer une solution 1 M sodium azide en dissolvant 65,01 mg NaN3 dans 1 ml dH 2 O ; Ajouter 200 µL de cette solution de 1M dans 20 mL de tampon de M9. Prendre vers rapidement en goutte de solution d’azoture de sodium afin d’éviter la solution de se dessécher. Choisissez les étapes séparément pour un montage optimal, visant à environ 50 embryons par diapositive et environ 20 larves lors de l’examen des populations plus importantes. On peut utiliser M9 au lieu de la solution d’azoture de sodium lors de la cueillette des embryons. Si vous utilisez l’azoture de sodium, des animaux doit être copié dans les 30 minutes pour éviter d’endommager les tissus de ce produit chimique toxique.
      ATTENTION : l’azoture de sodium est toxique.
    3. Placer délicatement une lamelle de 22 × 22 mm sur la diapositive. Veillez à ne pas écraser les vers. Utiliser une pression légère et vérifiez sous binoculaire pour s’assurer que les vers sont fixés entre lame et lamelle couvre-objet. L’étiquette de la diapositive.
      Remarque : La bonne quantité de pression est essentielle pour éviter d’endommager le spécimen (trop de pression) et en le fixant ne pas bien (pas assez de pression : animaux flotte au lieu de s’en tenir à la diapositive). Animaux flottants empêche essentiellement imagerie appropriée.
  2. Imaging
    1. lame de Place sous le microscope confocal. Recherche de worms avec 10 x objectif et attention.
      Remarque : Utilisez une lumière vive pour se concentrer lorsque c’est possible d’éviter le photoblanchiment.
    2. Changement x 60 ou 100 x objectif et se concentrer sur l’intestin.
      Remarque : L’intestin peut être facilement identifié sous une lumière vive par sa lumière qui traverse le milieu de l’animal, du pharynx à l’anus près de l’extrémité de la queue. Soyez prudent lorsque vous appliquez l’huile pour la x 60 ou l’objectif d’huile 100 x. Mélanger différentes sortes d’huiles peut-être gêner davantage d’imagerie. Place petite goutte d’huile sur la diapositive lorsque vous utilisez un microscope vertical ou sur l’objectif lorsque vous utilisez un champ inversé, prenant soin de ne pas pour contaminer les autres objectifs ou les parties du microscope.
    3. Établir Kohler DIC/Nomarski illumination pour l’objectif à utiliser pour l’analyse de 36. Inspecter les animaux sous une lumière fluorescente avec canal approprié pour vérifier l’étiquetage de l’intestin et/ou vérifier le phénotype, afin de sélectionner un échantillon approprié pour l’imagerie. Travail rapidement pour éviter la décoloration.
    4. Interrupteur à balayage pour limiter l’image prospective à l’intestin en définissant des limites à ses côtés dorsale et ventrale de balayage au laser.
      Remarque : Bracketing de l’intestin de cette façon est critique si fluorophore étiquettes également des structures en dehors de l’intestin. Lors de ce pilote scan, travailler avec des conditions de balayage rapides à avOID photobleaching.
    5. Arrêter le balayage pour sélectionner les paramètres de numérisation pour l’expérience. Set 6-20 sections pour balayage intestinal le long de l’axe z, par exemple à 0,2 µm intervalles, selon l’enquête, stade de considérations animales et/ou techniques. Définir la trame titrant image selon la complexité de l’étiquetage et nécessaire résolution pour réduire le bruit.
      Remarque : Les détails de réglage varient selon microscope et experiment. On peut avoir besoin de réduire la quantité de sections afin d’éviter le blanchiment si on effectue un balayage séquentiel des fluorophores différents trois. Ajuster le nombre d’images à nombre de sections (doit être inférieur à nombre de sections pour éviter la distorsion de l’image ; également peser dans l’augmentation de photoblanchiment). 4-6 cadres sont généralement suffisants.
    6. Revenir à balayage avec définitif à des conditions de balayage laser (lent) et ajuster : luminosité (utilisation de gain minimal pour réduire le fond) ; laser puissance (aussi haut que possible nécessaire, aussi bas que - augmentations photobleaching, habituellement réglage minimum est suffisante) ; sténopé (éviter ouverture si n’est pas nécessaire, pour maintenir la résolution).
      Remarque : Analyse des conditions dépendent du modèle et doivent être déterminées empiriquement au début de la session de scannage. Assurez-vous que la luminosité ne dépasse pas saturation (limitera la capacité de modifier l’image par la suite de logiciels d’imagerie). Lors de la définition des conditions d’analyse, également envisager que des conditions identiques doivent être utilisées pour l’imagerie tous dans des expériences qui permettent de comparer des animaux de laboratoire avec des contrôles.
    7. Séries d’images de capture. Fusionner des images dans une image de projection unique.
      Remarque : Peut-être sauver les images de projection et/ou des superpositions séparément selon microscope.
    8. Lors de la prise d’images multi canaux utilise scanner séquentiellement pour éviter cordeau entre canaux (critique d’études co-localisation).
      Remarque : Paramètres de l’Image peuvent devoir être modifiée compte tenu de l’augmentation photoblanchiment connecté à plus temps de numérisation.
    9. Toujours acquérir les images correspondantes de DIC/Nomarski (sections) pour les points de repère et état général de la morphologie des animaux numérisée.

5. Défauts de quantification de la biogenèse membranaire polarisée dans l’intestin de c. elegans

Remarque : exemple : basolatérale déplacement apical ERM-1::GFP et formation ectopique lumen latérale induite par la décision no let-767 et APS-1 Arni.

  1. Notation phénotypes sous le microscope à dissection ( Figure 5 A, D, E)
    1. définir des catégories pour la notation. Exemple : (i) type sauvage (WT), (ii) basolatérale déplacement de MCE-1::GFP (défaut de polarité) et (iii) formation de lumen ectopique (se développe à la suite de déplacement basolatérale).
      Remarque : Une analyse visuelle faible grossissement prête à marquer le nombre d’animaux avec ou sans un phénotype spécifique. Ici, nous avons choisi un exemple de trois catégories de phénotypiques qualitativement différentes qui sont dans le même temps l’indicatif du verbe une aggravation du phénotype polarité qui est analysé. Cependant, une variété de différents phénotypes qualitatives et quantitatives peut être marquée, comme lumen morphogenèse défauts, absence/présence diamètre (ou nombre) de vacuoles cytoplasmiques positives GFP, lumen et taille ou nombre de kystes d’intralumenal (voir < classe forte = « xfig » > Figure 3 pour des exemples).
    2. Selon l’ampleur des différences escomptées, marquer environ 100 vers direct sur leurs plaques d’agar sous le microscope à dissection dans un jeu en double ou en triple d’expériences.
      Remarque : On doit marquer chaque animal qui est en vue lorsque vous numérisez des plaques systématiquement, par exemple du coin supérieur gauche au bas à droite de la plaque (Assurez-vous que les vers ont peuplé les plaques uniformément).
    3. Répétez cette opération pour 3 séries indépendantes d’expériences. Générer le graphique à barres et d’évaluer l’importance des résultats.
  2. Notation phénotypes au microscope confocal ( Figure 5 B)
    1. définir des catégories pour la notation, par exemple le nombre de lumens ectopiques par animal
      Remarque : un grossissement plus élevé analyse visuelle prête à marquer un repère quantifiable ou phénotype par animal et permet de marquer des marqueurs subcellulaires qui peuvent ne pas être perceptibles en disséquant la microscopie. L’exemple de comptage ectopiques lumens par animal dans un sous-ensemble vers de la même expérience que précédemment évalué en disséquant la microscopie (5.1.1, catégorie 3) Affine l’évaluation de l’aggravation phénotype de polarité qui est examiné ici. Cependant, une variété d’autres phénotypes ou paramètres peut être marqué, par exemple le nombre de vésicules, présence/absence ou nombre de composants subcellulaires qui co localisation, intensité de la fluorescence (ce dernier quantifiés par ImageJ ; voir document d’accompagnement sur la canal excréteur) 2.
    2. Selon l’ampleur des différences escomptées, quantifier les marqueurs phénotypiques (ici, ectopiques lumens) dans environ 20 animaux dans un jeu en double ou en triple d’expériences sous le microscope confocal.
    3. Repeat pour 3 séries indépendantes d’expériences. Générer des graphiques à barres et d’évaluer l’importance des résultats.

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Representative Results

Ce protocole décrit comment moléculairement, analyser et visualiser la membrane polarisée biogenèse et lumen morphogenèse dans l’intestin de c. elegans , unicellulaires et niveau subcellulaire. Le vingt-cellule seule couche c. elegans intestin est formé par dirigé la division cellulaire et migration durant l’embryogenèse mid. À cette époque, polarisée membrane domaines sont établissent, encore de novo biogenèse membranaire polarisée se poursuit dans l’âge mûr mais expansion épithélium tout au long des quatre stades larvaires jusqu'à l’âge adulte, ce qui permet d’axer l’analyse sur polarisé biogenèse (Figure 1 a) de la membrane.

Pour visualiser les composantes cellulaires et subcellulaires des elegans de Caenorhabditis , deux stratégies sont couramment utilisés : immunofluorescence (détaillée dans le présent protocole, article 1 ; Figure 2 , Figure 4 -F) et l’expression des protéines de fusion de fluorescence (détaillée dans le document qui l’accompagne sur canal excréteur polarisé de biogenèse membranaire2; Figure 1 b, Figure 2, Figure 4, , Figure 5). Double et étiquetages multiples, combinant différentes étiquettes de chaque ou les deux méthodes, peuvent résoudre les asymétries de membrane comme apicale et domaines de membrane basolatérale et la relation des différents composants subcellulaires les uns aux autres (Figure 2, Figure 4-E). L’éditeur de liens de membrane-cytosquelette ERM-1::GFP apparaît ici comme un indicateur de la biogenèse membrane apicale qui coïncide avec la morphogénèse de la lumière dans cet épithélium simple-posée. En utilisant ce marqueur, un tableau des défauts de biogenèse membranaire/lumière apicale intestinale et ses défauts de gène peut être identifié par des études de perte de fonction, par exemple par impartiales pangénomique écrans à l’aide d’Arni (ARNi approches adoptées pour la génération de ces phénotypes sont décrites à l’article 2 du présent protocole). Figure 3 et Figure 4 montrent des exemples d’images de grossissement faible à modéré de la membrane apicale/lumen phénotypes biogenèse acquis par un microscope à fluorescence dissection équipé d’un objectif de haute puissance ; et de grossissement supérieur images acquises par un laser confocal scanning microscope (ces approches microscopiques sont décrites aux sections 3 et 4). À titre d’exemple de quantifier les défauts de la biogenèse membrane polarisée, les effets de l’ARNi avec let-767 (codant un stéroïde réductase de déshydrogénase/3-cétoacyl-CoA) et aps-1 (codant pour la sous-unité sigma de la clathrine AP-1 adaptateur) sur MCE1::GFP localisation et positionnement du lumen sont présentées à la Figure 5.

Figure 1
Figure 1 : Structure cellulaire et subcellulaire et la morphogénèse de la souche sauvage C. elegans intestin. (A) Schématique de c. elegans développement intestinal, composition cellulaire et endo - et les membranes plasmiques. L’intestin de c. elegans est généré par clonage à partir le blastomère E né au stade 8 cellules. Après quatre cycles de division cellulaire, ses 16 cellules forme (stade E16) une symétrie radiale épithélium doublé couches15. À ce stade, le cytoplasme de chaque cellule polarise, avec noyaux vers les futurs composants apicales et cytoplasmiques se déplaçant vers le contraire (futur basale), domaines membranaires. En une seule étape d’intercalation des cellules gauche et droite ventrales se déplacent (en parallèle) dans la couche de cellules dorsale pour former le tube bilatéralement symétrique de 9 anneaux INT. Chaque cellule est confrontée et génère de la lumière avec sa membrane apicale/lumière (vert ; structurellement se distingue par des microdomaines membranaires spécifiques, microvillosités) et contacts voisins des cellules ou la cavité du corps avec ses membranes basolatérales (bleu), sauf pour le premier Bague INT qui est formé par quatre cellules. Jonctions apicales (rouge) séparent apicales et basolatérale domaines membranaires. Après l’intercalation, biogenèse membranaire de novo continue ainsi que le développement de l’intestin au cours de l’embryogenèse fin et les quatre stades larvaires dans l’âge adulte, où seulement très peu plus il pousse (phase de maintenance membrane polarisée ). La seule cellule agrandie indique le système endomembranaire avec ER et Golgi au-dessus du noyau (N) et vésicules endosomale. (B) DIC/Nomarski et microscopie confocale chevauchement de l’intestin en développement de c. elegans étiqueté avec le marqueur de la membrane apicale-cytosquelette ERM-1::GFP. L’intestin au stade de la virgule est délimité par une ligne blanche (ERM-1::GFP est déjà faiblement exprimée à la membrane apicale au début d’intercalation mais ne peut être apprécié dans cette image). Animaux ici et ci-dessous sont montré antérieure (tête) à gauche, postérieur (queue) droite, up dorsale, ventrale vers le bas. Barre d’échelle : 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Exemples de doubles et triples étiquetage des pays en développement sauvage C. elegans intestin à l’aide d’anticorps et protéines de fusion. (A, B) Embryons. (A) stade de virgule. PAR-6::GFP (vert, composante de la polarité PAR apical complexe), anticorps anti-PAR-3 (rouge/TRITC (tétraméthyl rhodamine isothiocyanate) ; une autre composante de la polarité PAR apical complexe) et MH33 (bleu/Cy5 (Cyanine5) ; anti-IFB-2/intermédiaire filament). PAR-6::GFP et l’anticorps PAR-3 label la membrane apicale de l’intestin de c. elegans (entre crochets). IFB-2, un nouveau marqueur apical aux stades ultérieurs, est panmembraneously localisé à ce stade précoce. PAR-6::GFP et anti-PAR-3 également étiquettent le pharynx (à gauche) ; la lumière intestinale est indiquée par leur superposition avec IFB-2 (turquoise) et le tube intestinal est décrite par bleu anti IFB-2 (à droite). (B) stade 2 fois. AJM-1::GFP (vert ; component de jonction), anticorps ICB4 (rouge/Alexa, ICB4 détecte un antigène intestinal membraneuses inconnu). AJM-1::GFP étiquettes les jonctions apicales de l’intestin de c. elegans , visible comme modèle d’échelle peri-lumière (elle aussi étiquettes jonctions hypodermiques ; non visibles depuis l’image sont centrée sur l’intestin ; Voir la section 4, imagerie confocale). ICB4 taches toutes les membranes de l’intestin de c. elegans . Flèches pointent vers les membranes basolatérales colorées par anti-ICB4. (C, D) Larves L2. (C) LET-413::GFP (vert), la phalloïdine (Texas-rouge/rouge, un phallotoxin lie à l’actine F) et MH33 (bleu/Cyanine5, anti-IFB-2). Décision no LET-413/Scribble est une composante de la polarité basale complexe et se localise à membranes basolatérales de l’intestin de c. elegans (entre crochets). Phalloïdine et l’IFB-2 anticorps étiquettent le cytosquelette submembraneous apical de l’intestin de c. elegans (violet). Phalloïdine taches également fortement muscles de la paroi du corps, écrasant la coloration intestinale. Encart montre un grossissement supérieur de la zone boxed. (E) larve L3. SLCF-1::GFP (vert ; intégrante membtransporteur de composant/sucre Rochon), ERM-1::mCherry (rouge) et les anticorps MH27 (bleu/Cyanine5, anti-AJM-1). SLCF-1::GFP étiquettes la membrane basolatérale, tandis que les étiquettes de MCE-1::mCherry la membrane apicale de l’intestin de c. elegans (entre crochets) ; AJM-1 étiquette ses jonctions apicales. (F-F''') Larve de la L2. (F, F') Images de couleur unique. SLCF-1::GFP (vert) étiquettes la membrane basolatérale (membranes latérales indiqués par les flèches blanches minces). MH27 (bleu/Cyanine5) étiquettes apicale des jonctions (flèches jaunes courtes). (F"F''') Superposer des images avec et sans l’actine. Encarts montrent un grossissement supérieur des zones en boîte. Remarque la distinction claire d’angle émettent des cellules intestinales par ces marqueurs membranaires différents/jonction qui ressemblent superficiellement en images unicolores (F, F'). Les flèches blanches épaisses en FA'''pointent vers le cytosquelette d’actine apicale/lumière marqué par la phalloïdine (sinon dépassé par l’actine musculaire). Toutes les images sont des projections confocale (z-cheminées de 0,2 µm), acquises par scanner séquentiellement pour éviter cordeau entre les canaux. Barreaux de l’échelle (pour A-E, et F'' ' et tous les EISN) : 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Exemples de C. elegans intestinale morphogenèse de membrane et de la lumière polarisée défauts au grossissement faible à modérée (microscopie de fluorescence de dissection). Toutes les images sont acquises par un microscope à fluorescence dissection équipé d’une fixation de fluorescence stéréo haute puissance sur mesure (Table des matières). Des grossissements différents sont affichés. Tous les phénotypes ont été obtenues par l’ARNi avec différents gènes dans une souche étiqueté avec MCE-1::GFP (localisé à membranes apicales/lumière de canal excréteur et intestinal à embryonnaires et premiers stades larvaires, montrés ici). Les phénotypes de lumen et polarité intestinales sont : embryon de type sauvage (A, B) (A) et de la larve (B) ; (C, D) basolatérale déplacement d’ERM-1::GFP ; les cellules intestinales sont agrandies et apparaissent gonflés dans cet embryon (C, flèches pointent aux cellules intestinales unique), mais sont de taille de type sauvage et l’arrangement dans ces larves (D, flèche pointe vers les membranes latérales entre INT II et III) ; (E) s’est creusé et alambiquée lumen dans trois embryons ; (F) ERM-1::GFP élargir dans la zone de jonction latérale (lumen zigzag) et dans le cytoplasme intestinaux contenant des vacuoles de GFP-négatif (flèches) ; (G) des kystes lumière inbetween intralumenal adhérences (flèches pointe à deux kystes). (H) cytoplasmiques et basolatérale ERM-1::GFP déplacement avec ectopiques lumens (flèches) ; (j’ai) ERM-1::GFP déplacement à GFP-positifs punctums (flèches) dans le cytoplasme. Les canaux excréteurs et les phénotypes de canal excréteur ne sont pas décrits ici (canal s’est avéré l’intestin gauche, à droite dans toutes les images). Barreaux de l’échelle : 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Exemples de C. elegans intestinale polarisé morphogenèse défauts membranaires et lumen à fort grossissement (images confocales). (A, C, E, G, I, K) Embryons. (B, D, F, H, J, L) Larves. Tous les phénotypes ont été obtenues par l’ARNi avec différents gènes dans une souche étiqueté avec MCE-1::GFP (vert dans toutes les images). L’imagerie est axée sur l’intestin. Images d’embryons montrent aussi des canaux excréteurs (à gauche de l’image), y compris des phénotypes de canal (non décrits). (A, B) Embryon de type sauvage (A) et larve (B). (C) basolatérale déplacement d’apicale ERM-1::GFP (stade de virgule ; intercalation tardive). (D) conversion de polarité : basolatérale déplacement apical ERM-1::GFP et accumulation apicale de basolatérale ICB4, révélée par un double marquage. Actine F (marqué par la phalloïdine-TRITC) décrit les animaux par coloration des faisceaux musculaires longitudinales (animal est triple étiqueté). (E) déplacement de basolatérale des ERM-1::GFP en retard 3 voies embryon. L’anticorps apicale de l’IFB-2 (bleu/Cyanine5) indique lumen intact et les filaments intermédiaires peri-lumière. (F) ectopique lumens étiquetés par anti-IFB-2 (bleu/Cyanine5). (G) ERM-1::GFP négatif des vacuoles dans cytoplasme intestinale. (H) ERM-1::GFP positifs vacuoles dans cytoplasme intestinale. (I, J) Absence de lumière dans les embryons et les larves, respectivement. (K) grand intestin. Kystique (L) et l’intestin alambiquée. (A, D, H, I, J, K, L) sont des projections confocale. (B, C, E, F) sont des sections confocale. Luminosité augmentait chez G pour mettre en évidence des vacuoles cytoplasmiques de GFP-négatif. Barreaux de l’échelle : 10 µm (idem pour tous les embryons et les larves, respectivement). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Conversion de polarité intestinale et retour : un exemple pour la quantification des défauts de biogenèse membranaire et de la lumière polarisées. (A, B, C) laissez-767et aps-1Arni deux cause déplacement basolatérale ERM-1::GFP (BL) et formation de lumen ectopique (EL), mais à des stades de développement différents. (A) Quantification par binoculaire : comptage des embryons (gauche) et des larves (àdroite) avec des phénotypes de polarité 2 jours après l’ensemencement vers sur les plaques de l’ARNi. Remarque : tous les animaux mock et let-767(RNAi) ont éclos en ce moment (il n’y a donc aucun des embryons, qui avaient néanmoins tous sauvage polarité ; cassé les colonnes de la ligne). APS-1 Arni induit des défauts de polarité déjà chez les embryons, considérant que la décision no let-767Arni eux induit chez les larves. Le pourcentage plus élevé de lumens ectopiques (vs basolatérale déplacement) chez les embryons RNAi aps-1contre les larves est en raison de l’arrestation d’embryons avec lumens ectopiques. (B) Quantification par microscopie confocale : comptage des lumens ectopiques par animal au début du développement de lumen ectopique chez les larves. décision no LET-767 Arni induit lumens plus ectopiques chez les larves que aps-1Arni (aps-1Arni larves sont « évadés » qui n'ont pas arresm. Ted comme embryons). (C) les images confocales pour les larves de type sauvage et les larves avec MCE-1::GFP basolatérale déplacement (BL) et ectopiques lumens (EL) ; barre d’échelle : 5 µm. inversion de polarité (D, E) chez les animaux d’Arni let-767(comptage d’animaux avec et sans défaut de polarité [BL/EL] par binoculaire). 20 let-767(RNAi) animaux avec des phénotypes lumen ectopique doux ont été transféré d’une plaque d’Arni à une plaque OP50 jour 4 et évaluées après 40 heures. (D) plus de 50 % des larves ont revenue à polarité de type sauvage (MCE-1 à la membrane apicale). (E) 20 % de animaux grandissent au-delà du stade larvaire L1 (let-767(RNAi) des résultats dans l’arrestation de L1). Toutes les données sont affichées sous forme de moyenne +/-SEM, n = 3. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Exemples de marqueurs pour le système de membrane intestinale larves et adultes de c. elegans 1.
Nom de la protéine Localisation subcellulaire Structure/fonction des protéines Disponible dans le commerce c. elegans des anticorps spécifiques (DSHB2) Exemples de souches disponibles à la CCG
OPT-2/PEPT-1 protéine transmembranaire apicale oligopeptide transporteur KWN246 (pha-1(e2123) III, rnyEx133[opt-2(aa1-412) ::
GFP) + pha-1(+)]
)
AQP-4 protéine transmembranaire apicale voie d’eau
ERM-1 brushborder apical éditeur de liens de membrane – cytosquelette ERM1
LOI-5 brushborder apical actine cytoplasmique (3)
IFB-2 brushborder apical composant de filaments intermédiaires MH33
EPS-8 brushborder apical Human-epidermal-growth-factor-receptor-kinase-substrate-8 orthologues
PAR-6 membrane apicale composant complexe apical de polarité
SLCF-1 protéine transmembranaire basolatérale monocarboxylate transporteur
AQP-1 protéine transmembranaire basolatérale voie d’eau
DÉCISION NO LET-413 membrane basolatérale Scribble homologue, adaptateur et déterminant de la polarité LET413
HMP-1 jonction apicale (CCC4) Α-caténine, cadhérine-caténine composant complexe FT1609 (unc-119(ed3) III ; xnIs528 [hmp-1p::hmp-1 ::
GFP + unc-119(+)]
)
HMR-1 jonction apicale (CCC) E-cadhérine, cadhérine-caténine composant complexe HMR1
AJM-1 jonction apicale (DAC5) molécule d’intégrité Junction, composant de DLG-1/AJM-1complex MH27 SU159 (jcEx44 [ajm-1::GFP + rol-6(su1006)])
DLG-1 jonction apicale (DAC) Disques-grand homologue, protéine MAGUK, composant de DLG-1/AJM-1complex DLG1
RAB-11 vésicules endosomale trafic6 RT311 (unc-119 (ed3) III ; pwIs69 [vha6p::gfp::rab-11, Cbunc-119(+)])
RAB-5 vésicules endosomale le trafic RT327 (unc-119 (ed3) III ; pwIs72 [pvha6::gfp::rab-5, Cbunc-119(+)])
RAB-7 vésicules endosomale le trafic RT476 (unc-119 (ed3) III ; pwIs170 [vha6p::gfp::rab-7, Cbunc-119(+)])
RAB-10 vésicules endosomale le trafic RT525 (unc-119 (ed3) III ; pwIs206 [pvha6::gfp::rab-Cbunc-119(+) 10)
MANS Appareil de Golgi Α-mannosidase II RT1315 (unc-119 (ed3) III ; pwIs503 [pvha6::mans::gfp Cbunc-119(+)])
1 Des exemples sont tirés de ressources indiquées dans le tableau 3.
2 Perfectionnement des études hybridome Banque.
3 Anticorps anti actine vertébré ont une réaction croisée.
4 CCC : cadhérine-caténine complexe ; se localise à la partie apicale de la jonction apicale ; correspondant à la jonction adherens (AJ).
5 DAC : DLG-1/AJM-1complex ; se localise à la partie basale de la jonction apicale ; correspondant à la jonction serrée (TJ).
6 Pour des molécules associées aux vésicules supplémentaires exprimées dans l’intestin voir ref (22).
Remarque : pas toutes les molécules ont été testées comme protéines de fusion en vertu de leurs propres promoteurs ou par les anticorps.
Tableau 2 : Exemples de C. elegans intestin des promoteurs et des temps d’expression1.
Promoteurs Stade de l’expression
ELT-2 expression commence au cours de l’étape 2 de cellules E et persiste à l’âge adulte
VHA-6 expression commence dans l’embryon fin et persiste à l’âge adulte
GES-1 expression commence à environ le stade de la cellule 4E et persiste à l’âge adulte
fin-1 expression commence après la 1E étape de la cellule et diminue au cours de l’embryogenèse plus tard
1 Des exemples sont tirés de ressources répertoriées dans le tableau 3.
Tableau 3 : Ressources pour trouver C. elegans intestin spécifique molécules, étiquetage des anticorps et réactifs/foulures.
1. Caenorhabditis Genetics Center (CCG)42 pour des souches et des réactifs disponibles
2. Wormbase43 pour plus d’informations sur l’intestin spécifique des molécules, des souches et des anticorps
3. Informa
tion sur les molécules spécifiques intestin20,44 4. Transgeneome site45 pour des constructions de fusion de GFP translationnelles 5. C. elegans expression modèle46 pour des constructions de fusion de GFP transcriptionnelles 6. national BioResource Project (PRBN) ::C.elegans47 pour plus d’informations sur les promoteurs de l’intestin-spécifique 7. développement Banque d’hybridome Studies (DSHB)48 pour les anticorps de c. elegans 8. pour les anticorps secondaires et colorants voir référence27,28

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Discussion

Ce protocole décrit comment combiner standard perte de fonction génétique/ARNi et imagerie (étiquetage et microscopiques) approches afin de tirer parti de l’épithélium intestinal de c. elegans comme modèle pour le visuel et moléculaire dissection du in vivo la biogenèse membranaire et de la lumière polarisée.

L’étiquetage

Ce protocole met l’accent sur la coloration de l’anticorps. In situ , marquage par des anticorps est une approche très spécifique à l’étiquetage par fusion fluorescent protéines (décrites dans le document d’accompagnement sur la biogenèse membranaire canal excréteur)2. Anticorps ne permettant pas l’imagerie direct, il peut prévoir la confirmation pour la localisation d’une protéine d’intérêt (ni méthode d’étiquetage est sans faute). En outre, questions au sujet de la morphogenèse et/ou la localisation subcellulaire d’une protéine peuvent souvent être évaluées dans animaux fixe. Immunomarquage est utile pour double et étiquetage multiples et il peut être combiné avec le marquage de protéines de fusion fluorescent si ceux-ci peuvent être conservés par les procédures de fixation et perméabilisation requis. Le protocole décrit ici permet généralement cette (Figure 2). In situ , étiquetage des animaux fixe les anticorps ou les taches chimiques peut-être également prévoir avantages superrésolution techniques microscopiques comme STORM (microscopie stochastique reconstruction optique). Immunofluorescence détecte les antigènes endogènes et peut être adapté, par exemple, pour distinguer les modifications protéiques post-traduction spécifiques. Il peut produire des résultats rapides si les anticorps sont disponibles, une fois sur place des techniques de coloration - non pas comme simple chez c. elegans spécimens comme en culture cellulaire - ont été établis.

La génération d’un nouvel anticorps (non décrit ici) est, cependant, beaucoup de temps. Malheureusement, la sélection de disponible dans le commerce c. elegans anticorps primaires reste plutôt faible, et ne sont pas tous en mesure de détecter l’antigène in situ (voir le tableau 1 pour des exemples d’anticorps a démontré à détecter les antigènes intestinaux in situet au tableau 3 pour des ressources supplémentaires). La plupart des anticorps générés contre des antigènes de vertébrés ne seront pas de réaction croisée avec leurs homologues de chez c. elegans . La sélection des anticorps secondaires doit prendre en compte les espèces du premier anticorps (abordé en immunofluorescence générales protocoles27,28). Grandes sélections sont disponibles dans le commerce avec l’amélioration continue des colorants fluorescents (p. ex. Alexa Fluor colorants). Pour optimiser la coloration, colorants peuvent être sélectionnés pour leur capacité à correspondre au microscope utilisé pour l’imagerie, par exemple le laser du microscope confocal, ou, si la microscopie Super-résolution est également prévue, pour leur capacité à « clignoter »37. Anticorps primaires directement étiquetés ou chimique les taches (par exemple fluorescent étiqueté phalloïdine) sont également disponibles et sont particulièrement utiles pour la double coloration.

La difficulté pour in situ les anticorps coloration chez c. elegans est l’imperméabilité de la coquille d’oeuf de l’embryon et de la cuticule larvaire/adulte que requièrent les perturbations chimiques et/ou mécaniques pour permettre l’accès de l’anticorps au tissu. Bien que les protocoles complexes anticorps liquide de coloration ont été développés afin de surmonter ce problème27,28, la plupart comprennent collagénase pour perméabilisation, ce qui a tendance à endommager le tissu cible. En revanche, la méthode de congélation-crack décrite ici est un moyen simple d’ouvrir de ver cuticules ou coquilles de œufs. Il est effectué directement sur le verre glisser où les échantillons sont prélevés (et où le reste de la coloration est également réalisé), et fonctionne particulièrement bien pour les œufs et les larves qui collent mieux à lames en verre (c'est-à-dire les stades examinés principalement dans études de tubulogenèse). Il n’interfère pas avec la préservation des protéines de fusion marqués au fluorophore. La technique nécessite une dextérité manuelle, comme la bonne pression sur la lamelle couvre-objet (avant pichenette) et éviter la pression de cisaillement sont essentiels pour conserver l’échantillon (comme c’est une manipulation douce et pipetage pendant toute la procédure de coloration).

Conditions de fixation peuvent doivent être empiriquement déterminée et ajustée pour la structure/antigène qui est à colorer (il est indiqué à27). Plus doux (p. ex. formaldéhyde) techniques de fixation peuvent mieux préserver antigénicité, même si cela doit être équilibré avec la nécessité de maintenir la morphologie tissulaire, critique pour l’analyse de la morphogénèse. Fixation des conditions aussi aide à préserver des protéines de fusion fluorescent dans des expériences de marquage doubles. De même, la quantité d’agent (par exemple du lait ou sérum albumine bovine/BSA) et détergent dans la solution de lavage de blocage nécessite ajustement empirique pour équilibrer le fond avec une coloration spécifique. Détails sur les aspects généraux des techniques d’immunofluorescence, par exemple la discussion des différentes techniques de coloration, la conception des contrôles appropriés et des conseils pour l’optimisation de ces procédures d’intestins de ver (par exemple réduction intestinale autofluorescence) se trouvent en général et protocoles d’immunofluorescence spécifique c. elegans , telles que citées dans l’ensemble.

Interférence avec la fonction du gène et l’évaluation des phénotypes tubulogenèse

Ce protocole met en évidence les approches Arni spécifiques qui sont utiles lors de l’évaluation des gènes avec des fonctions précoces, indispensables et omniprésentes, dont la perte partielle (et plutôt complète) est plus informative, comme c’est le cas pour la plupart des gènes tubulogenèse (notre génome-large écran sur MCE-1::GFP-intestins étiquetées a suggéré cette ingérence dans ces causes de gènes > 90 % de tous les phénotypes de tubulogenèse instructif dans cette configuration particulière12). Les nombreux avantages que c. elegans offre aux manipulations génétiques (par exemple son temps de génération court) et les différentes approches de perturber la fonction des gènes par l’avant (en commençant par la fonction/phénotype) et marche arrière (à partir de la les approches génétiques gènes) sont discutés dans le général c. elegans littérature31,38. La disponibilité de l’ARNi de Génome-large disponible dans le commerce nourrir aussi les bibliothèques permet d’utiliser cette technique de génétique inverse comme outil de dépistage génétique vers l’avant (voir Table des matières pour les ressources). Les avantages spécifiques de l’ARNi pour l’analyse de tubulogenèse incluent sa capacité : pour générer une gamme des phénotypes équivalents à une mutante série allélique (général fonctionne bien pour les gènes de la morphogenèse de la dose-dépendante) ; pour supprimer la maternelles RNAs (généralement impliqué dans début morphogenèse/tubulogenèse) ; stade-spécifiquement nuire (utile pour évaluer les effets sur la biogenèse membranaire polarisée au cours de la croissance larvaire postmitotiques).

Détails sur les aspects généraux des procédures de l’ARNi sont discutés au sein de refs (26,s = « xref » > 31). Clé pour l’analyse des phénotypes tubulogenèse létale est la possibilité de moduler l’ARNi conditions pour augmenter le spectre des phénotypes. Tubulogenèse instructif phénotypes peuvent être généralement générés dans un fond de type sauvage sans la nécessité d’intestin spécifique Arni souches39. Toutefois, ces souches sont disponibles si cela échoue et permet également de distinguer les cellules autonomes des effets non autonomes. Différentes approches permettant de moduler la force de l’ARNi ont été signalés, par exemple le titrage des concentrations d’IPTG pour l’induction de dsRNA, une approche qui peut produire des résultats plus reproductibles30. Cependant, titrage quantitativement exacte ne peut-être pas nécessaire lorsque visant à générer un spectre des phénotypes différents. Dans l’ensemble, le succès de cette analyse n’est pas tellement tributaire de maximiser l’effet de l’ARNi, car c’est sur la détermination des conditions d’Arni qui génèrent un spectre informatif des phénotypes (qui peut souvent être le résultat de sous-optimal (p. ex. plus doux) Arni conditions).

Pour l’évaluation visuelle des phénotypes tubulogenèse induite par l’ARNi, il est important de déterminer la fenêtre optimale pour évaluation phénotypique. Il est préférable de commencer à évaluer les plaques au début (par exemple, deux jours après la cueillette les animaux à leurs plaques d’Arni dans des conditions normales de RNAi) et à les suivre assez longtemps pour que des séquelles possibles. Un cours de la durée du développement d’un défaut de polarité qui s’aggrave, par exemple, devrait couvrir 3 à 7 jours chez les larves généralement arrêtées. Conditions pour l’analyse de la biogenèse membranaire polarisée dans mitotiques de Division des cellules de l’intestin larvaire peuvent encore être améliorées lorsque vous utilisez des mutants ou RNAi animaux avec une croissance ralentie (comme, par exemple, let-767(RNAi) ou mutant animaux 12, figure 5). Toute évolution temporelle doit être abandonnée si F2 animaux apparaître (s’enlèvent L4s dans les expériences où la plupart mais pas tous les animaux arrêt sous forme de larves). Chaque expérience exige l’évaluation concomitante de contrôles positifs et négatifs appropriés (par exemple des clones bactérien Arni qui induisent un phénotype tubulogenèse défini et vider le vecteur ou brouillés Arni clones, respectivement). Une autre exigence d’évaluation est une couvée de taille suffisante (au moins 50). Si ne pas satisfait, les autres conditions (p. ex. conditionnel) Arni peuvent être essayées. Enfin, certains phénotypes tubulogenèse particulièrement intéressant se produisent à pénétrance faible, donc un nombre suffisant d’animaux doit être évalué.

Microscopie

Grossissement faible à modéré, dissection, microscopie fluorescente et microscopie confocale fort grossissement, les deux procédures d’imagerie standards décrites ici, sont généralement suffisantes pour caractériser les aspects fondamentaux d’un phénotype de tube ou de la lumière dans le C.elegans intestin et peut également servir d’écran visuellement plus grands ensembles d’animaux dans les écrans avant. Disséquer la microscopie de fluorescence permet : l’imagerie in vivo des animaux dans leurs assiettes (Cependant, animaux vivants, transitoirement immobilisés par des anesthésiques, peuvent aussi être récupérées de montures après confocale ou imagerie DIC) ; dépistage des grands ensembles d’animaux ; suivi des événements développementaux (p. ex. le déplacement et le remplacement d’un marqueur polarisé durant l’expansion de la membrane) ; suivi des modèles d’expression spécifiques (quelques modèles et asymétries sont distinguent mieux à un grossissement inférieur) ; sélection et cueillette vers fluorescent pour une analyse plus approfondie (par exemple la microscopie confocale) ou pour l’entretien des transgènes extrachromosomique. Visualisation à fort grossissement par microscopie confocale permet de caractériser le phénotype unicellulaire et niveau subcellulaire. Ce protocole décrit l’imagerie avec un laser scanning microscope confocal qui offre la meilleure confocalité sur alternatives comme un microscope confocal de disque de filature. Un microscope confocal de rotation disque est, cependant, le microscope de choix pour les études dynamiques et Time-lapse puisqu’il induit moins phototoxicité (voir Réfs (34,,35) pour poursuivre la discussion de grossissement faible et élevé microscopie chez c. elegans). Roman, ainsi que des techniques microscopiques classiques offrent des avantages supplémentaires et permettent d’imagerie à résolution plus élevée dans l’échelle nanométrique (microscopie électronique et Super-résolutionpar exemple transmission ; il est indiqué à37, 40).

Lorsque l’imagerie c. elegans intestins sous un microscope confocal, la fixation et l’immobilisation est critique. Parmi les différents produits chimiques pour l’immobilisation, azoture de sodium - bien que toxique - fonctionne plus fiable si l’analyse est effectuée immédiatement. Levamisole, bien que non toxique, produit hypercontraction nuisant parfois à l’évaluation des phénotypes de la morphogenèse. Certains anesthésiques peuvent interférer avec les protéines fluorescentes associées aux membranes et peuvent produire des artefacts qui peuvent ressembler à des défauts de polarité. C. elegans est un spécimen épais et analyse 3D (sectionnement) est donc essentiel de profiter de la force spécifique de l’épithélium intestinal tubulaire qui permet l’excellente visualisation de jonctions apicales et la membrane latérale (pas facilement accessible dans l’épithélium plat). Confocal paramètres doivent être adaptées pour chaque diapositive et l’objectif d’obtenir des images de bonne qualité, y compris les paramètres tels que le bracketing, en moyenne, puissance du laser, gain, sténopé et luminosité. Un problème particulier de l’imagerie intestinale est le contenu de cet orgue de granules auto-fluorescente vert/jaune (lysosome associés (BEI) d’organites) qui peuvent gêner l’interprétation des résultats, en particulier lors de l’évaluation de déplacement de GFP-étiqueté endo - et -membrane plasmique composants associés. Ce problème est largement reconnu dans le domaine et peut être combattu par des approches différentes (selon le microscope), y compris DAPI exclusion, empreintes spectrales et scanner empiriques paramètres13,41.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Nous remercions Mario de Bono (laboratoire de biologie moléculaire de MRC, Cambridge, UK), Kenneth J. Kemphues (Cornell University, Ithaca, États-Unis), Michel Labouesse (Institut de Biologie Paris Seine, Université Pierre et Marie Curie, Paris, France), Grégoire Michaux (Université deRennes 1, Rennes, France) et la CGC, financé par le NIH Bureau des programmes d’Infrastructure de recherche (P40 OD010440), pour les souches et les anticorps. Ce travail a été soutenu par subventions GM078653 NIH, HGM est 224570 et SAA 223809 à V.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody staining
poly-L-lysine Sigma P5899
Methanol Fisher Scientific A452-4
Acetone Fisher Scientific A949SK-4
Tween Fisher Scientific 50-213-612
Permount Fisher Scientific SP15-100
Powdered milk Sigma MT409-1BTL
Primary antibodies
MH27 (mouse) Concentration: 1:20 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
MH33 (mouse) Concentration: 1:10 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
anti-ICB4 (rabbit) Concentration: 1:5 Resources: A gift from Mario de Bono (Medical Research Council, England)
anti-PAR-3 (rabbit) Concentration: 1:50 Resources: A gift from Kenneth J. Kemphues (Cornell University)
Secondary antibodies
Alexa Floor 568 (anti-rabbit) ABCam AB175471 Concentration: 1:200
Cy5 (anti-mouse) Life technologies A10524 Concentration: 1:200
TRITC (anti-rabbit) Invitrogen T2769 Concentration: 1:200
FITC (anti-mouse) Sigma F9006 Concentration: 1:100
Labeled chemicals
Texas Red-Phalloidin Concentration: 1:100 Resources: Molecular Probes-T7471
Materials
Vacuum Grease Silicone Beckman 335148
Microscope slides Fisher Scientific 4448
Microscope coverslips (22x22-1) Fisher Scientific 12-542-B
C. elegans related see reference29 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates see reference29 for protocols.
Tryptone Acros Organics 611845000
Yeast Extract BD Biosciences 212750
NaCl Sigma S7653
Bacto Agar BD Biosciences 214040
Ampicillin Sigma A0116
Tetracycline Fisher Scientific BP912
M9 Medium see reference29 for protocols.
NaCl Sigma S7653
KH2PO4 Sigma P0662
Na2HPO4 Sigma S7907
MgSO4 Sigma M2773
NGM plates see reference29 for protocols.
NaCl Sigma S7653
Peptone BD Biosciences 211677
Tryptone Acros Organics 611845000
Bacto Agar BD Biosciences 214040
MgSO4 Sigma M2773
CaCl2 Sigma C3881
Cholesterol Sigma C8667
K2HPO4 Sigma P3786
KH2PO4 Sigma P0662
RNAi plates see reference30 for protocols.
NaCl Sigma S7653
Peptone BD Biosciences 211677
Tryptone Acros Organics 611845000
Bacto Agar BD Biosciences 214040
MgSO4 Sigma M2773
CaCl2 Sigma C3881
Cholesterol Sigma C8667
K2HPO4 Sigma P3786
KH2PO4 Sigma P0662
IPTG US Biological I8500
Carbenicillin Fisher Scientific BP2648
NaOH Fisher Scientific SS266-1
Sodium hypochlorite Fisher Scientific 50371500
Bacteria
OP50 bacteria CGC
HT115 bacteria CGC
Genome-wide RNAi libraries Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref 30,49,50) Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref51) Source BioScience
Imaging related
Sodium azide Fisher Scientific BP9221-500
Equipment
dissecting microscope Nikon SMZ-U
dissecting microscope equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions) Olympus SZX12
Laser-scanning confocal microscope Leica Microsystem TCS SL
laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope Nikon C2

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