Aedes aegypti sivrisinek enfekte Wolbachia ile bakımını yapma

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Wolbachia ile enfekte aedes aegypti sivrisinek arboviruses iletimini bastırmak için doğal nüfus serbest edilmektedir. Biz laboratuvar adaptasyon ve seçimi en aza indirmek önlemler alarak deneyler ve alan açıklaması, arka Ae. aegypti laboratuvarda Wolbachia enfeksiyonları ile yöntemleri açıklanmaktadır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia. J. Vis. Exp. (126), e56124, doi:10.3791/56124 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Deneysel olarak Wolbachia ile enfekte aedes aegypti sivrisinek arboviruses Dang, chikungunya ve Zika gibi yayılmasını kontrol programlarında kullanılmaktadır. Wolbachia-virüslü sivrisinekler de nüfus boyutları arasında uyumsuz matings azaltmak veya virüs iletim için ateşe dayanıklı sivrisinek ile nüfus dönüştürmek için alana piyasaya sürülmelidir. Bu stratejiler başarılı olmak laboratuvar alanından içine serbest sivrisinek yerli sivrisinek ile rekabetçi olmalı. Ancak, sivrisinekler laboratuvarda Bakımı akraba evliliği, genetik sürüklenme ve onların zindelik alanını azaltabilir ve deneylerin sonuçlarını yıkmak laboratuvar adaptasyon neden olabilir. Farklı Wolbachia enfeksiyonlar dağıtımı için uygunluğu sahada test için sivrisinek kontrollü laboratuvar ortamında birden çok nesiller boyunca korumak gereklidir. Her iki Wolbachiaiçin uygundur laboratuvarında Ae. aegypti sivrisinek korumak için basit bir protokol tanımlayan-virüslü ve vahşi-türü sivrisinekler. Yöntemler laboratuvar adaptasyon en aza indirmek ve deneyler alaka alan sivrisinekler için artırın için outcrossing uygulamak. Ayrıca, koloniler onların zindelik açık alan sürümleri için en üst düzeye çıkarmak için en uygun koşullarda korunur.

Introduction

Aedes aegypti sivrisinek Dang, Zika ve chikungunya1de dahil olmak üzere dünyanın en önemli arboviruses bazıları iletmek için sorumludur. 2,3,4genişletmek Ae. aegypti tropikal yaygın dağıtım devam ederken bu virüsler küresel sağlık için artan bir tehdit hale gelmektedir. Kadın Ae. aegypti tercihen insan kanı5 besleme ve böylece insanlar, özellikle kentsel alanlarda nüfusun en yoğun olduğu yakın yaşamak eğilimindedir. İnsanlar ile bu yakın ilişki yoluyla onlar da lastikleri, tencere, oluklar ve su tankları6,7de dahil olmak üzere, yapay yaşam alanları içinde üremek için adapte olması. AE. aegypti da kolayca nerede onlar herhangi bir özel gereksinimleri olmadan doğrudan alanından farklı olarak bazı diğer türler Aedes cins8toplanan sonra korunabilir laboratuvar ortamlarına uyum, 9,10. Bakım kolaylığı onları geniş alanları geniş bir laboratuvarda Okulu'nu gördü, sonuçta hastalıkları sivrisinek kontrolü amaçlayan iletmek.

Geleneksel olarak, arboviral denetim ağır sivrisinek örneğin alınma olasılığını azaltmak için böcek öldürücüler kullanımına dayanıyor. Ancak, değiştirilmiş sivrisinek nereye laboratuvarda yetiştirilen ve sonra doğal nüfus serbest yaklaşımlar artan ilgi vardır. Yayımlanan sivrisinekler11,12,13, biyolojik olarak14,15, ışınlama16, kimyasal arıtma17,18genetik olarak değiştirilmiş, ya da sivrisinek nüfus bastırmak veya bunların yerine arboviral iletim20' ye ateşe dayanıklı sivrisinekler teknikleri-19 ile birlikte.

Wolbachia olan bir biyolojik mücadele ajanı olarak arboviruses. için kullanılmakta olan bakteri Birkaç soy-in Wolbachia son zamanlarda deneysel olarak embriyonik mikroenjeksiyon21,22,23,24kullanarak Ae. aegypti tanıtıldı. Bu suşların yaymak ve onların iletim potansiyel23,25,26,27,28 azalan sivrisinek içinde çoğaltmak için arboviruses kapasitesini azaltmak . Ancak hastalık bulaşmamış tek kadın22ile enfekte erkek dostum zaman belirli suşları kısırlık neden Wolbachia enfeksiyonlar çoluk, anneden iletilir. Wolbachia-virüslü erkekler bu nedenle doğal sivrisinek nüfus, son diğer Aedes türler15,29gösterdi bastırmak için büyük miktarlarda yayınlanacak. Wolbachia da inhibe bu yana arboviral Ae. aegyptiiletimde, ancak, sivrisinekler de yerli nüfus ile yoksul vektörel çizimler yerine yayınlanacak. Deneysel olarak Wolbachia ile enfekte Ae. aegypti are şimdi serbest bırakmak içine alan birçok ülkede bu ikinci yaklaşımı14,30,31kullanarak.

Wolbachia-arboviral denetimi için tabanlı yaklaşımlar itimat Wolbachia, Sivrisinek ve çevre arasındaki etkileşimler ses bir anlayış. Wolbachia ortaya doğal olarak çok çeşitli böcekler ve sivrisinekler tanıttı suşları onların etkileri32çeşitlidir. Yeni Wolbachia enfeksiyon türü Ae. aegypti24tanıtıldı gibi sivrisinek fitness, üreme ve koşulları bir dizi altında arboviral girişim üzerindeki etkileri için her zor karakterize etmek gereklidir. Titiz deney Laboratuvarı bu nedenle alanında başarılı olmak Wolbachia suşları potansiyeli değerlendirmek için gereklidir.

Ae. aegypti açık alan bültenleri Wolbachia enfeksiyonları ile kez sivrisinek olmak serbest bölge başına, on binlerce binlerce her hafta14,30,31yetiştirilen gerektirebilir. İlk bültenleri başarısı sivrisinekler onların verimlilik33 ve çiftleşme başarı34,35en üst düzeye çıkarmak için büyük bir boyutta serbest bırakarak geliştirilebilir. Sivrisinekler de alanında, ancak uzun vadeli laboratuvar yetiştirme değişiklikler davranış ve alan performans36,37etkileyen Fizyoloji neden olabilir yaşayacaksınız koşullarına adapte edilmelidir, 38.

Biz Ae. aegypti temel ekipman kullanarak laboratuvar yetiştirme için basit bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı için her iki vahşi türü uygundur ve Wolbachia-enfekte sivrisinekler, ikincisi olan gerektirebilir özel ilgi gibi bazı Wolbachia suşları sivrisinek hayat-Tarih özellikleri39, üzerinde önemli etkileri 40. aşırı kalabalık ve vektör yetkinlik ve fitness deneyler için önemlidir ve sivrisinekler için alan serbest bırakmak41 sağlıklı olmasını sağlar tutarlı bir boyuta sivrisinekler üretmek gıda için rekabet yetiştirme durumlardan kaçınmak . Biz laboratuvar adaptasyon ve akraba evliliği seçici baskıların azaltılması ile en aza indirmek önlemler almak ve yeni nesil sağlamak büyük, rasgele havuzundan örneklenir. Ancak, laboratuvar ortamları alan koşullarından farklı ve rahat koşullarda uzun vadeli bakım yayın içine alan37,42,43 üzerine sivrisinek fitness azaltabilir . Bu nedenle kadın alan toplanan erkeklerin periyodik olarak, laboratuvar satırlarından, deneysel karşılaştırmalar için genetik olarak benzeyen, ve için hedef alan nüfus39adapte olan koloniler sonuçlanan geçeriz. Yöntemleri herhangi bir özel ekipman gerektirmez ve arka on binlerce her hafta alan sürümleri için bireylerin ölçeklendirilebilir. Protokol ayrıca fitness kuruluş doğal nüfus için mukadder böcekler için önemli bir göz sivrisinek içinde ve nesiller arasında öncelik. Protokol sivrisinekler ve relatability alanı için tutarlı bir kalite nerede önemli özellikle deneysel karşılaştırmalar için Ae. aegypti, bakım gerektiren çoğu laboratuarlar için uygundur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Sivrisinek insan denekler üzerinde kan besleme University of Melbourne insan Etik Komitesi tarafından onaylanmış (onay #: 0723847). Tüm gönüllüler sağlanan yazılı izni haberdar.

1. larva yetiştirme

Not: Sivrisinekler 26 ± 0,5 ° C ile 50-%70 bağıl nem, 12:12 h (ışık: karanlık) photoperiod bu koloni bakım protokol ile düzenlenen. Bu koşullar Ae. aegypti hayatta kalma ve gelişme44,45,46için ortalama iklim koşulları Cairns, Avustralya ve en iyi termal Aralık içinde benzer. Yüksek sıcaklık Wolbachia enfeksiyonlar sivrisinek kolonilerden kaybına neden ve kaçınılması47olmalıdır. Biz akraba evliliği en aza indirmek için başına en az 500 kişi korumak; daha küçük bir boyuta kolonileri korumak fitness [Ross vd yayınlanmamış] sonuçlara yol açabilir. Bu koşullar ve varsayarak yeterli beslenme altında 28 gün (bkz. Tablo 1) ortalama üretimi zamanı.

  1. Balık yemi ~ 300 mg üzerinde substrat kasetlerine (şekil 1A) 3 L su (ters osmoz su veya yaşlı musluk suyu, musluk suyu kanalları 24 kullanılmadan önce s için bırakarak oluşturulan), içeren yumurta daldırın (ezilmiş bir tablet, Tablo malzemelerigörmek) ve bir damızlık48ikna etmek için aktif kuru maya kaç taneler.
  2. Tarama sonra bir gün bir cam pipet 4 L su (şekil 1B) içeren tepsi için yaklaşık 500 larva transferi, bir tıkırtı sayaç saymak için kullanın. İki ezilmiş balık yiyecek tabletleri her tepsisi. Gerekirse, larva (şekil 1A) yetiştirme için farklı boyutlarda kaplar kullanın ama larva yoğunluğu 0,5 larva/mL aşırı kalabalık önlemek için aşağıda tutun.
  3. Tepsiler günlük larvalar yeterli yiyecek var emin olun; yaklaşık iki gıda tabletleri tepsi için iki günde ekleyin. Gıda ad libitum sağlar, ancak 0,5 mg/larva/gün, geliştirme zaman uyumlu olarak ve vücut boyutu sağlamak için bu dönemde tutarlı olarak, aksi takdirde deneylerin sonuçlarını şaşırmış sağlamak (temsilcisi sonuçları görmek).
  4. Larva overfeeding önlemek için özen, özellikle içinde daha küçük yetiştirme kapları ile daha az yüzey alanı ve hacmi su. Su bulanık veya önemli larva ölüm ise, eski yerine koymak o ile tatlı su; Ölüm larva en iyi şekilde beslenir eğer ihmal edilebilir olmalıdır.

2. yetişkin ortaya çıkması

Not: Larvaları üzerinden beş gün sonra tarama iyi beslenen Eğer YavruIar başlayacak ve çoğunluk tarafından yedi gün sonra damızlık YavruIar. Yetişkin yaklaşık iki gün pupation sonra ortaya çıkan en iyi şekilde 26 ° C'de muhafaza Eğer başlayacak ( Temsilcisi sonuçlarıgörmek). Yeterli gıda23,39,49sağlandığında larva geliştirme Wolbachia enfeksiyonları genellikle etkilenmez.

  1. Yedi gün sonra damızlık dökün tepsiyi tüm içeriğini iyi bir ağ (gözenek boyutu 0.4 mm). Daha sonra kullanmak üzere filtre uygulanmış larva su ovicups içinde tutmak ("Kan besleme ve Oviposition" bölümüne bakın). Mesh ters çevir ve pupa aktarmak için su 200 mL ile plastik bir kap içine daldırma. Herhangi bir larva kalırsa ek besin içerir.
  2. Yetişkin ortaya çıkması kafesleri (şekil 1 c) % 10 Sükroz çözüm (şekil 1F) iki bardak ve nemli pamuk kuruma (şekil 1E) önlemek için iki bardak sağlayarak hazırlayın.
  3. Pupa seks tarafından sıralanır gerekiyorsa, Pupa tepecikte kapsayıcılar kafesin içine yerleştirin ve kapağı biraz yetişkin kafesin içine çıkmaya izin vermek için açık bırakın. Alternatif olarak, bir ters huni boğulma en aza indirmek için konteyner üzerinde yerleştirin. Tüm yetişkin karşı yavaş geliştiriciler seçmelerini önleme belgili tanımlık kafes gelen konteyner kaldırmadan önce ortaya çıkan emin olun.

3. pupa Outcrossing için seks

  1. Pupa (outcrossing içinörneğin,) seks tarafından sıralanması gerekirse, Pupa larva tepsileri üzerinden pipette ve cinsiyetler (Şekil 2) plastik kaplara (şekil 1A) 200 mL su ile her 24 h her seks için istediğiniz sayıyı kadar ayrı ulaşıldı. Kapakları üzerinde Konteyner yeri ve kapalı bırakın.
  2. Yetişkin kaplara ortaya çıkacak; onların seks kafesleri (şekil 2C) serbest bırakmadan önce onaylayın. Herhangi bir yetişkin cinsel olgunluğa ulaşmadan yanlış çıkması 24 saat içinde bir aspiratör ile sexed kaldırın. Cinsiyetler onayladıktan sonra yetişkin her 24 h kafesler bırakın.
  3. Wolbachiaelde etmek için-bir benzer genetik arka plan doğal bir popülasyon için virüslü koloniler outcross Wolbachiaekleyerek-enfekte dişilerini laboratuvar kolonilerden kafesleri için hastalık bulaşmamış tek erkek ovitraps içinde topladığı yumurta elde 500 kişi başına öngörülen yoğunluğu Bakımı alan39.
    1. Outcrossing en az % 87,5 genetik olarak alan nüfus39için benzer olan koloniler üretmek en az üç ardışık nesiller için yineleyin. Kritik: cinsiyetler bu aşamada doğru olduğundan emin olun (bkz. Adım 3.1).
  4. Kadın Ae. aegypti genellikle50çiftleşme saat içinde daha fazla inseminasyon için ateşe dayanıklı. Koloniler outcrossing izin için tüm erkekler eşit fırsat sağlamak kadın ve erkek için iki gün ayrı kafeslerde olgun ve kadın erkek kafesin içine Aspire edin.

4. kan besleme ve Oviposition

  1. En az üç gün önce kan olgun için yeterli zaman izin vermek için besleme son dişi sonra bekleyin. Kan çıkması uzun ömürlü22,24,49olumsuz yönde Wolbachia enfeksiyonları ile sivrisinek için özellikle aşırı ölüm önlemek için iki hafta içinde dişilerin yem. Şeker su bardağı besleme oranlarını artırmak için besleme önce gün kaldırın.
    1. Onların önkol dişi sivrisinekler beslemek izin vermek için kafesin içine eklemek için bir gönüllü sor. Çoğu kadın repletion 5 dk içinde beslemesi ama yavaş besleyiciler karşı seçim azaltmak için önkol kadar bütün kadınlar gözle görülür tıkanmış veya 15dk için kafese bırakın; lateks eldiven el ısırıkları korumak için isteğe bağlıdır ancak önerilir.
    2. İki gün sonra kan besleme, larva yetiştirme su içeren ve zımpara (şekil 1G) (veya filtre kağıdı (şekil 1 H)) bir şerit ile kaplı iki plastik bardak dişiler yumurtalarını bırakmak için kafes içine yerleştirin. Kısmen su nemli tutmak için zımpara şerit daldırın. Su oviposition Kupası dışında onların yumurta koyarlar dişiler önlemek için diğer kaynakları kaldırın.
      Not: bardak musluk suyu kullanılabilir ama larva yetiştirme su oviposition51,52 teşvik eder ve dişiler yumurtalarını daha zaman uyumlu olarak bırakmak.

5. yumurta toplama ve Klima

  1. Dişiler yumurta zımpara hemen su hattı üzerinde yatıyordu; toplamak ve hiçbir daha fazla yumurta koyulur kadar zımpara şeritler her gün değiştirin. Not Bu oviposition bir hafta kadar devam edebilir.
  2. Kısmen kuru zımpara şeritler tarafından yavaşça onları 30 kağıt havlu üzerinde kurutma s, yumurta çıkarmak değil için dikkat çekici. O zaman, şeritler sabıkası kuru kağıt havlu sarın ve yapışmalı plastik torba (şekil 1I) yerleştirin.
  3. Yumurta diseksiyon mikroskop (şekil 3) altında durumunu kontrol. Zımpara şeritler (şekil 3B) suda batık önce yumurtadan, ama eğer çok sert kurutulmuş yumurta (şekil 3 c) çökebilir çok ıslak vardır.
  4. Yumurta üç gün sonrası koleksiyonu ötesinde herhangi bir zamanda yumurtadan; Tüm gün boyunca su nesil bireylerin büyük, rasgele havuzundan örneklenir emin olmak için aynı kap içinde toplanan her koloni üzerinden tüm yumurtalar çatlar.
  5. Uzun süreli depolama için yumurta yüksek (> %80) nem, kapalı bir kapta yaklaşık 20 ° C'de tutmak Bu koşullar altında yumurta Wolbachia olmadan yüksek kapağı oranları53,54korurken birkaç ay depolanabilir.
  6. Bazı Wolbachia enfeksiyonlar, büyük ölçüde yaş49,55ile yumurta canlılığı azaltmak gibi Wolbachiagelen yumurtadan-enfekte satırları önlemek için ilgili aşırı ölüm koleksiyonunun bir hafta içinde suşları. Daha fazla yumurta gerekirse kan dişiler daha bir hafta sonra besleme.
Gün Adım
0 Kapak yumurta
1 Count larva tepsileri içine
7 Larva ve pupa koloni kafesleri için transfer
17 Kan kadın yetişkin feed
21 Yumurta toplama başlar
25 Yumurta toplama bitirmek
28 Kapak yumurta

Tablo 1: Genel bakış Ae. aegypti koloni bakım zamanlamayı 26 ° C. Kadın kan besleme ve yumurta hatching zamanlaması esnek olsa da, Bu aşamalar uzun süreler, özellikle ölüm en aza indirmek için Wolbachiaile enfekte sivrisinekler için kaçınılmalıdır. Bu programı aşağıdaki seçim şartıyla larva en iyi şekilde beslenir hızlı veya yavaş geliştirmek veya tüm yaşam evreleri olgun olan sivrisinek karşı en aza indirir.

Figure 1
Resim 1: Ae. aegypti laboratuvarda yetiştirme için kullanılan ekipman. (A)plastik kaplar yumurta kuluçkalık veya 500, hacimleri ile larva yetiştirme için kullanılan 750 ve 5000 mL (soldan sağa). (B) tepsiler larvalar genelde 500 larvalar 4 L su içinde kontrollü bir yoğunluk, yetiştirme için kullanılan. (C) 19,7 L ve konut yetişkinler için kullanılan (D) 3 L kafesleri. 25 yetişkin yoğunluğu veya litre başına daha az yeterli alan sağlamak için sağlanmalıdır. (E) 35 mL bardak su kaynağı olarak yetişkin için sağlanan nemli Pamuk yün ile. (F) 35 mL bardak şeker kaynağı olarak bir kordon veya diş fitil üzerinden sağlanan Sükroz çözümü ile. (G-H) Bardak larva yetiştirme su ve bir oviposition substrat zımpara veya filtre kağıdı ile kaplı (G ve H, sırasıyla). Zımpara şeritler ya da filtre kağıdı depolanmasında kullanılan (ben) Zip kilit çanta. Siyah noktalar zımpara üzerinde Sivrisinek yumurta vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Lateral (A) ve dorsal (B) görüş yetişkin Ae. aegypti (C) kendi cinsel dimorfizm gösteren ve pupa. Erkek, kadın her panelinde sağ ve sol konumlandırılır. Ne zaman en iyi şekilde fed, erkek ve dişi pupa boyutuna göre ayrılır; Dişiler daha erkek(a)daha büyük ve düz iki tarafın (B) olduğundan erkek için karşılaştırıldığında nispeten soğanlı bir cephalothorax. Erkek yetişkin öncelikle onların tüysü anten ve uzun dokunacı tarafından kolayca ayırt edici kadın tüm yetiştirme koşullarında üzerinden. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3. Farklı koşullar altında dört gün eski Ae. aegypti yumurta. (A)bozulmamış yumurta yüksek (> %80) nem, ama görünür herhangi bir nem olmadan tutulan zımpara şeritler üzerinde. Hatch oranları vahşi tipi Ae. aegypti için % 90'ı yukarıda düzgün muhafaza olmalıdır. Su (Erken gelişmiş tarama) sular altında önce yumurtadan (B) yumurta bir müstakil yumurta kap ve görünür larva tarafından ayırt edilir. Bu zımpara şerit çok nemli tutuldu gösterir. Çok sert kurutulmuş (C) yumurta çökebilir ve içbükey görünümlerini tarafından açıkça görülebilir. Zımpara sert olursa bu da yumurtaları çok kuru olabileceğini gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 4 Ae. aegypti larva gelişimine suboptimal beslenmenin etkisi gösterir. Ne zaman kapsayıcı gıda larva günlük başına 0,25 mg ile sağlanır veya daha az, hem kadın ve erkek için Geliştirme süresini artırır, ve daha az kaplar içinde zaman uyumlu gıda 0.5 mg ile sağlanır. Yeterli gıda larva geliştirme süresi boyunca sağlanmazsa, bu bakım planı üzerinde olumsuz bir etkisi olabilir. Yavaş gelişen bireylerin karşı seçilmiş olmanın riski vardır, kan besleme gecikebilir ve üreme oluşmadan önce yetişkin mortalite daha yüksek bir risk olduğunu.

Şekil 5 beslenme rejimleri çeşitli altında yetiştirilen Ae. aegypti yetişkin kanat uzunluğu (vücut büyüklüğü tahmini) gösterir. Kadın ve erkeklerde kanat uzunlukları önemli ölçüde azaltmak ve beslenme suboptimal olduğunda daha değişken olur. Tek tip gövde boyutları gibi vücut büyüklüğü olumlu verimlilik ile ilişkilidir ve büyük sivrisinek büyük fitness alanı koşulları33,34,35 altında sergi bekleniyor deneysel karşılaştırmalar için önemlidir .

Wolbachia enfeksiyonları yukarıdaki özellikleri üzerinde etkileri diğer çalışmalarda açıklanan ama genelde orada hiçbir etkisi23,39,49için küçük.

Figure 4
Şekil 4: Toplu oranda Ae.aegypti (A) kadın ve (B) erkek yetişkinliğe farklı gıda rejimleri 26 ° C'de altında geliştirme 100 larva 500 mL su (bir larva yoğunluğu mL başına 0.2 larva), gıda farklı seviyeleri ile sağlanan kaplarda yetiştirilen (bkz: malzemeler tablo) için onların geliştirme zaman giriş yaptı. Yetişkinliğe hayatta larva dahil edildi. Hata çubukları çoğu standart hataları, n ile tedavi başına 4 çoğaltır =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: Kanat uzunluğu Ae.aegypti (A) dişi ve erkek (B) farklı gıda rejimleri 26 ° C'de altında geliştirme 100 larva kapsayıcılarındaki 500 mL su (mL başına 0.2 larva bir larva yoğunluk) yetiştirilen ve gıda farklı seviyeleri ile sağlanan. Yetişkin alt kümesini sonra önceden açıklanan yöntemleri56kullanarak için onların kanat uzunluğu ölçüldü. Hata çubukları standart sapmalar vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada Wolbachiabakım için sunulan protokol sonrası-virüslü Ae. aegypti sağlamak tutarlı bir kalite sağlıklı sivrisinekler deneyler için üretilen ve açık alan bültenleri. (Bkz: başvuru57) sivrisinek miktarda üretim öncelik diğer iletişim kuralları aksine, onların zindelik, hem rahat yetiştirme koşulları uygulayarak ve arasında nesiller içinde en üst düzeye çıkarma yöntemleri odaklı akraba evliliği, seçim ve laboratuvar uyum en aza nesiller. Bu iletişim kuralı da Ae. aegypti ile Wolbachia enfeksiyonlar için özel olarak tasarlanmış ancak Ae. aegyptiherhangi bir türü için uygun olmalıdır. Ancak, nüfus bastırma57,58elde etmek yüksek sayılar gerektiren steril veya uyumsuz böcek sürümleri için gerekli olabilen kitle miktarları (sırasına göre her hafta milyonlarca), yetiştirme için uygun değildir.

Dikkatle takip edilmesi gereken bazı önemli adımlar vardır. En iyi şekilde larva yem ve gelişimleri süresince aşırı kalabalık önlemek önemlidir. Bu sivrisinekler zaman uyumlu olarak geliştirmek ve tutarlı bir boyutu vardır sağlayacaktır. Özel bakım da yumurta Klima alınmalıdır; larva çok yakında yumurtadan çok kolay ya da eğer oviposition yüzeylerde sırasıyla çok ıslak veya kuru, yumurta yazılıolduğu. İletişim kuralı tüm adımları her adımını tamamlamak için mümkün olduğunca koloni olarak birçok kişi için yeterli zaman izin öneririz. Seçim geliştirmek, olgun, yem kan, hayır veya yumurtadan yavaş bireyler karşı büyük olasılıkla genetik varyasyon kaybına neden.

Wolbachiabakım için daha fazla bazı konuları not-enfekte yukarıdaki iletişim kuralında açıklanmayan sivrisinekler. Laboratuar koloniler kaybolmasına Wolbachia enfeksiyonlar mümkündür ve bu nedenle kolonileri düzenli olarak kendi Wolbachia enfeksiyon durumunun izlenmesi önerilir. Nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR)49,59 her Wolbachiaen az 30 kişi test etmek için kullandığımız-enfekte satır her nesil. Herhangi bir kişi için uygun Wolbachia enfeksiyon negatif test ederseniz, koloniler etkilenen koloni üzerinden mümkün olduğunca çok sayıda kadın yalıtma ve sonra nesil kurmak döl gelen virüslü anneler sadece, kullanarak saf. Laboratuvar kolonilerden bazı Wolbachia suşlarının kaybının nedeni büyük ölçüde bilinmemektedir, fakat yüksek sıcaklıklar Wolbachia enfeksiyonlar47kaybına neden olabilir gibi sıcaklık kontrol, başarısızlık tarafından açıklanabilir, 60.

Bakım ne zaman yetiştirme değil yapmazsanız kolonileri ve deneyler de bireylerin farklı çizgiler ile kontamine. Kirlenme larva, yumurta, kafesleri mislabeling toplu işlemleri karıştırma dikkatsiz pipetting dan neden olabilir veya yanlış içinde pupa seks haçlar. Özel bu nedenle kolonileri farklı Wolbachia enfeksiyon türleri ile işlerken özen gösterilmelidir. İyice temiz tepsiler ve kafesleri, yeniden kullanma önce yetiştirme herhangi bir oviposition bardak larva her yeni tepsi tutmadan önce Pipetler temiz ve temiz kafes her zaman larva ve pupa diğer kapsayıcıları için transfer ederken. Ayrıca, zımpara gerçekleştirirken şeritler ve her kurutma şerit kafesler bırakmadan önce yetişkin doğru seks olduğundan emin olun ve herhangi bir kaçakların ile hızlı bir şekilde başa taze kağıt havlu kullanın parmak yumurta için kontrol edin. Bu önlemler alarak çoğu kirlenmesini önlemek ama kolonileri hala düzenli olarak tanı deneyleri59kullanarak takip edilmelidir.

Kadın Ae. aegypti yumurtalarını bırakmak için bir kan yemek gerektirir ve laboratuvarlar dünyanın her yerinden çeşitli şekillerde, membran besleme sistemleri57, ölçülü hayvanlar61 ve daha az bir ölçüde, yapay kan62 içlerinde sağlar . Ancak, sivrisinek deneysel Wolbachia enfeksiyonları ile sık sık kötü olmayan insan kanıyla gerçekleştirmek ve düşük verimlilik ve kapağı oranları ve Wolbachia eksik iletim için onların çoluk çocuk63, sergileyebilirler 64 , 65. receptiveness kadın insan kokuları da alan yayımlanacak sivrisinekler için önemlidir ve onları membran ya da diğer hayvan besleme bu yeteneği37uzlaşma bakımı. Diğer yöntemler bazı durumlarda gereklidir ama biz bu nedenle bu koloni bakım protokolü için insan gönüllü önkol kullanmayı tercih. Doğrudan arboviruses ile çalışırken, diğer yollarla kan tarafından sağlanan ve arboviruses transovarial iletim66oluşabilir gibi alan nüfus ile yüksek viral yük kolonileri kaynaklanan zaman özen gösterilmelidir. İletim riski olabileceğinden son arboviral endemik ülkeler ziyaret ettiğiniz insan gönüllü değil aynı zamanda kan akışı gerekir.

Bizim bakım protokol amaçları laboratuvar adaptasyon ve seçici baskıların en aza indirmek için ama geliştirilmesi için bir oda olduğunu. Leftwich vd. 42 daha fazla öneriler açık alan bültenleri sivrisinekler uygunluk Bakımı, daha farklı ve doğal larva diyetler kullanımı da dahil olmak üzere, Yetişkin kafeslerde yoğunluğunu azaltarak ve karmaşık bir ortam sağlar. Şu anda fitness değişiklikler nedeniyle laboratuvar adaptasyon burada açıklanan bakım Protokolü [Ross vd yayınlanmamış] altında kanıtı yok olsa bu hususlar Ae. aegypti fitness büyük bir seviyeye artırabilir. Bazı ek önlemler sınırlı alanlarda ve kaynakları ile laboratuarlar için mümkün olmayabilir ama yine de araştırmaya değer bulunmaktadır. Büyük nüfus boyutları Bakımı, protokolleri yetiştirme ve uygulama yoluyla büyük seçici baskıların kaçınarak periyodik alan sivrisinekler için outcrossing yüksek Ae. aegypti uygunluk açık alan bültenleri sağlamada yardımcı olmalıdır. İlkeleri yaklaşımda dahil diğer hastalık vektör türler yönetmek veya doğal nüfus bastırmak serbest bırakılması için yetiştirme için uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgements

Heng Lin Yeap, Chris Paton, Petrina Johnson ve Clare Doig bizim koloni bakım yöntemleri gelişmesine katkılarından dolayı ve el yazması geliştirmeye yardımcı olan öneriler için üç adsız yorumcular anıyoruz. Bizim araştırma programı hibe ve dostluk tarafından AAH için Ulusal Sağlık desteklenir ve tıbbi araştırma Konseyi ve bir çeviri Wellcome Trust verin. PAR bir Avustralya hükümeti araştırma eğitim programı bursu bir alıcı var.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wild type Aedes aegypti Collected from field locations in Queensland, Australia, see Yeap and others39 for details
w Mel-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Walker and others23 for information on the strain
w AlbB-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Xi and others21 for information on the strain
w MelPop-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to McMeniman and others22 for information on the strain
Instant dried yeast Lowan Stimulates egg hatching. Found in general grocery stores. Other brands may be used
5 L plastic tub Quadrant Q110950 Used for hatching and rearing larvae. Other products may be used
Fish Food (Tetramin Tropical Tablets) Tetra 16152 Provided to larvae as a source of food. Web address: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE
Plastic containers Used for rearing larvae. Any plastic container above 500 mL should be suitable
Glass pipette Used for transferring larvae and pupae between containers. Web address: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez
Clicker counter RS Pro 710-5212 Used to assist in the counting of larvae, pupae and eggs. Web address: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y
Rearing trays Gratnells Used for rearing larvae. Web address: http://www.gratnells.com
Nylon mesh Used to transfer larvae and pupae to containers of fresh water. Other brands may be used. Web address: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white
Cages BugDorm DP1000 Houses adult mosquitoes. Alternative products may be used. Web address: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html
35 mL plastic cup Huhtamaki AA272225 Used to provide water or sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
35 mL plastic cup lid Huhtamaki GB030005 Used to provide sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
Cotton wool Cutisoft 71841-13 Moist cotton wool is provided as a source of water to adults. Other brands may be used
White Sugar Provided as a source of sugar to adult mosquitoes. Found in general grocery stores
Rope M Recht Accessories C323C/W Used to provide sucrose solution to adults. Other brands may be used. Web address: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/
Plastic cup (large) Used as an oviposition container. Any plastic cup that holds 100 mL of water should be suitable
Sandpaper Norton Master Painters CE015962 Provided as an oviposition substrate. Alternative products may be used, but we use this brand because it is relatively odorless. Lighter colors are used for contrast with eggs. Web address: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html
Filter paper Whatman 1001-150 Used as an alternative oviposition substrate. Other brands may be used
Latex gloves SemperGuard Z560979 Prevents mosquito bites on hands when blood feeding. Other brands may be used. Web address: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mayer, S. V., Tesh, R. B., Vasilakis, N. The emergence of arthropod-borne viral diseases: A global prospective on dengue, chikungunya and zika fevers. Acta Trop. 166, 155-163 (2017).
  2. Campbell, L. P., et al. Climate change influences on global distributions of dengue and chikungunya virus vectors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370, (1665), (2015).
  3. Kraemer, M. U., et al. The global distribution of the arbovirus vectors Aedes aegypti and Ae. albopictus. eLife. 4, (2015).
  4. Carvalho, B. M., Rangel, E. F., Vale, M. M. Evaluation of the impacts of climate change on disease vectors through ecological niche modelling. Bull Entomol Res. 1-12 (2016).
  5. Scott, T. W., et al. Longitudinal studies of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in Thailand and Puerto Rico: population dynamics. J Med Ent. 37, (1), 77-88 (2000).
  6. Cheong, W. Preferred Aedes aegypti larval habitats in urban areas. Bull World Health Organ. 36, (4), 586-589 (1967).
  7. Barker-Hudson, P., Jones, R., Kay, B. H. Categorization of domestic breeding habitats of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in Northern Queensland, Australia. J Med Ent. 25, (3), 178-182 (1988).
  8. Watson, T. M., Marshall, K., Kay, B. H. Colonization and laboratory biology of Aedes notoscriptus from Brisbane, Australia. J Am Mosq Control Assoc. 16, (2), 138-142 (2000).
  9. Williges, E., et al. Laboratory colonization of Aedes japonicus japonicus. J Am Mosq Control Assoc. 24, (4), 591-593 (2008).
  10. Munstermann, L. E. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. Springer. 13-20 (1997).
  11. McDonald, P., Hausermann, W., Lorimer, N. Sterility introduced by release of genetically altered males to a domestic population of Aedes aegypti at the Kenya coast. Am J Trop Med Hyg. 26, (3), 553-561 (1977).
  12. Rai, K., Grover, K., Suguna, S. Genetic manipulation of Aedes aegypti: incorporation and maintenance of a genetic marker and a chromosomal translocation in natural populations. Bull World Health Organ. 48, (1), 49-56 (1973).
  13. Harris, A. F., et al. Field performance of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnol. 29, (11), 1034-1037 (2011).
  14. Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476, (7361), 454-457 (2011).
  15. O'Connor, L., et al. Open release of male mosquitoes infected with a Wolbachia biopesticide: field performance and infection containment. PLoS Negl Trop Dis. 6, (11), e1797 (2012).
  16. Morlan, H. B. Field tests with sexually sterile males for control of Aedes aegypti. Mosquito news. 22, (3), 295-300 (1962).
  17. Grover, K. K., et al. Field experiments on the competitiveness of males carrying genetic control systems for Aedes aegypti. Entomol Exp Appl. 20, (1), 8-18 (1976).
  18. Seawright, J., Kaiser, P., Dame, D. Mating competitiveness of chemosterilized hybrid males of Aedes aegypti (L.) in field tests. Mosq News. 37, (4), 615-619 (1977).
  19. Zhang, D., Lees, R. S., Xi, Z., Gilles, J. R., Bourtzis, K. Combining the sterile insect technique with Wolbachia-based approaches: II- a safer approach to Aedes albopictus population suppression programmes, designed to minimize the consequences of inadvertent female release. PloS One. 10, (8), e0135194 (2015).
  20. McGraw, E. A., O'Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. Nature Rev Microbiol. 11, (3), 181-193 (2013).
  21. Xi, Z., Khoo, C. C., Dobson, S. L. Wolbachia establishment and invasion in an Aedes aegypti laboratory population. Science. 310, (5746), 326-328 (2005).
  22. McMeniman, C. J., et al. Stable introduction of a life-shortening Wolbachia infection into the mosquito Aedes aegypti. Science. 323, (5910), 141-144 (2009).
  23. Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476, (7361), 450-453 (2011).
  24. Joubert, D. A., et al. Establishment of a Wolbachia superinfection in Aedes aegypti mosquitoes as a ppotential approach for future resistance management. PLoS Pathog. 12, (2), e1005434 (2016).
  25. Ferguson, N. M., et al. Modeling the impact on virus transmission of Wolbachia-mediated blocking of dengue virus infection of Aedes aegypti. Sci Transl Med. 7, (279), 279ra237 (2015).
  26. Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia Reduces Transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Sci Rep. 6, 28792 (2016).
  27. van den Hurk, A. F., et al. Impact of Wolbachia on infection with chikungunya and yellow fever viruses in the mosquito vector Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 6, (11), e1892 (2012).
  28. Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139, (7), 1268-1278 (2009).
  29. Mains, J. W., Brelsfoard, C. L., Rose, R. I., Dobson, S. L. Female Adult Aedes albopictus Suppression by Wolbachia-Infected Male Mosquitoes. Sci Rep. 6, 33846 (2016).
  30. Nguyen, T. H., et al. Field evaluation of the establishment potential of wmelpop Wolbachia in Australia and Vietnam for dengue control. Parasit Vectors. 8, 563 (2015).
  31. Garcia Gde, A., Dos Santos, L. M., Villela, D. A., Maciel-de-Freitas, R. Using Wolbachia releases to estimate Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) population size and survival. PloS One. 11, (8), e0160196 (2016).
  32. Hoffmann, A. A., Ross, P. A., Rašić, G. Wolbachia strains for disease control: ecological and evolutionary considerations. Evol Appl. 8, (8), 751-768 (2015).
  33. Briegel, H. Metabolic relationship between female body size, reserves, and fecundity of Aedes aegypti. J Insect Physiol. 36, (3), 165-172 (1990).
  34. Ponlawat, A., Harrington, L. C. Factors associated with male mating success of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. Am J Trop Med Hyg. 80, (3), 395-400 (2009).
  35. Segoli, M., Hoffmann, A. A., Lloyd, J., Omodei, G. J., Ritchie, S. A. The effect of virus-blocking Wolbachia on male competitiveness of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 8, (12), e3294 (2014).
  36. Imam, H., Zarnigar,, Sofi, G., Seikh, A. The basic rules and methods of mosquito rearing (Aedes aegypti). Trop Parasitol. 4, (1), 53-55 (2014).
  37. Spitzen, J., Takken, W. Malaria mosquito rearing-maintaining quality and quantity of laboratory-reared insects. Proc Neth Entomol Soc Meet. 16, 95-100 (2005).
  38. Lorenz, L., Beaty, B. J., Aitken, T. H. G., Wallis, G. P., Tabachnick, W. J. The effect of colonization upon Aedes aegypti susceptibility to oral infection with Yellow Fever virus. Am J Trop Med Hyg. 33, (4), 690-694 (1984).
  39. Yeap, H. L., et al. Dynamics of the "popcorn" Wolbachia infection in outbred Aedes aegypti informs prospects for mosquito vector control. Genetics. 187, (2), 583-595 (2011).
  40. Turley, A. P., Moreira, L. A., O'Neill, S. L., McGraw, E. A. Wolbachia infection reduces blood-feeding success in the dengue fever mosquito, Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 3, (9), e516 (2009).
  41. Yeap, H. L., Endersby, N. M., Johnson, P. H., Ritchie, S. A., Hoffmann, A. A. Body size and wing shape measurements as quality indicators of Aedes aegypti mosquitoes destined for field release. Am J Trop Med Hyg. 89, (1), 78-92 (2013).
  42. Leftwich, P. T., Bolton, M., Chapman, T. Evolutionary biology and genetic techniques for insect control. Evol Appl. 9, (16), 212-230 (2016).
  43. Calkins, C., Parker, A. Sterile Insect Technique. Springer. 269-296 (2005).
  44. Tun-Lin, W., Burkot, T., Kay, B. Effects of temperature and larval diet on development rates and survival of the dengue vector Aedes aegypti in north Queensland, Australia. Med Vet Entomol. 14, (1), 31-37 (2000).
  45. Richardson, K., Hoffmann, A. A., Johnson, P., Ritchie, S., Kearney, M. R. Thermal sensitivity of Aedes aegypti from Australia: empirical data and prediction of effects on distribution. J Med Ent. 48, (4), 914-923 (2011).
  46. Richardson, K. M., Hoffmann, A. A., Johnson, P., Ritchie, S. R., Kearney, M. R. A replicated comparison of breeding-container suitability for the dengue vector Aedes aegypti in tropical and temperate Australia. Austral Ecol. 38, (2), 219-229 (2013).
  47. Ross, P. A., et al. Wolbachia infections in Aedes aegypti differ markedly in their response to cyclical heat stress. PLoS Pathog. 13, (1), e1006006 (2017).
  48. Gjullin, C., Hegarty, C., Bollen, W. The necessity of a low oxygen concentration for the hatching of Aedes mosquito eggs. J Cell Physiol. 17, (2), 193-202 (1941).
  49. Axford, J. K., Ross, P. A., Yeap, H. L., Callahan, A. G., Hoffmann, A. A. Fitness of wAlbB Wolbachia infection in Aedes aegypti: parameter estimates in an outcrossed background and potential for population invasion. Am J Trop Med Hyg. 94, (3), 507-516 (2016).
  50. Degner, E. C., Harrington, L. C. Polyandry depends on postmating time interval in the dengue vector Aedes aegypti. Am J Trop Med Hyg. 94, (4), 780-785 (2016).
  51. Bentley, M. D., Day, J. F. Chemical ecology and behavioral aspects of mosquito oviposition. Ann Rev Entomol. 34, (1), 401-421 (1989).
  52. Wong, J., Stoddard, S. T., Astete, H., Morrison, A. C., Scott, T. W. Oviposition site selection by the dengue vector Aedes aegypti and its implications for dengue control. PLoS Negl Trop Dis. 5, (4), e1015 (2011).
  53. Meola, R. The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti. Ann Entomol Soc Am. 57, (4), 468-472 (1964).
  54. Faull, K. J., Williams, C. R. Intraspecific variation in desiccation survival time of Aedes aegypti (L.) mosquito eggs of Australian origin. J Vector Ecol. 40, (2), 292-300 (2015).
  55. McMeniman, C. J., O'Neill, S. L. A virulent Wolbachia infection decreases the viability of the dengue vector Aedes aegypti during periods of embryonic quiescence. PLoS Negl Trop Dis. 4, (7), e748 (2010).
  56. Ross, P. A., Endersby, N. M., Hoffmann, A. A. Costs of three Wolbachia infections on the survival of Aedes aegypti larvae under starvation conditions. PLoS Negl Trop Dis. 10, (1), e0004320 (2016).
  57. Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. J Vis Exp. (83), e3579 (2014).
  58. Benedict, M. The first releases of transgenic mosquitoes: an argument for the sterile insect technique. Trends Parasitol. 19, (8), 349-355 (2003).
  59. Lee, S. F., White, V. L., Weeks, A. R., Hoffmann, A. A., Endersby, N. M. High-throughput PCR assays to monitor Wolbachia infection in the dengue mosquito (Aedes aegypti) and Drosophila simulans. Appl Environ Microbiol. 78, (13), 4740-4743 (2012).
  60. Corbin, C., Heyworth, E. R., Ferrari, J., Hurst, G. D. Heritable symbionts in a world of varying temperature. Heredity. 118, (1), 10-20 (2017).
  61. Day, J. F., Edman, J. D. Mosquito engorgement on normally defensive hosts depends on host activity patterns. J Med Ent. 21, (6), 732-740 (1984).
  62. Gonzales, K. K., Hansen, I. A. Artificial diets for mosquitoes. Int J Environ Res Public Health. 13, (12), (2016).
  63. McMeniman, C. J., Hughes, G. L., O'Neill, S. L. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti disrupts mosquito egg development to a greater extent when mosquitoes feed on nonhuman versus human blood. J Med Ent. 48, (1), 76-84 (2011).
  64. Caragata, E. P., Rances, E., O'Neill, S. L., McGraw, E. A. Competition for amino acids between Wolbachia and the mosquito host, Aedes aegypti. Microb Ecol. 67, (1), 205-218 (2014).
  65. Suh, E., Fu, Y., Mercer, D. R., Dobson, S. L. Interaction of Wolbachia and bloodmeal type in artificially infected Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. (2016).
  66. Thangamani, S., Huang, J., Hart, C. E., Guzman, H., Tesh, R. B. Vertical transmission of Zika virus in Aedes aegypti mosquitoes. Am J Trop Med Hyg. 95, (5), 1169-1173 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics