In Vitro e In Vivo rilevamento di Mitophagy in cellule umane, C. Eleganse topi

Medicine

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Summary

Mitophagy, il processo di schiarimento danneggiato i mitocondri, è necessario per la manutenzione di salute e omeostasi mitocondriale. Questo articolo presenta alcune delle mitophagy più recenti metodi di rilevazione in Caenorhabditis eleganse cellule umane in topi.

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Fang, E. F., Palikaras, K., Sun, N., Fivenson, E. M., Spangler, R. D., Kerr, J. S., Cordonnier, S. A., Hou, Y., Dombi, E., Kassahun, H., Tavernarakis, N., Poulton, J., Nilsen, H., Bohr, V. A. In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice. J. Vis. Exp. (129), e56301, doi:10.3791/56301 (2017).

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Abstract

I mitocondri sono le centrali elettriche delle cellule e producono energia cellulare sotto forma di ATP. La disfunzione mitocondriale contribuisce all'invecchiamento biologico e una vasta gamma di disturbi tra cui malattie metaboliche, sindromi di invecchiamento precoce e malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer (annuncio) e malattia di Parkinson (MDP). Mantenimento della salute mitocondriale dipende la biogenesi mitocondriale e la liquidazione efficiente dei mitocondri disfunzionali attraverso mitophagy. Metodi sperimentali per rilevare con precisione l'autofagia/mitophagy, soprattutto nei modelli animali, hanno state difficili da sviluppare. Recenti progressi verso la comprensione dei meccanismi molecolari di mitophagy ha permesso lo sviluppo di tecniche di rilevamento del romanzo mitophagy. Presentiamo il versatile diverse tecniche per monitorare mitophagy in cellule umane, Caenorhabditis elegans (ad es., Rosella e ceppi DCT-1 / LGG-1) e topi (mt-Keima). Una combinazione di queste tecniche di rilevamento mitophagy, inclusa la valutazione inter-specie, migliorerà l'accuratezza delle misurazioni mitophagy e portare a una migliore comprensione del ruolo della mitophagy nella salute e nella malattia.

Introduction

Mitophagy è essenziale per manutenzione mitocondriale. I mitocondri si intersecano molteplici vie di segnalazione delle cellule e sono universale degli organelli sub-cellulari responsabili della produzione di energia cellulare, metabolismo cellulare e calcio omeostasi1,2,3, 4. i mitocondri costantemente esperienza sfide da fonti endogene ed esogene, come specie reattive dell'ossigeno (ROS) e sostanze tossiche mitocondriale, rispettivamente, che portano alla generazione dei mitocondri disfunzionali e "invecchiati". Accumulazione dei mitocondri danneggiati diminuisce l'efficienza di produzione di ATP aumentando la quantità di ROS è nocivo ed è stato collegato alle malattie età-correlate quali malattie metaboliche, annuncio e PD1,5,6 . Per evitare che i mitocondri indotti disfunzione cellulare, cellule hanno bisogno di riconoscere specificamente danneggiato i mitocondri e rimuoverli in modo efficiente attraverso un processo cellulare chiamato autophagy mitocondriale (mitophagy). Questo ha dimostrato importanza di mitophagy in salute e malattia illustra l'esigenza di precisi ed efficienti metodi rilevare mitophagy sia in vitro che in vivo.

Mitophagy è un processo di più-passaggio che coinvolge molte proteine e proteina complessi5,7,8. In breve, un mitocondrio danneggiato è in primo luogo riconosciuto e inghiottito da un phagophore a membrana doppia, che può provenire dalla membrana plasmatica, del reticolo endoplasmatico, complesso di Golgi, nucleo o mitocondrio stesso9,10. Il phagophore sferica si allunga e alla fine sigilla i mitocondri all'interno, che costituiscono l'autofagosoma mitocondriale (mitophagosome). Il mitophagosome si fonde quindi con il lisosoma per degradazione, formando un autolisosoma in cui il mitocondrio danneggiato è degradato e riciclato7,8. Principali proteine autofagica anche coinvolti in mitophagy includono: Autophagy correlate 7 (ATG7) e Beclin1 (iniziazione), Microtubule-Associated proteina 1A/1B-Light Chain 3 (LC3-II) (LGG-1 in elegan c.s) e p62 (componenti di phagophore), e glicoproteina di membrana lisosomiale associati 2 (LAMP2)6,7. In aggiunta, ci sono parecchie proteine essenziali unico a mitophagy, tra cui indotta da PTEN putativo chinasi 1 (rosa-1), proteina nucleare Dot 52 kDa (NDP52), Parkin1, optineurin, BCL2 interazione proteina 3 come (NIX/BNIP3L) (DCT-1 c.elegans), tra gli altri5,6,11.

Un metodo comune per rilevare i cambiamenti nei livelli dell'autofagia è con il rapporto di LC3-II/LC3-I o LC3-II/actina. Tuttavia, questo metodo è non specifico, come un aumento di questo rapporto può riflettere un'iniziazione maggiore o un'alterata fusione di mitophagosome al lisosoma12. Un altro metodo è quello di valutare la colocalizzazione tra un marcatore di autofagia (ad es., LC3) e una proteina mitocondriale (ad es., Translocase di Outer mitocondriale della membrana 20 (TOMM20, che potrebbe essere degradata da proteosomi)). Tuttavia, questo può solo indicare cambiamenti nei livelli di totale mitophagy e non riesce a distinguere il passo (s) al quale blocco si verifica. Questo può essere chiarito utilizzando lysosomal inibitori (ad es., A E64d + pepstatina, chiamato EP) in parallelo per causare l'accumulo di mitophagosomes. La differenza tra il numero di mitophagosomes alla linea di base e il numero di mitophagosomes dopo il trattamento con EP può indicare mitophagy. Queste limitazioni hanno richiesto lo sviluppo di tecniche di rilevamento del romanzo mitophagy. In considerazione della crescente importanza di mitophagy in un ampio spettro di malattie umane, vi presentiamo diverse tecniche di rilevamento mitophagy robusto che possono essere utile per i ricercatori. Copriamo le tecniche sia in vitro che in vivo e consiglia di combinare le tecniche multiple per verificare le modifiche di mitophagy.

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Protocol

Animali (topi maschi e femmine) nati e cresciuti in un impianto di animale accreditati, in conformità e approvazione del Comitato di uso e cura degli animali di NIH. Metodi di eutanasia devono essere coerente con tutte le normative nazionali e istituzionali.

1. rilevamento di Mitophagy in cellule umane

  1. Rilevamento di mitophagy utilizzando mt-Keima plasmide
    Nota: La proteina di Keima, fusa ad un segnale di bersaglio di mitocondri, semplificato come mt-Keima, ha dimostrato utile per il rilevamento di mitophagy in vivo . Mt-Keima è una proteina fluorescente di pH sensibili raziometrici che esibisce verde fluorescenza (eccitazione 458 nm) in condizioni di base o neutrale e rosso in condizioni acide, in fluorescenza (eccitazione 561 nm). Mitocondri sani prosperano in condizioni di base o neutrale (pH 7-8) e sono indicati da fluorescenza verde quando transfected con mt-Keima. Quando i mitocondri subiscono mitophagy e fondono con i lisosomi silicei, il pH scende a 4.5 e mitocondri contenenti mt-Keima presentano fluorescenza rossa6,13,14. La cosa importante, mt-Keima è resistente alle proteasi lisosomiale, permettendo la valutazione di mitophagy su periodi più lunghi. Il protocollo seguito è progettato per piastre da 6 pozzetti.
    1. Giorno 1: Utilizzare cellule umane primarie (ad es., fibroblasti) o cellule umane immortalizzate (ad es., cellule cellule Hela o U2OS). Seme circa 0,3-1 × 106 cellule/pozzetto (secondo il tasso di crescita delle cellule per consentire alle cellule di raggiungere confluency di 70% il giorno successivo) in una piastra a 6 pozzetti. Mantenere le cellule in terreno di coltura cellulare completo (medium per volta Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco supplementato con 10% FBS e 1% soluzione di penicillina-streptomicina mista) e procedere all'incubazione in un'incubatrice di coltura cellulare a 37 ° C (20% O2, 5% CO2 ). Aggiungere 1 mL di coltura cellula completa pozzetto in una piastra a 6 pozzetti.
      Nota: Trattamenti di sovraespressione/atterramento o droga del Gene possono essere fatto in questo fase6.
    2. Giorno 2: Mix mt-Keima plasmide DNA6 e reagente di transfezione del DNA (la miscela per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti).
      1. Diluire 15 µ l di un reagente di transfezione del DNA con 150 µ l di terreno privo di siero secondo il protocollo del produttore.
      2. Diluire 2-5 µ g di DNA plasmidico di mt-Keima con 150 µ l di terreno privo di siero.
      3. Aggiungere diluito mt-Keima plasmide al reagente di transfezione del DNA diluito, vortexare per 10 s e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
        Nota: Ottimizzazione delle condizioni di transfezione del DNA può essere necessario a seconda delle dimensioni della piastra (Vedi protocolli dei costruttori per i dettagli).
      4. Aggiungere goccia a goccia miscela reagente di transfezione del DNA/alle celle, quindi agitare le piastre delicatamente per 5-10 s fino a quando la soluzione è completamente mescolata.
    3. Giorno 3: Cambiare il supporto sostituendo il mezzo di reagenti contenenti transfezione del DNA con terreno di coltura fresco cellulare completo (1 mL/pozzetto).
    4. Giorno 4: Immagine le cellule mediante microscopia confocale6. Utilizzare due canali di formazione immagine: canale verde (eccitazione 458 nm, emissione 570-695 nm) per visualizzare i mitocondri normali e canale rosso (eccitazione 561 nm, emissione 570-695 nm) per visualizzare i mitocondri, che sono in fase di mitophagy. Casualmente l'immagine 20 aree sotto ingrandimento 40x a coprire un totale di 100-200 celle in ogni pozzetto.
    5. Eseguire analisi di dati. Calcolare l'indice di"mitophagy" (percentuale di mitocondri che subiscono mitophagy), utilizzando software di analisi di immagine per quantificare la quantità di fluorescenza in entrambi i canali rossi e verdi: prendere il rapporto di fluorescenza rossa a fluorescenza rosso + verde, e moltiplicare per 1006.
      Nota: Alternative di transfezione includono l'utilizzo di linee mt-Keima stabilmente espressa delle cellule HeLa14. Poiché le cellule HeLa non esprimono Parkin, Parkin deve essere espresso stabilmente per studiare mitophagy Parkin-dipendente in questa linea cellulare.
  2. Rilevamento di mitophagy utilizzando la colocalizzazione tra citocromo C ossidasi subunità II (COXII) e LAMP2
    Nota: COXII è una proteina di membrana interna codificati dal genoma mitocondriale. il 'indice di mitophagy' è uguale il rapporto di COXII colocalized con LAMP2 espresso come una percentuale dell'importo totale di COXII.
    1. Cellule HeLa (o altre cellule di interesse di cui al punto 1.1.1) di semi in una diapositiva 4 pozzetti camera (1-5 × 104 cellule in 1 mL cellula completa di coltura/pozzetto) in una cella cultura incubatore a 37 ° C (20% O2, 5% CO2) durante la notte.
    2. Aggiungere 3,0 µ l di carbonilico 10mm cianuro - 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) ed incubare l'incubatrice di coltura cellulare (punto 1.2.1) per 3 h.
      Nota: Altre droghe che interessano mitophagy possono essere utilizzati.
    3. Rimuovere il terreno di coltura utilizzando una pipetta da 1 mL, lavare le cellule due volte con 1 mL/bene di freddo (0-4 ° C) 1x PBS. Lasciare riposare per 10-30 s prima il lavaggio successivo. Quindi aggiungere 0,5 mL 3,7% paraformaldeide (PFA) in 1X PBS in ciascun pozzetto e incubare per 10 minuti sul ghiaccio per fissare le cellule.
      Attenzione: PFA è tossina. Lavorare in una cappa quando si utilizza PFA.
    4. Scartare la soluzione PFA utilizzando una pipetta da 1 mL, lavare le cellule due volte con freddo 1 X PBS (1 mL/pozzetto; lasciate soluzione riposare per 10 s prima il lavaggio successivo) e permeabilize le cellule con 1 mL/bene di 0,25% detergente (in 1X PBS) per 10 min sul ghiaccio.
    5. Scartare il buffer permeabilizing, lavare delicatamente le cellule due volte con freddo 1X PBS e scartare (lasciate che la soluzione di sedersi per 10 s tra i lavaggi). Bloccare le cellule con 1 mL/bene di 5% FBS in PBS 1X durante la notte a 4 ° C. Coprire gli alloggiamenti per evitare la perdita di umidità.
    6. Preparare 0,5 mL/pozzetto di una soluzione di anticorpo misto con anticorpo COXII (mouse, diluizione 1: 250) e l'anticorpo di LAMP2 (coniglio, 01:20-01:50 diluizione) in PBS 1x con 5% di FBS e negozio sul ghiaccio per 0,5-1 h.
    7. Estrarre la diapositiva 4 pozzetti camera dalla camera fredda e scartare la soluzione bloccante con una pipetta da 1 mL. Lavare delicatamente le cellule due volte con 1 mL/bene di freddo 1X PBS e scartare (lasciate che la soluzione di sedersi per 10 s tra i lavaggi), quindi aggiungere 0,5 mL/bene della soluzione mista dell'anticorpo. Incubare a 37 ° C per 1 ora su un agitatore a bassa velocità.
    8. Scartare la prima soluzione di anticorpo usando una pipetta da 1 mL e delicatamente lavare le cellule tre volte con 1 mL/bene di PBS 1X freddo e scartare. Lasciate che la soluzione si siede per 10 s prima il lavaggio successivo. Aggiungere 1 mL/pozzetto di fluorescenti anticorpi secondari (per esempio, capra anti-coniglio con nm di lunghezza d'onda 568 di proteina fluorescente rossa (RFP) per LAMP2; e anti-topo di capra con lunghezza d'onda 488 nm della proteina fluorescente verde (GFP) per COXII) in una diluizione di 1: 250 con 5% FBS in PBS 1X. Coprire la diapositiva 4 pozzetti camera con carta stagnola e incubare a 37 ° C per 1 ora su un agitatore a bassa velocità.
    9. Scartare la soluzione seconda anticorpo con una pipetta da 1 mL. Lavare delicatamente le cellule sei volte con 1 mL/bene di PBS 1X freddo. Lasciare riposare per 1 min prima il lavaggio successivo.
    10. Montare le cellule con 50 µ l/pozzetto di mezzo di montaggio antifade con DAPI e aggiungere vetrini coprioggetto.
    11. Le cellule al microscopio confocale con 66 x ingrandimento ed immersione olio di immagine (mattonelle scansioni / mosaici possono essere utilizzati per aumentare il numero delle cellule imaged tramite il software). Utilizzare le stesse impostazioni come tempo di esposizione di canale, guadagno digitale, offset digitale, ecc in tutto tutto imaging processi (Vedi istruzioni del software per i dettagli)15.
    12. Software di analisi di colocalizzazione di uso per analizzare quantitativamente almeno 20 immagini casuali di 100 cellule15. Utilizzare la funzione "Bezier chiuso" per selezionare intere celle individuali. Confrontare il coefficiente di Pearson colocalizzazione GFP a RFP, appesantito o non pesato, per determinare i livelli di mitophagy in cellule analizzate. Mantenere i valori per mirino orizzontali e verticali del software di analisi di colocalizzazione nel corso di analisi. Per impostare con precisione questi mirini, preparare due insiemi supplementari delle cellule ed etichettare uno COXII e l'altro LAMP2. Quindi, impostare mirino direttamente sopra la distribuzione di pixel per ogni canale15 (vedere istruzioni del software per i dettagli).
  3. Un alto throughput misura per lo screening mitophagy di imaging
    Nota: Eseguendo schermi elevato throughput di mitophagy-induttori o inibitori mitophagy composti da grandi biblioteche composti è tecnicamente impegnativo. Una tecnica di imaging basata sulla colocalizzazione dei mitocondri con autofagosomi è un'alternativa più semplicistica, ma altamente sensibile per mitophagy16di screening.
    1. Giorno 1: Cellule (ad es., fibroblasti umani primari alle 5.000 cellule/100 mL delle cellule di coltura/pozzetto) in una piastra a 96 pozzetti del seme (Vedi punto 1.1.1).
    2. Giorno 2: Trattare le cellule dal secondo giorno con FCCP o altri composti di interesse per periodo di incubazione designato (Vedi punto 1.2.2).
    3. Seguire i passaggi 1.2.2-1.2.9 usando gli anticorpi primari per COXII (mouse, diluizione di 1: 250 con 5% FBS in 1X PBS) e LC3B (coniglio, 1: 100-diluizione 1: 200 con 5% FBS in PBS 1X). In alternativa, possono essere utilizzati anticorpi primari per COXII e LAMP2.
    4. Le celle utilizzando un lettore fluorescente16della battuta. Raccogliere immagini nei campi posizionati in modo casuale e con un minimo 500 cellule per pozzetto.
    5. Analizzare i dati utilizzando una cella analizzatore su misura protocollo16.

2. rilevamento di Mitophagy in c. elegans

Nota: Il nematode c. elegans fornisce una piattaforma per analizzare mitophagy a livello organismal. Due ceppi possono essere utilizzati per monitorare mitophagy: (1) mitocondrio-mirati Rosella (mtRosella) o (2) mitophagy recettore DCT-1 fusi con GFP con indicatore di autofagosoma LGG-1 fuso con Discosoma sp. proteina fluorescente rosso (DsRed)5, 17.

  1. Mitophagy monitoraggio mediante biosensore Rosella
    Nota: Rosella è un biosensore molecolare che combina un pH-insensibile DsRed fusa ad una variante GFP pH sensibili. Il biosensore Rosella sfrutta le differenze di pH tra il lisosoma acida (pH ~ 4,5) e altri compartimenti cellulari. Questo biosensore è stato utilizzato per monitorare correttamente mitophagy in Saccharomyces cerevisiae e numerose linee di cellule di mammifero, come HeLa, HEK293 e HCT11618,19. Abbiamo adattato questo versatile dual-fluorescente reporter e generato transgenici c. elegans nematodi esprimendo mitocondrio-mirati Rosella (mtRosella) in cellule di muscolo della parete del corpo. Mitophagy induzione è indicato da un ridotto rapporto GFP/DsRed di mtRosella di fluorescenza.
    1. Giorno 1: Pick L4 larve di vermi esprimendo mitocondrio-mirati Rosella (mtRosella) in cellule di muscolo della parete del corpo su un piatto di Nematode crescita Media (NGM) seminato con Escherichia coli (OP50) utilizzando un microscopio di dissezione5. Mettere 10-20 worm/piastra su almeno tre piatti di 3,5 cm. Incubare i nematodi alla temperatura standard di 20 ° C5.
      Nota: Vedere il riferimento per l'anatomia della vite senza fine, compresa l'individuazione di L4 larve20e il modo per fare un pick che viene utilizzato per trasferire i vermi da una posizione a un'altra21.
    2. Giorno 5: Sincronizzare nematodi selezionando 15-20 L4 larve transgeniche e trasferendoli sul fresco OP50 seminato piastra NGM. Utilizzare almeno cinque piastre a condizione sperimentale.
    3. Giorno 7: Preparare piastre dei veicoli per le droghe che interessano mitophagy di interesse o controlli positivi.
      1. Uccidere i batteri e. coli (OP50) seminati esponendo piastre NGM per 15 min con 222 µW/cm2 (intensità) di luce UV per garantire che i composti d'induzione mitophagy non sono metabolizzati dai batteri. Piastre devono essere esposti con 2.000 J/m2.
        Nota: Secondi di esposizione necessaria = 2.000/((intensity in µW/cm2) * 100).
      2. Aggiungere presenti di interesse per la parte superiore delle teste di serie NGM piastre. Aggiungere una quantità equivalente di veicolo composto (solvente utilizzato per sciogliere il composto, come il dimetilsolfossido (DMSO)) per le piastre di veicolo come controllo negativo. Controllo positivo di induzione di mitophagy, un tossico mitocondriale, è stato utilizzato il paraquat (concentrazione finale di 8 mM). Aggiungere una soluzione contenente 10 µ l di stock il paraquat 8m con 190 µ l di ddH2O nella parte superiore della piastra di agar per il gruppo di trattamento. Per il gruppo di veicolo, aggiungere una soluzione contenente 10 µ l di DMSO con 190 µ l di ddH2O nella parte superiore della piastra di agar.
        Nota: La soluzione di paraquat-lavoro può essere conservata per 1 mese a 4 ° C.
      3. Agitare delicatamente le piastre fino a quando il farmaco o veicolo ricopre tutta la superficie. Lasciate le piastre a secco con i coperchi chiusi a temperatura ambiente per almeno 1 h prima di trasferire i vermi.
        Nota: Piastre di droga possono essere preparati anche con l'aggiunta di farmaci nel liquido NGM prima si solidifica.
    4. Giorno 7: Trasferimento di 10-20 di animali transgenici adulti 2-giorno-vecchio preparati al punto 2.1.2 per piastre contenenti sia il paraquat, presenti di interesse, o di veicolo (DMSO). Incubare gli animali transgenici a 20 ° C per 2 giorni.
    5. Giorno 9: Preparare 2% agarosio cuscinetti (Vedi Materiale supplementare). Quindi aggiungere una goccia (10 µ l) di levamisole 20mm in M9 a pad. Immobilizzare gli animali transgenici per l'imaging, inserendoli nella goccia M9-levamisole. Posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti in alto a sinistra.
    6. Catturare gli animali transgenici singoli utilizzando una telecamera collegata ad un microscopio a epifluorescenza. Acquisire immagini fluorescenti di nematodi intero transgenici che esprimono mtRosella in cellule di muscolo del corpo-parete di ingrandimento 10 X5. Salvare le immagini raccolte.
    7. Elaborare le immagini acquisite con il software ImageJ. Analizzare le cellule di muscolo del corpo muro situate nella testa del worm per evitare autofluorescenza nel tessuto intestinale. Misurare l'area valore e totale di intensità medio dei pixel per ogni immagine fluorescente solo della regione della testa di ogni animale. Per analizzare la specifica area di interesse:
      1. Selezionare 'dividere canale' sotto il menu a discesa 'immagine' e 'colore' di convertire le immagini.
      2. Utilizzare lo strumento di «selezione a mano libera» per acquisire l'area fluorescente di interesse.
      3. Selezionare il comando 'misurazione' sotto il menu a discesa 'analizzare' ed eseguire analisi di intensità di pixel.
      4. Intensità di pixel deve essere normalizzato dividendo intensità dall'area totale analizzato. Al momento di normalizzazione, calcolare la GFP a DsRed rapporto22.
    8. Utilizzare delle analisi statistiche software a una condotta di student t-test (confronto tra due gruppi) o ANOVA (confronto tra più gruppi) per l'analisi statistica con p < 0,05 come significativo5,17 .
  2. Valutazione mitophagy usando co-localizzazione tra DCT-1 e LGG-1
    Nota: DCT-1 è una proteina della membrana mitocondriale esterna che agisce come recettore mitophagy in risposta allo stress condizioni, simile al suo presunto ortologhi BNIP3 e NIX/BNIP3L in mammiferi5. Così, mitophagy iniziazione è valutata da co-localizzazione tra mitophagy DCT-1 del ricevitore e autofagosoma proteina della membrana LGG-1 (omologo dei mammiferi LC3).
    1. Giorno 1: Pick L4 larve di animali transgenici che esprimono sia DCT-1::GFP e DsRed::LGG-1 nel corpo-parete muscolo cellule5 su un OP50 seminato piastra NGM. Posizionare la piastra di 5-10 vermi/3.5 cm e utilizzare almeno tre piastre. Incubare i nematodi a 20 ° C.
      Nota: I transgeni si trovano su plasmidi separati e non sono integrati nel genoma. Raccogliere i nematodi che trasportano marcatori GFP contransformation sia rol-6(su1006) e pmyo-2 . Solo vermi transgenici con entrambi gli indicatori di contransformation rapidi sia DCT-1::GFP e DsRed::LGG-1 in cellule di muscolo della parete del corpo.
    2. Seguire i passaggi da 2.1.2-2.1.5.
    3. Cellule di muscolo del corpo-parete singola immagine utilizzando una telecamera collegata ad un microscopio confocale5,23. Rilevare i bordi delle cellule di muscolo intero corpo-parete e z-stack di prendere immagini sotto 63 ingrandimenti. Maggiore ingrandimento può anche essere utilizzato.
    4. Aprire ed elaborare le immagini acquisite con il software confocale. Iniziazione di mitophagy è indicato da co-localizzazione del recettore mitophagy (DCT-1::GFP) al marcatore autofagosoma (DsRed::LGG-1). Misurare manualmente eventi co-localizzazione in ogni pila di corpo-parete muscolare cella5. È essenziale per mantenere tutte le impostazioni di microscopio e la fotocamera (lente e lente d'ingrandimento, filtri, tempo di esposizione, ad alta risoluzione, intensità del laser, guadagno, ecc.) coerenti durante gli esperimenti. Dovrebbero essere notate tutte le impostazioni.
    5. Utilizzare delle analisi statistiche software a una condotta di student t-test (confronto tra due gruppi) o ANOVA (confronto tra più gruppi) per l'analisi statistica con p < 0,05 come significativo5,17 . Per utilizzano i confronti bidirezionali dello studente t-test (p < 0,05 è considerato significativo). Per i confronti multipli utilizzare l'analisi di varianza di singolo fattore (ANOVA), rettificato dal test di Bonferroni post hoc . Si consiglia di analizzare almeno 50-70 animali o le cellule di muscolo del corpo-parete 30-50 per ogni condizione sperimentale. Ripetere l'esperimento almeno tre volte.

3. rilevamento di Mitophagy in topi

Nota: Precedenti metodi per rilevare mitophagy in topi erano ingombranti, insensibile e difficili da quantificare. Un modello di topi transgenici che esprimono la forma mitocondriale mirata del reporter fluorescente Keima (mt-Keima) ora possa essere utilizzata per valutare i livelli di mitophagy in una vasta gamma di condizioni fisiologiche e fisiopatologiche.

  1. Eutanasia topi utilizzando un protocollo approvato dal istituzionale Animal Care e uso Comitato14.
  2. Fissare il mouse (lato ventrale verso l'alto) per la piattaforma di funzionamento con perni nelle membra. Praticare un'incisione nel basso addome utilizzando pinze e forbici di microchirurgia per esporre il fegato24. Tagliare un pezzo di fegato (per esempio, un pezzo del lobo di destra alle 1 × 1 × 1 cm) con delle forbici di microchirurgia, forcipe.
    Nota: Rilevamento di mitophagy nei topi è complicato e richiede la conoscenza del mouse anatomia e gestione del mouse altamente abile e chirurgia del mouse. Questo protocollo viene descritta la procedura base, chiave su questo metodo, e un metodo più dettagliato è disponibile24.
  3. Posizionare il campione del fegato su una piastra metallica sul ghiaccio per raffreddare rapidamente il tessuto. Mantenere il tessuto sulla placca di metallo fredda ed elaborare più velocemente possibile. Utilizzare in modo ottimale, all'interno di 1 h di dissezione.
  4. Sollevare l'esempio del fegato utilizzando forcipe curvo e sciacquare con 5 mL di PBS 1X ghiacciata.
  5. Trasferire il fegato di una capsula di Petri (Ø 100 mm) sul ghiaccio con il fine di cucchiaio di una spatola.
  6. Tagliare il fegato campione a mano in 0,5-1 sezioni spesse mm utilizzando lame tagliente.
  7. Trasferire con cautela le sezioni di tessuto per un piatto di fondo di vetro usando il forcipe di microchirurgia.
  8. Impostare con attenzione la sezione del fegato con il forcipe per appiattire sul fondo.
  9. Coprire il fegato affettato con 3-5 gocce di PBS 1X freddo.
    Nota: Colorazione DAPI è consigliato per identificare l'area di interesse in determinati tessuti (ad es., cervello)24. Per convalidare la co-localizzazione del segnale rosso mt-Keima con il lisosoma, coloranti lisosomiale, come destrano cascata blu e lysosensor, possono essere utilizzati24.
  10. Le sezioni di tessuto sotto microscopia confocale tramite due eccitazioni sequenziale24della battuta. Impostare i due canali di formazione immagine: "verde" mt-Keima canale (eccitazione 458 nm, emissione 570-695 nm gamma) e "rosso" mt-Keima (eccitazione 561 nm, intervallo di emissione 570-695 nm). Mantenere le impostazioni di imaging tra condizioni sperimentali. Per l'imaging più efficiente, è necessario analizzare due animali in una sola volta.

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Representative Results

Rilevamento di Mitophagy in cellule umane:

Utilizzando la procedura qui presentata, umane cellule HeLa transfected con mt-Keima plasmide. Le cellule sane hanno dimostrato una ben organizzata rete mitocondriale (GFP, 488 nm) con poche incidenze di mitophagy (RFP, 561 nm). Tuttavia, le celle pretrattati con un mitocondriale disaccoppiante FCCP (30 µM per 3 h) ha esibito un aumento profondo mitophagy incidenza (Figura 1A). Mitophagy inoltre è stata misurata utilizzando la co-localizzazione tra LAMP2 e COXII (Figura 1B).

Rilevamento di Mitophagy in C. Elegans

Abbiamo esaminato il muscolo della parete del corpo cellule di nematodi transgenici che esprimono DsRed fusa con LGG-1 e mtRosella o DCT-1 fusi con GFP in condizioni normali e indurre mitophagy come lo stress ossidativo. Gli animali transgenici sono stati esposti al paraquat (8 mM per 2 giorni). Mitophagy induzione è indicato dal rapporto GFP/DsRed in diminuzione della fluorescenza mtRosella (Figura 2A). Inoltre, l'elevato numero di eventi di co-localizzazione tra DCT-1::GFP e DsRed::LGG-1 segnali significa mitophagy stimolazione in risposta allo stress ossidativo (Figura 2B).

Rilevamento di Mitophagy usando i topi mt-Keima:

Analisi di in vivo mitophagy di imaging fornisce la comprensione in mitophagy in condizioni normali e patologiche. Utilizzando il protocollo descritto in precedenza, mitophagy occorrenza nei tessuti di diversi organi, quali fegato e cervelletto (Figura 3), può essere visualizzato con mitophagy confocale.

Figure 1
Figura 1. Diversi metodi per valutare mitophagy in cellule umane. HeLa umano (A) le cellule sono state trasfettate con mt-Keima plasmide per tre giorni, seguita da formazione immagine a entrambi 488 nm e 561 nm. Come controllo positivo, ceflls sono stati trattati con FCCP (30 µM) 3 h prima a imaging. (B) immagini di fibroblasti primari umani macchiati con LAMP2 (RFP) e COXII (GFP). (C) immagini dei fibroblasti umani macchiato con gli anticorpi anti-LC3 (verde) e anti-TOM20 (rosso). Le barre a destra mostrano la lettura dei mitocondri co-localizzazione con autofagosomi. Co-localizzazione è aumentata dallo stress energico (media privo di glucosio galattosio) e l'aggiunta di inibitori di lysosomal E64d e pepstatina A (EP) per barre della scala rappresentante 24 h. per (A), (B) e (C) sono etichettati come l'ultimo Figura di ogni pannello, in modo indipendente. I dati quantitativi sono mostrati in media ± s.e.m. * * *p < 0,001; t-test. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Nella figura 2. Rilevazione in vivo di mitophagy in c. elegans. (A) nematodi transgenici che esprimono mtRosella in cellule di muscolo della parete del corpo sono stati trattati con il paraquat 8 mM. Mitophagy stimolazione è significata per il rapporto in diminuzione tra GFP pH sensibili al pH-insensibile DsRed (n = 50; * * *p < 0,001; t-test). Punte di freccia sottolineare autofluorescence intestinale. Le barre di scala indicano 20 dettagli µm. acquisizione: tempo di esposizione, 200 ms; Contrasto, medio. Immagini sono state acquisite utilizzando un obiettivo obiettivo 10x. I dati quantitativi sono mostrati in media ± s.e.m. valori. (B) nematodi transgenici cheesprimono mitophagy recettore che DCT-1 fusi con GFP insieme con la proteina autofagosoma che LGG-1 fusa con DsRed in cellule di muscolo della parete del corpo sono stati esposti al paraquat di 8 mM. Mitophagy induzione è indicato dalla co-localizzazione di GFP e DsRed segnali (per ogni gruppo di immagini DCT-1 è indicato in verde sulla parte superiore, autofagosomi in rosso qui sotto e un'immagine unita nella parte inferiore; n = 30; * * *p < 0,001; t-test). Vendita barre indicano 20 dettagli µm. acquisizione: risoluzione 1.024 X 1.024; Master gain, Track1: 562 e Track2: 730; Filtri di emissione, Track1 canale1: 639 nm e Track2 canale2: 519 nm; Intensità, Track1 del laser (543 nm): 12,9% e Track2 (488 nm): 39,4%. Immagini sono state acquisite utilizzando un obiettivo X 40. I dati quantitativi sono mostrati in media ± s.e.m. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Rilevazione in vivo di mitophagy in topi transgenici mt-Keima. Immagini rappresentative di mt-Keima segnali nella zona del cervelletto (tra cui le cellule di Purkinje, pannello inferiore) di un mouse di mt-Keima e fegato (superiore) (458 nm, verde; 561 nm, rosso). Barra della scala indica 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Misurazione accurata di mitophagy è tecnicamente impegnativo. Qui, abbiamo presentato diverse tecniche robuste che consentono entrambi rilevazione qualitativa di mitophagy e quantificazione dei livelli di mitophagy nei modelli sperimentali di laboratorio più comuni.

Acquisire dati replicabili, un disegno sperimentale con almeno tre ripetizioni biologiche è necessario. Tutti i ricercatori coinvolti nella sperimentazione e analisi devono essere accecati alle identità di gruppo sperimentale. Inoltre, campi di imaging devono essere scelti a caso durante l'acquisizione di immagini. Per colture cellulari e gli studi di c. elegans , devono essere eseguite almeno tre ripetizioni biologici. Per gli studi del topo mt-Keima, si consiglia di utilizzare un numero sufficiente di topi per raggiungere il significato statistico. Per cellule di mammifero, 30-100 cellule per ogni esperimento di analizzare ed eseguire almeno 3 diversi esperimenti. Controllo di qualità a questi passi permette risultati replicabili. Rilevamento di mitophagy nel lievito è stato recentemente sintetizzato altrove25.

Ci sono diversi passaggi critici nelle tecniche di rilevazione in vitro mitophagy. L'efficienza di trasfezione, che dipende dalla qualità dei reagenti e il DNA usato, è di vitale importanza durante la transfezione della proteina mt-Keima. Così, l'ottimizzazione dell'efficienza di trasfezione in condizioni diverse (ad es., utilizzando linee cellulari differenti) è necessario. Per il metodo di LAMP2/COXII, specificità dell'anticorpo e piega diluizione ottimale anticorpo primario influenzano la qualità delle immagini e dovrebbe essere testati prima di iniziare gli esperimenti. Lo stesso vale per il metodo di imaging ad alto contenuto, dove la qualità dell'anticorpo e diluizione sono cruciali. Il sistema di microscopia automatizzata e il protocollo di analisi personalizzata consente l'imaging e l'analisi di almeno 1.500 cellule/condizione, che rende i risultati estremamente robusti rispetto ad altri in vivo imaging base metodi. Inoltre, il protocollo di analisi fornisce dati su ulteriormente i parametri mitocondriali come zona lunghezza e totale su una base di cella per cella, che è molto utile nella ricerca di mitophagy.

In alcuni casi, non è consigliabile analizzare la colocalizzazione di LAMP2 con proteine della membrana esterna mitocondriale come TOMM20. Le primissime fasi di mitophagy coinvolgono Parkin-mediata di ubiquitinazione delle proteine della membrana esterna mitocondriale, tra cui TOMM20 e Mitofusin 1 (MFN1). Parkin coniugati più collegamenti di catena di ubiquitina diversi su queste proteine tra cui catene di ubiquitina K48-collegato, che promuovono la degradazione della proteina dal proteasoma 26S. Di conseguenza, queste proteine della membrana esterna mitocondriale ubiquitinate ancora possono essere degradate anche se mitophagy è bloccato6. Questo può comunque alterare i dati, con conseguente falsi positivi nella interpretazione complessiva dei dati. Inoltre, l'eliminazione del DNA mitocondriale (mtDNA nucleoids) è un secondo indicatore di mitophagy, e può essere quantificato dall'immunofluorescenza usando un anticorpo di anti-DNA6.

Alcuni passaggi critici per il monitoraggio in vivo mitophagy in c. elegans sono elencati di seguito:

1. trasferimento di animali transgenici per nuove piastre che ogni 24-48 h è consigliato per evitare la conseguenza della prole, che conduce a una popolazione mista o di fame, che a sua volta può innescare mitophagy. Pertanto, devono essere utilizzati nematodi non morti di fame.

2. il Levamisole è un lieve anestetico che viene utilizzato per immobilizzare i nematodi. Evitare anestetici che potrebbero influenzare l'attività mitocondriale, ad esempio sodio azide. Sodio azide blocca componenti della catena respiratoria mitocondriale e perturba la generazione di energia, che porta allo stress ossidativo e mitocondriali. Così, la sodio azide rischia di innescare mitophagy.

3. i campioni non dovrebbero poter asciugare durante l'esame al microscopio. Pertanto, l'uso di buffer di M9 anziché acqua raccomanda di garantire condizioni favorevoli osmotiche.

4. intestinale autofluorescence aumenta con l'età in c. elegans. Così, le cellule di muscolo del corpo-parete vicino l'intestino dovrebbero essere evitate durante l'esame al microscopio.

5. se il paraquat non riesce ad indurre mitophagy: r. aumentare il tempo di esposizione di paraquat su vermi, b. aumento il paraquat concentrazione, o c. preparare una soluzione di lavoro fresca del paraquat dal momento che la sua efficienza diminuisce nel tempo.

6. se aumentato matricida schiusa è osservata in vermi esposti al paraquat, sia: a. ridurre il periodo di trattamento il paraquat, b. ridurre la concentrazione di paraquat, c. supplemento piastre con fluorodeossiuridina (FUdR) (def. concentrazione di 100-400 μM), un inibitore della sintesi del DNA che impedisce schiusa dell'uovo, o d. condurre l'esperimento a worms più vecchi (ad es., 4-giorno-vecchio worm).

Questa procedura descrive i passaggi per l'imaging mitophagy nel fegato utilizzando i topi transgenici mt-Keima, come mostrato nella Figura 3. Tessuti diversi il cervello ed il fegato sono stati analizzati utilizzando il sistema di mt-Keima14. La formazione immagine Dual-eccitazione rapporto nei tessuti del fegato è ottenuta tramite due eccitazioni sequenziale. Tutte le immagini devono essere ottenute da organi appena asportati. Tessuti esaminati dovrebbero essere mantenuti freddo e trasformati più rapidamente possibile. Fette del fegato possono essere ottenute a qualsiasi età. Quando imaging mitophagy, ottimizzare i tempi di poteri e l'esposizione di laser per ogni organo durante l'analisi al microscopio. Potere del laser deve essere impostata in uscita minima che permette la visualizzazione libera del mt-Keima segnale14. Tuttavia, esistono alcune limitazioni per i topi transgenici mt-Keima. A causa dell'instabilità di Keima, nonché la perdita di un gradiente di pH attraverso la membrana lisosomiale sotto fissazione, questo modello di mouse non è adatto per cryo-sezionamento e immunohistochemistry. Un'altra limitazione è che mt-Keima, o aggregati di matrice di questa proteina, possono influenzare le funzioni mitocondriali o cellulare sconosciute, anche se non cambia ossigeno mitocondriale consumo tasso14. Inoltre, i tempi e costi associati con mt-Keima topi rendono meno desiderabile per analisi di alto-rendimento rispetto alla coltura delle cellule di cui sopra e metodi di c. elegans . Oltre ai metodi citati, altri modi per studiare quantitativamente mitophagy in mt-Keima topi sono Western blot o FACS. Notare che, oltre ai topi transgenici mt-Keima, c'è un altro modello di topo mitophagy, il "mito-QC", un modello di topo transgenico con un segnale mitocondriale fluorescente pH sensibili26. A causa della complessità e della mitophagy dinamica, è consigliabile combinare i metodi di cui sopra fluorescenza con altri metodi di rilevamento mitophagy comuni, quali la microscopia elettronica e Western blotting, per rafforzare i risultati.

Lo sviluppo di nuove tecniche di rivelazione di mitophagy come quelli menzionati qui avrà vaste applicazioni, da studi meccanicistici di mitophagy per gli schermi della droga a resa elevata. Si noti che mitophagy è facilmente influenzata dalle fluttuazioni sia endogene che esogene (ad esempio, condizioni di coltura delle cellule come densità cellulare, inedia, ipossia, ecc.) 1 , 5 , 8. Pertanto, è fondamentale che le stesse condizioni sperimentali sono mantenute per tutti gli esperimenti. È importante utilizzare una combinazione di metodi di rilevazione diversi mitophagy in studi sia in vitro che in vivo per verificare la corretta interpretazione della mitophagy stato. Ulteriore comprensione dei meccanismi di mitophagy, raggiunto attraverso tecniche menzionati, consentirà lo sviluppo di metodi nuovi, più precisi di rilevamento mitophagy.

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Disclosures

Il laboratorio di Bohr ha CRADA accordi con ChromaDex e GlaxoSmithKline.

Acknowledgments

Ringraziamo Dr. Atsushi Miyawaki e Dr. Richard J. Youle per aver condiviso il plasmide Keima mt e mt-Keima integrato cellule Hela. Ringraziamo Raghavendra A. Shamanna e Dr. Deborah L. Croteau per la lettura critica del manoscritto. Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca intramurale di NIH (VAB), Istituto nazionale su invecchiamento, nonché un 2014-2015 e 2016-2017 NIA intra-laboratorio concedere (FEP, VAB). FEP è stata sostenuta da HELSE SOR-OST RHF (progetto No: 2017056) e il Consiglio di ricerca di Norvegia (progetto No: 262175).

AUTORE DI CONTRIBUTI:

FEP progettato il manoscritto ed elaborato il progetto; KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH ed ED ha scritto diverse sezioni del libro; NT, JP, HN e VAB rivisto il manoscritto e fornito competenze.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mt-Keima mouse Jackson Laboratory
Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent Thermofisher #11668027
Opti-MEM medium (Gibco) Thermofisher #31985062 serum-free medium
mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima addgene #72342
COXII antibody (mouse) abcam #ab110258
LAMP2 antibody (rabbit) NOVUS #CD107b
goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP) Thermofisher #Z25306 Alexa Fluor 568 dye
goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP) Thermofisher #Z25002 Alexa Fluor 488 dye
prolong gold antifade with DAPI Invitrogen #P36931
6-well plate SIGMA
Corning Costar
#CLS3516
4-well chamber slide THermofisher, Nunc Lab-Tek #171080
Nunc F 96-well plate Thermofisher #152038
LC3B antibody rabbit NOVUS #NB100-2220
DNA antibody Progen Biotechnik #anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10
DAPI Thermofisher #D1306 antifade mounting medium with DAPI
IN Cell analyzer (fluorescent reader ) GE Healthcare Life Sciences #IN Cell analyzer 2200
Eclipse TE-2000e confocal microscope Nikon #TE-2000e
Colocalization software Volocity #Volocity 6.3 alternative Zeiss ZEN 2012 software
IN Cell Investigator Software GE Healthcare Life Sciences #28408974
cell culture medium Thermofisher #DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermofisher #15140122
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich #12003C-1000ML
Cell culture Incubator Thermofisher #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator
epifluorescence microscope Zeiss Zeiss Axio Imager Z2
camera Olympus Olympus DP71
confocal microscope Zeiss Zeiss Axio Observer Z1
confocal software Zeiss ZEN 2012
image analysis software Image J colocalization analysis, etc https://imagej.nih.gov/ij/
statistical analysis software GraphPad Software Inc., San Diego, USA GraphPad Prism software package
material to make a worm pick Surepure Chemetals #4655 The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire
IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] Material inquiry to Tavernarakis Nektarios Maintain transgenic animals at 20 °C
IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 TOMM-20::Rosella Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pdct-1 DCT-1::GFP Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 DsRed::LGG-1 Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
Paraquat solution see supplementary data for preparation
M9 buffer see supplementary data for preparation
M9-levamisole buffer see supplementary data for preparation
Glass Microscope Slides and Coverslips Fisher Scientific #B9992000
Surgical forceps STERIS Animal Health 19 Piece Canine Spay Pack Economy
Surgical scissors STERIS Animal Health 19 Piece Canine Spay Pack Economy
1x PBS Thermofisher #AM9625 10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O
shaker Fisher Scientific #11-676-178 Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A
2% agarose pad see supplementary data for preparation
Vibroslice blades World precision instruments #BLADES-2 single-edge blade
metal plate MSC #78803988 0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet
Triton X-100 detergent
Methyl viologen dichloride hydrate Sigma-Aldrich #856177 paraquat
Incubator for nematodes AQUALYTIC Incubator to maintain 20 °C
Dissecting stereomicroscope Olympus SMZ645
Confocal microscope Zeiss AxioObserver Z1 For nematodes (step 2)
epifluorescence microscope Zeiss AxioImager Z2 For nematodes (step 2)
UV crosslinker Vilber Lourmat BIO-LINK – BLX-E365 UV light source; 356 nm

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References

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