Mäta effekten av kemikalier på tillväxt och reproduktion av Caenorhabditis elegans

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En grundläggande protokollet att utvärdera toxiciteten av kemikalier i en modell djur, Caenorhabditis elegans, beskrivs. Metoden är bekvämt och praktiskt för utveckling av läkemedel samt för riskbedömning av olika miljöföroreningar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lee, S. Y., Kang, K. Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (128), e56437, doi:10.3791/56437 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Toxikologisk utvärdering är avgörande för att förstå effekterna av kemikalier på levande organismer i grundforskning och tillämpad biologisk vetenskap fält. En icke däggdjur jord runt masken Caenorhabditis elegans, är värdefulla modellorganism för toxikologiska studier på grund av dess bekvämlighet och djuretik problem jämfört med däggdjur djur system. I detta protokoll beskrivs ett detaljerat förfarande av toxikologiska utvärdering av kemikalier i C. elegans . En klinisk cancer drog, etoposid, som riktar sig till mänsklig topoisomeras II och hämmar DNA-replikation av mänskliga cancerceller, valdes som modell testning kemiska. Ålder-synkroniserad C. elegans ägg utsattes för antingen dimetyl sulfoxid (DMSO) eller etoposid och då tillväxten av C. elegans var övervakas varje dag i 4 dagar av stereo Mikroskop observationen. Totala antalet ägg som från C. elegans behandlas med DMSO eller etoposid räknades också med hjälp av stereomikroskopet. Etoposid behandling påverkas signifikant tillväxt och reproduktion av C. elegans. Genom jämförelse av totala antalet ägg som från maskar med olika behandlingsperioder av kemikalier, kan det beslutas att reproduktiv toxicitet av kemikalier på C. elegans reproduktionen är reversibel eller irreversibel. Dessa protokoll kan vara till hjälp för både utvecklingen av olika droger och riskbedömning av miljögifter.

Introduction

Toxikologisk utvärdering är avgörande för utvecklingen av läkemedel, nutraceuticals, och cosmeceuticals, samt riskbedömningen av olika miljögifter. Gnagare modellen är en av de mest populära i vivo experimentella system för toxikologi studien; Alternativt används också allmänt icke däggdjur organismer såsom C. elegans . Icke-däggdjur toxikologisk utvärdering modeller är fördelaktigt på grund av inte bara djur etiska frågor utan också deras bekvämlighet och nyttan med tanke på kostnadseffektivitet, underhållsmässighet, hastighet och reproducerbarhet1,2 ,3,4.

C. elegans, en jord runt mask, har utnyttjats som ett modell djur i olika grundläggande och tillämpad biologi och kemi forskning. Det är en 1 mm långa, genomskinliga nematod, som helt enkelt upprätthålls i fast eller flytande Nematoden Growth Media (NGM) matas med bakteriell stam Escherichia coli OP50. C. elegans har kort livslängd och vildtyps-N2 C. elegans lägger cirka 300 ägg. Därför är det lätt förökas för att användas som experimentella material3,4,5. C. elegans har också använts i de toxikologiska studierna av många läkemedel och miljögifter6,7,8,9.

Eftersom många cytostatika mål snabbt delande cancerceller, kan de också skada snabbt delande normala celler såsom benmärg, intestinal epitel och hårsäcken celler. Till exempel rikta topoisomeras hämmande cytostatika DNA replikeringen av cancerceller; Därför, de hämmar också snabbt delande normala celler. Varje levande organism har topoisomeraser, och dessa topoisomeras hämmare mest sannolika inverkan miljömässiga ekosystem6,10,11. En drog toxikologisk utvärdering plattform med hjälp av en modell djur är alltså värdefullt för både utvecklingen av läkemedel och miljöriskbedömning.

I den här artikeln beskriver vi de detaljerade protokoll för att testa toxiciteten av etoposid, som är en klinisk cancer agent att mål topoisomeras II, som en modell miljögift i C. elegans. För detta ändamål kommer vi att beskriva mätmetoden av kroppsstorlek och det totala antalet ägg som i C. elegans behandlas med etoposid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Obs: hela experimentet måste utföras i en ren isolerade laboratorium upprätthålls vid 20 ° C med låg damm och minimering av kontaminering under masken och bakteriell hantering. För detta ändamål experiment måste utföras under lågan av en alkohol lampa eller använda en ren bänk.

1. underhåll av C. elegans och ägg beredning för kemiska Test

  1. Underhåll C. elegans N2 (var. Bristol) på en agarplatta för NGM som utfodrats med live E. coli OP50 vid 20 ° C 12 , 13.
  2. Förbered ålder-synkroniserad ägg använder antingen bleka lösning behandling 5 eller tiden ägg äggläggande metod 6 , 14 , 15.
    Obs: innan ägget förberedelse, coat etoposid-innehållande NGM plattan med Värmeinaktiverade E. coli OP50 enligt beskrivningen nedan. Värmeinaktiverade E coli OP50 används för att minimera den metaboliska aktiviteten av E. coli 6 , 16.

2. Beredning av Värmeinaktiverade E. coli OP50 feed C. elegans under the toxicitetstest

  1. förbereda 500 mL dubbel jäst trypton (DYT) medium som beskrivs i tabell 1 och Inokulera en enda koloni av E. coli OP50 odlade på en Luria-Bertani (LB) agar plåt 5.
  2. Inkubera i E. coli OP50 i en skakande inkubator för 14 h vid 37 ° C och 150 rpm.
  3. Efter centrifugering under 30 minuter vid 3 220 x g och 20 ° C, ta bort alla supernatant DYT medium och lägga till en blandning av 25 mL av S-buffert, 250 µL av 1 M MgSO 4 och 25 µL av 5 mg/mL kolesterol (löst i etanol). Alla dessa lösningar är steril.
  4. Omsuspendera bakterierna och överföra dem till en disponibel plast tub 50 mL.
  5. För värme-inaktivering, inkubera den återsuspenderade E. coli OP50 i ett vattenbad under 30 minuter vid 65 ° C.
  6. Svalna ner till rumstemperatur och förvaras vid 4 ° C fram till användning. Detta kan förvaras i upp till en månad.

3. Beredning av NGM plattor som innehåller antingen 1% DMSO eller 750 µM etoposid

  1. Förbered två rena 200 mL glasflaskor. Lägga till 0,6 g NaCl, 0,5 g pepton, 3,4 g agar, 195 mL destillerat vatten och en magnetomrörare i en flaska. Lägga till en magnetomrörare i andra tomma flaskan.
  2. Autoklav dessa två flaskor under 15 minuter vid 121 ° C, och sedan kyla ner flaskorna i ett vattenbad under 30 minuter vid 55 ° C.
  3. Lägg till 0,2 mL 1 M CaCl 2, 0,2 mL av 5 mg/mL kolesterol, 0,2 mL 1 M MgSO 4 och 5 mL 1 M KPO 4 (alla dessa lösningar är sterila) och sedan blanda dem genom magnetisk omrörning på en värmeplatta vid 55 ° C.
  4. Dela blandade NGM mediet i två flaskor med samma volym (100 mL). Nästa, tillsätt 1 mL av DMSO till en flaska, blanda den igen med hjälp av magnetisk omrörning. Förvara andra flaskan i ett vattenbad vid 55 ° C tills nästa steg. Alikvotens 3 mL av DMSO-innehållande medium till varje 35 x 10 mm 2 petriskål. Ungefär 33 DMSO-innehållande NGM plattor kan göras från detta steg.
  5. Blanda andra flaskan med den magnetisk omrörningen, tillsätt 1 mL 75 mM etoposid (lager upplöst i DMSO), blanda igen och upprepa alikvotens procedur (steg 3,4). Ungefär 33 etoposid (750 µM)-innehållande NGM plattor kan göras från detta steg.
    Obs: Korrelerade tidigare papper 6, vi testade 0, 250, 500 och 1000 µM av etoposid. Baserat på dessa data, vi valde den 750 µM av etoposid dos i detta papper.
  6. Cool ner kemiska-innehållande NGM plattorna till rumstemperatur genom att lämna dem i rumstemperatur i ca 3 h, och lagra dem vid 4 ° C fram till användning.
    Obs: När det gäller ljuskänsliga kemikalier, blockera ut ljus för att minimera den ljus-inducerad nedbrytningen.
    Obs: Du kan också göra en normal NGM plåt utan kemikalier för den äggläggning test, som kan utföras med två olika kemisk behandling villkor som beskrivs nedan.
  7. Tillsätt 100 µL av Värmeinaktiverade E. coli OP50 (som beskrivs i avsnitt 2) och sprids på varje NGM platta. Låt torka över natten i en C. elegans inkubator vid 20 ° C för det kemiska test

4. Mätning av C. elegans tillväxt

  1. överföring av ålder-synkroniserad C. elegans ägg till NGM plattan kompletteras med 1% DMSO eller 750 µM etoposid.
  2. Inkubera C. elegans i en inkubator vid 20 ° C i 4 dagar. Observera maskar med stereo Mikroskop och ta mikroskopiska bilder varje dag. Vanligen är 20 X förstoring (1 X objektiv, 2 X zoom förstoring och 10 X okular objektivet) lämpligt för tillväxt observationen av C. elegans. Också ta en mikroskopisk bild av mikroskopet objektmikrometern för mask storlek kalibrering.
    Obs: Svält påverkar toxicitetstest. Därför, mata med tillräcklig bakterier eller justera den överförda C. elegans ägg nummer i början. Iaktta fram till 3 dagar att utesluta möjligheten av svält.
  3. Mäta kroppslängden av C. elegans som behandlats med DMSO eller etoposid vid varje tidpunkt med hjälp av ImageJ programvara.
    Obs: För varje prov mätning, 50 maskar är tillräckliga för den statistiska analysen.
    1. I ImageJ, öppna scenen mikrometer Mikroskopbilden (' fil ' → ' öppna ').
      Obs: Mikrometer bilden och masken bilder (steg 4,2) måste vara samma förstoringsgrad.
    2. Dra en linje av 1000 µm på Mikrometern kalibrering bilden med hjälp av ' rak linje ' verktyget.
    3. Klicka ' analysera ' → ' ange skala ' och skriv in 1.000 och µm in den ' känt avstånd ' box och ' enhet av längden ' box, respektive. Kontrollera ' Global ' och klicka på ' OK '.
    4. Öppna mask (' fil ' → ' öppna '). Ritar en linje längs funktionen av varje mask med ' frihandslinje ' verktyg. Få kroppen längd data genom att klicka ' analysera ' → ' åtgärd '.
    5. Upprepa dessa steg för 50 maskar.

5. C. elegans ägg om Assay

  1. Inkubera det ålder-synkroniserad ägg på NGM tallrik innehållande DMSO eller etoposid för 64 h (före första födseln) tills ung vuxen scenen vid 20 ° C.
    Obs: Det är frivilligt att använda maskar från tillväxt mätning experimenten. Det är bekvämt att göra tillväxt mätningen och ägg äggläggande assay tillsammans.
  2. Överföra 5 vuxna maskar till nya NGM plattor utan kemikalier (villkor 1, kemisk behandling inom en viss tidsperiod, från ägg till unga vuxna Stadium) eller nya NGM plattan som innehåller samma kemisk förbehandling (villkor 2, kontinuerlig exponering av kemikalier genom övergripande experimentell period), och sedan Inkubera dem i 24 h.
    Obs: Det rekommenderas att göra replikat med 3-5 NGM plattor för varje behandling; dessa replikat kan användas för statistisk analys.
  3. Överföring till nya NGM plattan som beskrivs ovan, och räkna antalet ägg varje dag. Räkna de maskar som kröp, dog och var internt hatchEd.
  4. Upprepa dessa steg tills maskar lägger inga fler ägg, vanligen i 5 dagar.
  5. Beräkna antalet ägg som per mask från varje platta och summera dessa värden varje dag i 5 dagar för att bestämma det totala antalet ägg som.
    Obs: Utesluta antalet maskar som kröp ut och internt kläckts från beräkningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Behandling av etoposid (24-96 h) efterbliven betydligt tillväxten av C. elegans. Efter 96 timmars inkubation ökade etoposid-behandlade maskar till 0,86 mm i kroppslängd, medan fordonet-behandlade maskar ökade till 1,04 mm (figur 1). Tillväxthämning observerades också tydligen under stereo Mikroskop observation (figur 2). Vi började se ägg från fordonet-behandlade maskar på 72 h inkubation. Å andra observerades ägg efter 96 h etoposid behandling. Från dessa data spekulerade vi att etoposid behandling försenas första födelsetiden i C. elegans.

Förutom fördröjningen av äggläggning, minskade etoposid behandling betydligt det totala antalet ägg som per mask (figur 3). Reproduktionstoxicitet, minskningen av totala ägg nummer av etoposid behandling, observerades när de unga vuxna maskarna var odlade i närvaro (figur 3B) eller frånvaro (figur 3A) kontinuerlig etoposid behandling. Det fanns inga signifikanta skillnader mellan kontroll-behandlade maskarna både experimentella villkor. Det totala antalet ägg från maskar behandlas för en viss tidsperiod (från ägg till unga vuxna scenen) var inte signifikant från det av maskar behandlas kontinuerligt med etoposid. I denna jämförelse utfördes statistisk analys av envägs variansanalys (ANOVA) följt av den Tukey flera jämförande test.

Figure 1
Figur 1: Mätning av tillväxt i C. elegans behandlas med etoposid. Ålder-synkroniserad C. elegans ägg odlades på NGM tallrikar kompletteras med DMSO (1%, fordonskontroll) eller etoposid (750 µM) för 24-96 h. mikrofotografier (visas i figur 2) togs varje dag, och kroppslängden mättes med ImageJ programvara. Data är uttryckta som medelvärde ± standardavvikelsen (SD) (n = 50, 50 maskar per grupp). p < 0,01, för betydande skillnader mellan fordon kontroll och etoposid behandling vid varje tidpunkt. Statistisk analys utfördes med hjälp av Students t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Stereo mikroskopbilder av C. elegans behandlas med etoposid. C. elegans behandlades som beskrivs i figur 1 (skalstapeln = 1 mm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Totala antalet ägg som från C. elegans behandlas med etoposid. Ålder-synkroniserad C. elegans ägg inkuberades på NGM tallrikar innehållande DMSO (1%, fordonskontroll) eller etoposid (750 µM) för 64 h. Nästa, det totala antalet ägg som observerades i frånvaro (A) eller (B) förekomsten av kontinuerlig kemisk behandling i 5 dagar. Maskar överfördes varje dag på normala NGM plattan (A), eller NGM platta kompletteras med samma kemikalier: 1% DMSO eller etoposid (750 µM) (B). Antalet ägg som var räknade och dividerat med det totala antalet maskar varje dag för att beräkna antalet ägg som per mask. Alla nummer av ägg per mask var sammanfattade i 5 dagar. Data uttrycks som den medelvärde ± SD från quadruplicate experiment. p < 0,01, för betydande skillnader mellan fordon kontroll och etoposid behandling. Statistisk analys utfördes med hjälp av Students t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Normal NGM agar media – 1000 mL för underhåll och äggläggning test utan kontinuerlig kemisk behandling
1. Tillsätt 2,5 g pepton, 3 g NaCl, 17 g agar och 975 mL destillerat vatten i en glasflaska.
2. autoklav under 15 minuter vid 121 ° C.
3. svalna i vattenbad under 30 minuter vid 55 ° C, och Lägg sedan till 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL av 5 mg/mL kolesterol (löst i etanol), 1 mL 1 M MgSO4, 25 mL KPO4.
4. Blanda med magnetisk omrörning och sedan alikvot i petriskålar (90 x 15 mm rätter för underhåll; 35 x 10 mm2 rätter för den äggläggning assay).
5. Förvara NGM plattorna vid 4 ° C fram till användning.
DYT media för odling av E. coli OP50 – 500 mL
1. Lägg 2,5 g NaCl, 5 g jäst extrakt, 8 g pepton, och 485 mL destillerat vatten till en Erlenmeyerkolv.
2. autoklav under 15 minuter vid 121 ° C.
3. kyl och förvara i rumstemperatur fram till användning.
S-buffert – 1000 mL
1. Tillsätt 5,85 g NaCl, 6 g KH2PO4, 1 g K2HPO4och 987 mL destillerat vatten i en glasflaska.
2. Justera pH-värdet i lösningen till 6.0.
3. autoklav under 15 minuter vid 121 ° C.
4. svalna och förvara i rumstemperatur fram till användning.

Tabell 1: Recept av kultur tillväxt medier och buffertar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I den här artikeln beskriver vi toxicitet utvärdering av kemikalier i C. elegans, en jord nematod, med etoposid som en toxiska exempel. För detta ändamål använde vi två experimentella förhållanden. C. elegans har odlats på etoposid som innehåller plattor från ägg till unga vuxna scenen i första set, och sedan tilläts maskarna lägger ägg på normala NGM plattor utan kemikalier. I den andra experimentella uppsättningen behandlades kontinuerligt C. elegans med etoposid under hela försöksperioden. Genom jämförelse av ägg nummer mellan de två experimentella villkor, kan vi avgöra om reproduktiv toxicitet av de testa föreningarna var reversibel eller irreversibel. Etoposid betydligt minskade det totala antalet ägg som både experimentella villkor (figur 3). Dessa data antyds att förbehandling av etoposid under den tidiga tillväxtfas var tillräcklig för att framkalla skador på reproduktiva organ, inklusive gonad groddar celler6; baserat på dessa data kunde vi spekulerar att etoposid behandling irreversibelt inducerad reproduktionstoxicitet i C. elegans.

Förutom de C. elegans experiment som beskrivs i denna artikel om metoden, tester annan toxicitet såsom livslängd assay14,15, mikroskopisk observation av gonad könsceller6,17, mätning av faryngeal pumpning hastighet och rörelse analys18,19 kan också användas för kemisk toxicitet utvärdering i C. elegans. In vitro odlade mänskliga cellinjer, primära celler, stamceller och 3D sfäroid kultur är andra möjliga alternativ för att utvärdera toxiciteten av olika kemikalier för att föröka begränsning av C. elegans experiment1, 6,20,21.

Även om det är blickar bevarande av viktiga gener i C. elegans, icke däggdjur organismen är olika från människor i termer av proteinsekvenser, mag och tarm system, ämnesomsättning, samt det saknar många gener. Därför behövs däggdjur djurförsök och kliniska prövningar för fullständig utvärdering av toxicitet av kemikalier. Med tanke på fördelarna med bekvämligheten och djur etiska frågor, kommer en C. elegans toxicitetstester plattform dock en användbar och praktisk lösning för den toxikologiska utvärderingen av olika kemikalier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgements

Denna studie stöddes av Korea Institute of Science och Technology intramurala forskning bidraget (2E27513) och höga moms mat teknik utveckling Program (IPET) finansieras av Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs (315067-03).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Affymetrix, USA 10906
Caenorhabditis elegans N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Wild type
Cholesterol Sigma, USA C3045
Dimethyl sulfoxide Sigma, USA D2650
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Etoposide Sigma, USA E1383
Image J software (ver 1.4) Natinoal Institute of Health, USA https://imagej.nih.gov/ij/
Microscope camera Jenopitk, Progress Gryphax, Germany
Peptone Merck, USA 107213
35 × 10 mm Petri dish SPL Life Sciences, South Korea 10035
90 × 15 mm Petri dish SPL Life Sciences, South Korea 10090
Stereo microscope Nikon, Japan SMZ800N
Yeast extract Becton Dickinson, USA 212750

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blomme, E. A., Will, Y. Toxicology strategies for drug discovery: present and future. Chem. Res. Toxicol. 29, (4), 473-504 (2016).
  2. Lilienblum, W., et al. Alternative methods to safety studies in experimental animals: role in the risk assessment of chemicals under the new European Chemicals Legislation (REACH). Arch. Toxicol. 82, (4), 211-236 (2008).
  3. Honnen, S. Caenorhabditis elegans as a powerful alternative model organism to promote research in genetic toxicology and biomedicine. Arch. Toxicol. In Press (2017).
  4. Hunt, P. R. The C. elegans model in toxicity testing. J. Appl. Toxicol. 37, (1), 50-59 (2017).
  5. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
  6. Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environ. Toxicol. 32, (6), 1836-1843 (2017).
  7. Imanikia, S., et al. The application of the comet assay to assess the genotoxicity of environmental pollutants in the nematode Caenorhabditis elegans. Environ. Toxicol. Pharmacol. 45, 356-361 (2016).
  8. Guo, X., et al. Perfluorooctane sulfonate exposure causes gonadal developmental toxicity in Caenorhabditis elegans through ROS-induced DNA damage. Chemosphere. 155, 115-126 (2016).
  9. Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A C. elegans screening platform for the rapid assessment of chemical disruption of germline function. Environ. Health Perspect. 121, (6), 717-724 (2013).
  10. Singh, S., Sharma, B., Kanwar, S. S., Kumar, A. Lead phytochemicals for anticancer drug development. Front. Plant Sci. 7, 1667 (2016).
  11. Kang, K., et al. A novel topoisomerase inhibitor, daurinol, suppresses growth of HCT116 cells with low hematological toxicity compared to etoposide. Neoplasia. 13, (11), 1043-1057 (2011).
  12. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293 (2011).
  13. Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metab. 15, (4), 451-465 (2012).
  14. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. J. Vis. Exp. (27), e1152 (2009).
  15. Weimer, S., et al. D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice. Nat. Commun. 5, 3563 (2014).
  16. Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Mol. Metab. 2, (2), 92-102 (2013).
  17. Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. Comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (96), e52445 (2015).
  18. Hahm, J. H., et al. C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation. Nat. Commun. 6, 8919 (2015).
  19. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321 (2015).
  20. Schmidt, B. Z., et al. In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: an overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities. Arch. Toxicol. 91, (1), 1-33 (2017).
  21. Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line. Toxicol. Sci. 127, (2), 403-411 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics