En enkel neuronal mekanisk skada metodik att studera

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här beskriver vi en enkel och allmänt tillgänglig metod för att skada segmentala nerver i Drosophila larver för att visualisera och kvantifiera neurodegenerering av motorneuroner vid neuromuskulär korsning (NMJ) hos tredje instarlarver.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Danella, E. B., Keller, L. C. A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration. J. Vis. Exp. (125), e56128, doi:10.3791/56128 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Degenerationen av neuroner uppträder under normal utveckling och som svar på skada, stress och sjukdom. De cellulära kännetecknen för neuronal degenerering är anmärkningsvärt lika hos människor och ryggradslösa djur, liksom de molekylära mekanismerna som driver dessa processer. Fruktflugan, Drosophila melanogaster , ger en kraftfull, men enkel genetisk modellorganisme för att studera cellkomplexiteten hos neurodegenerativa sjukdomar. Faktum är att cirka 70% av sjukdomsassocierade humana gener har en Drosophila- homolog och en uppsjö av verktyg och analyser har beskrivits med användning av flugor för att studera mänskliga neurodegenerativa sjukdomar. Mer specifikt har den neuromuskulära korsningen (NMJ) i Drosophila visat sig vara ett effektivt system för att studera neuromuskulära sjukdomar på grund av förmågan att analysera de strukturella förbindelserna mellan neuron och muskel. Här rapporterar vi om en in vivo motor neuron skada analys i Drosophila , somReproducerbart inducerar neurodegenerering vid NMJ vid 24 timmar. Med hjälp av denna metod har vi beskrivit en tidssekvens av cellhändelser som resulterar i degenerering av motor neuron. Skademetoden har olika tillämpningar och har också använts för att identifiera specifika gener som krävs för neurodegenerering och att dissekera transkriptionssvar mot neuronskada.

Introduction

Neuronal degeneration uppträder under normal utveckling och kan orsakas av den naturliga åldringsprocessen, skada, stress eller sjukdomstillstånd. Drosophila melanogaster , den gemensamma fruktflugan, ger en enkel och kraftfull modellorganisme för att studera neurodegenerering på grund av de anmärkningsvärda likheterna i de molekylära mekanismerna som driver degenerationen av neuroner. Dessa likheter framhävs av det faktum att cirka 70% av sjukdomsassocierade humana gener har en Drosophila- homolog. 1 Dessutom har många analyser och tekniska verktyg för att studera mänskliga neurodegenerativa sjukdomar utvecklats och utnyttjats i Drosophila . 2 , 3 Inom Drosophila möjliggör neuromuskulär korsning (NMJ) analys av både cellulära och elektrofysiologiska egenskaper och har visat sig vara ett viktigt system för att studera neuromuskulär sjukdom på grund av det synliga nEuron-muskelförbindelser. 2 I denna studie beskriver vi en in vivo neuron skada analys i Drosophila larver som möjliggör reproducerbar skada av segmentala nerver. Denna motoneuronskada resulterar i en tidsmässig sekvens av cellulära händelser som resulterar i neurodegenerering vid NMJ 24 h efter skada. Förmågan att reproducerbart skada motoneuroner som resulterar i neurodegenerering har olika tillämpningar, såsom identifiering av specifika gener som erfordras för degenerativ processen, dissektionen av transkriptionella svar på neuronskada och analysen av skyddande signalkaskader. 4 , 5 , 6 Denna metod har också använts i kombination med mikrofluidika för att studera neuronal degenerering och regenerering hos levande djur. 7

Vi använder en etablerad kvantitativ analys för att undersöka motor neuron degeneratJon vid Drosophila NMJ efter mekanisk skada. Denna analys baseras på det faktum att förlust av presynaptiskt membran och proteiner föregår demontering av det subsynaptiska retiklet (SSR) som kännetecknas av postsynaptiska muskelmembranveckorna. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Denna analys möjliggör kvantifiering av "synaptiska fotavtryck" där den presynaptiska neuronen har förlorat koppling till den intilliggande postsynaptiska muskeln. Den degenerativa processen har visat sig vara progressiv genom larvalutveckling 12 och kan inte redovisas genom förändrad synapsutveckling eller spridning. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 AnnonsenUtseende för att använda mekanisk skada över tidigare existerande mutationer är att det möjliggör dissektion av den tidsmässiga sekvensen av cellulära händelser som leder till neurodegenerering vid NMJ. 13

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Framställning av reagens och utrustning

  1. Förbereda 1x Dissection buffert (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,02 mM CaCl2, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCOs 3, 115 mM sackaros, 5 mM trehalos, 5 mM HEPES; pH 7,2).
  2. Bered 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
  3. Förbered 1x PBT med 1x PBS med 0,01% Triton X-100.
  4. Förbered fruktsaftagarplattor. 14 Kortfattat, blanda 30 g agar i 700 mL H2O och autoklav. Lös 0,5 g metylparaben i 10 ml etanol och tillsätt lösningen till 300 ml fruktjuicekoncentrat (druv eller äpple). Blanda koncentrera till autoklaverad agarlösning och häll i locken på 10 mm x 35 mm petriskålar.
    OBS: Dricksagarförstärkningsförbrukningen kan också köpas från olika företag (se Tabls of Materials ).
  5. Få storlek 5 tångar som gör det möjligt för en att mekaniskt skada larverna.
  6. Använd standard Drosophila CO 2

2. Val av Drosophila Larvae

  1. Ta en injektionsflaska eller flaska Drosophila innehållande vandrande tredje instar larver som har odlats vid 25 ° C.
  2. Välj tio enskilda 2: a eller 3: e stadiet larver baserat på utseende. Tredje instar larver kan identifieras genom utseende av främre grenade spiracles, medan andra instar larver är mindre och har mer klubbliknande främre spiracles.
    OBS: Larvsteg kan också identifieras genom timing. Vid 25 ° C uppträder andra instarlarver ungefär 48 timmar efter kläckning och tredje instar larver smälter ungefär 24 timmar senare. Om man är intresserad av att undersöka neurodegenerering vid NMJ, måste andra instarlarver skadas.

3. Förberedelse av Drosophila Larvae för mekanisk skada

  1. Välj försiktigt enskilda larver upp med tång eller en pensel, var försiktigAtt inte komprimera det i alla fall.
  2. Placera tio larver direkt i glasfat som innehåller kall 1X PBS eller dissektionsbuffert för att avlägsna eventuella matrester och retardera larvalmotiliteten.

4. Mekanisk skada och behandling av Drosophila Larvae

  1. Placera varje enskild larva på en CO 2 -bedövningsapparat.
  2. Under ett dissekeringsmikroskop ska du noggrant rulla varje larva på sin dorsala sida för att visualisera de segmentala nerverna genom nagelbandet.
  3. Ställstorlek 5 tvingar ungefär 1/2 till 2/3 väg ner längden på larven som börjar vid munkrokarna. När du har placerats klistrar du ungefär 1/3 av den ventrala kutiklet som innehåller segmentna nerver med storlek 5 tångar.
    1. För att försäkra sig om att larvssegmentala nerver skadas, applicera tillräcklig kraft för att krossa de segmentala nerverna men lämna nagelbandet intakt. För att bestämma rätt mängd kraft, krossa 10 larver och se tillDödsfallet efter 5 timmar är under 50%.
  4. Efter skada överför försiktigt larver till en fruktjuiceagarplatta innehållande ungefär 0,5 g jästpasta. Placera varje larva så dess främre ände ligger på jästpasta, för fortsatt utfodring trots störd rörlighet.
    ANMÄRKNING: För att säkerställa att larvssegmentala nerver har skadats kan störd larvmotilitet observeras efter överföring till agarplattan. Skadad larva är effektivt förlamad bakom skadan, men kan fortfarande flytta sina munkrokar och mata. En hög dödshastighet av djur efter skada är vanlig så det är bäst att skada 20-50% fler djur än vad som är nödvändigt för ett experiment.
  5. Placera agarplattor som innehåller jästpasta och 10 skadade larver i botten av en tom 100 x 15 mm petriskål. Täck den här petriplattan, som nu innehåller de skadade larverna på en agarplatta med en fuktig pappershandduk, så att pappershandduken inte rör larverna eller agarplattorna. Placera dettaPetriskål i en större lufttät behållare, vid RT.
  6. Hämta larver för dissektion efter specificerade perioder (6, 12 eller 24 h) efter skada.
    OBS! För att undersöka omedelbara effekter av skador på axonal cytoskelet kan larver dissekeras direkt efter skada. För att undersöka axonala transportfel kan larver dissekeras ca 6 timmar efter skada. Ca 12 h efter skada kan en uppbyggnad av ubiquiterade proteiner observeras och 24 h efter skada kan degenerering av motorneuroner hos NMJ observeras.

5. Analys av neurodegenerering vid NMJ

  1. Dissekt Drosophila larval NMJ som beskrivits tidigare. 15 , 16 Kortfattat, tappa larver på en Sylgard-platta, skära längs dorsalytan och filé med tappar i en droppe dissektionsbuffert för att exponera kroppsväggsmuskulaturen. Fix larver i antingen 4% paraformaldehyd (PFA) eller Bouins lösning beroende på antiKroppar används för att visualisera neuroner och muskler.
    OBS! PFA-fixering ska användas om fluorescerande proteinmarkörer, såsom grönt fluorescerande protein (GFP) ska visualiseras som Bouins fixativ kan vara för hård.
  2. Utför immunofluorescens, som har beskrivits tidigare 11 , 13 , 16 , för att samtidigt markera presynaptiska motorneuroner och intilliggande postsynaptiska (SSR) muskelveckor. Visualisera presynaptiska membraner och axoner med fluorescenskonjugerad pepparrotsperoxidas (HR: s) (1: 300) 17 och aktiva zoner kan färgas med användning av en anti-Bruchpilot (Brp) antikropp (nc82; 1: 100; Development Studies Hybridoma Bank). Samtidigt märka postsynaptiska muskler med en anti-Dics Large (Dlg) antikropp (1: 10,000). 18
  3. Utför en etablerad analys för att kvantifiera neurodegenerering vid NMJ som beskrivits tidigare. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Visualisera samtidigt individuella NMJ för både pre- och postsynaptiska fack. Eventuella bocker märkta med postsynaptiska markörer men inte presynaptiska markörer indikerar ställen för neurodegenerering ( Figur 1 ). Det genomsnittliga antalet boutons per NMJ samt det genomsnittliga antalet NMJ per djur kan kvantifieras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med hjälp av det förfarande som presenteras här har vi visat att mekanisk neuronskada möjliggör temporal dissektion av neurodegenerativa händelser. 14 , 18 Sekvensen av händelser har tidigare karaktäriserats och börjar med en omedelbar störning av cytoskeleten, följt av axonala människofel, en ackumulering av ubiquiterade proteiner och efterföljande neurodegenerering 24 h efter skada. Före skada visar WT NMJs den presynaptiska aktiva zonmarkören Brp i apposition till den postsynaptiska markören Dlg genom hela NMJ ( Figur 1A ). Mekanisk skada av segmentna nerver kan inducera måttlig till svår neurodegenerering, i vilken bollar färgade med Dlg saknar nu det presynaptiska aktiva zonen protein Brp ( Figur IB ). Varje bouton som är färgad med Dgg men saknar Brp-färgning anses vara en "synAptic fotavtryck" och kan räknas och kvantifieras som en neurodegenerativ händelse. Både frekvensen och svårighetsgraden av den neurodegenerativa fenotypen kan kvantifieras såsom beskrivits tidigare. 11

Figur 1
Figur 1: Mekanisk neuronskada inducerar neurodegenerering vid NMJ i muskel 6/7. ( A ) Oinjorda NMJ visar den presynaptiska aktiva zonmarkören, Brp (grön) i apposition med postsynaptisk markör, Dlg (röd) under hela NMJ. ( B ) Neuronal mekanisk skada inducerar neurodegenerering indikerad av Dgg färgade boutons (röd) med förlusten av Brp. Arrowheads indikerar enskilda platser för neurodegenerering. Skala bar = 10 μm. Vänligen klicka här för att se en större version avden här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den neuronella mekaniska skada som beskrivits tidigare och demonstreras här kan användas för att inducera skada / stress i segmentens nerver hos Drosophila larver. 4 , 5 , 6 , 14 Denna experimentella teknik har tidigare använts för att dissekera den tidsmässiga sekvensen av händelser som leder till neurodegenerering, såväl som att undersöka transkriptionsförändringar i motorneuroncellcellerna efter skada. 5 , 14 Dessutom har denna teknik beskrivits i samband med mikrofluidik-chips för att observera och studera axonal degenerering och regenerering i Drosophila larver. 7 Begränsningar av denna teknik inkluderar larvernas död på grund av punktering av cuticle under införandet av skadan. Dock kan ett stort antal larver krossas i en shOrt tidsperiod för att övervinna en hög larver dödsfall. En modifiering som vi har inkluderat är skadan av 2 nd instar eller tidigt 3: e instar larver, som är kritisk för att visualisera motorneurondegeneration på NMJ, vilket sker 24 h efter skada.

Här visar vi att neuron mekanisk skada kan användas för att studera motor neuron degenerering vid NMJ. Vi använder en etablerad metod för att kvantifiera neurodegeneration som utnyttjar det faktum att neuroner och deras associerade proteiner degenererar snabbare än den intilliggande muskeln. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 För att observera och kvantifiera neurodegenerering är det kritiskt att NMJ färgas samtidigt för både pre- och postsynaptiska markörer. Här, vi dEmonstrera användningen av den aktiva zonmarkören Brp och den postsynaptiska markören Dlg, men det finns en mängd andra pre- och postsynaptiska markörer som kan användas för att studera neurodegenerering vid NMJ. Dessutom kan fluorescensmärkta molekyler av ett val användas för att studera deras effekter under den neurodegenerativa processen. Det finns mer komplicerade metoder för att studera degenerering efter axonskada, såsom mikrofluidics 7 , men vår metod har flera fördelar: 1) det är mycket billigt, 2) de flesta Drosophila- laboratorier har redan den nödvändiga utrustningen och 3) vävnaden är fast så Konventionell fluorescensmikroskopi kan användas för att kvantifiera neurodegenerativa händelser efter skada.

Vi ser att detta protokoll kan anpassas för att undersöka ett brett spektrum av cellulära och molekylära mekanismer relaterade till neurodegenerering efter skada. I synnerhet kan dessa metoder användas för att undersöka behAvior av något fluorescensmärkta protein före och efter neuronal skada och motor neuron degenerering och regenerering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja.

Acknowledgments

Vi skulle vilja tacka alla medlemmar av Keller och Magie Labs på Quinnipiac University för användbara förslag. I synnerhet vill vi tacka Barron L. Lincoln II för utveckling av denna skadaanalys inom Keller Lab. Vi vill också tacka Quinnipiac University College of Arts och Science Grant-In-Aid tilldelat LC Keller.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro-dissecting scissors Fine Science Tools 15000-08
Dumont #3 Forceps Fine Science Tools 11231-30 Some people prefer size 3, while others prefer size 5
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-30 Some people prefer size 3, while others prefer size 5
CO2 Air Tank Tech Air UN 1013 Various tank sizes can be purchased
CO2 Anesthetizing Apparatus Genesee Scientific 59-114
Stainless-steel pins, size 0.1 Fine Science Tools 26002-10
SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent Dow Corning 3097358-1004 To pour dissecting plates
Bouin's Solution Sigma HT 10132-1L Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA
4% Paraformaldehyde (PFA) in Phosphate-Buffered Saline (PBS) Affymetrix FLY-8030-20 Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA
Dissecting Stereo MIcroscope AmScope SM-1BZ
Light Source AmScope HL150-AY-220V
anti- nc82 antibody Developmental Studies Hybridoma Bank nc82-s
anti-discs large antibody Developmental Studies Hybridoma Bank AF3
Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase Jackson Immunoresearch 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647
Flystuff Grape Juice Agar Premix Genesee Scientific 47-102
Microscope slides Genesee Scientific 29-101
Glass Coverslips Fisher Scientific 12-545-87
Thermo Scientific Nalgene Utility Box Fisher Scientific 03-484C Used to create humid chamber for larval recovery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bier, E. Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6, (1), 9-23 (2005).
  2. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9, (3), 235-244 (2016).
  3. McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201, (2), 377-402 (2015).
  4. Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74, (6), 1015-1022 (2012).
  5. Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191, (1), 211-223 (2010).
  6. Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J Neurosci. 32, (2), 610-615 (2012).
  7. Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
  8. Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactic is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34, (5), 729-741 (2002).
  9. Eaton, B. A., Davis, G. W. LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor. Neuron. 47, (5), 695-708 (2005).
  10. Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization. Curr Biol. 15, (10), 918-928 (2005).
  11. Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58, (2), 195-209 (2008).
  12. Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton. J Cell Biol. 187, (1), 101-117 (2009).
  13. Lincoln, B. L. 2nd, Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction. J Exp Neurosci. 9, Suppl 2. 1-9 (2015).
  14. Drosophila apple juice-agar plates. Cold Spring Harb Protoc. (2011).
  15. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
  16. Smith, R., Taylor, J. P. Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction. J Vis Exp. (50), (2011).
  17. Jan, L., Jan, Y. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. 79, (8), 2700-2704 (1982).
  18. Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13, (4), 823-835 (1994).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics