Çip için çapraz-reactivity ücretsiz ve gözcü-Alerjik çoğaltılmış sandviç uzun snap

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Biz sadece iki slayt şaklatarak çoğaltılmış sandviç çapraz-reactivity ücretsiz uzun gerçekleştirmek için bir ek çip teknolojisi göstermek. Bir ek aparatı reaktifler Mikroarray Mikroarray güvenilir bir şekilde aktarmak için kullanılır. Ek çip olmadan Çapraz bulaşma farklı reaktifler colocalization gerektiren herhangi bir biyokimyasal reaksiyonlar için kullanılabilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Li, H., Bergeron, S., Larkin, H., Juncker, D. Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays. J. Vis. Exp. (129), e56230, doi:10.3791/56230 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Çoğaltılmış protein analizi üstün tanılama hassasiyet ve doğruluk için tek proteinler karşılaştırıldığında göstermiştir. Antikor microarrays aynı anda tek bir yonga üzerinde gerçekleştirilen mikro ölçekli uzun binlerce sağlar. Sandviç tahlil biçimi her hedef iki antikorlar ile tespit ederek tahlil özgüllük artırır, ancak böylece çoğullama yeteneklerini sınırlayan reaktifler arasında olan muzdarip. Antikor colocalization Mikroarray (ACM) çoğaltılmış protein çapraz-reactivity ücretsiz algılama için geliştirilmiştir, ancak pahalı bir gözcü yerinde Mikroarray imalat deneyleri sırasında için gerektirir. Bu çalışmada, biz sadece dayama iki fiş birlikte, böylece hiçbir gözcü örnek kuluçka ve algılama antikor (dAbs) sonraki uygulama sırasında gerekli tarafından Mikroarray Mikroarray reaktif aktarır bir ek çip teknolojisi göstermek depolama öncesi benekli slayt, slayt hazırlama tahlil yürütme dissociating. Her iki tek ve Çift Kişilik transfer yöntemleri iki microarrays arasında doğru uyum elde etmek için sunulmaktadır ve slayt imalat yöntemleri açıklanmıştır. Sonuçları gösteriyor ki < 40 mikron hizalama 625 noktalar/cm2bir dizi yoğunluğu ulaşan Çift Kişilik transferi ile elde. 50-plexed immunoassay çoğaltılmış protein analizi ek yongasında kullanılabilirlik göstermek için yapılmıştır. Sınırlar 35 proteinlerin algılama aralığı pg/mL vardır.

Introduction

Birden fazla protein oluşan biyolojik bir panel daha yüksek duyarlılık ve özgüllük kanserleri1,2gibi karmaşık hastalıkların tanısında tek bir biyomarker daha sağlayabilir. Enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) klinik laboratuvarlar bir limit düşük pg/mL plazma, algılama, ama sınırları tahlil3,4,5başına bir hedefe ulaşmada kullanılan altın standart teknoloji olmuştur. Paralel bir tek mikroskop slayt6,7,8bin-in küçültülmüş deneyleri accomodating yürütülen için antikor microarrays geliştirilmiştir. Ancak, bu yöntemin çoğullama yeteneği parmak izleri, karışımı uygulamadan kaynaklanan reaktif tahrik olan ile sınırlıdır ve hedefleri9,10 giderek artan sayıda daha sorunlu hale gelir , 11. Pla ve ark. Sonuçta ortaya çıkan güvenlik açığı bir multiplex sandviç testin hedefleri12numarası N olan 4N(N-1) ölçekler belirttiler.

Antikor microarrays, antikor colocalization Mikroarray olan etkisini azaltmak için (ACM) bizim laboratuvar multiplex sandviç tahlil12için geliştirilmiştir. Yakalama antikorlar (taksi) bir substrat Mikroarray gözcü ile tespit. Sonra engelleme örnekleri yüzeye uygulanır ve sonunda bireysel dAbs taksi-antijen kompleksi aynı noktalar üzerinde gördü. Antikorlar antijenleri arasındaki tüm olan senaryoları ACM ile azaltılabilir ve algılama pg/mL, sınırlarını elde ettik. Ancak, tahlil Protokolü hazırlama ve bir yerinde Mikroarray gözcü yüksek hassasiyetle pahalı ve zaman alıcı hizalama amaç için kullanarak, bu teknoloji içinde geniş uygulama sınırlama deneyler sırasında parmak izleri tespit gerekir diğer laboratuvarlar. Ek çip adında bir el ACM için çapraz-reactivity ücretsiz geliştirilmiştir ve gözcü-Alerjik multiplex sandviç uzun13,14,15. Kabinler ve parmak izleri bir tahlil slayt ve sırasıyla Mikroarray biçiminde bir transfer slayt üzerine önceden tespit ve depolanır. Tahlil sırasında slaytlar alınır ve dAbs Mikroarray aktarılır topluca tahlil slayt sadece birlikte iki fiş şaklatarak. Bir ek aparatı güvenilir reaktif aktarımı için kullanılır. Nispeten büyük antikor Bağlama kapasitesi ile kaplı nitroselüloz slaytlar sıvı damlacıkları emmek için tahlil slaytlar olarak kullanılmış ve böylece reaktif transfer kolaylaştırıcı, ancak, slaytları normal cam slaytlar ve Mikroarray daha daha pahalıdır saydam olmayan slaytlar ile uyumlu tarayıcılar sinyal alımı için ihtiyaç vardır.

Bu çalışmada, multiplex sandviç immunoassay ek çip ile gerçekleştirme Protokolü göstermektedir. Bir roman ek aparatı Mikroarray Mikroarray daha rahat ve güvenilir reaktif transferi için geliştirilmiştir. Önemlisi, burada reaktif aktarma yöntemi ek çip ile normal cam slaytlar üzerine kurduk. 1024 noktalar başarıyla transfer ve bu teknolojinin en laboratuarlarında kullanımı önemli ölçüde genişleyen bir cam slayt üzerine hizalanmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. imalat ve depolanmasını snap cips

  1. tek transfer yöntemi ( Şekil 1a)
    1. 400 µg/mL antikorlar içeren Spot taksi çözümleri ve fosfat tamponlu tuz çözeltisi % 20 gliserol (PBS) bir nitroselüloz (ya da functionalized bir cam) üzerine tahlil slayt ile bağıl nem oranı % 60, bir mürekkep püskürtmeli Mikroarray gözcü 13 (1.2 nL her nokta için) 800 µm Merkezden merkeze boşluğu ile. Slaydı bir köşe göre gözcü güvertede sabit olduğundan emin olun (burada, sol alt köşedeki kullanılmıştır).
    2. %60 bağıl nem ile 1 h için oda sıcaklığında benekli tahlil slayt kuluçkaya.
    3. Bir slayt modülü conta 16 kuyu bölmek için tahlil slayt üzerinde 16 bölmeleri ile kelepçe. 80 µL % 0,1 içeren PBS ekleyerek üç kez sürgüyü durulama ara-20 (PBST) her iyi ve titreyen bir shaker, 5 min her zaman üzerinde 450 rpm'de.
    4. Her şey ve 450 rpm'de 1 h için sallamak için çözümler engelleme eklemek 80 µL.
    5. Conta kaldırmak ve tahlil slaydı bir akımı azot ile kuru.
    6. Bir transfer slayt gözcü güvertede düzeltmek ve slayt sol alt köşesinde gözcü güverte karşı sol alt köşesinde itin. Mürekkep püskürtmeli spot hizalama işaretlerini (polistiren mikro-boncuk bir çözüm) oluşan bir dizi ile bu aynı düzeninde kabinler için.
    7. Kuru hizalama işaretlerini izin. Transfer slayt flip ve belgili tanımlık dip sol köşe karşı sabitleme gözcü güverte üzerine oturtacak.
    8. 20 µg/mL antikorlar, % 20 gliserol ve % 1 BSA içeren çözümler lekelenme dAb hazırlayın.
    9. Gözcü kullanarak ' s kamera, resim hizalama işareti bir. Bu resmi bir indirgeme olarak edindiği programa uygulamak ve görüntü tanıma sisteminin en üst sol işareti tanımlamak için mürekkep püskürtmeli gözcü olsun. Onun koordinat dAb dizi ilk spot kullanın. Nokta 8 nL damlacık ile 800 µm Merkezden merkeze aralığını başına.
  2. Çift Kişilik aktarma yöntemi ( Şekil 1b)
    1. sol alt köşedeki karşı mürekkep püskürtmeli gözcü güvertede bir transfer Slayt 1 yerleştirin. Spot 400 µg/mL antikorlar, % 20 gliserol ve PBS % 1 BSA ile bir mürekkep püskürtmeli Mikroarray gözcü bağıl nem oranı % 60, slayda içeren kabinler Çözümleri (0,4 nL her nokta için ve ~ çapı 200 µm). Merkezden merkeze boşluk 400 µm olabilir.
    2. Taksi damlacıkları tahlil slayt üzerine aktarmak için bir ek aparatı ( Şekil 2) kullanarak transfer slayt ile kaplı bir nitroselüloz (ya da functionalized bir cam) tahlil slayt çekin.
      1. Dönüş tüm altı düğmeleri tarafında ek aparat çekin ve tüm itici açık konumda kilitlemek için 90 derece. Transfer Slayt Slayt tutucu, kabın içinde kırpılmış köşesi sabit pogo PIN bakacak ekleyin. Üç düğme itici altın pogo iğne ile serbest bırakmak ve slaytları hizalama pimleri karşı itti emin olmak için ilk kümesi açmak.
      2. Ek aparat ters 4 pogo çivi üzerine oturan nitroselüloz kaplı bir slayt ekleyin. İtici gümüş iğne ile serbest bırakmak ve slaytları hizalama pimleri karşı itti emin olmak için üç düğme ikinci kümesi açmak.
      3. Ek aparat hizalama sütunlar ve delik bir hassas konumlandırma için kullanarak slayt kutusunda üst kabuk koyarak kapatın.
      4. Kapalı ek aparat onun kafes yerleştirin ve kapatma sekmesinde tamamen microarrays uygun basınç uygularken yüz yüze getirmek için aşağı doğru itin. 1 dk. için kapalı tutmak
    3. Slaytları ayırın. Bağıl nem oranı % 60 ile 1 h için oda sıcaklığında tahlil slayt kuluçkaya. Yıkama, engellemek ve tahlil slayt adımlarda 1.1.3 - 1.1.5 açıklandığı gibi kuru.
    4. Başka bir transfer slayt mürekkep püskürtmeli gözcü güverte ve sol alt köşedeki karşı itme üzerine koyun. 50 ya da 100 µg/mL (bkz. Tablo 1) antikorları, % 20 gliserol ve PBS % 1 BSA içeren spot dAb çözümleri. Her spot 0,8 olduğundan emin nL ve noktalar arasındaki Merkezden merkeze boşluğu olduğunu 400 µm.
    5. Tahlil ve transfer slayt saklayın. Mühür nem içeren hava geçirmez bir torbada tahlil ve transfer slaytlar ve -20 ° C dondurucuya koydu.

2. Multiplexed ek fiş ile uzun

  1. Al dondurucu tahlil slayttan. Çantayı slayt oda sıcaklığına gelene için 30 dk kapalı bırakın.
  2. Hazırla 7 uçlu seri seyreltilmiş örnek çözümler proteinlerin % 0.05 içeren PBS spiking tarafından ara-20.
    Not: Burada, bir 5-fold seyreltme faktörü kullanılır. Başlangıç konsantrasyonları her protein için tablo 1'de listelenen.
  3. Uygun olarak Prepare örnek çözümler. Örneğin, 4 kez içinde PBST tampon insan serumu sulandırmak.
  4. 16-bölme conta tahlil slayt üzerinde kelepçe.
  5. Pipetting tarafından bir sütunun 8 wells 7 protein seyreltme çözümleri ve protein-Alerjik PBST arabellek çözüm ile doldurun. Aynı slaytta yer alan diğer 8 Wells örnek çözümler pipette.
    Not: 80 µL çözümler her birinde uygun olabilir iyi. Daha fazla slayt ek örnekler gerektiğinde ölçmek için kullanılabilir.
  6. Örnekleri bir shaker gecede üç kez ile shaker 450 rpm'de 5 dk her zaman üzerinde PBST 4 ° c yıkama slayt veya oda sıcaklığında 1 h için 450 devirde üzerinde kuluçkaya. Conta kaldırmak ve azot gazı akışı altında slayt kuru.
  7. Parmak izleri ile transfer slayt dondurucudan almak. Çantayı, oda sıcaklığında 30 dakika kapalı tutun. Ardından, % 60 nem sabitleme boncuk rehidrasyon için 20 dk için içeren slayt kapalı Odası (örneğin boş ipuçları kutu) içinde kuluçkaya.
  8. Transfer slayt dAb damlacıkları aktarmak için bir ek aparatı ( Şekil 2) kullanarak tahlil slayt ile snap. 1.2.2 ek aparat çalışması için bkz.
  9. Slaytları ayırın. Tahlil slayt % 60 nem sabitleme boncuk 1 h. kelepçe bir 16 yuvası conta ile tahlil slayt içeren bir kapalı odasında kuluçkaya ve 4 kez sürgüyü durulama PBST bir shaker 450 rpm'de 5 dk her zaman kullanma.
  10. Pipet 80 µL PBS içinde her kuyuya 2,5 µg/mL streptavidin fluorophore içeren çözümler. Bir shaker 450 devirde üzerinde 20 dk için kuluçkaya.
  11. 450 devirde shaker üzerinde slayt 3 kez ile PBST ve bir kez distile su ile durulayın. Conta kaldırmak ve azot gazı kullanarak slayt kuru.

3. Slayt tarama ve veri analizi

  1. 635 nm lazer kullanarak Floresans Mikroarray tarayıcıyla tahlil slayt tarama.
  2. Bir analiz yazılımı (örneğin dizi-pro Çözümleyicisi) 16 kullanarak her nokta net yoğunluğunu ayıklamak.
  3. Bir istatistik yazılım kullanarak her protein algılama (lod olarak) sınırını hesaplamak ve protein konsantrasyonları örneklerde belirlemek.
    Not: Y-kesişim noktası standart cu LOD tanımlanırüç kez standart sapmasını tarafından üç bağımsız deneyleri için artan lezzetli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hem tek hem de çift transfer yöntemleri için tahlil yordamı şekil 1' de gösterilen. Tek transfer, kabinler doğrudan tahlil slaytta lekeli ve dAbs kabinler (Şekil 1a) bir ayna model kullanımda üzerine tahlil slayda aktarılır. Tek bir aktarım yordam gereklidir, ancak esas olarak slaytla mürekkep püskürtmeli makas köprüsü (Şekil 2) arasındaki açısal kayma nedeniyle iki microarrays arasında kayma bu yöntem muzdarip. Bu sorunu çözmek için bir yaklaşım olduğunu tespit ve slaytları ek aparat düzgün sabitleme sonra kabinler ve dAbs ardışık olarak tahlil slayda aktarmak (Şekil 1b). Bu yöntemi kullanarak, her iki microarrays tam olarak aynı konuma aktarılır. Hiçbir görüntü tanıma sistemi veya hizalama işaretçisi Çift Kişilik aktarma yöntemi için gereklidir. % 98'i için hatalı hizalaması noktalar 41 µm, tek transfer yöntemi14' e göre 6-fold gelişme içinde yapıldı.

Ek aparatı herhangi bir eğitim almadan kullanımı kolay ve dizi kayma riskini en aza indirmek için tasarlanmıştır. Slaytları hizalama pimleri tahlil ve transfer slaytlara ortak sayesinde doğru konumlandırma ile birlikte götürülür. Transfer slayt ek cihaz kapanana kadar pogo pins tarafından askıya zaman tahlil slayt sığdırmak için biraz daha küçük. Ayırıcı cam kaymak için güvenilir damlacık transferini sağlıyor mikrometre ölçekli bir boşluk korumak transfer slayt bulunur. Son olarak, kafes ve onun kapatma sekmesinde her ek tekrarlanabilir, yüksek kalite aktarmak için etkili aktarımı için gerekli basınç uygulamak için tasarlanmıştır. Ek aparat fotoğrafını şekil 3' te gösterilmiştir.

Temsili resim gösteren reaktif transfer nitroselüloz slaytla bir cam slayt üzerine sonuç şekil 4' te gösterilmiştir. Alexa IgGs etiketli 532 ilk reaktifi kullanılmıştır ve Alexa 647 IgGs etiketli ikinci reaktifi kullanılmıştır. Aktarımdan sonra slayt 532 ile taranmıştır nm ve 635 nm lazerler. Sonuç gösteriyor ki 3136 (için nitroselüloz slayt) veya 1024 (cam slayt için) mikrospots tahlil slayta sıfır hata ile transfer edildi ve Çapraz bulaşma ikinci reaktif aktarma üzerine gözlendi. Cam slaytlar kullanırken, functionalization, böylece her spot sildiyseniz ve noktalar daha çok sayıda aktarmak için nokta nokta mesafe azalan tarafından daha hidrofobik yüzey oluşturmak mümkündür. Bu eser ek çip teknolojisi uygulama için genel olarak kullanılan cam yüzeylerde genişletir.

Standart eğrileri 50-plex immunoassay hedefleme meme kanseri ile ilgili proteinler şekil 5en büyük katlı sandviç antikor Mikroarray olan olmadan tarihe karşılık gelen, gösterilmiştir. Çift-transfer yöntemi bu tahlil kullanıldı, slayt tarandı ve floresan yoğunluğu standart eğriler oluşturmak için sayılabilir. 35 dışarı-in 50 protein ulaştı LODs pg/mL (bkz. Tablo 1) ve tahlil koşulları optimize ederek daha da geliştirilmiş. Reaktifler colocalization olan olmadan tek bir slayda birden çok antikor çiftlerini kullanımını kolaylaştırır ve diğer çiftleri12tarihinde her çift bağımsız olarak herhangi bir girişim ile optimizasyonu sağlar. Bu sonuçlar ek çip, çoğaltılmış protein miktar için kullanılan ölçeklenebilir bir teknolojidir gösterir.

Figure 1
Şekil 1. Tahlil yordam tek (a) ve (b) çift aktarım yöntemlerini karşılaştırma şematik. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2. Tek Kişilik transfer arasındaki farkları gösteren şematik. (a) yansıtma aktarım reaktifler mürekkep püskürtmeli XY sahne ve slayt arasındaki açısal kayma güçlendirir. (b) çift-transfer yöntemi açısal kayma üstesinden gelir. Başvuru 14 izniyle uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3. Ek aparat fotoğrafı. (a) açılan aygıt. (b) kapalı aygıt. (c) perspektif görünüm cihazın. Kısaca, (i) Aktarım slaytları slayt yuvasına konumlandırılmış ve hizalama pimleri üzerinde itici monte pogopin kullanarak karşı itti. (ii) tahlil slaytlar pogopins üstüne yerleştirilir ve itici, ikinci bir kümesini kullanarak hizalama pimleri karşı itti. (iii) üst kabuk slayt tutucu üst kısmında konumlandırılmış ve kafesin içine eklenmiş. Bir basınç pogopin sıkıştırmak ve slaytları bir araya getirmek için kapatma sekmesini kullanarak uygulanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4. Bir ek kozu kullanımı lekelerin toplu transfer. 532 kullanarak Floresans tarama nm ve bir (a) nitroselüloz üzerine antikorlar transferini göstermek için 633 nm lazerler (b) cam slayt ve slayt (başvuru 14 izniyle uyarlanmıştır). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5. Bir tahlil slayt görüntüsünü Floresans ve 50 proteindir standart eğrileri Çift Kişilik aktarım yöntemini kullanarak paralel olarak ölçülen. (a) standart bir eğri oluşturmak için bir tahlil slayt floresan görüntü. (b) bir dizi close-up. Ölçek çubuğu 2 mm. (c) standart eğrileri 50 proteinler için =. Hata çubukları olarak standart sapmalar üç bağımsız deneyler üzerinden hesaplanır. Başvuru 14 izniyle uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Protein adı Başlangıç konsantrasyonu (ng/ml) LOD (pg/ml) Protein adı Başlangıç konsantrasyonu (ng/ml) LOD (pg/ml)
ANG2 500 1.3 × 104 Il-6b 1 2.1 × 102
BDNF 500 1,0 × 102 IL-5 50 77 CA 15-3 * 1 4,9 × 103 IL-4 1000 1.5 × 104 CEA 1000 5.4 × 103 IL-2 50 76 CXCL10/IP-10 50 1,7 × 102 LEP 200 4.0 × 102 CRP 200 44 MIG 500 11 × 102 ENG 1000 6.2 × 102 CCL3/MIP-1α 50 3.3 EGF 50 1.8 × 102 CCL4/MIP-1β 50 12 EGFR 200 1.9 × 102 MMP-3 500 1,0 × 102 FAS-L 500 4.5 × 102 M-CSF 500 8.2 × 103 FGF 500 1,0 × 103 MMP-9 200 3.1 × 102 G-CSF 500 39 CCL2/MCP-1 50 55 GM-CSF 50 3.8 NCAM-1 500 1,7 × 103 GRO-α 50 3.0 × 102 β-NGF 200 1.4 × 103 HER2 500 3,5 × 103 NT-3 200 5.8 × 102 PDGF-BB 200 73 OPN 500 1.9 × 103 IL-1β 500 7.9 × 102 RBP4 200 1.2 × 102 Il-1ra 200 1.1 × 103 SPARC 1000 4,6 × 104 IL-15 50 8.2 × 102 TNF-α 50 4.4 IL-12 1 30 TNF-RI 50 1.3 × 102 IL-11 500 1.2 × 103 TNF-RII 50 12 IL-10 500 6.1 × 102 FAS/TNFRSF6 200 2,8 × 102 IL-8 50 6,6 uPA 200 24 IL-7 2.5 26 uPAR(CD87) 200 76 Il-6bir 1000 84 VEGF 200 6,7 × 102

Tablo 1. Protein konsantrasyonları ve 50-plex tahlil arabelleğinden LODs. CA 15-3 için LOD U/ml (*) olduğunu. Başvuru 14 izniyle uyarlanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmada, araştırmacılar ile temel deneysel kurulum için çapraz-reactivity ücretsiz multiplex uzun yaygın olarak kullanılabilir duruma getirir bir ek çip teknolojisi sunulmuştur. Varolan antikor microarrays farklı, hiçbir Mikroarray gözcü son kullanıcılar için gereklidir. Hem tek hem de çift transfer yöntemleri gösterdi ve Çift Kişilik transfer affords üstün hizalama doğruluğu aşağı ~ % 98'i lekeli 63 µm14en büyük kayma için 40 mikron. Bir roman ek aparatı elverişli bir konuma sahip bu teknoloji araştırmacılar erişilebilir hale getirme tutarlı basınç ile iki slayt ek bileşeni için geliştirilmiştir. Güvenilir reaktif transfer nitroselüloz kaplı slaytlar değil sadece, aynı zamanda normal cam slaytlara, önemli ölçüde bu teknoloji yoğun eğitim, gerek kalmadan genişleyen gerçekleştirilmektedir. Ek fiş kullanımını göstermek için bir 50-plex immunoassay önceden benekli ve saklı slaytlar kullanılarak yapılmıştır ve proteinlerin % 70 LODs aralığı pg/mL14' te elde. Parmak izleri bir karışımı uygulamak varolan multiplex uzun, ACM ve ek çip teknolojisi önemli bir yararı böylece eklemek veya olmadan herhangi bir antikor çiftleri kaldırmak için izin bir yonga üzerinde deneyleri, bağımsız karşılaştırılır diğer bir çift ile müdahale. Onlarca yüzlerce proteinlerin aynı anda böylece her antikor 17seri uygulama gerektiren sıralı kuluçka tarafından otomatik seri ölçüm gibi diğer yöntemleri ile karşılaştırıldığında tahlil zaman kısaltma bir ek çip ile ölçülebilir. Yalnızca alt-nanoliter her antikor, daha geleneksel uzun daha ekonomik hale ek çip imalat için gereklidir.

Kullanılan antikor konsantrasyonları ve antijen kuluçka adımları yüksek tahlil hassasiyet elde etmek için önemlidir. Ek fiş fabrikasyon antikor konsantrasyon antikor çiftleri ve tahlil slaytları (nitroselüloz veya nitroselüloz olmayan) türleri benzeşme bağlı olarak getirilebilir. Her antikor spot hacimleri gözcü kapasite ve hizalama doğruluğu göre ayarlanabilir ve noktalar arasındaki Merkezden merkeze boşluğu buna göre değiştirilebilir. 1 h. gecede kuluçka 4 ° C'de daha iyi antikor Bağlama kapasitesi verebilir için kabinler için tahlil slayt aktardıktan sonra biz tahlil slayt oda sıcaklığında inkübe. BSA serbest dengeleyici Çözümleri (malzemelerin tabloya bakın) burada taksi kuluçka sonra tahlil slayt engellemek için kullanılmıştır. Hayvan serum veya süt gibi diğer engelleme reaktifler de bu uygulama için işe yarayabilir.

Çoğaltılmış uzun içinde iletişim kuralları ile farklı yüzey kimyası nitroselüloz olmayan slaytlar için geliştirilen ve en iyi duruma getirilmiş. Farklı seyreltme faktörü hedef proteinler bağlı olarak standart eğrileri yapmak için kullanılabilir. Farklı fluorophores parmak izleri etiketlemek için kullanılan ve bir lazer farklı bir dalga boyu sinyal koleksiyonu için kullanarak slayt taranabilir.

Şu anda, bir yoğunluk 625 noktalar/cm2 Çift Kişilik transfer yöntemi14ile elde edilmiştir. Daha fazla ek çip çoğullama kapasitesini geliştirmek için çeşitli stratejiler mevcuttur. İlk olarak, daha küçük birimler böylece daha kısa Merkezden merkeze mesafe artan dizi yoğunluğu arasındaki noktalar için izin noktalar boyutunu azaltmak için kullanılabilir. İkinci olarak, bir nokta boyutunu azaltmak için daha hidrofobik yüzey ile transfer slayt seçebilirsiniz. Üçüncü olarak, iki microarrays arasında daha iyi uyum mürekkep püskürtmeli gözcü hassas ayar yapmak ve daha fazla gibi püskürtme uçlarını ve slayt yüzey arasındaki mesafe tespit parametreler optimize etmek tarafından elde.

Mevcudiyeti ve kalitesinden de antikorlar tabi tüm antikor tabanlı uzun gelince, ek çip immunoassay performanstır. ELISA en çok kullanılan tahlil biçiminde sayesinde yüksek duyarlılık ve özgüllük farklı epitopları hedefleme antikorlar bir çift çift, sıralı bağlama tarafından tanınan bir sandviç tahlil biçiminde kullanarak ek çip çalışır ama bağımlı olduğu uyumlu antikorlar yakalama ve hedef protein tespiti için gerekli bir çift kullanılabilirliği.

Ek çip teknolojisi değerini uzun için kurulur ve çapraz-contaminations18,19 olmadan farklı reaktifler uygulama gerektiren herhangi bir kimyasal ve biyokimyasal reaksiyonlar için kullanılabilir bekleniyor , 20 , 21 , 22. aslında, ek chip Mikroarray-için-böylece tahlil işlemde, çip imalat kesilmesi Mikroarray, üzerinden çeşitli önceden benekli reaktifler sunmak için genel bir çözüm sağlar ve bu nedenle yardımcı olur adresleme " Makro mikro"arabirim meydan23. Örneğin, ek fiş 4-plex homojen enzim inhibisyonu tahlil için hassas zamanlama ve büyük hacimli deneyler14karşılaştırılabilir sonuçlar ile 128 koşulları analiz etmek için kullanılmıştır. Ayrıca çoğaltılmış doku boyama için uygulanmıştır. Buna ek olarak, uyuşturucu uygulamaları kimyasallar farklı bakteri veya hücreleri tek hücre analizi21,24, binlerce test etmek için ya da tek veya çok adım kimyasal farklı koşullarda test etmek için eleme için katkıda bulunabilir tepkiler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

McGill Üniversitesi bir patent başvurusu bu iş Huiyan Li ve David Juncker ile bazı yönleri üzerinde mucitler şikayetçi oldu.

Acknowledgments

Biz Dr Rob Sladek mürekkep püskürtmeli gözcü kullanım için teşekkür ederim. Sağlık Araştırma (CIHR), Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada (NSERC), Kanada Kanser Derneği Araştırma Enstitüsü ve Kanada Vakfı için son destek için yenilik (CFI) Kanadalı Enstitüleri üzerinden anıyoruz. DJ teşekkürler bir Kanada araştırma sandalyeden destekler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline tablet Fisher Scientific 5246501EA
Streptavidin-conjugated Cy5 Rockland s000-06
Tween-20 Sigma-Aldrich p1379
Bovine serum albumin Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc 001-000-162
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer SurModics, Inc SG02
Nitrocellulose coated slides Grace Bio-Laboratories, Inc 305116
Aminosilane coated slides Schott North America 1064875
Snap Device Parallex BioAssays Inc. PBA-SD01
Inkjet microarray spotter GeSiM Nanoplotter 2.0
Slide module gasket Grace Bio-Laboratories, Inc 204862
Humidity Stabilization Beads Parallex BioAssays Inc. PBA-HU60
Array-Pro Analyzer software Media Cybernetics Version 4.5
Fluorescence microarray scanner Agilent SureScan Microarray Scanner
Biostatistics software GraphPad Software GraphPad Prism 6
Endoglin capture antibody R&D Systems MAB10972
Endoglin protein R&D Systems 1097-EN
Endoglin detection antibody R&D Systems BAF1097
IL-6a (see Table 1) R&D Systems
IL-6b (see Table 1) Invitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, (21), 7677-7682 (2005).
  2. Nicolini, A., et al. Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases. BMC Cancer. 6, (1), 1-9 (2006).
  3. Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 410, (4), 726-731 (2011).
  4. Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility. Biochim. Biophys. Acta - Proteins and Proteomics. 1844, (5), 917-926 (2014).
  5. Ekins, R. P. Multi-analyte immunoassay. J Pharm Biomed Anal. 7, (2), 155-168 (1989).
  6. Mahlknecht, P., et al. An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes. Proteome Sci. 10, (1), 71-80 (2012).
  7. Miller, J. C., et al. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers. Proteomics. 3, (1), 56-63 (2003).
  8. Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis. Lab Chip. 11, (3), 528-534 (2011).
  9. Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing. Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).
  10. Blank, K., et al. Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity. Anal. Bioanal. Chem. 379, (7), 974-981 (2004).
  11. Albrecht, C., et al. DNA: A Programmable Force Sensor. Science. 301, (5631), 367-370 (2003).
  12. Pla-Roca, M., et al. Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples. Mol. Cell. proteomics. 11, (4), (2012).
  13. Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays. Anal. Chem. 84, (11), 4776-4783 (2012).
  14. Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer. Sci. Rep. 5, 11688 (2015).
  15. Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray. Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).
  16. Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance. Anal. Bioanal. Chem. 407, (28), 8451-8462 (2015).
  17. Whiteaker, J. R., et al. Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 11, (6), (2012).
  18. Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays. Anal. Chem. 88, (5), 2652-2658 (2016).
  19. Lee, M. -Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, (4), 983-987 (2005).
  20. Fernandes, T. G., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 106, (1), 106-118 (2010).
  21. Kwon, C. H., et al. Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis. Anal. Chem. 83, (11), 4118-4125 (2011).
  22. Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5, (4), 28 (2016).
  23. Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science. 270, (5235), 467-470 (1995).
  24. Wu, J., et al. A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening. Biomaterials. 32, (3), 841-848 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics