Un metodo standardizzato per la misurazione della superficie interna polmonare tramite la polmonite e l'impianto di protesi

Developmental Biology

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Summary

La superficie interna polmonare (ISA) è un criterio critico per valutare la morfologia polmonare e la fisiologia delle malattie polmonari e della rigenerazione alveolare indotta da lesioni. Qui descriviamo un metodo standardizzato che può ridurre al minimo la polarizzazione di misura per ISA sia nei modelli di polmonite polmonare sia nei modelli di protesi.

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Liu, Z., Fu, S., Tang, N. A Standardized Method for Measuring Internal Lung Surface Area via Mouse Pneumonectomy and Prosthesis Implantation. J. Vis. Exp. (125), e56114, doi:10.3791/56114 (2017).

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Abstract

Introduction

La funzione fondamentale del polmone è lo scambio di ossigeno e di anidride carbonica tra i vasi sanguigni e l'atmosfera. Le malattie polmonari come la displasia broncopolmonare (BPD), la malattia polmonare cronica ostruttiva (COPD) e le infezioni respiratorie acute provocano una riduzione dell'ISA 2 . I ricercatori che studiano la malattia polmonare hanno sviluppato diversi metodi quantitativi per valutare i cambiamenti morfologici nei polmoni, tra cui MLI, ILV, numero di scambiatori di gas, ISA e conformità ai tessuti polmonari 2 , 3 . Studi pionieristici di Weibel et al. 4 e Duguid et al. 5 hanno stabilito che l'ISA può essere utilizzata come misura diretta della capacità di scambio del gas polmonare nei polmoni umani e può essere utilizzata come criterio per determinare la gravità dell'emfisema. Alcuni studi pubblicati negli ultimi cinque anni hanno utilizzato parametri morfologici polmonari ( ad esempio, 6 e durante il recupero da lesioni PNX 1 , 7 . L'ISA viene calcolato utilizzando l' equazione 1 8 , 9 :

Equazione

, Dove ILV è il volume polmonare interno e MLI è un parametro intermedio che rappresenta la dimensione aerospaziale periferica polmonare 10 .

La PNX, la rimozione chirurgica di uno o più lobi del polmone, è stata ampiamente riportata per indurre la rigenerazione alveolare in molte specie, tra cui gli esseri umani 11 , i topi 1 , i cani 12 , i ratti 13 e i conigli 14 e 15 . Un studY dei polmoni dei topi a quattordici giorni dopo il PNX ha mostrato che sia l'espansione di alveoli preesistenti e la de novo formazione di alveoli contribuiscono al restauro di ISA, ILV e il numero di alveoli nei restanti tessuti polmonari 1 . Noi e altri abbiamo dimostrato che l'inserimento di materiali come la spugna, la cera o una protesi a forma personalizzata nella cavità toracica vuota dopo PNX ( cioè l' impianto di protesi) compromette la rigenerazione alveolare. È ora stabilito che la forza meccanica funziona come uno dei fattori più importanti per iniziare la rigenerazione alveolare 1 , 16 , 17 . Tali studi hanno evidenziato l'efficacia dell'uso dei valori ISA da polmoni trattati con PNX e protesi da protesi come criterio per valutare quantitativamente la rigenerazione alveolare.

Il bias dell'osservatore è noto per influenzare in modo significativo la misura misurataPer i parametri morfologici polmonari ( es . MIL e ILV). I protocolli standardizzati possono essere utilizzati per ovviare a questa polarizzazione per determinare sia ILV che MLI, i due parametri utilizzati per il calcolo dell'ISA. Qui forniamo protocolli altamente dettagliati e standardizzati per misurare questi parametri polmonari. Importante, la capacità di quantificare con precisione le promesse ISA migliora l'affidabilità e la riproducibilità degli studi sulla funzionalità polmonare nei modelli di rigenerazione alveolare indotta da lesioni e dovrebbe facilitare le scoperte meccaniche in molteplici patologie polmonari.

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Protocol

Tutte le procedure utilizzate in questo protocollo sono state eseguite in conformità alle raccomandazioni contenute nelle Linee Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dell'Istituto Nazionale di Scienze Biologiche di Pechino. I topi maschi CD-1 di 8 settimane sono stati alloggiati in una struttura specifica senza patogeni (SPF) fino all'esecuzione degli esperimenti. Le chirurgie sono state eseguite utilizzando topi completamente anestetizzati ( cioè , senza risposte a pizzicotto). Dopo l'intervento chirurgico, i topi sono stati tenuti in una stanza calda e umida con cibo sufficiente e acqua dolce. I topi sono stati sacrificati usando un sovradosaggio di anestetico erogato mediante iniezione intraperitoneale.

1. Mouse PNX Chirurgia

  1. Completa l'anestesia dei topi con fenobarbital di sodio (120 mg / kg di peso corporeo) e buprenorfina (0,1 mg / kg di peso corporeo) tramite l'iniezione intraperitoneale (IP). Effettuare la chirurgia quando i topi non reagiscono più a pizzicamento del piede.
  2. Togliere i capelli sul torace sinistro dei topi con la sostanza chimicaTrattamento infettivo (~ 3 x 3 cm 2 area).
  3. Fissare ogni mouse su una piattaforma di intubazione con il lato ventrale rivolto verso l'operatore ( Figura 1A ).
  4. Estrarre la linguetta del mouse e illuminare le corde vocali con un piccolo laringoscopio animale contenente una tacca per guidare i cateteri 18 ( Figura 1A ).
  5. Distinguete le corde vocali osservando i movimenti delle corde vocali durante la respirazione. Inserire delicatamente una cannula intubazione endovenosa da 20 G nella trachea ad un angolo anteriore 19 .
  6. Posizionare i topi in una posizione reclinabile laterale destra e collegare la cannula ad un ventilatore meccanico ( ad esempio, a pressione controllata, vedere la tabella dei materiali ). Controllare l'inserimento della cannula nella trachea osservando i movimenti respiratori del petto del mouse ( Figura 1B ).
  7. Impostare la pressione inspiratoria oF il ventilatore a 12 cm H 2 O e impostare la frequenza respiratoria a 120 breath per min ( Figura 1B ).
  8. Decontaminare la pelle nell'area chirurgica con betadina e il 70% di etanolo.
  9. Effettuare un'incisione toracotomica posterolaterale da 2 - 3 cm nello spazio al 5 ° spazio intercostale, tagliato attraverso la pelle e i muscoli con forbici a molla Noyes (tagliente: 14 mm; diametro punta: 0,275 mm) ( Figura 2B , C ). Gli strumenti chirurgici utilizzati per la procedura toracotomia vengono sterilizzati prima dell'uso.
  10. Effettuare un'incisione di 1,5 cm al 5 ° spazio intercostale per esporre il polmone sinistro ( Figura 2D , E ). Durante l'operazione, utilizzare un cauterizzatore ad alta temperatura per bloccare l'emorragia.
  11. Sollevare un terzo del lobo polmonare sinistro dal torace con punte punte sbilanciate ( Figura 2F ), quindi utilizzare un tampone di cotone per estrarre l'intera sinistraPolmone ( Figura 2G ).
  12. Identificare l'arteria polmonare ei bronchi del lobo polmonare sinistro ( Figura 2G ).
  13. Legare leggermente i bronchi ei vasi all'hilum con una sutura chirurgica di seta e tagliare il lobo polmonare sinistro a 3 - 4 mm dalla legatura ( Figura 2H , I ).
    NOTA: Fare attenzione a non tagliare i nodi di sutura sull'hilum sinistro, che possono causare pneumotorace ( ossia aria o gas nella cavità del torace) .
  14. Chiudere la parete toracica con 1 sutura e quindi cucire lo strato muscolare e lo strato della pelle in sequenza, utilizzando 5 - 6 suture interrotte. Lasciare uno spazio tra 3 e 4 mm tra ciascuna sutura ( figura 2M , 2N ).
    NOTA: Tenere l'ago chirurgico di sutura lontano dal cuore; La puntura cardiaca involontaria provoca la morte immediata.
  15. Disinfettare l'area chirurgica con povidone-iodio.
  16. afteR l'operazione chirurgica, posizionare il mouse su un tampone termico a 38 ° C e collegare il mouse al ventilatore fino a quando non inizieranno i movimenti respiratori spontanei ( Figura 2O ).

2. Implantologia della protesi

  1. Eseguire i passaggi 1.1-1.13 della procedura PNX (cioè fino al punto in cui il lobo polmonare sinistro del mouse viene rimosso).
  2. Fissare il centro della protesi in silicone (cliente realizzato, 12 mm di lunghezza, 3 mm di spessore, 7 mm di larghezza, 0,2 g, forma ellisse) utilizzando pinze a punta ( Figura 2J ). Sterilizzare la protesi al silicone prima dell'inserimento.
  3. Tenere la nervatura con le pinze con una mano per esporre la cavità toracica e poi inserire la protesi nella cavità toracica vuota sinistra con un'altra mano.
    NOTA: L'angolo di inserzione è di circa 45 gradi tra il piano frontale della protesi e la superficie toracica ( Figura 2K ,L). Essere molto gentile quando si inserisce la protesi. La forza eccessiva provoca una rottura pleurica.
  4. Regolare l'orientamento della protesi con pinze sbilanciate per assicurare che la protesi occupa la cavità toracica vuota sinistra.
  5. Eseguire i passaggi 1.14 - 1.16 della procedura PNX del mouse.

3. Misurazione dell'ILV

  1. Preparare un dispositivo personalizzato ("tubo di inflazione") costituito da uno stantuffo rimosso da una pipetta serologica usa e getta (10 mL), un tubo flessibile lungo 40 cm con adattatore a ago, valvola di controllo della portata e un ago da 18 G. Dopo l'assemblaggio, fissare la pipetta su una scheda con nastro ( Figura 3A ). La distanza tra la parte superiore della pipetta e la panca sperimentale deve essere di almeno 30 cm.
  2. Preparare la soluzione di fissazione del 4% di paraformaldeide (PFA), sciogliendo 20 g di PFA in 500 ml di soluzione salina fosforata tamponata pre-riscaldata (PBS) in un bagno d'acqua di 55 ° C, scuotendo manualmenteCe ogni 10 minuti fino a quando la soluzione è chiara. Dopo raffreddamento a temperatura ambiente, filtrare la soluzione con un filtro da 0,45 μm.
    ATTENZIONE: Usare un adeguato dispositivo di protezione individuale (PPE) quando si maneggia PFA.
  3. Mouse sacrificato con un'iniezione di sovradosaggio di anestetico (0,8% fenobarbital sodico, 1000 U / ml di eparina).
  4. Fissare ogni mouse su una piastra di dissezione in polistirene e spruzzarla con alcool al 70%.
  5. Aprire con cautela il petto del mouse e tagliare lo sterno con forbici per esporre completamente i lobi del polmone.
  6. Rimuovere il tessuto eccessivo con forbici per esporre la trachea. Assicuratevi di separare la trachea dall'esofago.
  7. Tagliare l'aorta addominale e inserire un ago da 25 gauge nel ventricolo destro del cuore; Collegare l'ago ad una siringa da 20 ml prima di questo inserimento. Spingere lentamente 1x PBS nel cuore per rimuovere le cellule del sangue fino a quando i polmoni diventano bianchi. Tipicamente, 5 - 10 mL di PBS è necessario per eliminare i vasi sanguigni polmonari.
  8. Compilare il thE tubo di infusione personalizzato con 4% di PFA fresco e rimuovere tutte le bolle dal tubo di inflazione.
  9. Inserire l'ago da 18 gauge del tubo di infusione nella trachea e agganciare la trachea con le clip del recipiente per evitare perdite di liquido.
  10. Gonfiare i polmoni con il 4% di PFA ad una pressione costante di 25 cm / H 2 O 2 , 20 . Incubare i polmoni a temperatura ambiente per 2 ore per ottenere polmoni completamente espansi. Questo passo "pre-fix" è fondamentale per la conservazione della morfologia polmonare.
    1. Monitorando il tubo di inflazione, registrare il valore del volume iniziale del 4% PFA e registrare il volume finale. Il volume polmonare interno equivale al volume iniziale del PFA del 4% meno il volume PFA finale del 4%.
  11. Legare la trachea e usando le forbici, disseccare delicatamente i polmoni (mantenendo intatti i polmoni) dai tessuti connettivi circostanti. Essere molto gentile per evitare di danneggiare i polmoni.
  12. incuVersare i polmoni in un tubo conico da 50 ml riempito con 4% di PFA per 12 h a 4 ° C con una leggera agitazione su un agitatore (50 rpm). Procedere alla lavorazione del tessuto e alla colorazione (vedere la sezione 4).

4. Incorporazione del tessuto, sezionamento e colorazione di ematossilina & eosina (H & E)

  1. Dopo la fissazione, utilizzare le forbici forensi di Noyes per tagliare il cuore e i tessuti connettivi eccessivi dai polmoni. Separare delicatamente i singoli lobi del polmone tagliando il bronco che collega i lobi del polmone alla trachea.
  2. Lavare ampiamente i lobi del polmone 3 - 4 volte in 50 ml di 1x PBS (30 minuti / lavaggio) su un agitatore orbitale (50 rpm).
  3. Dopo il lavaggio finale, crioprire i lobi del polmone immergendoli in una soluzione al 30% di saccarosio (in 1x PBS) a 4 ° C fino a quando il tessuto si affonda sul fondo dei tubi conici da 50 ml (circa 12 h).
  4. Prima di incollare e criocondire i tessuti, rimuovere i campioni del lobo polmone dai tubi con le pinze, mantenere l'accesI lobi per l'analisi istologica, immergere la residua soluzione di saccarosio dalla superficie dei campioni del lobo accessorio e quindi immergere completamente il campione in un piatto di Petri contenente il composto ottimale di taglio (OCT) per circa 30 minuti.
  5. Bloccare i campioni di lobi accessorio incorporati in OCT in azoto liquido usando criomaglie. Posizionare la superficie più grande del lobo parallela alla parte inferiore dello stampo.
  6. Preparare un totale di tre sezioni di 10 μm di spessore per ciascun campione durante la crizione per l'analisi istologica. Scartare il primo 1 mm di tessuto, raccogliere una sezione di 10 μm di spessore, scartare 0,5 mm di tessuto, raccogliere un'altra sezione, scartare 0,5 mm di tessuto e raccogliere la terza sezione (finale).
  7. Aria asciugare le sezioni per 1 ora prima di eseguire la colorazione H & E.
  8. Effettuare la colorazione H & E
    1. Lavare le sezioni in 3 - 4 cambi di acqua di rubinetto e poi macchia le sezioni in fresco ematoxilina per 2 min; Sciacquare la sezione sotto l'acqua corrente del rubinetto; Immergere la sezione due volte in una soluzione 1% HCl-70% di etanolo per rimuovere l'ematoxilina in eccesso.
    2. Macchiare la sezione in eosin fresco per 3 min; Deidratare le sezioni con due successive lavaggi a 30 s in etanolo al 95% e due lavaggi a 30 s con etanolo al 100%; Chiudere le sezioni in xilene per 30 s, ripetere la fase di compensazione una volta in xilene fresco; Montare le diapositive con il supporto di montaggio usando le copertine di vetro.

5. Quantificazione di MLI

  1. Acquisire immagini digitali delle sezioni Lobe accessorio macchiate H & E (ingrandimento 20X) utilizzando un microscopio a campo luminoso.
  2. Per quantificare il MLI, selezionare un totale di 15 viste non sovrapposte (1.000 μm x 1.000 μm) in modo casuale dalle aree adattate (senza arterie e vene, vie respiratorie principali e condotti alveolari) di 3 sezioni.
  3. Inserire una griglia con 10 linee verticali distribuite uniformemente e 10 linee orizzontali distribuite equamente distribuite di lenGth (1.000 μm) sulle aree di vista prescelte usando uno strumento di righello; Ogni linea è così distanziata da 100 μm di distanza ( Figura 4B ).
  4. Definire il valore di una intercetta come la lunghezza lineare tra due epiteli alveolari adiacenti. Misurare i valori di tutte le intercettazioni lungo ciascuna linea di lunghezza di 1000 μm.
  5. Per ciascuna griglia, quantificare i valori di tutte le intercetta tra le 10 lunghezze orizzontali di lunghezza 1.000 μm e le 10 lunghezze verticali di 1.000 μm.
    NOTA: MLI è il valore medio delle lunghezze di intercettazione da un totale di 15 griglie analizzate tra le tre sezioni predisposte per ciascuno dei lobi accessori.

6. Calcolo dell'ISA

  1. Calcola l'ISA utilizzando l' equazione 1 (vedi Introduzione ). Fare riferimento alla sezione 3 per la misura di ILV e fare riferimento alla sezione 5 per la quantificazione di MLI.

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Representative Results

Abbiamo eseguito qui un esperimento con un gruppo trattato con PNX e un gruppo di protesi (impianto protesico). Questi raggruppamenti sono gli stessi dei raggruppamenti utilizzati in uno studio precedentemente pubblicato dal nostro gruppo di ricerca 14 .

Le mostre PNX e le protesi di protesi sono mostrate in Figura 2 . 8 settimane vecchi topi maschi CD-1 vengono utilizzati per gli interventi chirurgici e per la quantificazione. Nel gruppo trattato con PNX e nel gruppo protetto da protesi, i lobi del polmone sinistro erano entrambi resettati ( Figura 2A - 2I ). Nel gruppo protetto da protesi, una protesi che imita la dimensione e la forma del lobo del polmone sinistro è stata inserita nel petto dopo che il lobo polmonare sinistro è stato rimosso ( Figura 2J - 2L ).

Per 14 giorni dopo l'intervento chirurgico è stato utilizzato un tubo di infusione su misura per determinare l'ILV dei rimanenti polmoni destro ( figura 3A ). L'ILV medio del residuo destro I polmoni dei 5 mieli trattati con PNX erano circa 1,4 mL, significativamente superiori ai valori di ILV da 1,05 mL dei polmoni destro dei 5 protettori protesi ( Figura 3B , Tabella 1 ).

Per la misurazione MLI, sono stati analizzati complessivamente 15 visite tra le tre sezioni preparate da ciascun mouse. La Figura 4A mostra un'immagine unita da una sezione del lobo accessorio e lo standard morfologico per un'area scelta ( ad esempio, vista 1-3) o un'area non scelta ( ad esempio, vista da 4 a 5) utilizzata per la quantificazione di MLI. Qui è stata presa come esempio un punto 3 di una sezione del lobo del polmone accessorio del gruppo trattato con PNXLa misurazione di MLI ( Figura 4B ). Viene anche visualizzata un'immagine ingrandita 3 per illustrazione ( Figura 5A ). Viene presentata la linea 3 come esempio: la lunghezza di uno spazio aereo alveolare intercettato indicato dalle linee di freccia a doppia faccia. La nostra analisi ha dimostrato che i valori dei MLI nei rimanenti polmoni destro dei topi trattati con PNX erano significativamente maggiori di quelli dei rimanenti polmoni destro dei topi protesi da protesi ( figura 5B , tabella 1 ). Tutti i dati sono presentati come la media ± SEM ( Figura 5B ).

L'ISA è stato calcolato utilizzando l' equazione 1 . La Tabella 1 mostra i valori ILV, i valori MLI e l'ISA di tutti i polmoni. L'ISA dei topi protesi da protesi era significativamente più piccolo di quello dei topi trattati con PNX, dimostrando che l'inserzioneN di una rigenerazione indotta da PNX a una protesi compromessa.

Figura 1
Figura 1: Intubazione endotracheale del mouse e ventilazione meccanica. ( A ) Intubazione endotracheale con una cannula intubazione endovenosa da 20 g via laringoscopia. ( B ) Collegare il mouse completamente anestetizzato a un ventilatore meccanico a pressione prima dell'intervento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Pneumonectomia del topo (PNX) e impianto di protesi. ( A - C ) Taglia la pelle e lo strato muscolare; Arresto bLasciando con un cauterizzatore ad alta temperatura durante l'operazione chirurgica. ( D - E ) Effettuare un'incisione di 1,5 cm al 5 ° spazio intercostale. ( F - H ) Estrarre il lobo polmonare sinistro con pinze a punta e identificare l'arteria polmonare e bronchi, legare all'hilum. Le frecce rappresentano l'arteria polmonare ei bronchi del lobo polmonare sinistro. ( I ) Il lobo polmonare sinistro è stato resecato a 3 - 4 mm dalla legatura. ( J - L ) Inserire una protesi nella cavità toracica sinistra. ( M, N ) Sutura il petto, lo strato muscolare e lo strato della pelle. ( O ) Monitorare i topi fino a quando cominciano i movimenti respiratori spontanei. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.


Figura 3: Misurazione dei volumi interni del polmone (ILV) dei polmoni destro rimanenti. ( A ) Un dispositivo personalizzato ("tubo di inflazione") per misurare i volumi polmonari interni. ( B ) Gli ILV (media ± SEM) dei polmoni destro rimasti del gruppo trattato con PNX e gruppo protetto da protesi sono stati misurati a 14 giorni dopo PNX. **, p <0.01, test t dello studente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: Quantificazione dell'intercettazione lineare media (MLI) delle lobi accessorie nei polmoni destra rimanenti. ( A ) Un impianto fusoViene mostrata l'età di una sezione del lobo accessorio. Esempi di aree selezionate ( ad esempio, vista 1 - 3) e aree non scelte ( ad esempio, vista da 4 a 5) utilizzate per la quantificazione MLI. ( B ) 10 zone verticali distanziate e 10 linee orizzontali distanziate di lunghezza definita (1.000 μm) sono state collocate nell'area prescelta. Barra di scala = 1 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: Quantificazione del MLI in polmoni trattati con PNX e polmoni impiantati in protesi. ( A ) Viene mostrata un'immagine ingrandita 3 di figura 4B . Le righe rosse con doppie frecce rappresentano la lunghezza di una intercetta lineare. ( B ) I valori MLI (media ± SEM.) dei lobi accessorio di topi trattati con PNX e topi protesi protesi sono stati misurati a 14 giorni dopo il PNX. *, P <0,05, t- test di Student. Barra di scala: 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

14 giorni dopo l'intervento chirurgico Volume interno del polmone (ml) Intercetta lineare media (mm) Superficie polmonare interna = 4ILV / MLI (cm 2 )
PNX-trattati 1.5 57.8 1.038,06
1.35 49.6 1.088,71
1.42 48.5 1.171,13
1.4 51,5 1.087,38
1.4 54.6 1.025,64
-Protesi impiantata 1.1 49.6 887,10
1 50,5 792,08
1.1 47.3 930,23
1.15 44.8 1.026,79
0.86 46.3 742,98

Tabella 1: Calcolo dei valori ISA di mioppi trattati con PNX e protesi da protesi. I valori di ILV, MLI e ISA dei lobi accessorio a 14 giorni dopo PNX.

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Discussion

In questo protocollo forniamo descrizioni dettagliate sulla misura dei parametri polmonari dopo il polmone a sinistra del polmone PNX e l'impianto di protesi. L'ISA è ora considerata una metrica chiave per la valutazione della funzione respiratoria in molte malattie polmonari e nella rigenerazione alveolare indotta da lesioni. Tuttavia, sebbene la comunità di ricerca polmonare sia d'accordo sull'utilità dell'ISA come metrica utile, fino ad oggi non è stata presa in considerazione la standardizzazione della misurazione di ILV e MLI, i due parametri utilizzati per calcolare l'ISA. Ovviamente, come per qualsiasi misurazione, è importante cercare di ottenere dati imparziali. L'obiettivo principale del presente sforzo di ricerca è quello di stabilire un protocollo standardizzato per l'uso da parte della comunità di ricerca polmonare murina.

Abbiamo tentato di ridurre le fonti di polarizzazione di misura in diversi modi, come abbiamo sviluppato questo protocollo. Abbiamo scoperto che la variazione delle misurazioni del ILV potrebbe essere rossaZione impedendo la fuoriuscita del fluido assicurando che la dimensione dell'ago inserito nella trachea sia dimensionata (abbiamo trovato che gli aghi a 18 gauge hanno stretto trachea di topi). Abbiamo anche scoperto che la parete del torace del mouse deve essere completamente rimossa prima dell'inflazione PFA, in quanto ciò minimizza l'influenza potenziale della parete toracica sulle misure ILV. I valori MLI dipendono in larga misura dalla morfologia alveolare. Di conseguenza, oltre all'importanza di utilizzare i topi adattati all'età e al sesso, la corretta manutenzione della morfologia alveolare durante le procedure di fissazione del polmone è di fondamentale importanza. Abbiamo usato un metodo di fissazione ampiamente adottato: abbiamo gonfiato i polmoni a una pressione transpulmonaria di 25 cm H 2 O con PFA appena preparato al 4% per dilatare completamente il tessuto polmonare. Nella nostra esperienza, minori pressioni di distensione possono portare alla contrazione tissutale, morfologia alveolare anormale e, in ultima analisi, risultano in valori MLI più bassi.

Osservazioni inI nostri studi precedenti hanno indicato che il lobo accessorio del polmone rimanente mostra l'espansione volumetrica massima, rispetto agli altri tre lobi del polmone destro dopo la rigenerazione PNX; Il lobo accessorio del polmone rimanente mostra anche massimi aumenti del valore dei parametri morfologici ( es. MLI) 21 , 22 , 23 , 24 . Abbiamo quindi analizzato solo sezioni da lobi accessorio per evitare variazioni da diversi lobi polmonari. Per contribuire a ridurre la variazione tra le varie sezioni utilizzate nella quantificazione di MLI, abbiamo controllato l'orientamento del lobo durante l'incasso: abbiamo posizionato la superficie più grande del lobo parallela alla parte inferiore del criomolo. Abbiamo anche controllato attentamente lo spessore delle fette del campione, la sequenza di campionamento delle sezioni e la posizione di taglio durante la sezione. Oltre all'elaborazione del campione, un altro importanL'aspetto della standardizzazione è che tutte le arterie e le vene, la pleura, le vie respiratorie principali e i condotti alveolari vanno esclusi dalle aree tissutali valutate durante la quantificazione MLI. Le arterie, le vene e i condotti alveolari sono molto più grandi di alveoli (da 4 a 10 volte), per cui escludendo queste grandi strutture è importante per ottenere misurazioni intercettate affidabili. Per ogni gruppo, 5 topi sono adeguati per la quantificazione. Per ciascun mouse, sono stati selezionati in modo casuale, dalle aree adattate (senza arterie e vene, vie aeree principali e condotti alveolari), 15 viste non sovrapposte (1000 μm x 1.000 μm) delle 3 sezioni del lobo accessorio. Il metodo di incorporazione del campione e la misura MLI possono essere applicati anche ai tessuti polmonari trattati con paraffina.

Mentre altri hanno definito MLI come la lunghezza totale della linea divisa per il numero di intercettazioni con pareti alveolari incrociate 25 , abbiamo usato qui un intercetta lineare come la lunghezza lineareTra due pareti epiteliali alveolari adiacenti nei calcoli MLI, trascurando lo spessore del mesenchimo dai dati MLI. Di conseguenza, abbiamo calcolato ISA utilizzando ILV, ma non il volume totale del polmone.

Per le procedure di impianto PNX e protesi, il tasso di sopravvivenza dei topi sottoposti a PNX varia dall'85% al ​​90%. Il tasso di sopravvivenza di topi sottoposti ad impianto di protesi era circa ~ 80%. Durante tutti gli interventi chirurgici, dovrebbero essere adottati diversi passi per migliorare la sopravvivenza dei topi. 1) L'inserimento appropriato del catetere nella trachea è un prerequisito per un'operazione PNX di successo. Con la guida di un laringoscopio, la trachea del topo può essere facilmente osservata per facilitare un'intubazione endotracheale sicura ed efficace. 2) Non forare i polmoni oi cuori durante la procedura. Assicurarsi che il torace del quinto spazio intercostale sinistra sia ampiamente aperto e che l'ano del lobo sinistro sia chiaramente identificato prima della lobectomia. Quando si esegue il lobo polmonare sinistro riAssicurarsi che il lobo sinistro sia intatto attraverso l'utilizzo di pinze sbilanciate per evitare emorragia polmonare e / o rottura lobare. Durante la chiusura della ferita, tenere la punta dell'ago chirurgico lontano dal cuore e dai polmoni. 3) Essere gentili quando si inserisce la protesi nella cavità toracica vuota, poiché la forza eccessiva può causare la rottura della pleura. 4) I topi devono essere posizionati su un tampone termico a 38 ° C e monitorati fino a quando i loro sensi non si riprendono, in quanto l'ipotermia postoperatoria è nota per aumentare la morbilità del topo.

Dopo la rimozione del lobo del polmone sinistro, entrambe le unità respiratorie polmonari e l'area di scambio del gas polmonare interno sono state significativamente ridotte. 14 giorni dopo la chirurgia, ILV, MLI e ISA nel tessuto polmonare rimanente erano significativamente più grandi nel gruppo trattato con PNX di topi che nel gruppo protetto da protesi, suggerendo fortemente che l'inserimento di una protesi bloccato alveolare indotta da PNX rigenerazione. Così, sia la modalità PNX che la protesi-impiantoLs può essere utilizzato come potente strumento per indagare gli eventi cellulari e molecolari che si verificano durante la re-alveolarizzazione indotta dalla forza meccanica. Inoltre, i valori ISA dei polmoni Yap AT2 null erano significativi inferiori a quelli dei polmoni di controllo al giorno post-PNX 14 1 , indicando che il nostro protocollo è anche adatto per la rilevazione della rigenerazione compromessa di topi mutanti genetici. I metodi quantitativi rigorosi e standardizzati presentati in questo studio possono essere applicati per misurare i parametri polmonari e ISA negli studi di sviluppo e con modelli animali geneticamente modificati di molteplici malattie, tra cui l'emfisema nelle malattie polmonari croniche ostruttive, la rigenerazione alveolare a seguito di lesioni polmonari e lo sviluppo del polmone difetti.

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Disclosures

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori vorrebbero riconoscere all'Istituto Nazionale di Scienze Biologiche di Pechino per l'assistenza. Questo lavoro è stato sostenuto da Beijing Municipal Natural Science Foundation (numero Z17110200040000).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Low cost cautery kit Fine Science Tools 18010-00
Noyes scissors Fine Science Tools 15012-12
Standard pattern forceps Fine Science Tools 11000-12
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools 12060-01
Vessel clips Fine Science Tools 18374-44
I. V. Cannula-20 gauge Jinhuan Medical Product Co., LTD. 29P0601
Surgical suture Jinhuan Medical Product Co., LTD. F602
Mouse intubation platform Penn-Century, Inc Model MIP
Small Animal Laryngoscope Penn-Century, Inc Model LS-2-M
TOPO Small Animal Ventilator Kent Scientific RSP1006-05L
Thermal pad Stuart equipment SBH130D
Pentobarbital sodium salt Sigma P3761
Heparin sodium salt Sigma H3393
Hematoxylin Solution Sigma GHS132
Eosin Y solution, alcoholic Sigma HT110116
10 mL Pipette Thermo Scientific 170356
Paraformaldehyde Sigma P6148
O.C.T Compound Tissue-Tek 4583
cryosection machine Leica CM1950
Disposable Base Molds Fisher HealthCare 22-363-553
18 gauge needle Becton Dickinson 305199
Povidone iodine Fisher Scientific 19-027132
70% ethanol Fisher Scientific BP82011
Infusion sets for single use Weigao SFDA 2012 3661704
Phosphate buffered saline Gibco 10010023
Tapes 3M Scotch 8915
Cotton pad Vinda Dr.P
Silicone prosthesis Custom made
Brightfield microscope Olympus VS120
Ruler tool Adobe Photoshop

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References

  1. Liu, Z., et al. MAPK-Mediated YAP Activation Controls Mechanical-Tension-Induced Pulmonary Alveolar Regeneration. Cell Rep. 16, (7), 1810-1819 (2016).
  2. Thurlbeck, W. M. Internal surface area and other measurements in emphysema. Thorax. 22, (6), 483-496 (1967).
  3. Knudsen, L., Weibel, E. R., Gundersen, H. J. G., Weinstein, F. V., Ochs, M. Assessment of air space size characteristics by intercept (chord) measurement: an accurate and efficient stereological approach. J Appl Physiol. 108, (2), 412-421 (2010).
  4. Weibel, E. R. Morphometry of the Human Lung. Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1963).
  5. Duguid, J. B., Young, A., Cauna, D., Lambert, M. W. The internal surface area of the lung in emphysema. J Pathol Bacteriol. 88, 405-421 (1964).
  6. Branchfield, K., et al. Pulmonary neuroendocrine cells function as airway sensors to control lung immune response. Science. 351, (6274), 707-710 (2016).
  7. Ding, B. -S., et al. Endothelial-derived angiocrine signals induce and sustain regenerative lung alveolarization. Cell. 147, (3), 539-553 (2011).
  8. Dunnill, M. S. Quantitative methods in the study of pulmonary pathology. Thorax. 17, (4), 320-328 (1962).
  9. Weibel, E. R., Gomez, M. Architecture of the human lung. Use of quantitative methods establishes fundamental relations between size and number of lung structures. Science. 137, (3530), 577-585 (1962).
  10. Thurlbeck, W. M. The internal surface area of nonemphysematous lungs. Am Rev Respir Dis. 95, (5), 765-773 (1967).
  11. Butler, J. P., et al. Evidence for adult lung growth in humans. N Engl J Med. 367, (16), 244-247 (2012).
  12. Hsia, C. C. W., Herazo, L. F., Fryder-Doffey, F., Weibel, E. R. Compensatory lung growth occurs in adult dogs after right pneumonectomy. J Clin Invest. 94, (1), 405-412 (1994).
  13. Thurlbeck, S. W. M. Pneumonectomy in Rats at Various Ages. Am Rev Respir Dis. 120, (5), 1125-1136 (1979).
  14. Cagle, P. T., Langston, C., Thurlbeck, W. M. The Effect of Age on Postpneumonectomy Growth in Rabbits. Pediatr Pulmonol. 5, (2), 92-95 (1988).
  15. Langston, C., et al. Alveolar multiplication in the contralateral lung after unilateral pneumonectomy in the rabbit. Am Rev Respir Dis. 115, (1), 7-13 (1977).
  16. Cohn, R. Factors Affecting The Postnatal Growth of The Lung. Anatomical Record. 75, (2), 195-205 (1939).
  17. Hsia, C. C., Wu, E. Y., Wagner, E., Weibel, E. R. Preventing mediastinal shift after pneumonectomy impairs regenerative alveolar tissue growth. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 281, (5), L1279-L1287 (2001).
  18. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. -Y. S., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318 (2013).
  19. Liu, S., Cimprich, J., Varisco, B. M. Mouse pneumonectomy model of compensatory lung growth. J Vis Exp. (94), (2014).
  20. Silva, M. F. R., Zin, W. A., Saldiva, P. H. N. Airspace configuration at different transpulmonary pressures in normal and paraquat-induced lung injury in rats. Am J Respir Crit Care Med. 158, (4), 1230-1234 (1998).
  21. Yilmaz, C., et al. Noninvasive quantification of heterogeneous lung growth following extensive lung resection by high-resolution computed tomography. J Appl Physiol. 107, (5), 1569-1578 (2009).
  22. Voswinckel, R., et al. Characterisation of post-pneumonectomy lung growth in adult mice. Eur Respir J. 24, (4), 524-532 (2004).
  23. Ravikumar, P., et al. Regional Lung Growth and Repair Regional lung growth following pneumonectomy assessed by computed tomography. J Appl Physiol. 97, 1567-1574 (2004).
  24. Gibney, B. C., et al. Detection of murine post-pneumonectomy lung regeneration by 18FDG PET imaging. EJNMMI Res. 2, (1), (2012).
  25. Muñoz-Barrutia, A., Ceresa, M., Artaechevarria, X., Montuenga, L. M., Ortiz-De-Solorzano, C. Quantification of lung damage in an elastase-induced mouse model of emphysema. Int J Biomed Imaging. 2012, (2012).

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