En standardiseret metode til måling af det indre lungeoverfladeområde via muspneumonektomi og proteseimplantation

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Det indre lungeoverfladeareal (ISA) er et kritisk kriterium til vurdering af lungemorfologi og fysiologi i lungesygdomme og skadefremkaldt alveolær regenerering. Her beskrives en standardiseret metode, der kan minimere måleforspændingen for ISA i både lungepneumonektomi og protesimplantationsmusemodeller.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Liu, Z., Fu, S., Tang, N. A Standardized Method for Measuring Internal Lung Surface Area via Mouse Pneumonectomy and Prosthesis Implantation. J. Vis. Exp. (125), e56114, doi:10.3791/56114 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Lungens grundlæggende funktion er udvekslingen af ​​ilt og kuldioxid mellem blodkar og atmosfære. Lungesygdomme såsom bronkopulmonær dysplasi (BPD), kronisk obstruktiv lungesygdom (COPD) og akut respiratoriske infektioner resulterer i nedsat ISA 2 . Forskere, der studerer lungesygdomme, har udviklet flere kvantitative metoder til evaluering af morfologiske ændringer i lungerne, herunder MLI, ILV, antal gasudvekslingsenheder, ISA og lungevævsoverensstemmelse 2 , 3 . Banebrydende undersøgelser af Weibel et al. 4 og Duguid et al. 5 fastslog sammen, at ISA kan anvendes som en direkte måling af lungegasudvekslingskapacitet i menneskelige lunger og kan anvendes som et kriterium for at bestemme sværhedsgraden af ​​emfysem. En række undersøgelser udgivet i de sidste fem år har brugt lungemorfologiske parametre ( f.eks. 6 og under genopretning fra skade PNX 1 , 7 . ISA beregnes ved anvendelse af ligning 1 8 , 9 :

ligning

, Hvor ILV er det interne lungemængde, og MLI er en mellemliggende parameter, der repræsenterer den lunge perifere luftrumsstørrelse 10 .

PNX, den kirurgiske fjernelse af en eller flere lungelaber, er blevet rapporteret meget for at inducere alveolær regenerering hos mange arter, herunder mennesker 11 , mus 1 , hunde 12 , rotter 13 og kaniner 14 , 15 . En studY af mus lunger på fjorten dage efter PNX viste, at både ekspansion af eksisterende alveoler og de novo dannelsen af ​​alveoler bidrager til genoprettelsen af ​​ISA, ILV og antallet af alveoler i de resterende lungevæv 1 . Vi og andre har vist, at indsættelse af materialer som svamp, voks eller en brugerdefineret protese i det tomme thoracic cavity efter PNX ( dvs. proteseimplantation) svækker alveolær regenerering. Det er nu klart fastslået, at mekanisk kraft fungerer som en af ​​de vigtigste faktorer for initiering af alveolær regenerering 1 , 16 , 17 . Sådanne undersøgelser har fremhævet effektiviteten af ​​at anvende ISA-værdier fra PNX-behandlede og protese-implanterede lunger som et kriterium for kvantitativt at evaluere alveolær regenerering.

Observer-bias er kendt for at påvirke målt va væsentligtLues for lungemorfologiske parametre ( fx MIL og ILV). Standardiserede protokoller kan bruges til at undgå denne bias ved bestemmelse af både ILV og MLI, som er de to parametre, der anvendes til beregning af ISA. Her giver vi meget detaljerede, standardiserede protokoller til måling af disse lungeparametre. Det er vigtigt, at evnen til nøjagtigt at kvantificere ISA løfter at forbedre pålideligheden og reproducerbarheden af ​​undersøgelser af lungefunktion i skadefremkaldte alveolære regenereringsmodeller og bør lette mekaniske opdagelser i flere lungesygdomme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer anvendt i denne protokol blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne i retningslinjerne for pleje og brug af laboratoriedyr fra National Institute of Biological Sciences, Beijing. 8 ugers gamle CD-1 hanmus blev anbragt i en specifik patogenfri (SPF) facilitet, indtil forsøgene blev udført. Surgerier blev udført ved hjælp af fuldstændigt bedøvede mus ( dvs. uden tåbspidsreaktioner). Efter operationen blev musene holdt i et varmt, fugtigt rum med tilstrækkelig mad og ferskvand. Mus blev ofret ved anvendelse af en overdosis af anæstetika leveret ved intraperitoneal injektion.

1. Mus PNX-kirurgi

  1. Fully bedøve musene med natriumphenobarbital (120 mg / kg legemsvægt) og buprenorphin (0,1 mg / kg legemsvægt) via intraperitoneal (IP) injektion. Udfør kirurgi, når mus ikke reagerer på tåen.
  2. Fjern håret på venstre thorax af musene med kemisk depIlatende behandling (~ 3 x 3 cm 2 område).
  3. Sikre hver mus på en intubationsplatform med den ventrale side mod operatøren ( figur 1A ).
  4. Træk musen ud og lyser vokalbåndene med et lille dyr laryngoskop, der indeholder et indlæg til styring af katetre 18 ( Figur 1A ).
  5. Distiller stemmekablerne ved at observere stemplets bevægelser under vejrtrækning. Indsæt forsigtigt en 20 G intravenøs intubationskanyl i luftrøret i en forreste vinkel 19 .
  6. Placer mus i en højre lateral liggende stilling og forbind kanylen til en mekanisk ventilator ( f.eks. Trykstyret, se Materialetabellen ). Kontrollér indsættelsen af ​​kanylen i luftrøret ved at observere muskelbrystets vejrtrækninger ( figur 1B ).
  7. Indstil det inspiratoriske tryk of ventilatoren til 12 cm H2O og indstille respirationsfrekvens til 120 indåndinger pr minut (figur 1B).
  8. Dekontaminere huden i det kirurgiske område med betadin og 70% ethanol.
  9. Lav en 2 - 3 cm posterolateral thoracotomi snit i rummet på det femte intercostalrum, skåret gennem hud og muskler med Noyes Spring Scissors (skærekant: 14 mm, spidsdiameter: 0,275 mm) ( Figur 2B , C ). Kirurgiske instrumenter anvendt til thoracotomi-proceduren steriliseres før brug.
  10. Lav et 1,5 cm snit på det femte intercostalrum for at afsløre venstre lunge ( Figur 2D , E ). Under operationen skal du bruge en højtemperatur-cauterizer for at stoppe blødningen.
  11. Løft en tredjedel af venstre lungelag fra brystet med stumpe spidspinde ( figur 2F ), og brug derefter en bomuldspinne til at trække hele venstrefløjenLunge ( figur 2G ).
  12. Identificer lungearterien og bronkierne i venstre lungelabbe ( figur 2G ).
  13. Stramt bronkierne og karrene i hilumet med en silk kirurgisk sutur og skær den venstre lungelap på 3 - 4 mm fra ligationen ( Figur 2H , I ).
    BEMÆRK: Pas på ikke at skære suturknobene på venstre hilum, hvilket kan forårsage pneumothorax ( dvs. luft eller gas i thoraxens hulrum) .
  14. Luk brystvæggen med 1 sutur, og sy derefter muskellaget og hudlaget sekventielt ved hjælp af 5-6 afbrudte suturer. Forlad et mellemrum på 3 - 4 mm mellem hver sutur ( figur 2M , 2N ).
    BEMÆRK: Hold kirurgisk suturnål væk fra hjertet; Utilsigtet hjertepunktur vil resultere i øjeblikkelig død.
  15. Desinficer det kirurgiske område med povidon-iod.
  16. afteR kirurgisk operation, læg musen på en 38 ° C termisk pude og forbinde musen til ventilatoren, indtil spontane vejrtrækninger begynder ( figur 2O ).

2. Protheseimplantation

  1. Udfør trin 1.1 - 1.13 i PNX-proceduren (det vil sige indtil det tidspunkt, hvor musens venstre lungelag er fjernet).
  2. Klem midten af ​​silikone protesen (kunde fremstillet, 12 mm i længden, 3 mm i tykkelse, 7 mm i bredden, 0,2 g, ellipsoidformet) ved hjælp af stump tang ( figur 2J ). Steriliser silikone protese inden indsættelse.
  3. Hold ribben med tang med den ene hånd for at eksponere thoracic hulrummet, og indsæt protesen i det venstre tomme thoracic hule med en anden hånd.
    BEMÆRK: Indføringsvinklen er ca. 45 grader mellem protesens frontalplan og thoraxfladen ( Figur 2K ,L). Vær meget forsigtig, når du indsætter protesen. Overdreven kraft vil resultere i pleural ruptur.
  4. Juster protesens orientering med blanke tang for at sikre, at protesen indtager det venstre tomme thoracic hulrum.
  5. Udfør trin 1.14 - 1.16 af musen PNX procedure.

3. Måling af ILV

  1. Forbered en brugerdefineret enhed ("inflationsrør"), der består af et stemplet fjernet fra en engangs serologisk pipette (10 ml), et 40 cm langt fleksibelt rør med en nåleadapter, en flowstyringsventil og en 18 G nål. Efter montering skal du sikre pipetten på et bord med tape ( figur 3A ). Afstanden mellem pipettens top og prøvebænken skal være mindst 30 cm.
  2. Forbered frisk 4% paraformaldehyd (PFA) fixeringsopløsning ved at opløse 20 g PFA i 500 ml forvarmet 1x phosphatpufret saltvand (PBS) i et 55 ° C vandbad, der ryster manuelt påCe hver 10 min indtil opløsningen er klar. Efter afkøling til stuetemperatur filtreres opløsningen med et 0,45 μm filter.
    FORSIGTIG: Brug passende personlige værnemidler (PPE) ved håndtering af PFA.
  3. Offer mus med en overdosis injektion af anæstetika (0,8% phenobarbital natrium, 1000 U / ml heparin).
  4. Sikre hver mus på en polystyren dissektionsplade og sprøjt den med 70% alkohol.
  5. Sørg for at åbne musen brystet og skære brystbenet ud med saks for at grundigt udsætte lungerne.
  6. Fjern alt for stort væv ved hjælp af en saks for at udsætte luftrøret. Sørg for at adskille luftrøret fra spiserøret.
  7. Skær abdominal aorta og indsæt en 25 gauge nål i højre hjertekammer; Tilslut nålen til en 20 ml sprøjte inden denne indsættelse. Tryk langsomt 1x PBS i hjertet for at fjerne blodlegemer indtil lungerne bliver hvide. Typisk kræves 5 - 10 ml PBS for at rydde lunge blodkarrene.
  8. Fyld thEt specialkonstrueret inflationsrør med 4% frisk PFA og fjern alle boblerne fra inflationsrøret.
  9. Indsæt 18-gauge nålen i inflationsrøret i luftrøret og klip luftrøret med beholderklip for at undgå væskelækage.
  10. Puste lungerne med 4% PFA ved et konstant transpulmonært tryk på 25 cm / H2O 2, 20. Inkuber lungerne ved stuetemperatur i 2 timer for at opnå fuldt udvidede lunger. Dette "pre-fix" -trin er afgørende for at bevare lungemorfologi.
    1. Ved at overvåge inflationsrøret registrerer du værdien af ​​det oprindelige 4% PFA-volumen og registrerer det endelige volumen. Det interne lungevolumen er det oprindelige 4% PFA-volumen minus det endelige 4% PFA-volumen.
  11. Ligér luftrøret og brug saks, dissekér forsigtigt lungerne (hold lungerne intakte) fra omgivende bindevæv. Vær meget forsigtig for at undgå at skade lungerne.
  12. INCUBede lungerne i et 50 ml konisk rør fyldt med 4% PFA i 12 timer ved 4 ° C med forsigtig omrystning på en ryster (50 rpm). Fortsæt med behandling af væv og farvning (se afsnit 4).

4. Tissue Embedding, Sectioning og Hematoxylin & Eosin (H & E) Farvning

  1. Efter fixering skal du bruge Noyes Spring Scissors til at trimme hjertet og for meget bindevæv ud af lungerne. Forsigtigt adskille de enkelte lungelaber ved at skære ned bronchusen, som forbinder lungelabberne til luftrøret.
  2. Vask lungen lobes 3 - 4 gange i 50 ml 1 x PBS (30 min / vask) på en orbital shaker (50 rpm).
  3. Efter den endelige vask beskytter du lungelabberne ved at nedsænke dem i en 30% saccharoseopløsning (i 1x PBS) ved 4 ° C, indtil vævet synker til bunden af ​​de 50 ml koniske rør (ca. 12 timer).
  4. Før embedding og cryosectionering af vævene, fjern lungelabeprøverne fra rørene med pincet, bevar adgangenSiriske lobes til den histologiske analyse, dab den resterende saccharoseopløsning ud af overfladen af ​​de ekstraudstyrede løvprøver og dernæst forsigtigt prøven i en petriskål, der indeholder en optimal skæringstemperatur (OCT) forbindelse i ca. 30 minutter.
  5. Frys det OCT-embedded tilbehør lobe prøver i flydende nitrogen med cryomolds. Placer lobens største overfladeareal parallelt med bunden af ​​formen.
  6. Forbered i alt tre 10 μm tykke sektioner for hver prøve under kryosektion for histologisk analyse. Kassér de første 1 mm væv, saml en 10 μm tykt sektion, kassér 0,5 mm væv, saml en anden sektion, kassér 0,5 mm væv og saml den tredje (endelige) sektion.
  7. Lufttør sektionerne i 1 time, inden de udfører H & E-farvning.
  8. Udfør H & E-farvning
    1. Vask afsnittene i 3 - 4 ændringer i ledningsvand og pletter derefter sektionerne i frisk hæmatoxylin i 2 minutter; Skyl sektionen under rindende vand fra vandet; Nedsænk sektionen to gange i en 1% HCI-70% ethanolopløsning for at fjerne overskydende hæmatoxylin.
    2. Sæt sektionen i frisk eosin i 3 minutter; Dehydrere sektionerne med to på hinanden følgende 30 s vaske i 95% ethanol og to 30 s vasker med 100% ethanol; Ryd sektionerne i xylen i 30 s, gentag clearingstrinnet en gang i frisk xylen; Monter gliderne med monteringsmedium ved hjælp af glasdæksler.

5. Kvantificering af MLI

  1. Få digitale billeder af H & E-farvet tilbehørs lobe sektioner (20X forstørrelse) ved hjælp af et lysfeltmikroskop.
  2. For at kvantificere MLI skal du vælge i alt 15 ikke-overlappende visninger (1.000 μm x 1.000 μm) tilfældigt fra de egnede områder (uden arterier og vener, større luftveje og alveolære kanaler) på 3 sektioner.
  3. Anbring et gitter med 10 jævnt fordelte lodrette linjer og 10 lige fordelte vandrette linjer med defineret lenGth (1000 μm) på de valgte synsfelter ved hjælp af et linjalværktøj; Hver linje er således adskilt 100 μm fra hinanden ( figur 4B ).
  4. Definer værdien af ​​en opfangning som den lineære længde mellem to tilstødende alveolære epiteler. Mål værdierne for alle aflytninger langs hver 1000 μm længde linje.
  5. For hvert gitter kvantificerer værdierne for alle aflytninger blandt de 10 vandrette 1,000 μm længde linjer og de 10 lodrette 1,000 μm længde linjer.
    BEMÆRK: MLI er gennemsnitsværdien af ​​interceptlængderne fra i alt 15 grids analyseret blandt de 3 sektioner, der er forberedt til hver af de tilbehørslober.

6. Beregning af ISA

  1. Beregn ISA'en ved hjælp af ligning 1 (se introduktionen ). Se afsnit 3 til måling af ILV og henvis til afsnit 5 til kvantificering af MLI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi gennemførte her et eksperiment med en PNX-behandlet gruppe og en proteseimplantation (Prothese-implanteret) gruppe. Disse grupperinger er de samme som grupperinger anvendt i en tidligere offentliggjort undersøgelse fra vores forskningsgruppe 14 .

PNX- og proteseimplantationsprocedurerne er vist i figur 2 . 8 uger gamle CD-1 hanmus anvendes til operationerne og til kvantificering. I den PNX-behandlede gruppe og den protese-implanterede gruppe blev de venstre lungelobber begge resekteret ( figur 2A - 2I ). I den proteseplanterede gruppe blev en protese, der efterligner størrelsen og formen af ​​venstre lungelag, indsat i brystet, efter at den venstre lungelap var fjernet ( figur 2J - 2L ).

14 dage efter operationen blev der brugt et brugerdefineret inflationsrør til at bestemme ILV for de resterende højre lunger ( figur 3A ). Den gennemsnitlige ILV for den resterende højre Lungerne af de 5 PNX-behandlede mus var ca. 1,4 ml, signifikant højere end 1,05 ml ILV-værdierne af de højre lunger af de 5 Prothese-implanterede mus ( figur 3B , tabel 1 ).

Til MLI-måling blev i alt 15 visninger analyseret blandt de 3 sektioner, der var udarbejdet fra hver mus. Figur 4A viser et flettet billede fra en tilbehørsløbsafsnit og den morfologiske standard for et valgt område ( fx visning 1 - 3) eller et ikke-valgt område ( fx visning 4-5) anvendt til kvantificering af MLI. Her ses eksempel 3 fra en tilbehør lungelabsektion af den PNX-behandlede gruppe som et eksempel påMåling af MLI ( figur 4B ). Et forstørret billede af billede 3 vises også til illustration ( figur 5A ). Linje 3 er præsenteret som et eksempel: længden af ​​et afskåret alveolært luftrum angivet ved de dobbelthovedede pilelinier. Vores analyse viste, at MLI-værdierne i de resterende højre lunger af de PNX-behandlede mus var signifikant større end de af de resterende højre lunger af de protese-implanterede mus ( figur 5B , tabel 1 ). Alle data præsenteres som middelværdien ± SEM ( Figur 5B ).

ISA blev beregnet under anvendelse af ligning 1 . Tabel 1 viser ILV-værdierne, MLI-værdierne og ISA af alle lunger. ISA'en af ​​de protes-implanterede mus var signifikant mindre end for de PNX-behandlede mus, hvilket demonstrerede, at insertionenN af en proteseforstyrret PNX-induceret regenerering.

figur 1
Figur 1: Mus Endotracheal Intubation og Mekanisk Ventilation. ( A ) Endotracheal intubation med en 20 G intravenøs intubationskanyl via laryngoskopi. ( B ) Forbind den fuldt bedøvede mus til en trykstyret mekanisk ventilator før operationen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2: Muspneumonektomi (PNX) og proteseimplantation. ( A - C ) Skær huden og muskellaget; Stop bLeeding med en høj temperatur cauterizer under operationen. ( D - E ) Lav et 1,5 cm snit på det femte intercostalrum. ( F - H ) Træk venstre lungelap med stumpe tang og identificer lungearterien og bronchi, ligat på hilum. Arrowheads repræsenterer lungearterien og bronchi i venstre lungelabbe. ( I ) Den venstre lungelap blev resekteret ved 3 - 4 mm fra ligationen. ( J - L ) Indsæt en protese i venstre thoracic hulrum. ( M, N ) Sutur brystet, muskellaget og hudlaget. ( O ) Overvåg musene, indtil spontane vejrtrækninger begynder. Klik her for at se en større version af denne figur.


Figur 3: Måling af de interne lungemængder (ILV'er) af de resterende højre lunger. ( A ) En brugerdefineret enhed ("inflationsrør") til måling af de interne lungemængder. ( B ) ILV'erne (middel ± SEM) af de resterende højre lunger i den PNX-behandlede gruppe og protese-implanterede gruppe blev målt efter 14 dage efter PNX. **, p <0,01, Studentens t- test. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4
Figur 4: Kvantificering af den gennemsnitlige lineære intercept (MLI) af tilbehørsklubber i de resterende højre lunger. ( A ) En fusioneret imAlderen af ​​en tilbehørsløbeafsnit vises. Eksempler på udvalgte områder ( fx visning 1 - 3) og ikke-valgte områder ( fx visning 4-5) anvendt til MLI-kvantificering. ( B ) 10 ligestillede lodrette linjer og 10 jævnt fordelte vandrette linjer med defineret længde (1000 μm) blev anbragt på det valgte område. Skalbjælke = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5
Figur 5: Kvantificering af MLI i PNX-behandlede lunger og protesimplanterede lunger. ( A ) Et forstørret billede af billede 3 i figur 4B er vist. Rødfarvede linjer med dobbelte pilehoveder repræsenterer længden af ​​en lineær aflytning. ( B ) MLI værdierne (middel ± SEM.) af accessoriske lobes af PNX-behandlede mus og protese-implanterede mus blev målt efter 14 dage efter PNX. *, P <0,05, Studentens t- test. Skalestang: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

14 dage efter operationen Indre lungevolumen (ml) Gennemsnitlig lineær aflytning (mm) indre lunge overfladeareal = 4ILV / MLI (cm2)
PNX-behandlede 1.5 57,8 1038,06
1,35 49,6 1088,71
1,42 48,5 1171,13
1.4 51,5 1087,38
1.4 54,6 1025,64
Protesen implanteret 1.1 49,6 887,10
1 50,5 792,08
1.1 47,3 930,23
1,15 44,8 1026,79
0,86 46,3 742,98

Tabel 1: Beregning af ISA-værdierne af PNX-behandlede og protese-implanterede mus. Værdierne for ILV, MLI og ISA af tilbehør lober ved 14 dage efter PNX.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol giver vi detaljerede beskrivelser af måling af pulmonale parametre efter musen venstre lunge PNX og protese implantation. ISA anses nu for at være en vigtig metrisk til vurdering af åndedrætsfunktionen i mange lungesygdomme og ved skadefremkaldt alveolær regenerering. Selv om det lungeforskningsmiljø er enig om brugen af ​​ISA som en nyttig metrisk, har der indtil videre været ringe overvejelse om standardiseringen af ​​måling af ILV og MLI, de to parametre, der bruges til at beregne ISA. Det er klart, som med enhver måling, at det er vigtigt at forsøge at opnå upartiske data. Kernens mål for den nuværende forskningsindsats er at etablere en standardprotokol til brug for det murine lungeforskningsmiljø.

Vi forsøgte at reducere kilder til måleforstyrrelser på en række måder, da vi udviklede denne protokol. Vi fandt ud af, at variation i ILV målinger kunne være rødForhindret ved at forhindre væskelækage ved at sikre, at nålens størrelse indsat i luftrøret er dimensionelt matchet (vi fandt, at 18 gauge nåle tæt matchede mus tracheae). Vi fandt også, at musens brystvæg skal fjernes grundigt før PFA-inflationen, da dette minimerer den potentielle påvirkning af brystvæggen på ILV-målingerne. MLI værdier afhænger i vid udstrækning af alveolær morfologi. Ud over vigtigheden af ​​at bruge alders-matchede og sex-matchede mus er den korrekte opretholdelse af alveolær morfologi under lungefiksationsprocedurerne derfor kritisk vigtig. Vi her anvendt en bredt vedtaget fiksering metode: vi oppustede lungerne ved et transpulmonalt tryk på 25 cm H2O med frisk fremstillet 4% PFA til fuldt ud at spile lungevævet. I vores erfaring kan lavere afvigende tryk føre til vævskontraktion, unormal alveolær morfologi og resulterer i sidste ende i lavere MLI-værdier.

Observationer iVores tidligere undersøgelser har indikeret, at den resterende lunges tilbehørslåge udviser maksimal volumetrisk ekspansion i forhold til de tre andre lobes i højre lunge efter PNX-regenerering; Tilbehørsloben af ​​den resterende lunge udviser også maksimale stigninger i værdien af ​​morfologiske parametre ( f.eks. MLI) 21 , 22 , 23 , 24 . Vi analyserede derfor kun sektioner fra tilbehørslobber for at undgå variation fra forskellige lungelabber. For at bidrage til at reducere variationen mellem de forskellige sektioner, der blev brugt til kvantificering af MLI, kontrollerede vi lobens orientering under indlejring: vi lagde den største overflade af loben parallelt med bunden af ​​kryomolden. Vi kontrollerede også omhyggeligt tykkelsen af ​​prøve skiver, sekvensen af ​​sektionsprøveudtagning og skærepositionen under snitning. Ud over at prøve behandling, en anden importanT aspekt af standardisering er, at alle arterier og vener, pleura, større luftveje og alveolære kanaler skal udelukkes fra de vævsområder, der vurderes under MLI-kvantificering. Arterier, vener og alveolære kanaler er meget større end alveoler (4 - 10 gange), så det er vigtigt at udelukke disse store strukturer for at opnå pålidelige afmålingsmålinger. For hver gruppe er 5 mus tilstrækkelige til kvantificering. For hver mus blev i alt 15 ikke-overlappende visninger (1.000 μm x 1.000 μm) tilfældigt udvalgt fra de egnede områder (uden arterier og vener, større luftveje og alveolære kanaler) af de 3 sektioner af tilbehørsløben. Prøveindlejringsmetoden og MLI-måling kan også anvendes på paraffinbehandlede lungevæv.

Mens andre har defineret MLI som den totale linjelængde divideret med antallet af aflytninger med krydsede alveolære vægge 25 , anvendte vi her et lineært afsnit som den lineære længdeMellem to tilstødende alveolære epithelialvægge i MLI-beregninger, idet man undlader tykkelsen af ​​mesenchym fra MLI-dataene. Derfor udregnede vi ISA ved hjælp af ILV men ikke den totale lungevolumen.

For PNX- og proteseimplantationsprocedurerne var overlevelseshastigheden for mus under PNX fra 85% til 90%. Overlevelseshastigheden for mus under proteseimplantation var ca. ~ 80%. Under alle operationer skal der tages flere skridt for at forbedre musens overlevelse. 1) Korrekt indsættelse af kateteret i luftrøret er en forudsætning for en vellykket PNX-operation. Under vejledning af et laryngoskop kan musens luftrør let observeres for at lette sikker og effektiv endotracheal intubation. 2) Punkt ikke lungerne eller hjerterne under proceduren. Sørg for, at thoraxen i det femte venstre interkostale rum er åbent åbent, og at hilum af venstre lobe er tydeligt identificeret forud for lobektomi. Ved udførelse af venstre lungelagreAfsnit, sørg for, at venstre lob er intakt ved brug af blunt tang for at undgå lungeblødning og / eller lobarbrud. Under sårlukning skal du holde spidsen af ​​den kirurgiske nål væk fra hjertet og lungerne. 3) Vær forsigtig, når protesen indsættes i det tomme thoraxhulrum, da overdreven kraft kan forårsage brud i pleura. 4) Mus bør placeres på en 38 ° C termisk pude og overvåges, indtil deres sanser genvinder, da postoperativ hypotermi er kendt for at øge mus-morbiditet.

Efter fjernelse af venstre lungelag blev både pulmonale respiratoriske enheder og det indre lunggasudvekslingsområde signifikant reduceret. 14 dage efter operationen var ILV, MLI og ISA i det resterende lungevæv væsentligt større i den PNX-behandlede gruppe af mus end i den protese-implanterede gruppe, hvilket stærkt antyder, at indsættelsen af ​​en proteseblokeret PNX-induceret alveolar regenerering. Således både PNX og protese-implantation mus-tilstandKan bruges som kraftige værktøjer til undersøgelse af de cellulære og molekylære hændelser, der opstår under mekanisk kraft induceret re-alveolarisering. Endvidere var ISA-værdierne for Yap AT2-null-lunger signifikant mindre end de af kontrollungerne efter post-PNX-dag 14 1 , hvilket indikerer, at vores protokol også er egnet til påvisning af svækket regenerering af genetiske mutantmus. De strenge og standardiserede kvantitative metoder, der præsenteres i dette studie, kan anvendes til måling af lungeparametre og ISA i udviklingsstudier og med genetisk modificerede dyremodeller af flere sygdomme, herunder emfysem i kronisk obstruktiv lungesygdom, alveolær regenerering efter lungeskader og lungevækst defekter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende National Institute of Biological Sciences, Beijing for at få hjælp. Dette arbejde blev støttet af Beijing Municipal Natural Science Foundation (nr. Z17110200040000).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Low cost cautery kit Fine Science Tools 18010-00
Noyes scissors Fine Science Tools 15012-12
Standard pattern forceps Fine Science Tools 11000-12
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools 12060-01
Vessel clips Fine Science Tools 18374-44
I. V. Cannula-20 gauge Jinhuan Medical Product Co., LTD. 29P0601
Surgical suture Jinhuan Medical Product Co., LTD. F602
Mouse intubation platform Penn-Century, Inc Model MIP
Small Animal Laryngoscope Penn-Century, Inc Model LS-2-M
TOPO Small Animal Ventilator Kent Scientific RSP1006-05L
Thermal pad Stuart equipment SBH130D
Pentobarbital sodium salt Sigma P3761
Heparin sodium salt Sigma H3393
Hematoxylin Solution Sigma GHS132
Eosin Y solution, alcoholic Sigma HT110116
10 mL Pipette Thermo Scientific 170356
Paraformaldehyde Sigma P6148
O.C.T Compound Tissue-Tek 4583
cryosection machine Leica CM1950
Disposable Base Molds Fisher HealthCare 22-363-553
18 gauge needle Becton Dickinson 305199
Povidone iodine Fisher Scientific 19-027132
70% ethanol Fisher Scientific BP82011
Infusion sets for single use Weigao SFDA 2012 3661704
Phosphate buffered saline Gibco 10010023
Tapes 3M Scotch 8915
Cotton pad Vinda Dr.P
Silicone prosthesis Custom made
Brightfield microscope Olympus VS120
Ruler tool Adobe Photoshop

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, Z., et al. MAPK-Mediated YAP Activation Controls Mechanical-Tension-Induced Pulmonary Alveolar Regeneration. Cell Rep. 16, (7), 1810-1819 (2016).
  2. Thurlbeck, W. M. Internal surface area and other measurements in emphysema. Thorax. 22, (6), 483-496 (1967).
  3. Knudsen, L., Weibel, E. R., Gundersen, H. J. G., Weinstein, F. V., Ochs, M. Assessment of air space size characteristics by intercept (chord) measurement: an accurate and efficient stereological approach. J Appl Physiol. 108, (2), 412-421 (2010).
  4. Weibel, E. R. Morphometry of the Human Lung. Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1963).
  5. Duguid, J. B., Young, A., Cauna, D., Lambert, M. W. The internal surface area of the lung in emphysema. J Pathol Bacteriol. 88, 405-421 (1964).
  6. Branchfield, K., et al. Pulmonary neuroendocrine cells function as airway sensors to control lung immune response. Science. 351, (6274), 707-710 (2016).
  7. Ding, B. -S., et al. Endothelial-derived angiocrine signals induce and sustain regenerative lung alveolarization. Cell. 147, (3), 539-553 (2011).
  8. Dunnill, M. S. Quantitative methods in the study of pulmonary pathology. Thorax. 17, (4), 320-328 (1962).
  9. Weibel, E. R., Gomez, M. Architecture of the human lung. Use of quantitative methods establishes fundamental relations between size and number of lung structures. Science. 137, (3530), 577-585 (1962).
  10. Thurlbeck, W. M. The internal surface area of nonemphysematous lungs. Am Rev Respir Dis. 95, (5), 765-773 (1967).
  11. Butler, J. P., et al. Evidence for adult lung growth in humans. N Engl J Med. 367, (16), 244-247 (2012).
  12. Hsia, C. C. W., Herazo, L. F., Fryder-Doffey, F., Weibel, E. R. Compensatory lung growth occurs in adult dogs after right pneumonectomy. J Clin Invest. 94, (1), 405-412 (1994).
  13. Thurlbeck, S. W. M. Pneumonectomy in Rats at Various Ages. Am Rev Respir Dis. 120, (5), 1125-1136 (1979).
  14. Cagle, P. T., Langston, C., Thurlbeck, W. M. The Effect of Age on Postpneumonectomy Growth in Rabbits. Pediatr Pulmonol. 5, (2), 92-95 (1988).
  15. Langston, C., et al. Alveolar multiplication in the contralateral lung after unilateral pneumonectomy in the rabbit. Am Rev Respir Dis. 115, (1), 7-13 (1977).
  16. Cohn, R. Factors Affecting The Postnatal Growth of The Lung. Anatomical Record. 75, (2), 195-205 (1939).
  17. Hsia, C. C., Wu, E. Y., Wagner, E., Weibel, E. R. Preventing mediastinal shift after pneumonectomy impairs regenerative alveolar tissue growth. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 281, (5), L1279-L1287 (2001).
  18. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. -Y. S., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318 (2013).
  19. Liu, S., Cimprich, J., Varisco, B. M. Mouse pneumonectomy model of compensatory lung growth. J Vis Exp. (94), (2014).
  20. Silva, M. F. R., Zin, W. A., Saldiva, P. H. N. Airspace configuration at different transpulmonary pressures in normal and paraquat-induced lung injury in rats. Am J Respir Crit Care Med. 158, (4), 1230-1234 (1998).
  21. Yilmaz, C., et al. Noninvasive quantification of heterogeneous lung growth following extensive lung resection by high-resolution computed tomography. J Appl Physiol. 107, (5), 1569-1578 (2009).
  22. Voswinckel, R., et al. Characterisation of post-pneumonectomy lung growth in adult mice. Eur Respir J. 24, (4), 524-532 (2004).
  23. Ravikumar, P., et al. Regional Lung Growth and Repair Regional lung growth following pneumonectomy assessed by computed tomography. J Appl Physiol. 97, 1567-1574 (2004).
  24. Gibney, B. C., et al. Detection of murine post-pneumonectomy lung regeneration by 18FDG PET imaging. EJNMMI Res. 2, (1), (2012).
  25. Muñoz-Barrutia, A., Ceresa, M., Artaechevarria, X., Montuenga, L. M., Ortiz-De-Solorzano, C. Quantification of lung damage in an elastase-induced mouse model of emphysema. Int J Biomed Imaging. 2012, (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics