انجذاب شرائح لتحديدكم ساندويتش متعدد خالية إلى reactivity المشتركة وخالية من نصاب

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

علينا أن نظهر تكنولوجيا رقاقة المفاجئة لأداء تحديدكم ساندويتش متعدد خالية إلى reactivity المشتركة ببساطة العض شريحتين. جهاز الأداة تستخدم لنقل المواد الكاشفة موثوق من ميكرواري إلى ميكرواري. يمكن استخدام شرائح إضافية لأي من التفاعلات الكيميائية الحيوية التي تتطلب كولوكاليزيشن كواشف المختلفة دون التلوث عبر.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Li, H., Bergeron, S., Larkin, H., Juncker, D. Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays. J. Vis. Exp. (129), e56230, doi:10.3791/56230 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وقد أظهرت تحليل البروتين متعدد متفوقة التشخيص حساسية ودقة مقارنة بالبروتينات وحيدة. جسم [ميكروارس] السماح للآلاف من الصغر تحديدكم تنفيذها في وقت واحد على شريحة واحدة. تنسيق المقايسة ساندويتش يحسن خصوصية الفحص عن طريق الكشف عن كل هدف مع اثنين من الأجسام المضادة، ولكن يعاني من ه بين الكواشف مما يحد من قدراتها المتنوعة. جسم كولوكاليزيشن ميكرواري (ACM) قد وضعت للكشف عن البروتين متعدد خالية إلى ريكتيفيتي المشتركة، ولكن يتطلب نصاب مكلفة في الموقع لتلفيق ميكرواري خلال فحوصات. في هذا العمل، ونظهر تكنولوجيا رقاقة المفاجئة التي تنقل الكاشف من ميكرواري إلى ميكرواري ببساطة أطباق رقائق اثنين معا، وبالتالي يلزم لا نصاب أثناء حضانة عينة والطلب اللاحق للكشف عن الأجسام المضادة (اللمسات) عند تخزين الشرائح السابقة رصدت، الناي بإعداد الشرائح من تنفيذ المقايسة. يتم عرض كلا أساليب نقل مفردة ومزدوجة تحقيق المواءمة الدقيقة بين [ميكروارس] اثنين وشرح لتصنيع الشرائح لكلا الأسلوبين. وتبين النتائج أن < قد تحقق 40 ميكرومتر المحاذاة مع نقل مزدوجة، والوصول بكثافة صفيف من 625 البقع/سم2. وأجريت المناعة 50-بليكسيد لإثبات إمكانية استخدام رقاقة المفاجئة في تحليل البروتين متعدد. حدود الكشف عن البروتينات 35 في نطاق بيكوغرام/مل.

Introduction

قد توفر فريق يتألف من البروتينات المتعددة المؤشرات الحيوية أعلى حساسية وخصوصية من العلامات البيولوجية واحدة في تشخيص الأمراض المعقدة مثل السرطان1،2. وقد مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم (إليزا) معيار الذهب التكنولوجيا المستخدمة في المختبرات السريرية تحقيق حد كشف في انخفاض بيكوغرام/مل في البلازما، ولكن حدود لهدف واحد كل مقايسة3،،من45. وقد وضعت جسم [ميكروارس] لاستيعاب الآلاف من المنمنمة فحوصات أجريت بالتوازي على مجهر واحد شريحة6،،من78. ومع ذلك، محدودة القدرة المتنوعة لهذا الأسلوب التي يحركها كاشف ه، الناشئة عن تطبيق مزيج اللمسات، ويصبح أكثر إشكالية مع عدد متزايد من أهداف9،10 , 11-جيش التحرير الشعبي الصيني وآخرون. وقد ذكر أن ضعف الناتج مقايسة ساندويتش متعدد المقاييس ك 4N(N-1) حيث N هو عدد الأهداف12.

للتخفيف من ه في جسم [ميكروارس], جسم كولوكاليزيشن ميكرواري وضعت (ACM) في المختبر ل المقايسة ساندويتش متعدد12. التقاط الأجسام المضادة (سيارات الأجرة) رصدت على الركازة مع نصاب ميكرواري. بعد تطبيق عينات حظر على السطح، وثم رصدت اللمسات الفردية على البقع نفسها مع المجمع مستضد cAb. يمكن تخفيف جميع السيناريوهات ه بين الأضداد والمستضدات مع ACM، وحدود الكشف في pg/mL قد تحققت. ومع ذلك، يتطلب البروتوكول المقايسة إعداد واكتشاف اللمسات أثناء تجارب باستخدام نصاب ميكرواري في الموقع بدقة عالية لغرض المحاذاة، ومكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، وتحد من التطبيق الواسع النطاق لهذه التكنولوجيا في مختبرات أخرى. ACM يده، يدعى رقاقة المفاجئة وضعت للمشتركة الحرة reactivity وخالية من نصاب متعدد ساندويتش تحديدكم13،،من1415. سيارات الأجرة واللمسات مسبقاً رصدت على شريحة مقايسة وشريحة نقل على التوالي في تنسيق ميكرواري وتخزينها. أثناء الفحص، يتم استرداد الشرائح ونقلت ميكرواري اللمسات جماعياً على شريحة المقايسة ببساطة العض رقائق اثنين معا. يستخدم جهاز المفاجئة لنقل كاشف موثوق بها. استخدمت الشرائح النيتروسليلوز المغلفة بقدرة ربط جسم كبيرة نسبيا كالشرائح المقايسة لامتصاص قطرات السائل ومما ييسر نقل الكاشف، بيد الشرائح أكثر تكلفة من الشرائح الزجاجية العادية وميكرواري الماسحات الضوئية المتوافقة مع الشرائح غير الشفافة ضرورية للحصول على إشارة.

في هذا العمل، ونظهر البروتوكول المنفذ المناعة ساندويتش متعدد مع شريحة إضافية. قد وضعت جهاز رواية مبكرة لنقل كاشف أكثر ملائمة وموثوق بها من ميكرواري إلى ميكرواري. الأهم من ذلك، أنشأنا هنا طريقة نقل الكاشف على الشرائح الزجاجية العادية مع رقاقة المفاجئة. البقع 1024 تم بنجاح نقل والانحياز إلى شريحة زجاج، إلى حد كبير توسيع نطاق استخدام هذه التكنولوجيا في معظم المختبرات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تصنيع وتخزين المفاجئة رقائق

  1. طريقة نقل واحد ( الشكل 1a)
    1. بقعة cAb الحلول التي تحتوي على 400 ميكروغرام/مل أجسام والجلسرين 20% في المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS) على من النيتروسليلوز (أو كوب فونكتيوناليزيد) الشريحة المقايسة مع نفث حبر ميكرواري نصاب 13 في رطوبة النسبية 60% (1.2 nL لكل بقعة) مع 800 ميكرون مركز إلى مركز المباعدة بين الولادات. تأكد من أن يتم إصلاح الشريحة على سطح السفينة نصاب وفقا لزاوية واحدة (هنا، استخدمت الزاوية اليسرى السفلية).
    2. احتضان الشريحة المقايسة رصدت في درجة حرارة الغرفة ح 1 مع رطوبة النسبية 60%-
    3. المشبك طوقا شريحة الوحدة نمطية مع مقصورات 16 على الشريحة المقايسة لتقسيمه إلى 16 بئرا. شطف الشريحة ثلاث مرات بإضافة 80 ميليلتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1% 20 توين (ببست) في كل منهما جيدا، وتهتز عند 450 دورة في الدقيقة في شاكر، 5 دقيقة في كل مرة.
    4. ميليلتر إضافة 80 من عرقلة الحلول كل خير ويهز ح 1 450 لفة في الدقيقة-
    5. إزالة طوقا والجاف للشريحة المقايسة مع تيار نيتروجين.
    6. إصلاح شريحة نقلها على سطح السفينة نصاب
    7. ودفع الركن الأيسر السفلي من الشريحة ضد الزاوية السفلية اليسرى من سطح السفينة نصاب. نفث الحبر بقعة صفيف من محاذاة علامات (حلاً خرز الصغير البوليستيرين) مع نفس تخطيط أن لسيارة أجرة.
    8. واسمحوا
    9. علامات محاذاة الجاف. الوجه نقل الشريحة ووضعها مرة أخرى على سطح السفينة نصاب، تحديد ضد الزاوية اليسرى السفلي-
    10. إعداد الدأب اكتشاف الحلول التي تحتوي على 20 ميكروغرام/مل الأجسام المضادة والجلسرين 20% 1% جيش صرب البوسنة-
    11. استخدام نصاب ' s الكاميرا، اتخاذ صورة لعلامة المحاذاة. تنفيذ هذه الصورة في برنامج اكتشاف كالاعتماد والحصول على نظام التعرف على الصورة نصاب النافثة للحبر لتحديد علامة الأيسر العلوي أكثر. استخدام تنسيق لها كالمكان الأول في الصفيف الدأب. NL بقعة 8 كل قطره مع مسافة 800 ميكرون مركز إلى مركز-
  2. طريقة نقل مزدوجة ( الشكل 1b)
    1. مكان نقل شريحة 1 على سطح السفينة نصاب inkjet على الركن الأيسر السفلي. بقعة حلول سيارات الأجرة التي تحتوي على 400 ميكروغرام/مل الأجسام المضادة والجلسرين 20% 1% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني على الشريحة مع نصاب ميكرواري النافثة لحبر في رطوبة النسبية 60% (0.4 nL لكل بقعة و ~ 200 ميكرومتر في القطر). مركز إلى مركز التباعد هو 400 ميكرون.
    2. المفاجئة نقل مع النيتروسليلوز المغلفة (أو كوب فونكتيوناليزيد) المقايسة شريحة باستخدام جهاز المفاجئة ( الشكل 2) لنقل قطرات مقصورة على شريحة المقايسة.
      1. بدوره كل ستة أزرار على جانب الجهاز أداة إضافية بمقدار 90 درجة لسحب وقفل جميع بلونجيرس في موقف فتح. إدراج الشريحة نقل حامل الشرائح في وعاء به مع الزاوية المقطوعة التي تواجه دبوس بوجو الثابتة. تشغيل أول مجموعة من الأزرار الثلاثة للإفراج عن بلونجيرس مع دبوس بوجو الذهبي وتأكد من أن الشرائح يتم الضغط ضد دبابيس المحاذاة.
      2. إدراج شريحة المغلفة النيتروسليلوز في الأداة جهاز رأسا يجلس على دبابيس بوجو 4. تشغيل المجموعة الثانية من ثلاثة أزرار للإفراج عن بلونجيرس مع دبوس فضة وتأكد من أن الشرائح يتم الضغط ضد دبابيس المحاذاة.
      3. إغلاق الجهاز الأداة عن طريق وضع شل الأعلى على حامل الشرائح باستخدام أعمدة المحاذاة وثقوب لتحديد المواقع بدقة.
      4. إدراج الجهاز الأداة مغلقة في قفصة ودفع علامة الإغلاق تماما أسفل جلب [ميكروارس] وجها لوجه مع ممارسة الضغوط المناسبة. تبقى مغلقة للحد الأدنى 1
    3. فصل الشرائح. احتضان الشريحة المقايسة في درجة حرارة الغرفة ح 1 مع رطوبة النسبية 60%. أغسل وكتلة جافة الشريحة المقايسة كما هو موضح في الخطوات 1-1-3-1-1-5-
    4. مكان آخر نقل الشريحة على سطح نصاب النافثة للحبر ودفع ضد الركن الأيسر السفلي. حلول الدأب الموضعية التي تحتوي على 50 أو 100 ميكروغرام/مل من الأجسام المضادة (انظر الجدول 1) والجلسرين 20% 1% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني. التأكد من أن كل بقعة 0.8 nL ومركز إلى مركز التباعد بين البقع هو 400 ميكرون.
    5. تخزين
    6. الفحص ونقل الشريحة. ختم المقايسة ونقل الشرائح في محكم حقيبة تحتوي على ديسيككانت، ووضع في ثلاجة-20 درجة مئوية-

2. متعدد تحديدكم مع رقائق الأداة

  1. استرجاع الشريحة المقايسة من الثلاجة. اترك حقيبة مختومة لمدة 30 دقيقة حتى يأتي الشريحة إلى درجة حرارة الغرفة.
  2. المسلسل 7-نقطة
  3. تحضير تمييع عينة حلول النتوءات البروتينات في برنامج تلفزيوني تحتوي على 0.05% توين-20-
    ملاحظة: هنا، 5 إضعاف إضعاف هو استخدام عامل. تركيزات الانطلاق لكل البروتين وترد في الجدول 1-
  4. تحضير العينة الحلول حسب الاقتضاء. على سبيل المثال، يؤدي إلى تمييع مصل الدم البشري 4 مرات في المخزن المؤقت ببست.
  5. المشبك طوقا 16-مقصورة على الشريحة المقايسة.
  6. تعبئة عمود واحد من 8 آبار مع البروتين 7 إضعاف الحلول وحل عازلة خالية من البروتين ببست بيبيتينج. "الماصة؛" الحلول عينة في 8 آبار أخرى على الشريحة نفسها-
    ملاحظة: يمكن أن يكون لائقاً 80 ميليلتر الحلول في كل بئر. يمكن استخدام الشرائح أكثر لقياس عينات إضافية عند الضرورة.
  7. احتضان العينات على شاكر 450 لفة في الدقيقة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 ° C. أغسل الشريحة ثلاث مرات مع ببست على شاكر 450 لفة في الدقيقة، 5 دقيقة في كل مرة. إزالة طوقا والجاف للشريحة تحت تيار غاز النيتروجين.
  8. استرداد
  9. نقل الشريحة مع اللمسات من الثلاجة. الاحتفاظ بحقيبة مختومة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم احتضان الشريحة في دائرة مغلقة (مثل مربع فارغ نصائح) التي تحتوي على 60% رطوبة حبات الاستقرار لمدة 20 دقيقة الإماهة.
  10. المفاجئة نقل الشريحة مع الشريحة الفحص باستخدام جهاز المفاجئة ( الشكل 2) لنقل قطرات الدأب. راجع المقطع 1.2.2 لتشغيل الأجهزة الإضافية-
  11. فصل الشرائح. احتضان الشريحة المقايسة في دائرة مغلقة التي تحتوي على 60% رطوبة الاستقرار الخرز حاء 1 المشبك الشريحة المقايسة مع طوقا 16-المقصورة وشطف الشريحة 4 مرات استخدام ببست في شاكر 450 لفة في الدقيقة، 5 دقيقة في كل مرة.
  12. ميليلتر ماصة 80 من الحلول التي تحتوي على 2.5 ميكروغرام/مل ستريبتافيدين فلوروفوري في برنامج تلفزيوني في كل بئر. احتضان لمدة 20 دقيقة على شاكر 450 لفة في الدقيقة-
  13. شطف الشريحة 3 مرات مع ببست ومرة بماء مقطر على شاكر 450 لفة في الدقيقة. إزالة طوقا والجاف شريحة باستخدام غاز النيتروجين.

3. شريحة بيانات المسح والتحليل

  1. تفحص الشريحة المقايسة مع الماسح ضوئي ميكرواري الأسفار باستخدام الليزر-635-شمال البحر الأبيض المتوسط-
  2. استخراج صافي كثافة كل نقطة باستخدام برامج (مثل محلل برو الصفيف) تحليل 16-
  3. حساب الحد الأقصى للكشف (اللد) من البروتين كل استخدام برمجيات الإحصائية وتحديد تركيزات البروتين في العينات-
    ملاحظة: اللد يعرف التقاطع Y لمعيار الاتحاد الجمركيrve بمقدار ثلاثة إضعاف الانحراف المعياري لثلاثة فحوصات مستقلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد في الشكل 1إجراء فحص واحد وضعف أساليب نقل. في نقل واحدة، رصدت سيارة أجرة مباشرة على الشريحة المقايسة وينقلون اللمسات على شريحة المقايسة عند استخدامها في نمط مرآة من سيارات الأجرة (الشكل 1a). مطلوب إجراء نقل واحد فقط، ولكن هذا الأسلوب يعاني من اختلال بين اثنين [ميكروارس]، الناجمة أساسا عن اختلال الزاوي بين الشريحة والهزال النافثة للحبر (الشكل 2). نهج واحد للتصدي لهذا التحدي لنقل سيارات الأجرة واللمسات تسلسلياً على شريحة الفحص بعد اكتشاف وتحديد الشرائح في الجهاز الأداة الإضافية بشكل صحيح (الشكل 1b). باستخدام هذا الأسلوب، يتم نقل كلا [ميكروارس] بالضبط نفس الموقف. لا صورة الاعتراف بالنظام أو محاذاة علامة مطلوب لطريقة نقل مزدوجة. وكان اختلالها 98 في المائة من المواقع داخل 41 ميكرومتر، 6-fold تحسنا مقارنة ب أسلوب نقل واحد14.

جهاز المفاجئة، قد صمم ليكون سهل الاستخدام من دون أي تدريب، والتقليل من خطر اختلال الصفيف. وجلبت الشرائح جنبا إلى جنب مع تحديد المواقع الدقيقة وبفضل دبابيس المحاذاة شيوعاً للمقايسة ونقل الشرائح. نقل الشريحة أصغر قليلاً لتناسب أسفل الشريحة المقايسة عندما علقت بدبابيس بوجو، حتى يتم إغلاق الجهاز الأداة الإضافية. يتم تضمين فاصل على نقل الشريحة الإبقاء على فجوة الحجم ميكرومتر التي تسمح بنقل الحبرية موثوقة للشريحة الزجاجية. وأخيراً، القفص وإغلاق التبويب مصممة بحيث تنطبق الضغط اللازم لنقل فعالة في كل أداة إضافية لنقل استنساخه وعالية الجودة. صور للأجهزة الإضافية يظهر في الشكل 3.

تظهر الصور التمثيلية التي توضح نتائج نقل الكاشف على شريحة النيتروسليلوز وشريحة زجاجية في الشكل 4. 532 أليكسا المسمى إيجس واستخدمت الكاشف الأول، واستخدمت 647 أليكسا المسمى IgGs الكاشف الثاني. بعد نقل، تم مسحها ضوئياً الشريحة مع 532 نانومتر و 635 نانومتر الليزر. والنتيجة تبين أن 3136 (بالنسبة للشريحة النيتروسليلوز) أو 1024 (بالنسبة للشريحة الزجاجية) نقلوا ميكروسبوتس مع فشل صفر على الشرائح المقايسة وليس التلوث عبر لوحظ عند نقل الكاشف الثاني. عند استخدام الشرائح الزجاجية، من الممكن إنشاء سطح الماء أكثر من الروغان، مما يقلل من حجم كل بقعة وتقليل المسافة بقعة إلى بقعة لنقل عدد أكبر من النقاط. يوسع هذا العمل تطبيق تكنولوجيا رقاقة المفاجئة إلى ركائز الزجاج شائعة الاستخدام.

المنحنيات القياسية لسرطان الثدي تستهدف المناعة 50-من نوع plex المتعلقة بالبروتينات موضحة في الشكل 5، المقابلة لأكبر ساندويتش متعدد جسم ميكرواري حتى الآن دون ه. تم استخدام أسلوب نقل مزدوج في هذا التحليل، الشريحة تم مسحها ضوئياً، وشدة الأسفار كان كمياً لتوليد المنحنيات القياسية. البروتينات 35 من أصل 50 لودس وصلت pg/mL (انظر الجدول 1)، ويمكن تحسينها عن طريق تحسين ظروف المقايسة. يسهل استخدام أزواج الأضداد متعددة على شريحة واحدة دون ه كولوكاليزيشن كواشف ويتيح الاستفادة المثلى من كل زوج بشكل مستقل مع عدم التدخل في أزواج الأخرى12. هذه النتائج تشير إلى أن رقاقة إضافية قابلة تكنولوجيا التي يمكن استخدامها لتحديد مقدار البروتين متعدد.

Figure 1
رقم 1. التخطيطي لإجراء تحليل مقارنة واحد (أ) و (ب) ضعف أساليب نقل- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2. التخطيطي إظهار الاختلافات بين نقل مفرد، ومزدوج- (أ) النسخ المتطابق من الكواشف نقل يستفيض اختلالها الزاوي بين الشريحة وفي مرحلة تخطيط س وص النافثة للحبر. (ب) نقل مزدوج الأسلوب يتغلب اختلالها الزاوي. مقتبس من مرجع 14 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. صور للأجهزة الإضافية- (أ) فتح الجهاز. (ب) الجهاز مغلقة. (ج) عرض منظور للجهاز. باختصار، (ط) نقل الشرائح المتمركزة في حامل الشريحة ودفعت ضد دبابيس المحاذاة باستخدام بوجوبين التي شنت على بلونجيرس. (ثانيا) الشرائح مقايسة وضعت على رأس بوجوبينس ودفعت ضد دبابيس المحاذاة باستخدام مجموعة ثانية من بلونجيرس. (ثالثا) شل الأعلى تم وضعه فوق حامل الشرائح وإدراجها في القفص. يتم تطبيق ضغط باستخدام علامة التبويب إغلاق ضغط بوجوبين ويجمع بين الشرائح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4. نقل جماعي من البقع باستخدام شريحة إضافية. الأسفار المسح الضوئي باستخدام 532 نانومتر و 633 نانومتر الليزر لإثبات نقل الأجسام المضادة على النيتروسليلوز (أ) الشريحة (مقتبس من مرجع 14 مع إذن) و (ب) الزجاج الشريحة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5. قياس الصورة الفلورية شريحة المقايسة والمنحنيات القياسية من البروتينات 50 جنبا إلى جنب باستخدام أسلوب نقل مزدوجة. (أ) الأسفار صورة شريحة المقايسة لتوليد منحنى قياسي. (ب) عن قرب صفيف. شريط المقياس = 2 مم. المنحنيات (ج) القياسية للبروتينات 50. أشرطة الخطأ حسبت الانحرافات المعيارية من ثلاث تجارب مستقلة. مقتبس من مرجع 14 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

اسم البروتين بدء تركيز (ng/ml) اللد (pg/ml) اسم البروتين بدء تركيز (ng/ml) اللد (pg/ml)
ANG2 500 1.3 × 104 إيل-6ب 1 2.1 × 102
بدنف 500 1.0 × 102 إيل-5 50 77 CA 15-3 * 1 4.9 × 103 إيل-4 1000 1.5 × 104 سيا 1000 5.4 × 103 إيل-2 50 76 CXCL10/IP-10 50 1.7 × 102 لب 200 4.0 × 102 CRP 200 44 ميج 500 11 × 102 المهندس 1000 6.2 × 102 CCL3/MIP-1Α 50 3.3 لو 50 1.8 × 102 CCL4/MIP-1Β 50 12 EGFR 200 1.9 × 102 3-نظام التمثيل التناسبي المختلط 500 1.0 × 102 فاس-L 500 4.5 × 102 M-CSF 500 8.2 × 103 صندوق الأجيال القادمة 500 1.0 × 103 9-نظام التمثيل التناسبي المختلط 200 3.1 × 102 ز-CSF 500 39 CCL2/العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 50 55 GM-CSF 50 3.8 نكام-1 500 1.7 × 103 غرو-Α 50 3.0 × 102 Β-ستموت 200 1.4 × 103 HER2 500 3.5 × 103 3-الإقليم الشمالي 200 5.8 × 102 BB بدجف 200 73 أوبن 500 1.9 × 103 إيل 1Β 500 7.9 × 102 RBP4 200 1.2 × 102 إيل-1ra 200 1.1 × 103 سبارك 1000 4.6 × 104 إيل-15 50 8.2 × 102 تنف-Α 50 4.4 إيل-12 1 30 تنف-ري 50 1.3 × 102 إيل-11 500 1.2 × 103 ري تنف 50 12 إيل-10 500 6.1 × 102 فاس/TNFRSF6 200 2.8 × 102 إيل-8 50 6.6 التحالف التقدمي المتحد 200 24 إيل-7 2.5 26 uPAR(CD87) 200 76 إيل-6 1000 84 فيجف 200 6.7 × 102

الجدول 1- تركيزات البروتين ولودس في المخزن المؤقت من مقايسة 50-من نوع plex. ومن اللد لكاليفورنيا 15-3 يو/مليلتر (*). مقتبس من مرجع 14 مع الإذن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا العمل، وقد قدمنا عن تكنولوجيا رقاقة الأداة يجعل تحديدكم خالية إلى reactivity المشتركة المتعددة المتاحة على نطاق واسع للباحثين مع الإعداد التجريبية الأساسية. مختلفة من القائمة جسم [ميكروارس]، لا يوجد نصاب ميكرواري المسبق للمستخدمين النهائيين. أظهر كل واحد وضعف أساليب نقل، ونقل مزدوج يتيح دقة متفوقة محاذاة لأسفل إلى ~ 40 ميكرومتر للبقع 98 ٪، مع اختلال أكبر من 63 ميكرون14. جهاز رواية المفاجئة وضعت مريح انجذاب شريحتين مع ضغط متسقة، وجعل هذه التكنولوجيا متاحة للباحثين. يتحقق نقل كاشف موثوق بها ليس فقط على الشرائح المغلفة النيتروسليلوز، ولكن أيضا على الشرائح الزجاجية العادية، إلى حد كبير توسيع نطاق تطبيق هذه التكنولوجيا دون الحاجة إلى تدريب مكثف. لإثبات إمكانية استخدام رقاقة المفاجئة، أجرى المناعة 50-من نوع plex استخدام الشرائح رصدت مسبقاً والمخزنة، وحقق 70% البروتينات لودس في نطاق pg/mL14. مقارنة لتحديدكم متعدد القائمة التي تنطبق اللمسات كخليط، مزية هامة في ACM وتكنولوجيا رقاقة المفاجئة أن فحوصات على رقاقة المستقلة إلى بعضها البعض، مما يسمح لإضافة أو إزالة أي جسم أزواج دون تداخل مع أي أزواج أخرى. ويمكن قياس عشرات ومئات بروتينات في نفس الوقت مع شريحة إضافية، وبالتالي تقصير وقت الفحص مقارنة بالأساليب الأخرى مثل قياس المسلسل الآلي بحضانة المتسلسل الذي يتطلب التطبيق التسلسلي لكل جسم 17. مطلوب فقط sub-نانولتر لكل جسم لتصنيع الرقائق المفاجئة، يجعلها اقتصادية أكثر منها تحديدكم التقليدية.

تركيزات الأجسام المضادة المستخدمة والخطوات حضانة مستضد أمرا حاسما لتحقيق حساسية عالية التحليل. في تصنيع الرقائق الإضافية، يمكن أن يكون تركيز الأجسام المضادة الأمثل اعتماداً على تقارب أزواج الأضداد وأنواع الشرائح المقايسة (النيتروسليلوز أو غير النيتروسليلوز). وحدات التخزين من كل بقعة جسم يمكن تعديلها على أساس قدرة نصاب ودقة المحاذاة والتباعد مركز إلى مركز بين البقع يمكن أن تتغير تبعاً لذلك. بعد نقل سيارات الأجرة إلى الشريحة المقايسة، ونحن المحتضنة الشريحة المقايسة في درجة حرارة الغرفة للحضانة بين عشية وضحاها حاء – 1 في 4 درجات مئوية قد تعطي القدرة الملزمة جسم أفضل. (انظر جدول المواد) استخدمت جيش صرب البوسنة الحرة استقرار الحلول هنا كتلة الشريحة المقايسة بعد تفرخ سيارات الأجرة. كما قد تعمل الكواشف حظر الأخرى مثل الحليب أو مصل الحيوان لهذا التطبيق.

في تحديدكم متعدد، يمكن وضع بروتوكولات للشرائح غير النيتروسليلوز مع الكيمياء السطحية المختلفة والأمثل. يمكن استخدام عامل إضعاف مختلفة جعل المنحنيات القياسية تبعاً للبروتينات المستهدفة. Fluorophores مختلفة يمكن استخدامها لتسمية اللمسات، ويمكن تفحص الشريحة باستخدام ليزر في طول موجه مختلفة لجمع إشارة.

حاليا، بكثافة قدرها 625 البقع/سم2 وقد أحرز مع أسلوب نقل مزدوج14. لمواصلة تحسين قدرة المتنوعة من شرائح إضافية، تتوفر عدة استراتيجيات. أولاً، يمكن استخدام أحجام أصغر تقليل حجم البقع، مما يسمح لأقصر مسافة مركز إلى مركز بين البقع وكثافة زيادة الصفيف. ثانيا، يمكن للمرء أن يختار شريحة نقل مع سطح الماء أكثر لتقليل حجم البقعة. ثالثا، تحسين المواءمة بين [ميكروارس] اثنين قد يتحقق بأداء غرامة تعديل نصاب النافثة للحبر، وكذلك تحسين اكتشاف المعلمات مثل المسافة بين الفتحات وسطح الشريحة.

أما بالنسبة لجميع تحديدكم المستندة إلى جسم، أداء المناعة رقاقة الإضافية رهنا بتوافر ونوعية الأجسام المضادة. رقاقة إضافية تعمل باستخدام شكل الإنزيم ساندويتش، الذي هو الشكل الأكثر استخداماً بالانزيم في أليسا نظراً لحساسية عالية وخصوصية يتيحها الربط المزدوج، متسلسلة من زوج من الأجسام المضادة التي تستهدف مختلف [ابيتوبس]، بل أنها تعتمد على توافر زوج متوافق مع الأجسام المضادة اللازمة لالتقاط واكتشاف البروتين الهدف.

يتم إنشاء قيمة تكنولوجيا رقاقة المفاجئة لتحديدكم، ومن المتوقع أن يمكن استخدامه لأي التفاعلات الكيميائية والبيوكيميائية التي تتطلب تطبيق الكواشف المختلفة دون التلوث عبر18،19 , 20 , 21 , 22-فعلا، رقاقة المفاجئة يوفر حل عام لتوفير الكواشف مسبقاً رصدت مختلف من ميكرواري-إلى-ميكرواري، وبالتالي إلغاء اقتران تصنيع الرقائق مع إجراء المقايسة، وذلك يساعد على معالجة " التواصل الكلي إلى الجزئي "تحدي23. على سبيل مثال، استخدمت رقاقة المفاجئة مقايسة تثبيط إنزيم متجانسة 4-من نوع plex لتحليل ظروف 128 مع التوقيت الدقيق، ونتائج مماثلة ل تجارب كبيرة الحجم14. كما أنه طبق لتلطيخ الأنسجة متعدد. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تسهم المخدرات فرز الطلبات لاختبار الآلاف من المواد الكيميائية على البكتيريا مختلفة أو الخلايا لخلية مفردة التحليل2421،، أو لاختبار شروط مختلفة في مادة كيميائية واحدة أو متعددة الخطوات ردود الفعل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وقدمت جامعة ماكغيل طلب البراءة على بعض جوانب هذا العمل مع لي هاييان وديفيد جونكر المخترعين.

Acknowledgments

ونحن نشكر الدكتور روب سلاديك لاستخدام نصاب النافثة للحبر. ونعترف الدعم النهائي من "المعاهد الكندية" للبحوث الصحية (استوفوا)، والعلوم الطبيعية والهندسة بحوث المجلس من كندا (مقدمة)، والمعهد الكندي للبحوث المجتمع السرطان ومؤسسة كندا للابتكار (CFI). دي جي بفضل دعم من "كرسي أبحاث كندا".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline tablet Fisher Scientific 5246501EA
Streptavidin-conjugated Cy5 Rockland s000-06
Tween-20 Sigma-Aldrich p1379
Bovine serum albumin Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc 001-000-162
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer SurModics, Inc SG02
Nitrocellulose coated slides Grace Bio-Laboratories, Inc 305116
Aminosilane coated slides Schott North America 1064875
Snap Device Parallex BioAssays Inc. PBA-SD01
Inkjet microarray spotter GeSiM Nanoplotter 2.0
Slide module gasket Grace Bio-Laboratories, Inc 204862
Humidity Stabilization Beads Parallex BioAssays Inc. PBA-HU60
Array-Pro Analyzer software Media Cybernetics Version 4.5
Fluorescence microarray scanner Agilent SureScan Microarray Scanner
Biostatistics software GraphPad Software GraphPad Prism 6
Endoglin capture antibody R&D Systems MAB10972
Endoglin protein R&D Systems 1097-EN
Endoglin detection antibody R&D Systems BAF1097
IL-6a (see Table 1) R&D Systems
IL-6b (see Table 1) Invitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, (21), 7677-7682 (2005).
  2. Nicolini, A., et al. Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases. BMC Cancer. 6, (1), 1-9 (2006).
  3. Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 410, (4), 726-731 (2011).
  4. Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility. Biochim. Biophys. Acta - Proteins and Proteomics. 1844, (5), 917-926 (2014).
  5. Ekins, R. P. Multi-analyte immunoassay. J Pharm Biomed Anal. 7, (2), 155-168 (1989).
  6. Mahlknecht, P., et al. An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes. Proteome Sci. 10, (1), 71-80 (2012).
  7. Miller, J. C., et al. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers. Proteomics. 3, (1), 56-63 (2003).
  8. Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis. Lab Chip. 11, (3), 528-534 (2011).
  9. Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing. Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).
  10. Blank, K., et al. Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity. Anal. Bioanal. Chem. 379, (7), 974-981 (2004).
  11. Albrecht, C., et al. DNA: A Programmable Force Sensor. Science. 301, (5631), 367-370 (2003).
  12. Pla-Roca, M., et al. Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples. Mol. Cell. proteomics. 11, (4), (2012).
  13. Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays. Anal. Chem. 84, (11), 4776-4783 (2012).
  14. Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer. Sci. Rep. 5, 11688 (2015).
  15. Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray. Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).
  16. Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance. Anal. Bioanal. Chem. 407, (28), 8451-8462 (2015).
  17. Whiteaker, J. R., et al. Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 11, (6), (2012).
  18. Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays. Anal. Chem. 88, (5), 2652-2658 (2016).
  19. Lee, M. -Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, (4), 983-987 (2005).
  20. Fernandes, T. G., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 106, (1), 106-118 (2010).
  21. Kwon, C. H., et al. Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis. Anal. Chem. 83, (11), 4118-4125 (2011).
  22. Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5, (4), 28 (2016).
  23. Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science. 270, (5235), 467-470 (1995).
  24. Wu, J., et al. A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening. Biomaterials. 32, (3), 841-848 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics